Способ получения гибридных микрокапсул на основе полиаргинина и глутатиона для доставки лекарственных средств Российский патент 2024 года по МПК A61K9/14 A61K31/7105 A61K47/18 A61K47/42 A61K47/36 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения поликатионных микрокапсул, обладающих свойствами защиты содержимого от окислительного повреждения активными формами кислорода.

Хорошо известно, что эффективность доставки лекарственных веществ, включая молекулы РНК, определяется взаимодействием доставляющего агента с клеткой-мишенью. В этом взаимодействии важную роль играют физико-химические свойства контейнера, включая его размер, поверхностный заряд и содержание активных форм кислорода. Именно эти параметры в значительной мере определяют интернализацию, цитотоксичность и биодеградируемость системы доставки. Учитывая это, в рамках настоящего изобретения трансфекцию клеток гибридными поликатионными капсульными системами доставки, после чего мы провели оценку микронных (1,5-2 мкм) капсул в качестве средства доставки по такому параметру, как содержание в капсулах активных форм кислорода. Капсулы были получены с использованием технологии «Layer-by-Layer», путём послойного нанесения противоположно заряженных полиэлектролитов (полиаргинин, декстран сульфат) на CaCO₃-ядро, содержащее глутатион, с его последующим растворением. Преимуществами данной технологии являются высокая загружающая способность, низкая токсичность и, наконец, возможность модификации поверхности капсулы для придания ей новых свойств. Полученные таким образом капсулы были охарактеризованы с помощью трансмиссионной электронной микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при этом был подтверждён их характерный размер и особые свойства, заключающиеся в отсутствии в капсулах активных форм кислорода в концентрации, достаточной для прижизненной регистрации с помощью метода лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

Из источника: Tarakanchikova YV, Linnik DS, Mashel T, Muslimov AR, Pavlov S, Lepik KV, Zyuzin MV, Sukhorukov GB, Timin AS. Boosting transfection efficiency: A systematic study using layer-by-layer based gene delivery platform. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021 Jul;126:112161. doi: 10.1016/j.msec.2021.112161. известен способ получения гибридных микрокапсул на основе полиаргинина, основанный на технологии послойной полимеризации полиаргинина вокруг ядер карбоната кальция (CaCO₃) с последующим растворением ядер с помощью раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты. Для получения микрокапсул сначала получают частицы карбоната кальция (CaCO₃) субмикронного размера, затем у этих частиц формируют с помощью технологии послойной сборки оболочку полимерной структуры из полиаргинина и декстрансульфата. Для получения частиц карбоната кальция, два солевых раствора карбоната натрия (0,33 М), приготовленого в смеси этиленгликоль:H₂O (5:1), и хлорида кальция (0,33 М), приготовленого в смеси этиленгликоль:H₂O (5:1), смешивают и перемешивают в течение 20 мин, полученные ядра CaCO₃ дважды промывают деионизированной водой и 70% этанолом; для формирования 1-го слоя полимерной оболочки к полученным частицам добавляют водный раствор поли-L-аргинина (2 мг/мл) и встряхивают в течение 10 мин, для формирования 2-го слоя добавляют водный раствор декстрансульфата с молекулярной массой ~ 40 000 (2 мг/мл) и встряхивают в течение 10 мин, процедуру формирования слоёв повторяют дважды; в конце в смесь добавляют раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,2 М) для растворения ядра CaCO₃ и в итоге получают капсулы, предназначенные для доставки лекарственных веществ, например РНК, в клетки организма.

