БЕССЫВОРОТОЧНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПТИЧЬЕЙ ВАКЦИНЫ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/00 C12N5/07 C12N5/71 C12N5/73 

Перекрестные ссылки с другими заявками

Данная заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США 62/793 674, поданной 17 января 2019 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Область техники изобретения

Настоящее раскрытие в основном имеет отношение к составам сред для культивирования клеток и способам размножения вирусов и размножения клеток в культуре, в частности, для производства вакцин. Конкретнее, настоящее раскрытие предоставляет бессывороточные среды определенного состава для культивирования клеток, которые обеспечивают культивирование in vitro первичных или вторичных клеточных культур для производства птичьих вакцин, при этом среда для выращивания клеток содержит вегетарианскую диету. Кроме того, настоящее раскрытие предоставляет способы размножения вирусов и размножения клеток в культуре с использованием бессывороточной питательной среды. В частности, культуральные среды настоящего раскрытия подходят для адгезивной культуры фибробластов, таких как фибробласты куриных эмбрионов.

Уровень техники изобретения

Большинство вирусных вакцин производится за счет систем клеточных культур. «Урожай» вируса имеет определяющее значение в клеточной культуре, ориентированной на производство вакцин, не только по той причине, что более высокий «урожай» оборачивается более быстрой выработкой большего количества вакцины, но также потому, что это важно для определения экономической эффективности cпособа производства вакцины на основе клеточной культуры.

Клетки, используемые для производства вирусов/вакцин, могут быть клеточными линиями или первичным животным. Фибробласты куриных эмбрионов (CEF клетки) являются примером первичных клеток, используемых для производства вирусов. Ослабленные вирусы в большинстве случаев размножаются в CEF клеточных культурах. Для роста и размножения клеток in vitro требуются определенные условия культивирования, включающие среду, которая может поддерживать рост и размножение клеток. Как правило, обычно используемая среда для культивирования клеток, происходящих от млекопитающего, содержит богатый солевой раствор, включающий витамины, аминокислоты, основные микроэлементы и сахара. Кроме того, в качестве дополнения к среде обычно добавляют гормоны роста, ферменты и биологически активные белки, необходимые для клеточного роста, в виде сыворотки, полученной из крови животного, или альтернативно в виде белковых компонентов, выделенных из сыворотки, полученной из крови животного.

Примерами сывороточных продуктов, полученных из крови животного, являются сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота, куриная сыворотка, лошадиная сыворотка и свиная сыворотка. Эти сыворотки получают из фракционированной крови, из которой удалены эритроциты и лейкоциты. Первичные клетки, такие как CEF клетки, еще более зависят от источников сыворотки животного, чем клеточные линии. Таким образом, первичные клетки обычно культивируют в среде, содержащей от 5 до 10% сыворотки, в большинстве случаев эмбриональной телячьей сыворотки (FCS).

Сывороточные продукты, полученные из крови животного, могут содержать занесенные патогенные агенты, такие как вирусы или прионовые белки. Это является причиной опасения относительно безопасности использования сыворотки вследствие потенциального риска того, что эти патогенные агенты могут быть переданы животному/человеку, которого лечили или вакцинировали вакциной или каким-либо другим фармацевтическим продуктом, выработанным в клеточной культуре с добавлением сыворотки. Эти опасения касаются, например, широко используемого дополнения в виде бычьей сыворотки, поскольку одной из множества крупных проблем/рисков, связанных с ее использованием, является возможность передачи агента, вызывающего губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), животным/людям, которые вступали в контакт с продуктами/вакцинами, полученными из клеточных культур с использованием бычьей сыворотки в качестве дополнения. Соответственно, использование бессывороточной среды может быть предпочтительным для того, чтобы исключить наличие посторонних веществ в сыворотке, таких как вирусы или патогенные прионы, которые не должны содержаться в конечных продуктах, например, рекомбинантных белках или вакцинах на основе вирусного вектора.

Принимая во внимание возможный риск, связанный с использованием сыворотки животных в клеточной культуре, стало ясно, что разработка бессывороточной среды, которая не содержит каких-либо происходящих от животного белков или пептидов, может быть предпочтительной. Говоря более конкретно, замена белков или пептидов животного происхождения протеинами, пептидами или липидами, выделенными из источников неживотного происхождения, могла бы уменьшить тревогу по поводу безопасности, связанной с сывороткой.

Сохраняется потребность в стратегиях улучшения развития производства бессывороточных вакцин.

