Способ получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы Российский патент 2024 года по МПК A61L15/28 A61L15/36 A61L15/44 A61K35/74 C12N1/20 A61P17/02 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения биокомпозита на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы и действующих веществ (в частности биосовместимых полисахаридов), которые способствовали бы регенерации тканей и обладали антисептическим действием.

Назначением биокомпозита, получаемого на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы и действующих веществ, является создание раневого покрытия, способного не только обеззараживать рану, но и обеспечивать скорейшее ее заживление, а также соответствовать другим требованиям, предъявляемым к идеальной раневой повязке (легко прикрепляться и удаляться, обеспечивать газообмен, абсорбировать экссудат, сохранять влажную среду и т.д.) (Anton-Sales, I. Opportunities of bacterial cellulose to treat epithelial tissues / I. Anton-Sales, U. Beekmann, A. Laromaine // Current Drug Targets, 2019. 20 (8). pр. 808-822).

Для эффективного лечения ран кожи большой площади, для которых характерна подверженность инфекции и длительное заживление, были исследованы многочисленные материалы для перевязки ран, поскольку традиционные (вата, марля, бинт) имеют ряд недостатков. Среди них имеют место повязки, в основе которых лежат различные природные и синтетические материалы, в том числе и полисахариды.

Известна фармацевтическая композиция, применяемая для лечения ожогов, в состав которой входит полисахарид - декстран, а именно окисленный декстран с молекулярной массой 35-65 кДа, а также вспомогательные компоненты для симптоматической терапии ожогов: анестезин, фосфатидилхолин, полиэтиленоксид с молекулярной массой 1,5-6,0 кДа, метронидазол и фармацевтически приемлемый наполнитель (RU 2473349, МПК A61K 31/721, A61K 31/136, A61K 31/045, A61K 31/4164, A61K 31/685, A61P 17/02, опубл. 27.01.2013).

Данное изобретение обладает высокой лечебной эффективностью, изученной на лабораторных животных. Недостатком изобретения является то, что оно представляет собой слегка опалесцирующую бесцветную жидкость, что является менее удобной формой для использования при лечении ран, чем гидрогель.

Известна повязка для лечения ран в виде пленки, включающая хитозан, полученный из панцирей краба, в виде соли уксусной кислоты, сульфаты щелочных и щелочно-земельных металлов в качестве сшивающего агента, уксусную кислоту и антибактериальные препараты, при следующем соотношении компонентов, мас.%: хитозан - 65-70, антибактериальные препараты - 2-14, сшивающий агент - 10-15, уксусная кислота - остальное (RU 2582220, МПК A61L 15/20, A61L 15/28, A61L 15/44, A61F 13/00, опубл. 20.04.2016).

Использование сульфатов щелочных и щелочно-земельных металлов, таких как сульфат натрия, сульфат калия, сульфат кальция, позволяет пролонгировать выход антибактериальных препаратов и, как следствие, получить повязку для лечения ран, обладающую регенерирующими, антибактериальными свойствами, пролонгированным действием антибактериальных препаратов и являющуюся нерастворимой и мягкой.

Недостатком заявленного изобретения является использование в качестве антибактериальных препаратов антибиотиков цефалоспоринового ряда, что создает риск развития антибиотикорезистентности. Кроме того, технологию производства повязки для лечения ран затрудняет необходимость ее выдерживания в течение 7 суток для испарения растворителя.

Известна биологически активная гелевая повязка, содержащая в своем составе смесь из альгината натрия и порошка природных цеолитовых пород, предпочтительно клиноптилолит-смектитовых, и используемая для лечения ран (RU 2588968, МПК A61L 15/18, A61F 13/00, A61K 33/00, A61P 17/02, B82B 1/00, опубл. 10.07.2016).