Известен способ получения микрокапсул (Поликатионная микрокапсула на основе альгината и ее применение при встраивании биоактивного вещества: патент CN106860422: Китайская народная республика, заявка CN201510920872, заявл.·10.12.2015, опубл. 20.06.2017), в ходе которого альгинатно-поликатионные микрокапсулы модифицируют дофамином. При этом в настоящем способе в качестве дополнительных веществ могут быть использованы соединения кальция и глутатион.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения микрокапсул (Способ получения микрокапсул для доставки днк в макроорганизм: патент RU2409384, Российская Федерация, заявка 2009126856, заявл. 15.07.2009, опубл. 20.01.2011), в ходе которого осуществляют доставку ДНК в макроорганизм в биосовместимых и биодеградируемых микрокапсулах, состоящих из мультислойных полимерных оболочек DEAE-декстран / κ-каррагинан, которые предохраняют ДНК от расщепления нуклеазами в процессе ее доставки в клетки организма. Сорбируют плазмидную ДНК пористыми частицами СаСО₃ методом соосаждения. Получают мультислойные оболочки путем поочередного наслоения DEAE-декстран и κ-каррагинан на пористые частицы СаСО₃. Помещают микрокапсулы в раствор 0,1М ЭДТА. Интенсивно перемешивают до полного растворения внутреннего ядра, состоящего из СаСО₃. Трижды промывают водой полученные микрокапсулы. Вводят в клетки животных путем инъекции.

Вышеприведенные способы имеют один общий недостаток - в получаемых микрокапсулах, помещённых в клетки, генерируются активные формы кислорода. Из источника Kong Q., Lin C. G. Oxidative damage to RNA: mechanisms, consequences, and diseases //Cellular and Molecular Life Sciences. - 2010. - Т. 67. - №. 11. - С. 1817-1829. известно, что молекулы активных форм кислорода повреждают молекулы РНК, что приводит к нарушению их биологических функций. Можно предположить, что активные формы кислорода могут разрушать и другие лекарственные веществе, помимо РНК, помещённые в микрокапсулы.

Технической проблемой является необходимость разработки способа получения гибридных микрокапсул на основе полиаргинина и глутатиона для доставки лекарственных средств, обладающего пониженной концентрацией активных форм кислорода.

Технический результат состоит в снижении концентрации активных форм кислорода в получаемых микрокапсулах.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридных микрокапсул на основе полиаргинина и глутатиона для доставки лекарственных средств, в ходе которого получают частицы карбоната кальция, на которые послойно наносят полимерную оболочку, после чего к частицам добавляют действующее вещество, согласно изобретению наносят оболочку из слоев полиаргинина и декстрансульфата, при этом действующее вещество наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки или помещают внутрь частиц карбоната кальция, кроме того, глутатион наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки или помещают внутрь частиц карбоната кальция, затем растворяют ядра карбоната кальция.

Предлагаемый в настоящем изобретении способ позволяет получать микрокапсулы с пониженным содержанием активных форм кислорода, что позволит увеличить эффективность доставки в клетки организма с помощью таких микрокапсул лекарственный веществ различной природы, включая молекулы РНК.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

В первую очередь осуществляют получение частиц карбоната кальция. Предпочтительно получение частиц карбоната кальция осуществляют путем приготовления двух солевых растворов карбоната кальция 0,33 М, каждый из которых смешивают с растворами этиленгликоля с водой в соотношении по массе 5:1 к воде, и хлорида кальция 0,33 М. Далее на полученные частицы послойно наносят полимерную оболочку из полиаргинина и декстрансульфата. Для формирования первого слоя из полиаргинина к частицам карбоната кальция добавляют водный раствор поли-L-аргинина 2 мг/мл и встряхивают в течение 10 мин. Для формирования второго слоя из декстрансульфата к полученной субстанции добавляют раствор декстрансульфата с молекулярной массой ~ 40 000 в концентрации 2 мг/мл и встряхивают в течение 10 мин, формируя второй слой оболочки. Предпочтительно процедуру формирования слоёв повторяют по меньшей мере два раза. При этом действующее вещество наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки или на частицы карбоната кальция.

