Гидрогелевый биокомпозит на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C12P19/04 A61L15/36 

Изобретение относится к области биомедицины, а именно в тканевой инженерии, и может быть использовано в составе тканеинженерных конструкций для культивирования клеток, а также к способу изготовления биологического клеточного каркаса.

​Биологические каркасы представляют из себя структуры природного или искусственного происхождения, предназначенные в использовании для облегчения различных физиологических процессов клеточных культур. Разработка подобных каркасных гидрогелевых биокомпозиционных структур в виде предварительно изготовленных матриц, имеющих конкретную форму и структуру, задаваемую определёнными требованиями заменяемой ткани. Подобные каркасы отвечают в решении ряда вопросов тканевой биоинженерии и служат ряду целей, прежде всего как носитель клеточной культуры и тканевое крепление. Также благодаря заданной микроструктуре каркаса обеспечиваются такие естественные физиологические процессы клеточных культур, как миграция, обмен веществ, доставка и удержание. В дополнение к клеткам и/или тканям биологические каркасы могут содержать биологически активные агенты, фармацевтические соединения и/или текучие среды, например ​среда для выращивания клеток. По существу, биологические каркасы могут быть высеяны клетками и культивированы in vitro или непосредственно имплантированы в ткань. Однако для трехмерной тканевой инженерии требуются дополнительные соображения, относящиеся к матрицам скаффолда-ткани.

Основа в технологиях тканевой биоинженерии предполагает использование биологических макромолекул и живых клеток для разработки подходящих заместителей с целью замены повреждённых или дефектных участков тканей или органов. Тем не менее, для создания таких сложных конструкций, биологические каркасы, из которых они образуются, должны поддерживать клетку и рост ткани, который подобен естественному органогенезу тканей. Также важной составляющей в характеристике заменяемой гидрогелевой конструкции должна быть механическая пластичность материала в рамках оптимальных параметров для данной ткани, поэтому в конструкциях для тканеинженерных применений необходимы структуры, состоящие из изменяющихся степеней толщины и размера, которые могут влиять на долговечность ткани. ​

При замене тканеинженерными конструкциями зон дефектов тканей также стоит учитывать вопрос образования естественной ткани. И поскольку структура и устойчивость вновь образованных тканей могут варьироваться, необходимо обеспечить такую кинетику распада замещающей искусственной конструкции, которая бы напрямую зависела от кинетики образования новой естественной ткани. Это необходимо для обеспечения естественных клеточных метаболических процессов обмена веществ, а также возобновления и регенерации тканей организма, что по итогу обеспечивает целостность ткани.

В настоящее время имеются ряд публикаций, связанных с получением каркасов (скаффолдов) из гидрогелевых полимеров.

Известен гидрогель на основе коллагена для инженерии хрящевой ткани и способ его получения. Гидрогель содержит коллаген животного происхождения типа I и II или очеловеченный коллаген, а также полисахарид, состоящий из одного или двух хондроитинсульфата и гиалуроновой кислоты Такая комбинация коллагена и полисахарида представляет собой физическое и/или химическое сшивание. Предполагается, что такой гидрогель обладает эффектами восстановления нерегулярных дефектов путем прямой инъекции, совместного восстановления дефектов хрящевого слоя в виде лиофилизированной губки и совместного восстановления дефектов хрящевого слоя в качестве носителя доставки клеток, оборачивающего хрящевые клетки и/или стволовые клетки (CN113476657, МПК A61L 27/26, A61L 27/50, A61L 27/52, A61L 27/56, C08J 3/075, C08J 3/24, C08L 89/00, C08L 5/08, опубл. 08.10.2021).

Недостатком данной гидрогелевой конструкции является сложно контролируемая и, как правило, быстрая кинетика распада.

Известен биоразлагаемый полимерный носитель для доставки противоопухолевого лекарственного средства (варианты). Одним из вариантов гидрогелевого аналога считается полимерный гидрогель на основе таксанов (RU 2493848, МПК A61K 31/35, A61K 31/335, A61K 47/48, A61P 35/00, опубл. 27.09.2013).

Недостаток этого варианта гидрогеля заключается в невозможности его использования в качестве матрицы для клеток.

Известны гидрогелевые каркасы для тканевой инженерии. Описаны способы получения гидрогелевого скаффолда для тканевой инженерии, включающие один или несколько полимеров поливинилового спирта и один или более фенилборонатсодержащих сополимеров. Так, предложена комбинация фенилборонатных лигандов, таких как 4-винилфенилбороновой кислоты, 4-(1,6-диоксо -2,5-диаза-7-оксамил) фенилбороновой кислоты и [2-(диэтиламино) карбонил-4-бромметил] фенилбороната, с акриловыми мономерами, таких как акриламид, N-изопропилакриламид; N-метоксиметил-N-изопропилакриламида; и 2-(диметилмалеимидо)-N-этилакриламида. Гидрогелевый скаффолд представлен, как биоразлагаемый, что подтверждается деградацией сахаридами (US 20130236971, МПК C12N 5/00, C12N 5/071, A61L 27/52, A61L 27/38, A61L 27/26, опубл. 11.11.2014).