Данное изобретение показало высокую эффективность в эксперименте на лабораторных животных за счет использования альгината натрия в качестве полимерной гидрогелевой матрицы, иммобилизующую частицы цеолита, исключающую их прямое взаимодействие с раневой поверхностью, легко удаляющуюся с раны (при необходимости этого) без ее повреждения. Недостатком изобретения является возможность возникновения аллергической реакции, а также хранение ее в виде смеси порошков, что затрудняет оперативное применение для лечения раны.

Известно раневое покрытие с лечебным действием, представляющее собой единый комплекс из перфорированной целлюлозы Acetobacter xylinum и биологически активных ингредиентов, имеющих лечебный эффект. В раневое покрытие включены комплекс фуллерен С₆₀/Tween-80 (антиоксидант), антимикробный компонент, антиферментный и гемостатический компонент, некролитический компонент (RU 2437681, МПК A61L 15/18, A61L 15/44, A61L 15/28, опубл. 27.12.2011).

Недостатком данного изобретения является то, что способы выполнения раневого покрытия, представленные в изобретении, не совсем пригодны для использования в медицинской практике, поскольку предполагается выдерживание повязки перед применением в течение 60 минут в специально приготовленном растворе.

Бактериальная целлюлоза и ее производные обладают рядом свойств, которые делают их интересными в качестве материалов для перевязки ран, таких как способность к биологическому разложению, биосовместимость, высокое содержание влаги, большая площадь поверхности, гибкость и механическая стабильность. Кроме того, при использовании в качестве повязки на рану оптическая прозрачность бактериальной целлюлозы обеспечивает возможность использования диагностики на основе лазерной визуализации, такой как многофотонная томография, оптическая когерентная томография и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, что позволяет неинвазивно следить за процессом заживления раны. Также она демонстрирует высокую температурную стабильность, что позволяет проводить процессы температурной стерилизации композитов на ее основе (Ribeiro D. M. L. Polysaccharide-Based Formulations for Healing of Skin-Related Wound Infections: Lessons from Animal Models and Clinical Trials / D. M. L. Ribeiro, A. R. Carvalho Júnior, G. H. R. Vale de Macedo // Biomolecules, 2019. 10 (1). Pp. 1-16. DOI: 10.3390/biom10010063.; Carvalho T. Latest Advances on Bacterial Cellulose-Based Materials for Wound Healing, Delivery Systems and Tissue Engineering / T. Carvalho, G. Guedes, F. L. Sousa // Biotechnology Journal, 2019. 14. pp. 1-19. DOI: 10.1002/biot.201900059).

Наиболее близким решением, взятым в качестве прототипа, является способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы. При этом гидрогель бактериальной целлюлозы получают с внесением антибиотика фузидина натрия или фермента лизоцима в концентрации 7,5 мг/мл и 1 мг/мл гидрогеля соответственно (RU 2771864, МПК C12N 1/20, A61L 15/36, A61K 35/66, опубл. 13.05.2022).

Недостатком прототипа является то, что в данном изобретении в составах биокомпозитов отсутствуют компоненты, обеспечивающие пролонгированное лечебное действие раневых покрытий, что создает возможность для их улучшения. Кроме того, полифенолы растительного происхождения, являющиеся антиоксидантами, имеют доказанную эффективность при заживлении ран и могут быть внесены в композиционные материалы на основе бактериальной целлюлозы для увеличения регенеративной способности.

Технический результат заявленного изобретения заключается в расширении ассортимента раневых покрытий на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы с регенеративными и антисептическими свойствами.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы включает синтез гель-пленки бактериальной целлюлозы культурой-продуцентом Komagataeibacter sucrofermentans В-11267 в статических условиях на среде, содержащей отход свеклосахарного производства - мелассу, последующее ее очищение и механическое измельчение в течение 10 минут с получением гидрогеля бактериальной целлюлозы с гидромодулем с соотношением 1:3 и внесение в него действующих веществ. В качестве действующих веществ могут быть использованы следующие компоненты: дигидрокверцетин в количестве 2% от массы бактериальной целлюлозы, ресвератрол в количестве 0,1% от массы бактериальной целлюлозы, 2%-ный раствор хитозана, смешанный в уксусной кислоте, фузидин натрия, 2%-ный раствор альгината натрия в воде.