В первом случае осуществляют соосаждение водных растворов РНК-олигонуклеотидов с концентрацией 100 пмоль/мкл (либо с концентрацией по РНК 100 мкМ) с частицами карбоната кальция после сборки на частицах слоёв из полиаргинина и декстрансульфата; способом, аналогичным описанному в источниках Timin A.S. et al. Hybrid inorganic-organic capsules for efficient intracellular delivery of novel siRNAs against influenza A (H1N1) virus infection // Sci. Rep. - 2017. - V. 7, No 1. - P. 102.; Петрова-Бродская А.В., Бондаренко А.Б., Тимин А.С., Плотникова М.А., Афанасьев М.В, Семенова А.А., Лебедев К.И., Горшков А.Н., Горшкова М.Ю., Егоров В.В., Клотченко С.А. В.А.В. Сравнение эффективностей ингибирования вируса гриппа А in vitro комплексами малых интерферирующих РНК с производными хитозана, полиэтиленимином и гибридными микрокапсулами на основе полиаргинина с неорганическими компонентами // вопросы вирусологии. - 2017. - V. 62, No 6. - P. 259-265.

Во втором случае производят соосаждение РНК-олигонуклеотидов с концентрацией 100 пмоль/мкл с частицами карбоната кальция до сборки на частицах слоёв из полиаргинина и декстрансульфата. Предпочтительно в качестве действующего вещества используют молекулы РНК, например малые интерферирующие РНК (миРНК), технология использования противовирусных миРНК совместно с поликатионными капсулами описана в источнике Петрова-Бродская А.В., Бондаренко А.Б., Тимин А.С., Плотникова М.А., Афанасьев М.В, Семенова А.А., Лебедев К.И., Горшков А.Н., Горшкова М.Ю., Егоров В.В., Клотченко С.А. В.А.В. Сравнение эффективностей ингибирования вируса гриппа А in vitro комплексами малых интерферирующих РНК с производными хитозана, полиэтиленимином и гибридными микрокапсулами на основе полиаргинина с неорганическими компонентами // вопросы вирусологии. - 2017. - V. 62, No 6. - P. 259-265.

При этом глутатион наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки или помещают внутрь частиц карбоната кальция. В первом случае после формирования одного из слоев водный раствор 5 мМ глутатиона инкубируют с полученными частицами ядро-оболочка в течение 30 мин при температуре от +18°C до +25°C. Во втором случае изначально полученный раствор с частицами карбоната кальция смешивают с водным раствором 5 мМ глутатиона в течение 20 мин, после чего полученные ядра карбоната кальция с соосажденным глутатионом промывают деионизированной водой и 70% этанолом. После всех процедур осуществляют растворение ядра карбоната кальция. Предпочтительно для растворения ядра карбоната кальция к полученным частицам добавляют раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,2 М.

На Фиг. 1 показаны микрофотографии клеток линии A549, полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Общий вид культуры клеток A549 через 6 часов инкубации с субмикрокапсулами (20 капсул/клетку) BF-изображение в светлом поле; ROS-активные формы кислорода, окрашенные H2DCFDA; PAM- микрокапсулы, содержащие родамин; Merge- объединенное изображение из трех каналов. Масштабные отрезки = 10 мкм.

На Фиг. 2 Показана прижизненная визуализация микрокапсул в клетках A549 через 6 часов инкубации (20 капсул/клетку). Внутри клеток показаны микрокапсулы, полученные без использования глутатиона. Видны включения активных форм кислорода (зелёный канал) внутри меченных родамином микрокапсул (красный канал). (А) показана 3D-реконструкция, созданная с использованием Z-стэка из 50 оптических срезов; (Б, В) - оптический разрез и соответствующий график денситометрии из области, обозначенной белой пунктирной линией. Масштабные отрезки = 1 мкм

На Фиг. 3 Показаны изображения микрокапсул, содержащих глутатион, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии. (A) - контрольные субмикрокапсулы (PAM), (Б) - глутатион в капсулах связан с ядром (PAM-cGSH); (C) - глутатион в капсулах находится в стенке капсулы (PAM-wGSH).

На Фиг. 4 показаны глутатион-содержащие субмикрокапсулы. Прижизненная лазерная сканирующея конфокальная микроскопия клеток А549, через 6 часов после трансфекции субмикрокапсулами (40 капсул/клетка). (A) - PAM-cGSH глутатион в капсулах связан с ядром; (Б) PAM-wGSH глутатион в капсулах находится в стенке капсулы.