Раскрытие изобретения

Настоящее раскрытие предоставляет бессывороточную культуральную среду, которая дает возможность выращивать большое разнообразие клеток, как в суспензии, так и в виде монослоя, наряду с тем, что она позволяет обеспечивать производство птичьей вакцины.

Настоящее раскрытие предоставляет бессывороточную культуральную среду, содержащую различные неорганические соли, углеводы, аминокислоты, буферные вещества, витамины и соединения для того, чтобы воспроизводить естественную окружающую среду клетки. При необходимости, многие из аминокислот, углеводов, солей, витаминов и соединений могут быть получены из коммерчески доступной синтетической среды, не содержащей белков или способствующих росту веществ, такой как EMEM или DMEM.

Настоящее раскрытие предоставляет бессывороточную культуральную среду, содержащую триптон (пептиды и пептоны), полученные из растительных или овощных источников.

Кроме того, настоящее раскрытие также предоставляет способ использования бессывороточной среды для культивирования клеток и клеточных линий для культивирования и размножения вирусов.

Подробное описание изобретения

Цель настоящего раскрытия заключается в разработке бессывороточной культуральной среды, которая подходит для выращивания большого числа клеток, как в виде суспензии, так и в виде монослоя, при том, что она обеспечивает возможность производства птичьей вакцины.

Среда настоящего раскрытия также включает различные неорганические соли, углеводы, углеводы, аминокислоты, буферные вещества, витамины и соединения для того, чтобы воспроизводить естественную окружающую среду клетки. При необходимости многие из аминокислот, углеводов, солей, витаминов и соединений могут быть получены из коммерчески доступной синтетической среды, не содержащей белков или способствующих росту факторов, такой как EMEM или DMEM. В дополнение к вышеописанным заменителям сыворотки к среде могут быть добавлены различные дополнительные аминокислоты, соли, углеводы, витамины и другие соединения, такие как дрожжевой экстракт и антибиотики, для того, чтобы получить состав полной бессывороточной среды настоящего раскрытия.

Другая цель настоящего раскрытия имеет отношение к процессу использования бессывороточной среды для культивирования клеток и клеточных линий для культивирования и размножения вирусов. Бессывороточная среда содержит триптон (пептиды и пептоны), полученный из растительных или овощных источников.

Настоящее раскрытие предоставляет способ культивирования первичных клеток, в частности, птичьих клеток, в бессывороточной среде и способ производства вируса в первичных клетках в условиях без сыворотки. Текущий способ культивирования первичных клеток может характеризоваться тем, что клетки культивируются в бессывороточной среде с добавлением пептидов и пептонов, полученных из растительных или овощных источников.

Следует отметить, что в этом раскрытии и, в частности, в пунктах формулы изобретения, такие термины, как “содержит”, “содержащий” и тому подобные, могут означать “включает”, “включенный”, “включая” и тому подобное; и что такие термины как “состоящий в основном из” и “состоит в основном из” предусматривают включение элементов, не перечисленных в явном виде, но исключают элементы, которые содержатся в предшествующем уровне техники или которые затрагивают самые существенные или новые характеристики изобретения.

Если не указано иначе, технические термины используются в соответствии с обычным употреблением. Определения общих терминов в молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V. опубликованной Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Формы единственного числа “a,” “an” и “the” включают формы множественного числа, если контекст явно не диктует иное. Аналогично, слово “или” предназначается для включения “и”, если контекст явно не диктует иное. Слово “или” означает какой-либо один член из конкретного списка и также включает любую комбинацию членов из этого списка.

Термин “первичные клетки”, использованные в настоящем описании, хорошо известен специалистам в данной области техники. Без ограничения следующим определением термин “первичные клетки” может относиться к клеткам, которые недавно выделены из ткани животного или человека, органа или организма, при этом данные клетки не способны постоянно и неограниченно делиться и размножаться. Обычно, первичные клетки делятся в клеточной культуре меньше, чем 100 раз, часто меньше чем 50 раз, часто меньше чем 25 раз. Таким образом, первичные клетки не претерпевают процесса иммортализации. Примерами первичных клеток являются фибробласты животных, такие как, но без ограничения, фибробласты куриных эмбрионов (CEF клетки). Способы изолирования первичных клеток хорошо известны. Обычно первичные клеточные структуры получают непосредственно из тканей, органов или эмбрионов, подвергнув ткани, органы или эмбрионы обработке протеазой для получения отдельных клеток.

