Термофильный штамм водоросли Chlorella vulgaris Beijer для оперативного биотестирования токсичности водных сред Российский патент 2024 года по МПК C12N1/12 C02F3/32 G01N33/18 C12R1/89 

Изобретение относится к экотоксикологии и представляет собой термофильный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer (токситест-90), предназначенный для использования в качестве тест-организма при биотестировании токсичности природных и сточных вод, водных вытяжек из почв, грунтов, донных отложений и отходов.

При определении токсичности водных сред методом биотестирования широко применяются зеленые протококковые водоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. [Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей (ФР 1.39.2007.03223), Москва «АКВАРОС» 2007], или Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak [Freshwater algal growth inhibition test unicellular green algae ISO 8692:2004(E) Second edition 2004-10-01].

Токсикологический эксперимент проводят в лабораторных условиях, результатом которого является установление разницы в росте численности клеток в тестируемых пробах относительно контрольной водной пробы. Для обеспечения роста тест-культуры водоросли в контрольные и опытные пробы вносят необходимые элементы питания клеток, а также создают требуемые условия по световому облучению, температуре и снабжению углекислым газом. При этом для сохранения чистоты тест-культуры в процессе биотестирования необходимо исключить попадание в пробы из внешней среды других видов водорослей и микроорганизмов. С этой целью колбы с анализируемыми пробами, во время опыта на токсичность, закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или колпачками из алюминиевой фольги, а питательные среды и растворы солей, используемые для их приготовления, автоклавируют. Температуру во время биотестирования, длительностью 72 часа, необходимо сохранять в пределах 22-25°С, а освещенность - на уровне 3000-10000 люкс при 24-часовом световом периоде. Клетки водорослей поддерживают во взвешенном состоянии в колбах путем встряхивания 1-2 раза в сутки или перемешивания на мешалке, улучшая таким образом условия для газообмена исследуемых растворов с внешней средой.

Недостатком применения этих тест-организмов является их относительно низкая скорость роста, что удлиняет время проведения биотестирования. Ситуация усугубляется также тем, что использование специальных пробок, необходимых для предотвращения загрязнения проб другими организмами, ограничивает поступление СО₂ из воздушной среды, дополнительно снижая фотоавтотрофный рост клеток водоросли. Значительные трудозатраты в выполнении биотестирования создает необходимость проведения стерилизации посуды и питательных сред.

Целью изобретения является получение термофильного штамма одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer (токситест-90), имеющей более высокую скорость роста, а также способность расти при повышенной температуре (35-37°С). Указанные характеристики позволяют уменьшить время проведения токсикологического эксперимента и снизить трудозатраты на поддержание чистоты тест-культуры водоросли. Последнее достигается тем, что высокая температура культивирования, являясь оптимальной для самого штамма, ограничивает развитие значительного число других микроорганизмов. При этом благодаря большой скорости роста заявляемый штамм будет доминировать в среде, опережая развитии сопутствующей микрофлоры. Низкий уровень микробного загрязнения среды, который обеспечивает использование данного штамма, исключает процедуру автоклавирования, что существенно снижает трудозатраты на проведение биотестирования.

Термофильный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer (токситест-90) получен методом длительной автоселекции из штамма IPPAS С-18 при его выращивании в культиваторах типа KB (ТУ 3615-006-26218570-2007). В культиваторе КВ-при оптимальной температуре 35-37°С, непрерывном освещении светом лампы накаливания 40 Вт суточный прирост численности клеток водоросли составляет 100-150 раз. Активный газообмен с внешней воздушной средой создают вращением вокруг продольной оси открытой емкости биореактора, установленной наклонно [RU № 214983, С12М 3/02, C12N 1/12, опубл. 23.11.2022].