Красным цветом изображена капсула (родамин), зеленым цветом - АФК/ ROS (зонд H2DCFDA 488 нм). Merge наложение двух каналов изображения. Масштабные линейки = 1 мкм

На Фиг. 5 на графиках показаны результаты статистический анализ флуоресцентных конфокальных изображений: А - диаметра субмикрокапсул, оценённого по флуоресцентному сигналу родомина. В - уровня АФК, оценённого как флуоресцентный сигнал H2DCFDA внутри субмикрокапсулы. Под гистограммами указаны значения P - результаты применения критерия Краскела-Уоллиса для сравнения четырёх независимых групп количественных данных, экстремально низкие значения представлены в экспоненциальной нотации. Над квадратными скобками указаны уровни статистической значимости P - результаты приминения критерия суммы рангов Вилкоксона для попарного сравнения групп измерений ( * p <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001).

Заявляемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Получение микрокапсул

Материалы и методы.

Клетки линии A549 получали в ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Культивирование клеток и загрузка в клетки полиаргининовых микрокапсул подробно описаны в источнике Петрова-Бродская А. В. и др. Сравнение эффективностей ингибирования вируса гриппа а in vitro комплексами малых интерферирующих РНК с производными хитозана, полиэтиленимином и гибридными микрокапсулами на основе полиаргинина с неорганическими компонентами //Вопросы вирусологии. - 2017. - Т. 62. - №. 6. - С. 259-265. Вкратце, клетки A5492 культивировали при 37 °C (5% CO₂, влажность 90%). в ростовой среде, содержащей 90% среды DMEM/F12 и 10% фетальной бычьей сыворотки. Микробиологический анализ подтвердил отсутствие бактериального, грибкового или микоплазменного загрязнения культивированной линии.

Синтез полиэлектролитных микрокапсул.

Для синтеза полиэлектролитных капсул была использована технология послойного синтеза с использованием коровых частиц CaCO₃ различного размера (около 2 мкм и около 0,6 мкм), согласно ранее опубликованной методике. Получение частиц CaCO₃ было выполнено с помощью реакции ко-преципитации. Для получения микрочастиц CaCO₃ (около 2 мкм), 2 мл водного раствора CaCl₂ (0.33 M) были смешаны с 386 мкл раствора Na₂CO₃ (0.33 M). Инкубация длилась в течение 30 секунд, на магнитной мешалке при 1000 об/мин. Полученные таким образом микрочастицы CaCO₃ размером около 2 мкм были затем центрифугированы (4000 об/мин) промыты деионизированной водой, для удаления остаточных солей. Центрифугирование и промывка были повторены трижды.

Для получения субмикрочастиц CaCO₃ (около 0,6 мкм), реакция ко-преципитации проводилась путём смешивания растворов CaCl₂ х 2H₂O(0.33 M) и Na₂CO₃ (0.33 M), приготовленных на воде с добавлением этиленгликоля (объёмное отношение воды и этиленгликоля 5:1). 2 мл раствора CaCl₂ х 2H₂O(0.33 M) были смешаны с 386 мкл раствора Na₂CO₃ (0.33 M). Инкубация длилась в течение 30 мин, на магнитной мешалке при 1000 об/мин. Полученные таким образом субмикрочастицы CaCO₃ размером около 0,6 мкм были затем центрифугированы (8000 об/мин, 3 мин) и промыты деионизированной водой, для удаления остаточных солей. Центрифугировагие и промывка были повторены трижды.

Полученные вышеописанными методами субмикрочастицы CaCO₃ были суспендированы в водном растворе полиаргинина (PARG), 1 мг/мл, содержащем 0,15М NaCl. PARG адсорбировался на частицах CaCO₃ в течение 10 мин, после чего суспензию трижды центрифугировали и промывали деионизированной водой для удаления неадсорбированного полиэлектролита. Далее, выполняли осаждение следующего слоя декстрана (DEXS), с использованием той же манипуляции. Такая процедура сборки PARG / DEXS была повторена несколько раз, для формирования структуры ядро-оболочка со следующей архитектурой оболочки: (PARG / DEXS)₂ + PARG. Полученные таким образом частицы были трижды центрифугированы и промыты в деионизированной воде. Растворение коровой частицы CaCO₃ было выполнено воздействием на образец 0,2 М водного раствора ЭДТА. Полученные таким образом частицы инкубировали 1 ч в растворе родамина Б для возможности визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Как правило, количество получаемых в ходе одного синтеза капсул составляло 4,4 - 7,4 × 10⁶ капсул.