Способ настоящего раскрытия не ограничивается клетками, которые формируют монослои. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления способ согласно настоящему раскрытию может использоваться для всех других типов первичных клеток, таких как, клетки, по своей природе растущие в суспензионной культуре (например, лимфоциты или другие типы клеток крови), или клетки, по своей природе растущие как прикрепленные клетки, но адаптированные для роста в суспензионной культуре.

Как показано ниже, клетки также могут использоваться при отсутствии сыворотки для амплификации вирусов, которые могут использоваться в качестве вакцин.

В большинстве случаев вирусы, включая вирусы дикого типа, ослабленные вирусы и рекомбинантные вирусы, которые используются в качестве вакцин, выращиваются и размножаются при условиях с содержанием сыворотки. Однако, как отмечалось выше, существует потенциальный риск того, что сыворотка может содержать патогенные агенты, которые могут быть переданы животному/человеку, которого лечили или вакцинировали вакциной. С целью уменьшения риска наличия загрязняющих веществ в вакцине дополнительным аспектом раскрытия является возможность пассировать и/или культивировать в бессывороточных условиях те вирусы, которые предназначаются для использования в качестве вакцины, но которые ранее размножались в условиях с содержанием сыворотки.

Неожиданным было то, что первичные клетки, по своей природе растущие как прикрепленные клетки, могут эффективно прикрепляться к поверхности сосуда для культивирования клеток без формирования неприемлемых количеств агрегатов и могут расти в логарифмической фазе при отсутствии сыворотки, несмотря на то, что обычно считается, что первичные клетки зависят от большого количества различных факторов и компонентов, содержащихся в сыворотке. Более того, считается, что адгезивные клетки формируют нежизнеспособные агрегаты, которые не прикрепляются к поверхности сосуда для культивирования клеток при культивировании в бессывороточной среде. Таким образом, неожиданно было установлено, что достаточно дополнить бессывороточную среду пептидами и пептонами, происходящими из растительных или овощных источников, чтобы обеспечить прикрепление и рост адгезивных первичных клеток. Более того, также было неожиданно, что первичные клетки, культивированные в суспензионной культуре, могут быть выращены при помощи сред, использованных в способе согласно настоящему раскрытию.

В частности, это было неожиданно, что первичные птичьи клетки, такие как фибробласты куриных эмбрионов (CEF), могут культивироваться, будучи прикрепленными к поверхности сосуда для культивирования клеток без формирования неприемлемых количеств агрегатов в бессывороточной среде с добавлением пептидов и пептонов, полученных из растительных или овощных источников. Подразумевается, что птичьи клетки плохо растут в бессывороточной среде, не содержащей факторов роста или факторов, способствующих прикреплению, найденных в сыворотке, т.е. неожиданно было обнаружено, что плохой рост первичных птичьих клеток можно значительно улучшить путем дополнения бессывороточной среды пептидами и пептонами, происходящими из растительных или овощных источников.

Термин “культивирование клеток” в бессывороточной среде в контексте адгезивных первичных клеток относится к высеванию клеток в культуральный флакон в бессывороточной среде, наращиванию клеток в бессывороточной среде в логарифмической фазе до формирования монослоя и/или поддержанию клеток в бессывороточной среде до формирования монослоя. Термин “культивирование клеток” в бессывороточной среде также относится к способу, в котором все из вышеупомянутых этапов осуществляются в бессывороточной среде, так что в течение всего процесса культивирования клеток отсутствуют продукты из сыворотки животных. Таким образом, в более общем значении термин “культивирование клеток в бессывороточной среде” имеет отношение к тому факту, что все среды, приводящие к формированию монослоя, являются бессывороточными средами. В среды, использованные на всех вышеуказанных этапах, могут быть добавлены пептиды и пептоны, происходящие из растительных или овощных источников.

Термин “культивирование клеток” в бессывороточной среде в контексте клеток, растущих в суспензионной культуре, относится к высеванию клеток в культуральный флакон в бессывороточную среду, наращиванию клеток в бессывороточной среде в логарифмической фазе и/или поддержанию клеток в бессывороточной среде до получения максимальной плотности клеток, при которой не происходит дальнейшего размножения. Термин “культивирование клеток” в бессывороточной среде относится к способу, в котором все из вышеупомянутых этапов осуществляются в бессывороточной среде, так что в течение всего периода культивирования клеток отсутствуют продукты из сыворотки животных. В среды, использованные на всех вышеуказанных этапах, могут быть добавлены пептиды и пептоны, происходящие из растительных или овощных источников.

