СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДАПТИРОВАННОГО К ФИБРОБЛАСТАМ ЭМБРИОНОВ ПЕРЕПЕЛА ВИРУСА КРАСНУХИ Российский патент 2003 года по МПК C12N7/00 A61K39/20 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к сфере разработки вакцин, а именно к получению живого аттенуированного вируса краснухи, который вводится в организм людей, чтобы защитить их от заболевания краснухой. Изобретение заключается в получении переадаптированного вируса краснухи, способного размножаться в культуре первично-тринсинизированных фибробластов эмбрионов перепела.

Краснуха обычно характеризуется относительно легким течением заболевания у детей, хотя в ряде случаев может вызывать тяжелые побочные проявления, такие как энцефалиты, артриты, повреждения функции нервной системы и другие.

Наибольшую опасность заболевание может представлять для беременных женщин, зараженных вирусом краснухи в первом триместре беременности. Вирус инфицирует эмбрион, вызывая множественные нарушения внутриутробного развития, включая микроцефалию, слепоту или другие дефекты зрения, сердечные патологии и патологии ротовой полости.

Существование опасности инфицирования вирусом краснухи эмбриона в течение первых двух-трех месяцев беременности предполагает защиту девушек против заболевания краснухой до достижения ими репродуктивного периода. Аттенуированные вирусные вакцины позволяют обеспечить необходимый протективный иммунный статус женщинам детородного возраста.

В настоящее время известен способ адаптации вируса краснухи, включающий заражение вирусом краснухи смеси нескольких типов клеток, содержащей в качестве одного из компонентов фибробласты эмбрионов перепела - пат. США 4071618, 1978 (1).

Недостатком известного способа (1) является относительно невысокий урожай вируса краснухи.

Возникшая задача решается следующим образом: предложен способ получения адаптированного к фибробластам эмбрионов птиц вируса краснухи, включающий заражение вирусом краснухи смеси нескольких типов клеток, содержащих в качестве одного из компонентов фибробласты эмбрионов птиц, при этом используют вирус краснухи (штамм "Орлов") и проводят переадаптацию вируса краснухи к размножению с субстрата первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика к клеткам фибробластов эмбрионов птиц, при которой в процессе перехода от одного пассажа к другому увеличивают содержание в смеси клеток количество фибробластов эмбрионов птиц и доводят их в последующих пассажах до 100%, после этого вирус размножают на 100% культуре клеток фибробластов эмбрионов птиц с титром от 10³ до 10⁵, выраженных в тканевых цитопатических дозах в 0,1 мл культуральной среды.

В целом, настоящее изобретение позволяет обеспечить размножение вируса краснухи в культуре клеток, полученных из эмбрионов перепела.

Наиболее оптимальные результаты могут быть получены, если на 1-м и 2-м пассажах проводят заражение вирусом краснухи смеси клеток, состоящей из 45-55% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика и 45-55% клеток фибробластов эмбрионов птиц, на 3-м и 4-м пассажах проводят заражение вирусом краснухи смеси клеток, состоящей из 35-45% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика и 55-65% клеток фибробластов эмбрионов птиц, на 5-м, 6-м и 7-м пассажах проводят заражение вирусом краснухи смеси клеток, состоящей из 25-35% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика и 65-75% клеток фибробластов эмбрионов птиц, на 8-м, 9-м и 10-м пассажах проводят заражение вирусом смеси клеток, состоящей из 15-25% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика 75-85% фибробластов эмбрионов птиц, дальнейшее размножение вируса краснухи осуществляют на 100% культуре фибробластов эмбрионов перепела.

Этот процесс включал несколько ступеней:
1. Адаптация вируса краснухи (штамм Орлов) к размножению на культуре первично-трипсинизированных фибробластов эмбриона перепела.

2. Анализ полученного нового вируса краснухи.

1. Адаптация вируса краснухи (штамм Орлов) к размножению на культуре первично-трипсинизированных фибробластов эмбриона перепела.