Недостатком представленного гидрогелевого каркаса можно считать слабую биосовместимость его компонентов, а именно продуктов его распада, в условиях in vivo.

Известен биоразлагаемый и противомикробный каркас для инженерии костной ткани и способ его получения. Изобретение содержит вариант гидрогелевого биокомпозита для использования в тканевой инженерии предложен на основе полимерного каркаса и кальций-цинк альгината. Гидрогель содержит от 4% до 7% по массе ионов цинка и от 3% до 6% по массе ионов кальция. Полимерный состав корпусного каркаса представлен алифатическими сложными эфирами, например, полимолочная кислота. Предполагается, что такой вариант гидрогеля применим в регенерации костных дефектов, и относится к разлагаемому каркасу, имеющему пористую структуру с остеоиндуктивной способностью и оптимальными механическими и водопоглощающими свойствами (WO 2022117897, МПК A61L 27/44 2006.1, A61L 27/50 2006.1, опубл. 02.12.2020).

Недостаток данного изобретения заключается в том, что для достижения пористости биоматериала в данном случай необходимо использовать алифатические сложные эфиры, которые сложно разлагаются ферментами организма.

Наиболее близким решением к заявляемому изобретению является способ получения биокомпозита с регенерационными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы. Способ включает культивирование бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 на мелассе в статических условиях, отделение полученной гель-пленки бактериальной целлюлозы, ее очищение и механическое измельчение. Полученный гидрогель бактериальной целлюлозы с гидромодулем 1:3 смешивают с 2% раствором хитозана в соотношениях 50:50 или с 2% раствором хитозана, 10% раствором желатина, 20% раствором трансглютаминазы в соотношении 5:5:15:5, соответственно, затем добавляют фузидин натрия и физиологически активные соединения полифенольной природы, ферменты, низкомолекулярные пептиды (RU 2733137, МПК C12N 1/20, A61L 15/36, опубл. 29.09.2020).

Недостатком изобретения для использования в тканевой инженерии является плотная структура гидрогеля. Такая структура подходит непосредственно для раневых покрытий, тогда как заявленный гидрогель по своей структуре представляется как пористая и пластичная матрица для иммобилизации клеток.

Технический результат заявленного изобретения заключается в расширении ассортимента гидрогелевых каркасов на основе бактериальных полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы и бактериального левана, увеличении пластичности и адгезивных свойств благодаря бактериальному левану и повышении пористости благодаря бактериальной целлюлозе, которая формирует матрицу из тонкой сети нановолокон и обладает высокой влагосвязывающей и влагоудерживающей способностью, селективной проницаемостью для газов и пара, не проницаема для бактерий.

Сущность изобретения заключается в том, что гидрогелевый биокомпозит на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии содержит бактериальную целлюлозу, бактериальный леван, ростовые факторы, антибиотик и воду при следующем соотношении компонентов, мас. %:

бактериальная целлюлоза 12,0-12,4 бактериальный леван 4,6-5,0 ростовые факторы 1*10^-5-1*10^-4 антибиотик 0,5-0,6 вода 81,6-82,0

Конструкция обладает высокой пластичностью и адгезивными свойствами благодаря бактериальному левану, а также высокой пористостью с количеством пор равным 8-10 пор/см3, благодаря бактериальной целлюлозе. Антибиотик добавляется для полного исключения возможности заражения гидрогелевой среды для клеток. Добавление ростовых факторов стимулирует повышенный показатель активности клеток L929 в гидрогелевой среде.

Назначением заявляемого гидрогелевого биокомпозита на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии является создание материала с высокими показателями по биологической совместимости, низкой токсичности, адгезии, высокой влагопоглощающей способности, возможности удерживать добавки биологически активных веществ (в том числе ростовых факторов), возможности удерживать клеточные культуры и создания для них естественных условий для полноценной жизнедеятельности.

Способ получения гидрогелевого биокомпозита на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии заключается в следующем.

Для начала проводится совместное культивирование K. sucrofermentans с P. polymyxa на мелассной среде, доведя pH среды до 4,5 при помощи 1Н раствора серной кислоты (H₂SO₄). Объединение продуцентов осуществляется на этапе пересева культур с инокулятов на ферментативную питательную среду. Ферментационную питательную среду засеивают посевным материалом культуры из полученных инокулятов в количестве 10%. Таким образом, в колбы для совместного культивирования вводится по 5% с каждого инокулята. Культивирование ведется в статических условиях в колбах объемом 500 мл со 100 мл среды в термостате при 28˚C в течение 120 часов. Полученные бактериальные полисахариды выделяют и очищают. Бактериальную целлюлозу обрабатывают 0,1 Н раствором гидроксида натрия (NaOH) при 80°С в течении 30 минут и 5 раз промывают дистиллированной водой. Бактериальный леван осаждают тройным объемом 96% этилового спирта из нативной культуральной жидкости. Экзополисахариды высушивают при комнатной температуре. В качестве продуцента бактериальной целлюлозы в заявленном изобретении использовали штамм Komagataeibacter sucrofermentans Н-110, (RU 2536973, МПК C12N 1/20, опубл. 27.12.2014, RU 2536257, МПК C12N 1/20, опубл. 20.12.2014). В качестве продуцента бактериального левана в заявленном изобретении использовали штамм Paenibacillus polymyxa (RU0002740710, МПК C12P 19/04, C12N 1/20, C12R 1/01, опубл. 20.01.2021).