Способ осуществляют следующим образом:

Культивирование культуры-продуцента осуществляли на скошенных агаризованных средах в пробирках в термостате при температуре 28 градусов в течение 3 суток. После культивирования полученную культуру из пробирок смывали десятью миллилитрами питательной среды с мелассой, в результате чего получали суспензию микроорганизмов. Ее использовали для засева посевных колб со 100 мл среды (инокулят). Культивирование проводили на шейкере-инкубаторе ES-20/60 (BIOSAN, Латвия) при 250 об./мин 24 часа при 28 градусах. Затем питательную среду объемом 200 мл засевали 20 мл инокулята (10% от объема среды). Гель-пленку бактериальной целлюлозы (ГПБЦ) получали в статических условиях в термостате при 28°С в течение 6 суток.

Для того, чтобы очистить бактериальную целлюлозу от клеток бактерий и компонентов среды полученный полисахарид помещали в раствор щелочи (0,1 H NaOH) на 30 минут при 80°С. Раствор щелочи удаляли с помощью 0,5% раствора уксусной кислоты и дистиллированной воды до достижения нейтрального pH. Для получения гидрогеля очищенная гель-пленка бактериальной целлюлозы измельчалась механическим путем при помощи лабораторного гомогенизатора в течение 10 минут. Затем она смешивалась с водой в соотношении 1:3, после чего производили отбор некоторого количества гидрогеля и смешивали с дополнительными компонентами в указанном выше соотношении, чтобы обеспечить раневую повязку необходимыми свойствами.

В качестве липкой основы для крепления гидрогелей к коже может быть выбран любой медицинский фиксирующий лейкопластырь. В данном случае использован Unifilm от Master Uni. На пластырь с полимерной основой диаметром 30 мм наносили 200 мкл гидрогеля и распределяли ровным слоем по центру образца. Полученные композиты оставляли на сутки согласно ГОСТ Р 53498-2019. За 24 часа при комнатной температуре происходило лучшее сцепление гидрогеля и пластыря.

Культурой-продуцентом в данном изобретении выступает Komagataeibacter sucrofermentans Н-110, выделенный на кафедре биотехнологии Мордовского госуниверситета из чайного гриба с последующей селекцией на основе естественного отбора. Культура идентифицирована до вида с помощью анализа генов, кодирующих 16S рРНК в ФГУПГосНИИГенетика. Штамм бактерий Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером: В-11267. Штамм бактерий не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасности по другим причинам.

В данном изобретении к применению в составе раневых покрытий предложены растительные полифенолы - ресвератрол, обладающий противовоспалительными, противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами, и дигидрокверцетин, проявляющий антиоксидантное, антибактериальное, противовоспалительное и противовирусное действие, активно применяемое в медицине.

Один из вариантов способа получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы включает в себя использование в качестве действующих веществ хитозана и альгината. Для создания ранозаживляющих покрытий на основе бактериальной целлюлозы свойства бактериальной целлюлозы сочетали со свойствами таких полисахаридов, как хитозан и альгинат.

В заявленном изобретении в качестве действующих веществ используется фузидовая кислота в форме фузидина натрия. В настоящее время она доступна во многих препаратах для перорального (таблетки и суспензии), внутривенного и местного (крем и мазь) введения. Фузидовая кислота широко используется для системного и местного лечения стафилококковых инфекций, включая коагулазонегативный стафилококк и штаммы, устойчивые к пенициллину и другим противомикробным препаратам.

В другом варианте способа получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы включает в себя использование в качестве действующих веществ альгината натрия и фузидина натрия. Альгинат натрия, сшитый ионами Ca²⁺, может способствовать пролонгированному действию включенного в состав антибактериального агента - фузидина натрия. Из-за его нетоксичности, биосовместимости, биоразлагаемости, низкой стоимости, высокой доступности и очень близких физико-химических свойств к мягким тканям альгинат широко используется для медицинского применения.