Термин “бессывороточная” среда относится к любой среде для культивирования клеток, не содержащей сыворотку животного или человеческого происхождения. Подходящие для культивирования клеток среды известны специалисту в данной области техники. Эти среды содержат соли, витамины, буферы, углеводы, аминокислоты и другие соединения, такие как дрожжевой экстракт и антибиотики.

Среды, используемые согласно способу настоящего раскрытия, в частности, среды, используемые для адгезивных клеток, таких как CEF клетки, содержат пептиды и пептоны, происходящие из растительных или овощных источников. Примером пептидов и пептонов является триптон растительного происхождения.

Бессывороточная среда может дополнительно содержать одну или более добавок, выбранных из микробных экстрактов, растительных экстрактов и экстрактов от животных, не являющихся млекопитающими. Микробный экстракт может быть дрожжевым экстрактом или ультрафильтратом дрожжевого экстракта. Растительный экстракт может быть рисовым экстрактом или соевым экстрактом. Экстракт от животных, не являющихся млекопитающими, может быть рыбным экстрактом.

Эта бессывороточная среда также может использоваться вместе с добавлением продуктов, полученных из сыворотки крови животного (например, от 0,5 до 3%) в качестве способа уменьшения общей концентрации сыворотки, как правило, необходимой (5 до 10%) для поддержания роста первичных адгезивных клеток или клеточных линий.

Увеличение числа копий (амплификация) вируса может включать следующие этапы: на первом этапе первичные клетки культивируются согласно способу, описанному выше, т.е. первичные клетки культивируются в бессывороточной среде с добавлением пептидов и пептонов, полученных из растительных или овощных источников. Все условия и определения, данные в описании способа культивирования первичных клеток выше, также применяются к определению первой стадии способа амплификации вируса согласно этому варианту осуществления настоящего раскрытия. На втором этапе первичные клетки инфицируют вирусом. На третьем этапе инфицированные клетки инкубируют в бессывороточной среде до получения «потомства» вируса. Наконец, на четвертом этапе вирус изолируют из инфицированных клеток или клетки, содержащие вирус, собирают так, чтобы эти инфицированные клетки оставались жизнеспособными.

Способы инфицирования первичных клеток согласно второму этапу текущего способа увеличения копий вируса известны. В качестве примера, вирус может быть просто добавлен в среду. Альтернативно, среда может быть удалена, а вирус может быть добавлен в свежую среду, которая в свою очередь добавляется к клеткам. Для получения эффективного инфицирования количество суспензии вируса/среды должно быть как можно меньше, чтобы иметь высокую концентрацию вируса. После прикрепления вируса может быть добавлена дополнительная среда.

На третьей стадии текущего способа инфицированные клетки культивируют в бессывороточной среде до получения «потомства» вируса.

Вирусное «потомство» может быть сконцентрировано и очищено с помощью способов, известных специалистам в данной области техники.

Способы согласно настоящему раскрытию имеют отношение к способу увеличения копий (амплификации) поксвируса, включающему следующие стадии: (I) культивирование первичных клеток согласно способу, описанному в этом документе, т.е., способу, в котором первичные клетки культивируются в бессывороточной среде с добавлением пептидов и пептонов, полученных из растительных или овощных источников, (II) инфицирование первичных клеток поксвирусом, (III) культивирование инфицированных клеток в бессывороточной среде до получения «потомства» вируса и (iv) изолирование вируса из инфицированных клеток. Вирусы, выделенные согласно текущему способу, не содержат каких-либо продуктов и/или инфекционных агентов, содержащихся в сыворотке животных.

Процесс пассирования, культивирования и/или очистки в бессывороточных условиях тех вирусов, которые ранее были амплифицированы в условиях с содержанием сыворотки, называется “повторным получением”. Такое повторное получение также может использоваться, если не полностью понятно, как был получен главный посевной вирус, который используется для производства вакцины. Повторное получение в условиях без сыворотки резко снижает риск наличия загрязнений в вакцине, в частности, нежелательных инфекционных агентов.

Способы согласно настоящему раскрытию имеют отношение к культивированию первичных птичьих клеток и увеличению копий вируса, при этом вирус является повторно полученным вирусом. Например, текущие способы применяются для повторного получения вирусов и запасов (стоков) вирусов, в частности, запасов вирусов, которые пассируются или ранее пассировались в среде, содержащей сыворотку.