Для получения гидрогелей готовят гидромодуль бактериальной целлюлозы с соотношением 1:3 и проводят измельчение бактериальной целлюлозы при помощи ультразвукового гомогенезатора с продолжительностью 10-15 минут. Раствор левана 10% готовят в теплой дистиллированной воде (50 ^оС). Далее совмещают их в соотношении 1:1; стерилизуют гидрогель под ультрафиолетовым излучение 1 час. Затем добавляют в гидрогель антибиотик 5 мг/мл, ростовых факторов 100 нг/мл. На последнем этапе происходит иммобилизация клеточной культуры в гидрогель из расчёта 8-10 клеток/см3.

Варианты соотношения компонентов гидрогелевого биокомпозита на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии демонстрируются в примерах 1 и 2.

Пример 1

Для получения гидрогелевого биокомпозита на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии получают раствор левана 10%, используя 5 мас. % бактериального левана и 44,7 мас. % воды при температуре 50 ^оС. Также получают гидромодуль бактериальной целлюлозы, для этого смешивают 12,4 мас. % бактериальной целлюлозы с 37,3 мас. % воды и гомогенизируют на ультразвуковом гомогенизаторе. Далее смешивают полученные раствор левана и гидромодуль бактериальной целлюлозы и стерилизуют гидрогель под ультрафиолетовым излучением один час. Затем добавляют 1*10^-5 мас. % ростовых факторов и остальное антибиотика (в данном примере в качестве антибиотика используется пенициллин).

Пример 2

Для получения гидрогелевого биокомпозита на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии получают гидромодуль бактериальной целлюлозы, для этого смешивают 12,3 мас.% бактериальной целлюлозы с 37,3 мас.% воды и гомогенизируют на ультразвуковом гомогенизаторе. Также получают раствор левана 10%, используя 4,9 мас.% бактериального левана и 45 мас.% воды при температуре 50 ^оС. Далее смешивают соединяют раствор левана и гидромодуль бактериальной целлюлозы и стерилизуют гидрогель под ультрафиолетовым излучение один час. Затем добавляют 1*10^-5 мас. % ростовых факторов и остальное антибиотика (в данном примере в качестве антибиотика используется стрептомицин).

Заявленное изобретение обладает высокой пластичностью и адгезивными свойствами благодаря бактериальному левану, высокой пористостью с количеством пор равным 8-10 пор/см3 и со среднем размером пор 40-70 мкм, благодаря бактериальной целлюлозе, которая формирует матрицу из тонкой сети нановолокон и обладает высокой влагосвязывающей и влагоудерживающей способностью, селективной проницаемостью для газов и пара, не проницаема для бактерий. Помимо этого, гидрогелевый биокомпозит биосовместим по данным проточной цитометрии, которая выявила 96,39% функционально активных живых клеток, находящихся в среде исследуемого гидрогеля. А добавление ростовых факторов даёт повышенный показатель активности клеток L929 при добавлении ростовых факторов к ним в гидрогелевую среду, в среднем на 10-15%.

Изобретение создано за счет средств Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (соглашение №16329ГУ/2021 от 25.05.2021).

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен гидрогелевый биокомпозит на основе бактериальных полисахаридов, содержащий, мас.%: бактериальную целлюлозу штамма Komagataeibacter sucrofermentans Н-110 - 12,0-12,4, бактериальный леван Paenibacillus polymyxa - 4,6-5,0, ростовые факторы - 1*10^-5-1*10^-4, антибиотик пенициллин или стрептомицин - 0,5-0,6 и воду - 81,6-83,0. Изобретение обеспечивает расширение арсенала материалов для использования в тканевой инженерии, обладающих биологической совместимостью, повышенной пористостью, пластичностью, способностью удерживать добавки биологически активных веществ - ростовых факторов. 2 пр.

Гидрогелевый биокомпозит на основе бактериальных полисахаридов для использования в тканевой инженерии, содержащий бактериальную целлюлозу штамма Komagataeibacter sucrofermentans H-110, бактериальный леван Paenibacillus polymyxa, ростовые факторы, антибиотик пенициллин или стрептомицин и воду при следующем содержании исходных компонентов, мас.%:

бактериальная целлюлоза штамма Komagataeibacter sucrofermentans H-110 12,0-12,4 бактериальный леван Paenibacillus polymyxa 4,6-5,0 ростовые факторы 1*10^-5-1*10^-4 антибиотик пенициллин или стрептомицин 0,5-0,6 вода 81,6-83,0