При использовании в способе получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы в качестве действующих веществ хитозана и фузидина, хитозан проявляет внутреннюю антимикробную активность. Он считается антибактериальным средством, поскольку он способен связываться с отрицательно заряженной клеточной стенкой бактерий, что приводит к изменению проницаемости клеток и их разрушению.

Используя указанные выше действующие вещества в различных комбинациях, возможно создать раневую повязку, обладающую как антисептическими, так и регенеративными свойствами.

Способ получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы демонстрируется следующими примерами (1-6).

Пример 1. На питательной среде, содержащей отход свеклосахарного производства - мелассу, осуществляют культивирование Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 и последующие выделение и тщательную очистку бактериальной целлюлозы от клеток бактерий и компонентов среды. Для получения гидрогеля очищенная гель-пленка бактериальной целлюлозы измельчается механическим путем в течение 10 минут. Затем она смешивается с водой в соотношении 1:3. Для получения гидрогеля на основе бактериальной целлюлозы и дигидрокверцетина, дигидрокверцетин вносят в количестве 2% от массы бактериальная целлюлоза / вода.

Пример 2. На питательной среде, содержащей отход свеклосахарного производства - мелассу, производят культивирование Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 и последующие выделение и тщательную очистку бактериальной целлюлозы от клеток бактерий и компонентов среды. Для получения гидрогеля очищенная гель-пленка бактериальной целлюлозы измельчается механическим путем в течение 10 минут. Затем она смешивается с водой в соотношении 1:3. Для получения гидрогеля на основе бактериальной целлюлозы и ресвератрола, ресвератрол вносят в количестве 0,1% от массы бактериальная целлюлоза / вода.

Пример 3. На питательной среде, содержащей отход свеклосахарного производства - мелассу, производят культивирование Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 и последующие выделение и тщательную очистку бактериальной целлюлозы от клеток бактерий и компонентов среды. Для получения гидрогеля очищенная гель-пленка бактериальной целлюлозы измельчается механическим путем в течение 10 минут. Затем она смешивается с водой в соотношении 1:3. Получение гидрогеля на основе бактериальной целлюлозы и хитозана производят путем смешения 2%-го раствора хитозана в уксусной кислоте и бактериальной целлюлозы в соотношении 1:1.

Пример 4. На питательной среде, содержащей отход свеклосахарного производства - мелассу, производят культивирование Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 и последующие выделение и тщательную очистку бактериальной целлюлозы от клеток бактерий и компонентов среды. Для получения гидрогеля очищенная гель-пленка бактериальной целлюлозы измельчается механическим путем в течение 10 минут. Затем она смешивается с водой в соотношении 1:3. Для получения гидрогеля на основе бактериальной целлюлозы, хитозана и фузидовой кислоты производят смешение 2%-го раствора хитозана в уксусной кислоте и бактериальной целлюлозы в соотношении 1:1 и последующее внесение фузидовой кислоты в форме фузидина натрия в количестве 7,5 мг на мл гидрогеля.

Пример 5. На питательной среде, содержащей отход свеклосахарного производства - мелассу, производят культивирование Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 и последующие выделение и тщательную очистку бактериальной целлюлозы от клеток бактерий и компонентов среды. Для получения гидрогеля очищенная гель-пленка бактериальной целлюлозы измельчается механическим путем в течение 10 минут. Затем она смешивается с водой в соотношении 1:3. Для получения гидрогеля на основе бактериальной целлюлозы, альгината натрия и фузидовой кислоты из альгината натрия готовят 2% раствор и вносят его в бактериальную целлюлозу в соотношении 1:4. Для добавления антибактериального эффекта вносят фузидовую кислоту в форме фузидина натрия в количестве 7,5 мг на мл гидрогеля.