Одного пассажа исходного материала, т.е. вируса, повторно полученного в бессывороточных условиях, может быть достаточно для повторного получения вируса. Термин “пассирование” относится к этапам культивирования клеток в условиях без сыворотки, заражению клеток вирусом, который должен быть повторно получен, и получению вируса, продуцированного инфицированными клетками. Хотя одного пассажа может быть достаточно, предпочтительным может быть пассирование вируса несколько раз в бессывороточных условиях. В этом случае, вирус, полученный из первого этапа пассирования, используется для того, чтобы вновь инфицировать свежие клетки. Пассирование в бессывороточных условиях можно комбинировать с одним или более способами очистки вируса в бессывороточных условиях. Общее число пассажей, необязательно включая очистку, находится в пределах от 1 до более, чем 10, например, от 3 до 8 или от 4 до 6. Способы очистки являются стандартными вирусологическими методами, применяемыми специалистами в данной области техники.

Как обсуждалось ранее, специалистам в данной области техники понятно, что первичные птичьи клетки росли нежелательным образом в условиях без сыворотки. Можно было ожидать, что дополнительный стресс, связанный с инфекцией поксвирусом, будет являться причиной смерти уже и без того стрессированных клеток до того, как произойдет значительное увеличение копий поксвируса. Неожиданно оказалось, что птичьи клетки, выращенные согласно настоящему способу в бессывороточной среде с добавлением пептидов и пептонов, происходящих из растительных или овощных источников, эффективно обеспечивают репликацию и амплификацию поксвирусов.

Поксвирус является предпочтительно ортопоксвирусом. Примерами ортопоксвирусов являются авипоксвирусы и вирус осповакцины.

Термин “авипоксвирус” относится к любому авипоксвирусу, такому как Fowlpoxvirus, Canarypoxvirus, Uncopoxvirus, Mynahpoxvirus, Pigeonpoxvirus, Psittacinepoxvirus, Quailpoxvirus, Peacockpoxvirus, Penguinpoxvirus, Sparrowpoxvirus, Starlingpoxvirus и Turkeypoxvirus. Предпочтительными авипоксвирусами являются Canarypoxvirus и Fowlpoxvirus.

Термин “вирус болезни Марека” имеет отношение к любому из серологических типов альфа герпесвирусов, используемых для получения вакцин от болезни Марека, включая, но не ограничиваясь этим, вирусные серотипы 1, 2 и 3.

Цель настоящего раскрытия заключается в разработке способа для производства вакцин, в частности, поксвирусных вакцин, получаемых с помощью вышеописанного способа. Согласно предпочтительному варианту осуществления поксвирус представляет собой вирус оспы кур (FP).

Другая цель настоящего раскрытия заключается в разработке способа производства вакцин, используя производство вакцины от болезни Марека (серотипы 1, 2 и 3) в бессывороточной среде.

Другая цель настоящего раскрытия заключается в создании композиции, содержащей вирус, в частности, рекомбинантный вирус Марека серотип 3 (HVT), полученный способом согласно настоящему раскрытию. Благодаря данному способу размножения вируса, композиция не содержит каких-либо продуктов и/или инфекционных агентов, содержащихся в сыворотке животных. В противоположность этому, композиции, содержащие вирусы, полученные в соответствии с общепринятыми способами, содержат остаточные вещества, происходящие из сыворотки животных. Это особенно касается случаев композиций, содержащих вакцины от болезни Марека и полученных согласно общепринятым способам, такие как HVT вирусный серотип.

Другой целью настоящего раскрытия является разработка способа производства вакцины с использованием получения вакцины против инфекционного бурсита в бессывороточной среде.

Другая цель настоящего раскрытия заключается в разработке способа лечения или вакцинации животного, в том числе человека, нуждающегося в этом, включающего введение вируса, как определено выше, или композиции, как определено выше, в организм животного или человека.

Настоящее раскрытие станет более понятным в сочетании со следующими примерами, которые предназначаются для иллюстрации, но не для ограничения объема настоящего раскрытия.

Примеры

Пример 1. Первичная культура клеток фибробластов куриных эмбрионов (CEF)

Получение клеточной культуры

Ферментный препарат; TrypLE Select Enzyme (1X) от компании GIBCO использовали без дополнительного разведения.

Приготовление ростовой среды; готовили среду, содержащую среду EMEM и VEGITONE (1X) от SIGMA в виде ~5% VEGITONE об/об в среде EMEM.

Переработка эмбрионов; эмбрионы три раза промывали в 50 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) от GIBCO и затем расщепляли в растворе TrypLE четыре раза, причем каждый период обработки длился пять минут.