Морфологические признаки. Клетки шаровидные, размером 1,5-10 мкм. Оболочка тонкая, гладкая. Хлоропласт один, чашевидный с пиреноидом шаровидной до широкоэллиптической формы. Размножение 2-8, реже 16, автоспорами равной величины с чашевидным хлоропластом, которые освобождаются в результате разрыва материнской оболочки. На агаризованной минеральной среде Тамия образует плотные круглые колонии темно-зеленого цвета, поверхность колоний гладкая, край ровный. Штамм хранится в пробирках на агаризованной среде Тамия. При хранении в условиях комнатной температуры и минимальной освещенности не теряет свои свойства до 30 сут., а в холодильнике при температуре (+2) - (+4) - до одного года.

Физиологические свойства. Штамм автотрофный, растет на минеральной среде Тамия, углеродсодержащих соединений для роста не требует. Источником СО₂ является окружающая воздушная среда, без дополнительного ее обогащения углекислым газом. В многокюветных культиваторах типа КВМ (ТУ 26.51.70-002-64091810-2019), в которых проводится биотестирование, клетки водоросли не налипают на стенки емкостей с пробами, а благодаря непрерывному вращению кассеты с пробами, остаются во взвешенном состоянии. Емкости с пробами прикрыты пробками с отверстием, которые предотвращают излишнее испарения тестируемых проб и при этом не огранивают газообмен с внешней воздушной средой [RU №208961, С12М 3/00, опубл. 24.01.2022]. В этих условиях за время проведения биотестирования (22 часа) численность клеток штамма в контрольных пробах, не содержащих токсиканты, увеличивается в 30±5 раз. Наибольшая чувствительность водоросли к токсическим веществам наблюдается на среде Тамия, разбавленной в 50 раз.

Штамм Chlorella vulgaris Beijer (токситест-90) депонирован в коллекции культур микроводорослей (IPPAS) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН с присвоенным регистрационным номером IPPAS C-2058 от 28.11.2022г.

Пример. В 6 стаканов объемом 100 см³ заливаются по 48 см³ растворы бихромата калия в дистиллированной воды в концентрациях 0 (контроль), 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 мг/дм³. Затем в каждый стакан вносится засеваемый штамм водоросли Chlorella vulgaris Beijer (токситест-90) в объеме 2 см³, выращенный в 50% среде Тамия с численностью клеток 1,8-1,9 млн. клеток/см³. В результате 25-кратного разбавления начальный засев культуры водоросли составляет 70-75×10³ клеток/см³ в 2% среде Тамия. Из каждого стакана отбираются по 4 пробы объемом 6 см³ в емкости, которые закрываются специальными пробками с отверстием диаметром 6 мм и устанавливаются в многокюветный культиватор КВМ. После 22 часов культивирования всех 24 проб в условиях непрерывного вращения при температуре 36±1°С и световом облучении 10-15 Вт/м² подсчитывается средняя численность клеток в каждом варианте опыта. По полученным результатам устанавливается концентрация бихромата калия, вызывающая 50% подавления роста тест-культуры водоросли относительно контрольного варианта (таблица). Для сравнения в таблице приведены условия и результаты проверки чувствительности к бихромату калия двух других тест-культур водорослей, взятые из руководств, в которых они рекомендованы к использованию.

Из таблицы следует, что заявляемый штамм водоросли позволяет в несколько раз сократить время выполнения токсикологического анализа без потери чувствительности к токсиканту. При этом без применения специальных и трудоемких процедур, таких как автоклавирование питательной среды и рабочих растворов, водорослевая культура полученного штамма остается альгологически чистой при низком уровне сопутствующей микрофлоры.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer (токситест-90) обладает повышенной скоростью роста и способностью расти при повышенной температуре 35-37°С, депонирован в коллекции микроводорослей Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук (IPPAS) под номером IPPAS С-2058. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для биотестирования токсичности водных сред. 1 табл., 1 пр.

Термофильный штамм водоросли Chlorella vulgaris Beijer (токситест-90), депонированный в Российской коллекции микроводорослей при учреждении Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS С-2058, для оперативного биотестирования токсичности водных сред.