Первично-трипсинизированные почки кролика (5-ти дневные новорожденные крольчата) готовили следующим образом: почки кролика в асептических условиях промывали стерильным физраствором, измельчали ножницами и помещали в стеклянные флаконы. К ткани добавляли раствор трипсина и диспергировали клетки на магнитной мешалке. Культуральная среда может быть использована любая, способная обеспечить репродукцию клеток, например, среда 199, в которую добавлена сыворотка теленка. После добавления вируса (клетки заражали штаммом Орлов из ампулы, полученной из НИИЭМ им. Пастера, протокол передачи от 03.12.98 г). Инфицированные клеточные культуры инкубировали при температурах от 30^oС до 38^oС. Оптимальная температура составляла 36^oС. На 5-7 день инкубации вирус собирали из культуральной среды и титровали методом тканевых цитопатических доз (ТЦД). Для титрования использовали клетки линии Vero E6 (перевиваемая линия клеток почек зеленой мартышки), чувствительные к вирусу краснухи. Концентрация вируса, при которой поражались 50% клеток, и являлась искомым титром вируса.

После проведения первого пассажа титр вируса в культуральной среде составил 10^4,5 ТЦД50/0,1 инфекционных доз при гемагглютинирующем титре 8-16 ГАЕ (гемагглютинирующих единиц). Параллельно титрование вируса на клетках линии Vero E6 показало, что инфекционный титр также составляет 10^4,5 ТЦД50/0,1.

Тест по обнаружению гемагглютинирующей активности вируса проводили следующим образом: из подкрыльцовой вены голубей отбирали эритроциты и готовили 0,25% суспензию. Максимальное разведение вируса, при котором наблюдалась реакция агглютинации эритроцитов и являлась искомым гемагглютинирующим титром вируса.

Процедура 1. - Вирус краснухи собирали из культуральной среды первичных клеток почки кролика.

Процедура 2. - К тем же первичным клеткам почки кролика добавляли свежую культуральную среду и через 24-48 часов собирали вируссодержащую жидкость.

Инфекционный вирус был стабилен при использовании соответствующих стабилизаторов, таких как сахароза, бычий сывороточный альбумин, глютамин, фосфат или их комбинация. После титрования вирус разливали в ампулы и хранили длительное время в замороженном при -70^oС или в сухом виде.

Пример 1
Исходный вирус был получен по процедуре 1, как описано выше.

Переадаптацию вируса краснухи к размножению на культурах фибробластов эмбриона перепела проводили методом смешанных культур. Вирус краснухи выращивали в культуре, представляющей собой различные комбинации первичных клеток почки кролика и фибробластов эмбриона перепела:
а) 50% клеток почки кролика и 50% фибробластов эмбриона перепела (36,0^oС) - 2 пассажа.

б) 40% клеток почки кролика и 60% фибробластов эмбриона перепела (36,0^oС) - 2 пассажа.

в) 30% клеток почки кролика и 70% фибробластов эмбриона перепела (36,0^oС) - 2 пассажа.

г) 20% клеток почки кролика и 80% фибробластов эмбриона перепела (36,0^oС) - 3 пассажа.

д) 100% фибробластов эмбриона перепела (35,7^oС) - 3 пассажа.

Девяти-одиннадцати дневные эмбрионы перепела после измельчения в асептических условиях и промывки несколько раз в растворе Хенкса подвергали трипсинизации при 36^oС, используя 0,25% трипсин (фирма ICN, США) в трис-солевом буфере, в течение двух-трех часов. Клеточную суспензию собирали дважды и центрифугировали при 1500 r.p.m. в течение пяти минут. Далее клетки ресуспендировали в ростовой среде, содержащей среду 199,2% сыворотки теленка и 50 мкг/мл гентамицина. Культуральные флаконы засевали клетками с концентрацией 350 000 на мл. Клетки инкубировали при температуре 36^oС. Через 24-48 часов выращенные клеточные культуры могли быть использованы для пассирования вируса. Для культивирования клеток использовали стерильные пластиковые флаконы фирмы Nunc (Дания). Через 48 часов клетки трижды промывали 100 мл раствора Хенкса и заражали 2,5 мл посевного вируса. Далее во флакон добавляли 60 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки теленка и 50 мкг/мл гентамицина и инкубировали при 30-34^oС. Вирус собирали на 4-6 день из культуральной среды. Было проведено 10 пассажей. После каждого пассажа определяли инфекционный титр вируса на этих же клетках. Вируссодержащий материал хранили при -70^oС.

