СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОКАПСУЛ ДЛЯ ДОСТАВКИ ДНК В МАКРООРГАНИЗМ Российский патент 2011 года по МПК A61K39/00 A61K9/50 A61K45/00 

Изобретение относится к биотехнологии ДНК-вакцин и по своей сути принадлежит к технологиям соматической генной терапии.

Изобретение может быть использовано для повышения эффективности ДНК-вакцин и в области соматической генной терапии.

Для микрокапсулирования лекарственных средств и белков применяют кальцийкарбонатные (СаСО₃) микросферы, покрытые полимером [1]. В качестве оболочек использовали альгинат кальция и желатин. Такие микрогранулы неэффективны для микрокапсулирования органических кислот. Этот способ авторы использовали для иммобилизации белков, в процессе предусматривалась обработка кислотами, образование капсул, подобных микрогелевым структурам.

Известен способ микрокапсулирования для доставки нуклеиновой кислоты и адъюванта, включающий в себя микросферы, состоящие из растворимого полимера. Нуклеиновую кислоту вносили в раствор полимера, затем экстрагировали растворитель из эмульсии нуклеиновой кислоты с полимером, вызывая образование микросфер, содержащих нуклеиновую кислоту и/или нуклеиновую кислоту с адъювантом. Процесс инкапсулирования протекал при 37°С. В дальнейшем предусматривались процессы отмывания, замораживания и высушивания микросфер. Эффективность этого метода микрокасулирования составляла 50% [2].

Однако известные способы микрокапсулирования являются достаточно сложными, малоэффективными и не позволяют получать микрокапсулы с заключенными в них ДНК, легко деградируемыми в организме животного и нестабильными при длительном хранении, что является обязательным условием для вакцинных препаратов (ДНК-вакцин).

Наиболее близким аналогом является способ доставки ДНК для разработки вакцин, включающий в себя микрокапсулирование ДНК путем ее сорбции микрочастицами СаСО₃ в течение 20-22 часов при 4°С с последующим покрытием их мультислойными оболочками: поли-L-лизин - альгинат натрия и растворением внутреннего ядра СаСО₃ [3].

Однако композиционный состав полиэлектролитной мембраны не обеспечивает необходимые условия для формирования напряженного иммунного ответа на введение микрокапсулированной ДНК.

Целью изобретения является усовершенствование способа получения микрокапсул для доставки ДНК в макроорганизм.

Поставленная цель достигается тем, что способ включает сорбцию плазмидной ДНК микрочастицами СаСО₃, образование слоев мультислойной полимерной оболочки из модифицированного низкомолекулярного DEAE-декстрана (М 6500) / κ-каррагинана (М 15000-30000, Sigma) путем их поочередного наслоения и растворения внутреннего ядра СаСО₃, при этом сорбцию ДНК проводят одновременно с процессом синтеза микрочастиц СаСО₃. Для формирования первого слоя мультислойной оболочки микрочастицы центрифугируют и переносят в раствор κ-каррагинана (2 мг/см³ в 0,2 М NaCl), инкубируют в течение 15 мин при встряхивании и дважды отмывают в физиологическом растворе, а для формирования второго и последующих, вплоть до шестого слоев, частицы помещают в раствор DEAE-декстрана (2 мг/см³ в 0,2 М NaCl), инкубируют при встряхивании в течение 15 мин, отмывают дважды дистиллированной водой и переносят в раствор 0,1 М ЭДТА, интенсивно перемешивают, и наносят седьмой заключительный слой, состоящий из каппа-каррагинана.

В отличие от полилизин-альгинатных микрогранул декстран-каппагинановые капсулы медленно разрушаются. При проверке в культуре клеток деградация капсул полилизина происходит на 2-3 сутки, в то время как присутствие в культуральной жидкости декстран-каррагинановых микрогранул наблюдают и на 10-12 сутки.