Загрузка глутатиона

Включение коктейля глутатиона в микрокапсулы осуществляли двумя путями загрузки груза: (а) в ядро и (b) в слой оболочки.

а) Раствор 5 мМ глутатиона (2 мл) соосаждали в ядрах CaCO₃, как описано выше. Затем была проведена LbL-сборка PARG / DEXS для формирования полимерной структуры со следующей архитектурой: (глутатион/ PARG / DEXS)₂

б) Раствор 5 мМ глутатиона (2 мл) инкубировали с частицами ядро-оболочка в течение 30 мин при комнатной температуре, как описано на стр.6. Затем была выполнена LbL-сборка PARG/DS для формирования полимерной структуры со следующей архитектурой: PARG/DS/PARG/глутатион/PARG).

Просвечивающая электронная микроскопия микромикрокапсул.

Суспензия микро- и субмикрокапсул наносилась на медные сетки для электронной микроскопии, покрытые коллодиевой плёнкой-подложкой. После адсорбции капсул к подложке в течение 1 мин сетки были промыты дистиллированной водой. Далее сетки высушивались и исследовались в просвечивающем электронным микроскопе JEOL JEM 1011. Электронные микрофотографии были получены с помощью цифровой камеры Morada (Olympus Inc.).

Пример 2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия клеток после трансфекции микрокапсулами с флуоресцентной меткой.

Интернализацию и внутриклеточное распределение микрокапсул отслеживали с использованием лазерного конфокального сканирующего микроскопа (Leica TCS SP8, Германия). Клетки сеяли на 13 мм круглые покровные стекла, помещенные в лунки 24-луночного планшета и культивировали в течение 24 ч. Затем культуральную среду в каждой лунке заменяли на 1 мл свежей, содержащей полиэлектролитные микрокапсулы микронного размера (25х10⁵ капсул). После 24 ч инкубации клетки окрашивали H2DCFDA в течение 30 мин, трижды промывали PBS и исследовали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с помощью инвертированного микроскопа Leica TCS SP8, оснащённого аргоновым и гелий-неоновым лазерами. Флюоресценцию связанного с микрокапсулами родамина возбуждали лазером 561 нм и регистрировали в диапазоне 565-650 нм; флюоресценцию H2DCFDA возбуждали лазером 488 нм и регистрировали в диапазоне 495-560 нм. Проводилось раздельное сканирование в двух каналах, ширину конфокальной диафрагмы устанавливали на 100 мкм, что примерно соответствует толщине оптического среза в 1 мкм. Получали изображения в разрешении 1024 х 1024 пикселя с усреднением 7 по каждой линии сканирования. Для получения объёмных моделей получали пачки из 50 изображений (z-stacks) в разрешении 512 х 512 пикселей с шагом по оси z 0.35 мкм и усреднением 3 по каждой линии сканирования. Использовали объектив 60х с масляной иммерсией.

Статистическая обработка результатов

Сбор и систематизация исходных данных проводились с использованием электронных таблиц Office Excel 2016 (Microsoft, США). Статистический анализ проводился с использованием бесплатной вычислительной среды R версии 4.2.1 (R Core Team, 2022). Количественные показатели оценивали на соответствие нормальному распределению с применением критерия Шапиро - Уилка (Shapiro and Francia, 1972). При сравнении нескольких групп количественных данных для выявления статистически значимых различий (p < 0,05) использовались непараметрические критерии Краскела - Уоллиса и Вилкоксона (Kruskal and Wallis, 1952; Wilcoxon, 1992).

Результаты.