Пример 2
Исходный вирус был получен по процедуре 2, как описано выше.

Адаптацию вируса краснухи к размножению на культурах фибробластов эмбриона перепела проводили методом смешанных культур. Вирус краснухи выращивали в культуре, представляющей собой различные комбинации первичных клеток почки кролика и фибробластов эмбриона перепела:
а) 55% клеток почки кролика и 45% фибробластов эмбриона перепела (35,7^oС) - 2 пассажа.

б) 45% клеток почки кролика и 55% фибробластов эмбриона перепела (35,7^oС) - 2 пассажа.

в) 35% клеток почки кролика и 65% фибробластов эмбриона перепела (35,7^oС) - 2 пассажа.

г) 25% клеток почки кролика и 75% фибробластов эмбриона перепела (35,7^oС) - 3 пассажа.

д) 100% фибробластов эмбриона перепела (35,7^oС) - 3 пассажа.

Девяти-одиннадцати дневные эмбрионы перепела после измельчения в асептических условиях и промывки несколько раз в растворе Хенкса подвергали трипсинизации при 35,7^oC, используя 0,25% трипсин (фирма 1CN, США) в трис-солевом буфере, в течение двух-трех часов. Клеточную суспензию собирали дважды и центрифугировали при 1500 r.p.m. в течение пяти минут. Далее клетки ресуспендировали в ростовой среде, содержащей среду 199,2% сыворотки теленка и 50 мкг/мл гентамицина. Культуральные флаконы засевали клетками с концентрацией 350000 на мл. Клетки инкубировали при температуре 35,7^oС. Через 24-48 часов выращенные клеточные культуры могли быть использованы для пассирования вируса. Для культивирования клеток использовали стерильные пластиковые флаконы фирмы Nunc (Дания). Через 48 часов клетки трижды промывали 100 мл раствора Хенкса и заражали 2,5 мл посевного вируса. Далее во флакон добавляли 60 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки теленка и 50 мкг/мл гентамицина и инкубировали при 30-34^oС. Вирус собирали на 4-6 день из культуралыюй среды. Было проведено 10 пассажей. После каждого пассажа определяли инфекционный титр вируса на этих же клетках. Вируссодержащий материал хранили при -70^oС.

Вирус краснухи, адаптированный к репродукции на культуре фибробластов эмбриона перепела, был использован в качестве вакцинного вируса при иммунизации обезьян (макак резус).

2. Анализ полученного нового вируса краснухи.

1. Нейтрализация полученного вируса краснухи различными сыворотками.

ТЕСТ 1 (определение инфекционного титра вируса).

После адаптации вируса к фибробластам эмбриона перепела он утратил способность к размножению в клетках линии Vero E6 и вновь приобретал это свойство после 2-3 пассажей.

Титрование вируса на культурах фибробластов перепела показало наличие инфекционного титра, равного 10^4,5 ТЦД50/0,1.

Примечание: указанный титр вируса наблюдался через 10 пассажей, проведенных на фибробластах эмбриона перепела. С 5-го до 10-го пассажа титр вируса соответственно составлял 10^2,5-10^3,5 ТЦД50/0,1.

После обратной переадаптации вируса к клеткам линии Vero Е6, через три пассажа, инфекционный титр вируса также составлял 10^4,5 ТЦД50/0,1.

ТЕСТ 2 (определение гемагглютинирующей активности вируса).

Через 10 пассажей на фибробластах эмбриона перепела вирус утрачивал способность агглютинировать эритроциты голубей.

После обратной переадаптации вируса к клеткам линии Vero E6 вирус вновь приобретал это свойство. При исходном инфекционном титре 10^4,5 ТЦД50/0,1 вирус обладал гемагглютинирующим титром 1:64-1:128.