Технический результат - увеличивается количество сорбированной плазмидой ДНК до 96-99% от исходного количества вместо 90% и улучшаются ее биологические свойства. Использование полиэлектролитной пары DEAE-декстран / κ-каррагинан обеспечивает получение более плотной оболочки, в связи с чем увеличивается механическая прочность микрокапсул. После формирования мультислойной оболочки путем поочередного наслоения полимеров внутреннее ядро, состоящее из СаСО₃, растворяют, помещая микрокапсулы в раствор 0,1М ЭДТА, и интенсивно перемешивают до полного растворения СаСО₃ матрикса. После чего трижды промывают водой. Окончательно микрокапсулы состоят из 6-8 слоев полиэлектролитов и заключенной в них плазмидной ДНК. Эллюция ДНК из микрокапсул в водном или спиртовом растворе не превышает 1% в первые сутки и в дальнейшем выход ДНК из микрокапсул прекращается (срок наблюдения 20 дней). ДНК, заключенную в микрокапсулы, вводят в организм животного путем инъекции.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

В качестве модели для оценки предлагаемого способа доставки плазмидной ДНК в клетки животных используют плазмиды pInfNP и pInfHA, кодирующие соответственно нуклеопротеин и гемагглютинин вируса гриппа птиц.

500 мкг соответствующей плазмидной ДНК заключали в микрочастицы одновременно с получением частиц СаСО₃ методом соосаждения. Для этого смешивали при помощи магнитной мешалки водный раствор плазмидной ДНК с одномолярными растворами хлористого кальция и карбоната натрия в течение 30 секунд. После перемешивания осадок микрочастиц отделяли от супернатанта центрифугированием (1600 g, 1 мин). Количество сорбированной ДНК определяли спектрофотометрически (λ=260 нм) по разнице адсорбции исходных растворов и растворов супернатантов, отобранных при осаждении.

Количество ДНК, сорбированной микрочастицами, составляло 96%.

Иммобилизация ДНК в микрокапсулы (PLL/Alg)₃:

Для образования 1-го слоя оболочки микрочастицы центрифугируют и переносят в раствор низкомолекулярного (15000-30000) поли-L-лизина (2 мг/см³) в 0,2 М NaCl, инкубируют в течение 15 мин при встряхивании и дважды отмывают в физиологическом растворе. Для получения второго полимерного слоя частицы помещают в раствор альгината (1-2 мг/см³ в 0,2М NaCl), инкубируют при встряхивании в течение 15 мин, отмывают дважды дистиллированной водой и переносят в раствор 0,1М ЭДТА, интенсивно перемешивают в течение 15 мин. на шейкере со скоростью вращения 60-100 об/мин для растворения внутреннего ядра СаСО₃ и снова отмывают водой (1000 об/мин 5 мин). Такую последовательность операций повторяют до образования 7 слоев: LL-Alg- PLL-Alg- PLL-Alg- PLL. Последняя 7-я оболочка наносится аналогично, как и предыдущие.

Иммобилизация ДНК в микрокапсулы (ДЕАЕ-dextran/Car)₃:

Для образования 1-го слоя оболочки микрочастицы центрифугируют и переносят в раствор κ-каррагинана (2 мг/см³) в 0,2 М NaCl, инкубируют в течение 15 мин при встряхивании и дважды отмывают в физиологическом растворе. Для получения второго полимерного слоя частицы помещают в раствор DEAE-декстрана (2 мг/см³ в 0,2М NaCl), инкубируют при встряхивании в течение 15 мин, отмывают дважды дистиллированной водой и переносят в раствор 0,1М ЭДТА, интенсивно перемешивают в течение 15 мин на шейкере со скоростью вращения 60-100 об/мин для растворения внутреннего ядра СаСО₃ и снова отмывают водой (1000 об/мин 5 мин). Такую последовательность операций повторяют до образования 7 слоев: D-K- D-K- D-K- D. После формирования микрокапсул с мультислойной мембраной концентрация иммобилизованной ДНК составляет 480 мкг/см³.