Визуализация субмикрокапсул с глутатионом, интернализованных клетками А549, была проведена прижизненно с использованием зонда H2DCFDA и применением метода лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (рисунок 11). С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии получили микрофотографии клеток A549, окрашенных для выявления активных форм кислорода, и содержащих как микрокапсулы без глутатиона, так и микрокапсулы, в которых глутатион связан либо с ядром, либо с оболочкой. Пример изображений клеточной культуры, в которой выявлены микрокапсулы и активные формы кислорода, представлен на Фиг. 1. Получили 3D-реконструкции микрокапсул, не содержащих глутатиона, в которых выявлены активные формы кислорода, пример представлен на Фиг. 2. Получили 3D-реконструкции микрокапсул, содержащих глутатион, в которых не выявлены активные формы кислорода, пример представлен на Фиг. 4. Получили электронные микрофотографии микрокапсул, не содержащих глутатион и содержащих его либо в ядре, либо в оболочке, пример представлен на Фиг. 3. Был проведен статистический анализ сигналов, полученных с помощью конфокального микроскопа. Для полученных изображений, были вручную выбраны области интереса в количестве равном n = 15 для каждой группы с использованием приложения ImageJ, и затем обработаны с использованием программной среды вычислений R для дальнейшего анализа. Результаты измерений диаметра субмикрокапсул, оценённого по сигналу родамина, входящего в состав капсул, и уровня активных форм кислорода, оцененному по зеленому сигналу H2DCFDA, представлены на Фиг. 5. В микрокапсулах без глутатиона содержание АФК статистически значимо превышает уровень АФК в капсулах с глутатионом, независимо от локализации глутатиона (в ядре или оболочке). Из этого следует, что глутатион способствует снижению уровня АФК локально в микрокапсулах, следовательно снижает повреждающие эффекты АФК на доставляемые капсулами лекарственные вещества, например молекулы РНК.

Выводы. Результаты экспериментов, выполненных на клеточной культуре линии A549 с применением как микрокапсул, не содержащих глутатион, так и микрокапсул, полученных предлагаемым способом, и содержащих глутатион в ядре либо в оболочке, показывают, что модифицированные с помощью глутатиона микрокапсулы, помещённые в клетки культуры A549, не содержат активных форм кислорода в концентрации, достаточной для прижизненной регистрации с помощью флюоресцентного зонда H2DCFDA и метода лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

Настоящее изобретение относится к способу получения гибридных микрокапсул для доставки лекарственных средств, в ходе которого получают частицы карбоната кальция, на которые послойно наносят полимерную оболочку, после чего к частицам добавляют действующее вещество, отличающееся тем, что наносят оболочку из слоев полиаргинина и декстрансульфата, при этом действующее вещество наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки, кроме того, глутатион наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки, затем растворяют ядра карбоната кальция, при этом в качестве действующего вещества используют молекулы РНК. Настоящее изобретение обеспечивает снижение концентрации активных форм кислорода в получаемых микрокапсулах. 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Способ получения гибридных микрокапсул для доставки лекарственных средств, в ходе которого получают частицы карбоната кальция, на которые послойно наносят полимерную оболочку, после чего к частицам добавляют действующее вещество, отличающийся тем, что наносят оболочку из слоев полиаргинина и декстрансульфата, при этом действующее вещество наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки, кроме того, глутатион наносят по меньшей мере на один из слоев оболочки, затем растворяют ядра карбоната кальция, при этом в качестве действующего вещества используют молекулы РНК.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы карбоната получают путем приготовления двух солевых растворов карбоната кальция 0,33 М, каждый из которых смешивают с растворами этиленгликоля с водой в соотношении по массе 1:5 к воде, и хлорида кальция 0,33 М.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что после формирования первого слоя к полученной субстанции добавляют раствор декстрансульфата с молекулярной массой ~ 40000 в концентрации 2 мг/мл и встряхивают в течение 10 мин, формируя второй слой оболочки.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что после формирования второго слоя водный раствор 5 мМ глутатиона инкубируют с полученными частицами ядро-оболочка в течение 30 мин при температуре от +18°C до +25°C.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что процедуру формирования слоёв повторяют по меньшей мере два раза.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что для растворения ядра карбоната кальция к полученным частицам добавляют раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,2 М.