ТЕСТ 3 (нейтрализация вируса положительными сыворотками крови людей).

Результаты по нейтрализации вируса положительными и отрицательными сыворотками крови людей представлены в таблицах 1 и 2.

Параллельно, те же сыворотки в реакции нейтрализации были тестированы с использованием штаммов вируса краснухи Орлов и Judith. Оба штамма обладали гемагглютинирующей активностью. Штамм Орлов, выращенный на клетках линии Vero E6, при исходном инфекционном титре 10^4,5 ТЦД50/0,1 обладал гемагглютинирующим титром 1:64-1:128, штамм Judith, выращенный на тех же клетках, давал при инфекционном титре 10⁶ ТЦД50/0,1 гемагглютинирующий титр 1:256-1: 512.

Результаты представлены в таблице 3. Множественность заражения клеток Vero E6 составляла 1000 доз.

Вне зависимости от наличия/отсутствия гемагглютинирующей способности вирусов и различных субстратов, использованных для их культивирования, все изученные вирусы краснухи обладали сходной способностью нейтрализоваться теми же сыворотками крови человека.

Таким образом, вируснейтрализующие антитела, содержащиеся в положительных сыворотках, способны нейтрализовать полученный вирус как при низкой (100), так и при высокой (1000) множественности заражения клеток вирусом.

2. Определение наличия антигенов вируса краснухи.

Клетки ФЭП выращивали методом роллерного культивирования и заражали вирусом во взвесь с множественностью 1000 инфекционных доз и через 2 дня роста культуры с 10% сыворотки крупного рогатого скота, среду заменяли на бессывороточную и еще через 7 дней определяли инфекционный титр вируса в культуральной среде, который составил 10^4,5 ТЦД50/0,1. Далее вирус концентрировали в 100 раз. Концентрация общего белка составила 0,3 мг/мл.

Идентификацию антигенов вируса краснухи проводили методом иммуноблоттинга по стандартной технологии. Белки разделяли методом электрофореза в ПААГ (полиакриламидном геле) в присутствии SDS (додецилсульфат натрия) и МЭ (2-меркаптоэтанола), т. е. в разрешающих условиях. В лунки вносили по 5 мкг суммарного белка. Результаты представлены в положении 1, в котором
1 - положительная сыворотка крови человека, содержащая антитела против вируса краснухи,
2 - слабоположительная сыворотка крови человека,
3 - отрицательная сыворотка крови человека (не содержащая антител к вирусу краснухи),
4 - контроль конъюгата.

В качестве конъюгата использовали моноклональные антитела к Fс-фрагмснту IgG человека, ковалентно-сшитые с пероксидазой хрена.

Примечание: при разделении белков вируса краснухи в разрешающих условиях гемагглютинирующие сайты гликопротеинов Е1 и Е2 повреждаются и анализ антигенов краснухи проводится с сыворотками, положительными в ИФА (иммуноферментный анализ).

Как видно из чертежа (см. приложение), в препаратах, содержащих вирус краснухи, присутствуют все структурные антигены. Вверху видны антигенно-активные белки, представляющие димерные формы поверхностных гликопротеинов вируса, не разрушенные в результате обработки препарата SDS и МЭ.

E1-E1 - гомодимер, состоящий из гликопротеина E1 вируса краснухи,
E1-E2 - гетеродимер, состоящий из гликопротеинов E1 и E2 вируса краснухи,
Е2-Е2 - гомодимер, состоящий из Е2 гликопротеина вируса краснухи.

Далее видны дискретные полосы гемагглютининов E1 и E2, а также корового белка (С).

Таким образом, полученный вирус краснухи характеризуется наличием всех структурных антигенов, характерных для вирусов семейства краснухи, что позволяет сделать вывод об идентичности антигенной структуры полученного вируса другим вирусам этого семейства.

3. Электронно-микроскопическое изучение вируса.