Препараты плазмидной ДНК по 20 мкг/гол. (ДНК в водном растворе и в микрокапсулах) вводят мышам внутримышечно. На 14-е сутки в сыворотках крови мышей, иммунизированных микрокапсулами (ДЕАЕ-dex-dextran/Car)₃, наблюдают наиболее высокий титр антител. На 21-е сутки титры антител сывороток крови при иммунизации микрокапсулами (ДЕАЕ-dextran/ Car)₃ с плазмидами сравнялись и были в 3-4 раза выше, чем в случае иммунизации микрокапсулами (PLL/Alg)₃.

Таблица 1 Титр антител при иммунизации мышей микрокапсулами разного состава, содержащими плазмиду InfHA и InfNP. Взятие крови, сутки Титр антител InfHA InfNP   (PLL/Alg)₃ (ДЕАЕ-dextran/Car)₃ (PLL/Alg)₃ (ДЕАЕ-(dextran/Car)₃ 14 1:625 1:1125 1:125 1:2290

Пример конкретного выполнения 2

В качестве модели для оценки предлагаемого способа доставки плазмидной ДНК в клетки животных используют нуклеотидную последовательность, кодирующую протективный белок Е₂ (pTKShi) классической чумы свиней.

500 мкг соответствующей плазмидной ДНК pTKShi заключали в микрочастицы одновременно с получением частиц СаСО₃ методом соосаждения. Для этого смешивают при помощи магнитной мешалки водный раствор плазмидной ДНК с одномолярными растворами хлористого кальция и карбоната натрия в течение 30 секунд. После перемешивания осадок микрочастиц отделяют от супернатанта центрифугированием (1600 g, 1 мин). Количество сорбированной ДНК определяют спектрофотометрически (λ=260 нм) по разнице адсорбции исходных растворов и растворов супернатантов, отобранных при осаждении.

Для образования 1-го слоя оболочки микрочастицы центрифугируют и переносят в раствор κ-каррагинана (2 мг/см³) в 0,2 М NaCl, инкубируют в течение 15 мин при встряхивании и дважды отмывают в физиологическом растворе. Для получения второго полимерного слоя частицы помещают в раствор DEAE-декстрана (2 мг/см³ в 0,2М NaCl), инкубируют при встряхивании в течение 15 мин, отмывают дважды дистиллированной водой и переносят в раствор 0,1М ЭДТА, интенсивно перемешивают в течение 15 мин на шейкере со скоростью вращения 60-100 об/мин для растворения внутреннего ядра СаСО₃ и снова отмывают водой (1000 об/мин 5 мин). Такую последовательность операций повторяют до образования 7 слоев: D-K- D-K- D-K- D. Последняя 7-я оболочка наносится аналогично, как и предыдущие. После формирования микрокапсул с мультислойной мембраной концентрация иммобилизованной ДНК составляет 495,5 мкг/ см³, т.е. 99,1%.

Препараты плазмидной ДНК по 20 мкг/гол. (ДНК в водном растворе и в микрокапсулах) вводят мышам внутримышечно. На 14-е сутки в сыворотках крови мышей, иммунизированных микрокапсулами (СН-2(mod)/Car)₃, наблюдают наиболее высокий титр антител. На 21-е сутки титры антител сывороток крови при иммунизации микрокапсулами (ДЕАЕ-dextran/Car)₃ были в 3-4 раза выше, чем в случае иммунизации микрокапсулами (PLL/Alg)₃.

Таблица 2 Титр антител при иммунизации мышей микрокапсулами разного состава, содержащими плазмиду pTKShi. Взятие крови, сутки Титр антител (PLL/Alg)₃ (ДЕАЕ-dextran/Car)₃ 14 1:800-1:1600 1:6400-1:12800 21 1:3200-1:6400 1:12800-1:25600

Как видно из табл. 2, при введении одинакового количества инкапсулированной плазмидной ДНК индукция антител зависела от композиционного состава микрокапсул и были в 3-4 раза выше, чем в случае иммунизации микрокапсулами (PLL/Alg)₃.