Пример 6. На питательной среде, содержащей отход свеклосахарного производства - мелассу, производят культивирование Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 и последующие выделение и тщательную очистку бактериальной целлюлозы от клеток бактерий и компонентов среды. Для получения гидрогеля очищенная гель-пленка бактериальной целлюлозы измельчается механическим путем в течение 10 минут. Затем она смешивается с водой в соотношении 1:3. Для получения гидрогеля на основе бактериальной целлюлозы, альгината натрия и фузидовой кислоты из альгината натрия готовят 2% раствор и вносят его в бактериальную целлюлозу в соотношении 1:4. Для добавления антибактериального эффекта вносят фузидовую кислоту в форме фузидина натрия в количестве 7,5 мг на мл гидрогеля. Гидрогели с альгинатом натрия выдерживали в 5% растворе хлорида кальция для придания формы.

Определение антибиотической активности полученных биокомпозитов проводили методом, который базируется на возможности некоторых веществ проникать в питательную среду и образовывать зоны, в которых не развиваются тест - микроорганизмы. В качестве тест - микроорганизма использовали бактерию Staphylococcus aureus 209 P, поскольку именно St. aureus является ключевым патогеном, инфицирующим раны (He W. Bacterial cellulose: Functional modification and wound healing applications / W. He, J. Wu, J. Xu // Advances in Wound Care, 2021. 10. pp. 623-640. DOI: 10.1089/wound.2020.1219). Согласно ГОСТ Р 53498-2019 зону задержки роста измеряли от края образца до начала зоны роста бактерий с каждой из сторон пробы с точностью до 1 мм и затем усредняли полученное значение. Для достоверного результата проводили несколько повторов.

Исследования доказали, что все биокомпозиты демонстрируют антибактериальную активность в отношении грамположительного микроорганизма Staphylococcus aureus 209 P. Причем, наибольшей активностью обладает биокомпозиционный материал на основе бактериальной целлюлозы, альгината натрия и фузидина натрия (зона отсутствия роста 19,5 мм).

Проведено исследование длительности высвобождения действующего вещества путем погружения композита в стерильную воду на 1 час, после чего композит был перенесен в свежую воду, а из отстоявшейся отбирали 100 мкл жидкости и вносили в лунку диаметром 11 мм на агаризованной среде в чашке Петри, предварительно засеянной S. aureus. Данное действие повторяли каждый час на протяжении 6 часов. Диффузию антибактериальных веществ из пластырей оценивали по образовавшейся зоне задержки роста тест-микроорганизма.

Полученные биокомпозиционный материал на основе бактериальной целлюлозы, хитозана, фузидина натрия и биокомпозиционный материал на основе бактериальной целлюлозы, альгината натрия с CaCl₂ и фузидина натрия обладают более длительной антибактериальной активностью (до 4 часов). В то же время полученные биокомпозиционный материал на основе бактериальной целлюлозы, хитозана и биокомпозиционный материал на основе бактериальной целлюлозы, альгината натрия, фузидина натрия теряют свою активность спустя 1 час. Это может быть связано с взаимодействием посредством химических связей фузидина натрия и хитозана и сшивки альгината натрия раствором хлорида кальция, что значительно крепче, чем силы адсорбции, связывающие остальные компоненты.

Исследование эффективности регенеративного действия проводили путем моделирования термических ожогов на лабораторных животных. Для формирования ожоговых повреждений использовали золетил-ксиланитовый наркоз и инфракрасную паяльную станцию для BGA корпусов Ly M770, а также инструменты для удаления шерсти крыс в области между лопаток.

Для крепления гидрогелей использовали медицинский фиксирующий лейкопластырь Unifilm от Master Uni, не оказывающий положительного или отрицательного воздействия на процесс ранозаживления. На пластырь с полимерной основой диаметром 30 мм наносили 200 мкл гидрогеля и распределяли ровным слоем по центру образца. Полученные биокомпозиты оставляли на сутки согласно ГОСТ Р 53498-2019. За 24 часа при комнатной температуре происходило лучшее сцепление гидрогеля и пластыря.