Бессывороточную культуральную среду, содержащую вирус, концентрировали в 100 раз. Концентрация общего белка в препарате составляла 0,3 мг/мл. Вирус изучали методом негативного контрастирования с помощью фосфовольфрамовой кислоты.

На полученных микрофотографиях отчетливо видны многочисленные вирионы умеренной оптической плотности. В некоторых из них при проникновении фосфовольфрамовой кислоты внутрь вириона выявляется вирусная мембрана.

Размер вирионов варьирует в пределах 40-70 нм, что полностью соответствует размеру вирионов других штаммов вируса краснухи, описанных в литературе.

Необходимость разработки данного способа определялась тем, что вирус краснухи (штамм Орлов) размножается на культуре первично-трипсинизированных почек кролика. При этом кролики содержат флору, патогенную для человека. Получение культур почек кролика, свободных от патогенной флоры (СПФ), является дорогостоящим, кроме того, в России в настоящее время отсутствуют сертифицированные фермы по разведению СПФ-кроликов.

Указанные недостатки отсутствуют у перепелов.

В целом, настоящее изобретение позволяет обеспечить размножение вируса краснухи в культуре клеток, полученных из эмбриона перепела.

Вследствие персадаптации вирус сохранил свойства исходного вируса (штамм Орлов) не вызывать поствакцинальных реакций. При этом введение вируса в организм подопытных животных вызывало стимуляцию высокого уровня протективных антител, способных инактивировать "дикий" штамм вируса краснухи.

Изобретение относится к области вирусологии, а в частности к способу получения вируса краснухи, адаптированного к фибробластам эмбрионов перепела. Способ предусматривает заражением вирусом краснухи штамма "Орлов" смеси клеток, состоящей из первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика и клеток фибробластов эмбрионов перепела, с последующим культивированием вируса и его пассажированием. При этом в процессе перехода от одного пассажа к другому увеличивают содержание в смеси фибробластов эмбрионов перепела и доводят их содержание до 100%. После этого вирус размножают на 100% культуре клеток фибробластов эмбрионов перепела с титром от 10³ до 10⁵ ТЦД в 0,1 мл культуральной среды. Способ позволяет получить переадаптированный вирус краснухи штамма "Орлов", который при иммунизации не вызывает поствакцинальных реакций. Кроме того, способ позволяет повысить количество получаемого при культивировании вируса. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

1. Способ получения адаптированного к фибробластам эмбрионов перепела вируса краснухи, включающий заражение вирусом краснухи смеси нескольких типов клеток, содержащих в качестве одного из компонентов фибробласты эмбрионов перепела, и размножение вируса краснухи на клетках фибробластов эмбрионов перепела, отличающийся тем, что проводят адаптацию вируса краснухи штамм "Орлов" к размножению с субстрата первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика к клеткам фибробластов эмбрионов перепела, при которой в процессе перехода от одного пассажа к другому увеличивают содержание в смеси клеток количества фибробластов эмбрионов перепела и доводят их в последующих пассажах до 100%, после этого вирус размножают на 100% культуре клеток фибробластов эмбрионов перепела с титром от 10³ до 10⁵, выраженным в тканевых цитопатических дозах в 0,1 мл культуральной среды. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на 1-ом и 2-ом пассажах проводят заражение вирусом краснухи смеси клеток, состоящей из 45-55% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика и 45-55% клеток фибробластов эмбрионов перепела, на 3-ем и 4-ом пассажах проводят заражение вирусом краснухи смеси клеток, состоящей из 35-45% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика и 55-65% клеток фибробластов эмбрионов перепела, на 5-ом, 6-ом и 7-ом пассажах проводят заражение вирусом краснухи смеси клеток, состоящей из 25-35% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика и 65-75 % клеток фибробластов эмбрионов перепела, на 8-ом, 9-ом и 10-ом пассажах проводят заражение вирусом смеси клеток, состоящей из 15-25% первично трипсинизированных клеток почки новорожденного кролика 75-85% фибробластов эмбрионов перепела, дальнейшее размножение вируса краснухи осуществляют на 100%-ной культуре фибробластов эмбрионов перепела.