Сравнительная характеристика предлагаемого способа ДНК и прототипа представлена в таблице 3.

Таблица 3 Сравнительная характеристика способов доставки ДНК Этапы работы Предлагаемый способ Прототип Сорбция ДНК микрочастицами СаСО₃ 2,5 мин во время синтеза микрочастиц 20-22 часа при 4°С Количество сорбированной ДНК от исходной(%) 96-99,1 80-90 Полиэлектролитный состав мембраны покрытие мультислойной оболочкой DEAE-декстран / κ-каррагинан покрытие мультислой-ной оболочкой поли-L-лизин (PLL) / альгинат (Alg) Образование антител в сыворотках крови мышей при введении плазмид в микрокапсулах В 3-4 раза выше  

Использование предлагаемого способа получения микрокапсул для доставки ДНК в макроорганизм по сравнению с существующим способом имеет следующие преимущества:

1 - увеличивает количество сорбированной ДНК;

2 - значительно увеличивает прочность мультислойной оболочки микрокапсул за счет использования композиционного сочетания DEAE-декстран / κ-каррагинан;

3 - увеличивает синтез специфических антител в ответ на введение ДНК в микрокапсулах.

Источники информации

1. Mark E. Johnson, Sally Mossman, Tricia Cecil, Lawrence Evans, US 2002/0032165 A1 Mar. 14, 2002.

2. E.A.Markvicheva, E.Svrshchevskay, D.Volodkin, O.Selina, M.Gerstenberger, A.Batkoviak, G.Sukhorukov. Encapsulated protein and DNA delivery system for the development of vaccines against intracellular pathogens XII International Workshop on bioencapsulation, Vitoria, 2004, p.319-322.

3. Патент РФ 2336090, МПК С 12N 15/31. Способ доставки ДНК в макроорганизм для разработки вакцин и соматической генной терапии. В.И.Балышева, E.A.Марквичева, Н.Н.Власова, Сухоруков Г.Б., Сафиуллин Н.Ф, Селина О.Е. 2008 г.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Доставку ДНК в макроорганизм осуществляют в биосовместимых и биодеградируемых микрокапсулах, состоящих из мультислойных полимерных оболочек DEAE-декстран / κ-каррагинан, которые предохраняют ДНК от расщепления нуклеазами в процессе ее доставки в клетки организма. Сорбируют плазмидную ДНК пористыми частицами СаСО₃ методом соосаждения. Получают мультислойные оболочки путем поочередного наслоения DEAE-декстран и κ-каррагинан на пористые частицы СаСО₃. Помещают микрокапсулы в раствор 0,1М ЭДТА. Интенсивно перемешивают до полного растворения внутреннего ядра, состоящего из СаСО₃. Трижды промывают водой полученные микрокапсулы. Вводят в клетки животных путем инъекции. Способ увеличивает количество сорбированной ДНК до 96,0-99,1% и увеличивает прочность оболочки микрокапсулы. 3 табл.

Способ получения микрокапсул для доставки ДНК в макроорганизм, включающий сорбцию ДНК микрочастицами СаСО₃, образование семи слоев мультислойной полимерной оболочки, растворение внутреннего ядра СаСО₃, отличающийся тем, что сорбцию ДНК проводят одновременно с формированием частиц СаСО₃, а в качестве мультислойной полимерной оболочки используют DEAE-декстран/κ-каррагинан, при этом для образования первого слоя мультислойной оболочки микрочастицы после центрифугирования переносят в раствор κ-каррагинана, а для формирования второго, частицы помещают в раствор DEAE-декстрана, последовательность операций повторяют до образования семи слоев: K-D-K-D-K-D и наносят седьмой заключительный слой, состоящий из каппа-каррагинана.