Животным наносили по 2 повреждения II-III степени на спине с помощью ИК-излучателя: одно из них служило контролем с нанесенным поверх раны лейкопластырем (той же формы, но без действующих веществ) с целью исключить расчесывание раны и ее загрязнение, второй ожог подвергался лечению композиционным материалом. Все животные подвергались лечению в течение 21 суток. При этом каждые 7 суток производили замену пластырей на новые, а также измерение площадей ожогов с целью изучения оказываемого влияния композитов на рану по сравнению с контролем. Также на 0, 7, 14 и 21 сутки проводили забор материала для гистологического исследования.

При оценке ранозаживляющей способности биокомпозиционных материалов in vivo замечено, что такие раневые покрытия как пластыри с биокомпозиционным материалом на основе бактериальной целлюлозы, дигидрокверцетина и биокомпозиционным материалом на основе бактериальной целлюлозы, альгината натрия с CaCl₂, фузидина натрия существенно сокращают процесс ранозаживления, а именно на 8,8 % и 58,5 % соответственно по сравнению с контрольными образцами этих лабораторных животных.

Представленные биокомпозиционные материалы показали хорошую антибактериальную активность в отношении S. aureus, способность пролонгированного действия активных компонентов и высокую регенеративную способность, следовательно, могут быть использованы в медицине в качестве раневых покрытий.

По сравнению с известным решением предлагаемое изобретение позволяет расширить ассортимент раневых покрытий на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы с регенеративными и антисептическими свойствами.

Изобретение создано за счет средств Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (соглашение № 16225ГУ/2021 от 11.05.2021).

Изобретение относится к способу получения биокомпозита на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы и может быть использовано для создания раневого покрытия. Способ получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы включает синтез гель-пленки бактериальной целлюлозы культурой-продуцентом Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 в статических условиях на среде, содержащей отход свеклосахарного производства – мелассу, последующее очищение, механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы и смешивание с водой в соотношении 1:3 для получения гидрогеля бактериальной целлюлозы. К полученному гидрогелю бактериальной целлюлозы добавляют 2% раствор альгината натрия в соотношении 1:4, затем добавляют фузидин натрия в количестве 7,5 мг на мл гидрогеля. Наносят 200 мкл полученного гидрогеля на медицинский фиксирующий лейкопластырь с полимерной основой диаметром 30 мм посредством распределения гидрогеля ровным слоем по центру и выдерживают в течение 24 часов. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента раневых покрытий и позволяет сократить сроки заживления ран. 6 пр.

Способ получения биокомпозиционных материалов с регенеративными и антисептическими свойствами на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы, включающий синтез гель-пленки бактериальной целлюлозы культурой-продуцентом Komagataeibacter sucrofermentans B-11267 в статических условиях на среде, содержащей отход свеклосахарного производства – мелассу, последующее очищение посредством помещения полученного полисахарида в раствор щелочи - 0,1 H NaOH на 30 минут при 80°С, удаление раствора щелочи с помощью 0,5% раствора уксусной кислоты и дистиллированной воды, механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы посредством лабораторного гомогенизатора в течение 10 минут и смешивание с водой в соотношении 1:3 для получения гидрогеля бактериальной целлюлозы с гидромодулем с соотношением 1:3, добавление 2%-ного раствора альгината натрия к полученному гидрогелю бактериальной целлюлозы в соотношении 1:4 и последующее внесение фузидовой кислоты в форме фузидина натрия в количестве 7,5 мг на мл гидрогеля, нанесение 200 мкл полученного гидрогеля на медицинский фиксирующий лейкопластырь с полимерной основой диаметром 30 мм посредством распределения гидрогеля ровным слоем по центру и выдержку в течение 24 часов.