Клетки собирали в лабораторные химические стаканы с 50/50 VEGITONE и EMEM раствора и промывали средой для подготовки клеток (5% VEGITONE об/об в EMEM среде). Клетки центрифугировали при 750 RPM в течение двенадцати минут и хранили при 2-7°C в течение до 72 часов.

Общий объем клеток составлял 110 мл, причем, содержалось 6,0 x 10⁶ клеток/мл.

Каждый из сосудов для первичной клеточной культуры был подготовлен (всего 6) в соответствии с таблицей 1, ниже.

Таблица 1. Условия в сосудах для первичной клеточной культуры

Контейнер Число RB Объем EMEM
(мл) Количество клеток на мл Объем клеток (мл) Объем VEGITONE (мл ) Роллер-флакон (RB) 6 285 6.0 x 10⁶ 18 15

В роллер-флаконах наблюдалось 100% слияние после 48-часовой инкубации при 35-39,0°C и 0,2 RPM.

Пассирование HVT вируса в клеточной культуре

Пять роллер-флаконов «засевали» первичной (1°) CEF клеточной культурой из расчета 100 миллионов CEF клеток на сосуд. Для обеспечения дополнительного питания CEF клеток использовали 1X VEGITONE в концентрации ~ 5% в среде (EMEM). В роллер-флаконах наблюдалось 100% слияние после 48-часовой инкубации при 35-39,0°C и 0,2 RPM.

CEF клетки инокулировали 1 ампулой HVT SR-3, затем инкубировали при 35-39°C и 0,2 RPM, и примерно через ~ 46 часов определяли цитопатический эффект (CPE), который составил около 60%. Этот первый пассаж этих HVT-инфицированных CEF клеток (X+1) собирали с помощью трипсинизации с последующим центрифугированием и ресуспендированием во флаконах, содержащих 6 разных по составу сред для криоконсервации. Затем эти флаконы замораживали примерно до -110°C, используя программируемый криозамораживатель. Ресуспендированные флаконы метили следующим образом: X+1(1) для условия 1, X+1(2) для условия 2, X+1(3) для условия 3, X+1(4) для условия 4, X+1(5) для условия 5 и X+1(6) для условия 6. Среды для криоконсервации и параметры замораживания показаны в таблице 2, ниже.

Таблица 2. Среды для криоконсервации и параметры замораживания

Разные криоконсерванты в 1x EMEM с использованием 0,35 г/л бикарбоната натрия Усло-вие % DMSO % телячьей сыворот-ки¹ % LB Veg² % MC³ Подсчет клеток до заморозки (0, 2 мл доза) Титр до заморозки (0, 2 мл доза)⁴ Подсчет клеток после заморозки (0,2 мл доза) Титр после заморозки (0, 2 мл доза)⁴ 1 (конт-роль) 3.5 15 0 0 12k/дозу 4040 15k/дозу 4820 2 3.5 0 0 0 23k/дозу 4880 11k/дозу 4340 3 3.5 0 5 0 N/A N/A 18k/дозу 4560 4 5.0 0 0 0 16k/дозу 4160 13k/дозу 4940 5 10 0 0 0 15k/дозу 4120 9k/дозу 4340 6 10 0 0 10 14k/дозу 4400 12k/дозу 4480

¹Облученная телячья сыворотка от компании RMBio,

²1x LB VEGITONE от компании SIGMA,

³1% метилцеллюлоза (4000CP) от SIGMA в 1% PBS-растворе, и

⁴Образцы, разбавленные из расчета 0,5 мл состава вакцины в 49,5 мл разбавителе Марека, затем разведенные 1:500 для титрования и подсчета жизнеспособных клеток (1:1 трипановый синий).

Пример 2. Первичная клеточная культура фибробластов куриных эмбрионов (CEF)

Получение культуры клеток

Ферментный препарат; TrypLE Select Enzyme (1X) от компании GIBCO использовали без дополнительного разведения.

Приготовление среды для роста; готовили среду, содержащую RS-EMEM среду и VEGITONE (1X) от SIGMA, в виде ~5% VEGITONE об/об в EMEM среде.

Переработка эмбрионов; эмбрионы три раза промывали в 1000 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) от GIBCO и затем расщепляли в 50 мл раствора TrypLE четыре раза, причем каждый период обработки длился пять минут.

Клетки собирали в лабораторные химические стаканы с 20 мл 20% VEGITONE в EMEM и промывали 10 мл среды для подготовки клеток (5% VEGITONE об/об в EMEM среде). Клетки центрифугировали при 750 RPM в течение двенадцати минут и хранили при 2-7°C в течение до 72 часов.

Общий объем составлял 200 мл, причем, содержалось 28 x 10⁶ клеток/мл.

Каждый из сосудов-роллеров был подготовлен (всего 12) в соответствии с таблицей 3, ниже.

Таблица 3. Условия в сосуде для первичной клеточной культуры

Контейнер Число RB Объем EMEM
(мл) Количество клеток на мл Объем клеток (мл) Объем VEGITONE (мл ) Роллер-флакон (RB) 12 285 2,8 x 10⁷ 16 15,0

Пассирование HVT-вируса в клеточной культуре, второй пассаж

В десять роллер-флаконов 850см² высевали первичные (1°) CEF клетки в количестве 450 миллионов CEF клеток на роллер-флакон и инкубировали при 35-39,0°C и 0,15 RPM. Для обеспечения питания CEF клеток использовали 1X VEGITONE в концентрации ~ 5% в среде (EMEM).

В один роллер-флакон, содержащий CEF клеточную суспензию, инокулировали 1 мл X+1(2) из таблицы 2 и инкубировали при 35-39,0°C и 0,15 RPM. Через 50 часов после инокуляции определяли цитопатический эффект (CPE), который составлял около 60%. Этот второй пассаж этих HVT-инфицированных клеток (X+2) собирали, используя 1xTrypLE Select, и центрифугировали при 750xg в течение 15 минут для осаждения клеток. Осажденные клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 5% 1XLB VEGITONE и 0,1% метилцеллюлозы. 2,0 мл этой клеточной суспензии добавили в остальные 9 роллер-флаконов, для того, чтобы получить третий пассаж HVT-инфицированных CEF клеток (X+3).

Пассирование HVT-вируса в клеточной культуре, третий пассаж

Девять роллер-флаконов, содержащих клеточную суспензию CEF, инокулировали, используя 2,0 мл клеток второго пассажа (X+2), и инкубировали при 35-39,0°C и 0,15 RPM. Примерно через 48 часов после инокуляции было установлено, что цитопатический эффект (CPE) составляет около 75-80%. Клетки третьего пассажа (X+3), содержащиеся в каждом роллер-флаконе, собирали с помощью 1xTrypLE Select и центрифугирования при 750 x g в течение 15 минут, чтобы осадить клетки. TrypLE Select нейтрализовали примерно 20 мл EMEM, содержащей 10% VEGITONE до центрифугирования. Осажденные клетки ресуспендировали в двух разных средах для криоконсервации и замораживали, используя программируемый криозамораживатель. Среда для криоконсервации и параметры замораживания показаны в таблице 4, ниже.

Таблица 4. Среда для криоконсервации и параметры замораживания

Условие % DMSO % LB Veg¹ % MC² Среда, использованная для доведения до объема 100 мл Титр после замораживания (0,2 мл доза)³ 1 10 0 0,1 RS-EMEM 7160 2 10 5 0,1 PBS 4680

¹1x LB VEGITONE от SIGMA,

²1% метилцеллюлоза (4000CP) от SIGMA в 1% PBS-растворе.

Примерные составы сред, использованные для CEF клеточной культуры, показаны в таблице 5. Среда для криоконсервации CEF клеток или CEF клеток, инфицированных вирусом HVT, показана в таблице 6.

Таблица 5. Состав среды для CEF клеточной культуры. Показаны количества для получения 1 л бессывороточной среды

Компонент Количество/литр EMEM порошок (Sigma M1018) 10-12 грамм LB Broth, VEGITONE (Sigma 28713) 0.5-2,0 грамм Бикарбонат натрия 0.35-1,0 грамм Раствор антибиотика 0-20 мл Стерильная деионизированная вода до 1000 мл

Таблица 6. Среда для криоконсервации CEF/вируса. Показаны количества для получения 1 л среды

Компонент Количество/литр EMEM порошок (Sigma M1018) 10-12 грамм Бикарбонат натрия 0.35-1,0 грамм Диметил сульфоксид (DMSO) 50 мл Раствор антибиотика 0-20 мл Стерильная деионизированная вода до 1000 мл

Использование бессывороточной среды в соответствии с таблицей 5 давало в результате выход HVT-вируса, сравнимый с партиями, которые были получены при использовании общепринятых сред для выращивания культуры клеток, содержащих примерно 6% телячьей сыворотки (таблица 7) при сходных условиях роста/инкубации.

Таблица 7. Результаты выхода («урожая») рекомбинантного HVT вируса

Партия (культивирование) Клеток/в RB (log) Клеток/RB выход (log) % восстановленных PFU/RB
(log) Эффективность партии* Обычная партия 1 9,2 8,7 26,5% 8,2 0,095 Обычная партия 2 9,2 8,8 33,1% 8,2 0,095 Бессывороточная партия 1 8,4 7,9 30,7% 7,5 0,141

*Эффективность партии - это общее количество восстановленных PFU на роллер-флакон, разделенное на общее количество CEF клеток, которые были посеяны в роллер-флакон.

Пример 3. Выращивание вируса оспы кур, вируса инфекционного бурсита и вируса болезни Марека (серотипы 1, 2 и 3) в бессывороточной среде

При использовании бессывороточной среды согласно таблице 5 для выращивания CEF клеток инфицированных/инокулированных разными стоками вирусов в соответствии с таблицей 8 ниже и выращивании в сходных условиях для роста наблюдался CPE, по меньшей мере, 50% и репликация вируса, как показано в таблице 8.

Таблица 8. Вакцинный вирус и полученные результаты «выхода»

Вакцинный вирус CEF плотность клеток/RB Объем бессыворо-точной среды/RB Часы после инокуляции Наблюдаемый процент CPE Наблюдаемая репликация вируса Серотип 1
(Rispens) 10⁸ до 10¹⁰ 200 до 350 мл 48 до 120 часов 50 до 80% Да Серотип 2
(SB-1) 10⁸ до 10¹⁰ 200 до 350 мл 48 до 120 часов 50 до 80% Да Серотип 3
(HVT) 10⁸ до 10¹⁰ 200 до 350 мл 16 до 120 часов 50 до 80% Да Вирус инфекционного бурсита 10⁸ до 10¹⁰ 200 до 350 мл 20 до 72 часов ≥ 80% Да Рекомбинантный вирус оспы кур 10⁸ до 10¹⁰ 200 до 350 мл 48 до 96 часов ≥ 80% Да

Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в этом документе. Следует отметить, что различные модификации изобретения, в дополнение к описанным в этом документе, станут очевидны специалистам в данной области техники, исходя из предшествующего описания.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана культуральная среда для культивирования эмбриональных клеток птиц, включающая основную среду, не содержащую человеческий или животный белок, представляющую собой ЕМЕМ, где культуральная среда содержит триптон растительного происхождения. Также описан способ размножения вирусов, включающий культивирование клеток эмбрионов птиц в среде для культивирования эмбриональных клеток птиц. Технический результат заключается в создании бессывороточной среды для культивирования клеток с использованием для достижения этой цели триптона растительного происхождения. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.

1. Культуральная среда для культивирования эмбриональных клеток птиц, включающая основную среду, не содержащую человеческий или животный белок, представляющую собой ЕМЕМ, где культуральная среда содержит триптон растительного происхождения.

2. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая антибиотик.

3. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая дрожжевой экстракт.

4. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая соль.

5. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая углевод.

6. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая свободные аминокислоты.

7. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая один или более ионов металлов, витаминов и кофакторов.

8. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая продукты, полученные из сыворотки крови животного.

9. Культуральная среда по п. 8, в которой продукты, полученные из сыворотки крови животного, содержат от 0% до 7% включительно об/об культуральной среды.

10. Культуральная среда по п. 1, дополнительно содержащая, по меньшей мере, один буфер, выбранный из CaCl₂·2H₂O, MgSO₄·7H₂O, NaH₂PO₄·2H₂O, пирувата натрия, HEPES и MOPS в количестве, достаточном для поддержания значения рН среды в диапазоне 6,5-7,5.

11. Способ размножения вирусов, включающий:

a. культивирование клеток эмбрионов птиц в среде по п. 1,

b. формирование прикрепленной или неприкрепленной клеточной культуры, способной к пролиферации в основной среде при отсутствии сыворотки,

c. инфицирование указанных клеток эмбрионов птиц вирусом, выбранным из поксвируса или поксвирусного вектора, вируса инфекционного бурсита, Rispens, SB-1, HVT или какого-либо вектора вируса Марека серотипа 1, 2 или 3, когда плотность клеток достигает, по меньшей мере, 1,0 x 10⁶ клеток/мл,

d. культивирование указанных инфицированных птичьих эмбриональных клеток в среде по п. 1 до тех пор, пока CPE не достигнет, по меньшей мере, 50%, и

e. сбор указанного вируса.