ГЕМОСТАТИЧЕСКИЙ ПОРОШОК Российский патент 2024 года по МПК A61L15/22 A61L15/28 A61L15/32 A61K9/14 A61P7/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гемостатическому порошку, который содержит, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, содержащих:

частицы электрофильного полиоксазолина, содержащие электрофильный полиоксазолин, несущий по меньшей мере, 3 химически активных электрофильных группы, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и

частицы нуклеофильного полимера, содержащие нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных нуклеофильных группы, которые в присутствии воды могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером.

Когда гемостатический порошок по настоящему изобретению наносится на область кровотечения, агломераты частиц быстро формируют гель и в то же самое время связываются с белками, присутствующими в крови и в окружающей ткани, тем самым ускоряя гемостаз.

Уровень техники

Гемостаз представляет собой строго регулируемый процесс, который поддерживает поток крови через сосудистую систему одновременно с осуществлением тромботической реакции на повреждение ткан. Поддержание гемостаза требует сложного взаимодействия стенки сосуда, тромбоцитов и коагуляционной, и фибринолитической систем. Имеется две главных фазы гемостаза: первичная (то есть, клеточная фаза) и вторичная (то есть, гуморальная фаза).

Первоначальный гемостаз начинается непосредственно после разрушения эндотелия и характеризуется вазоконстрикцией, адгезией тромбоцитов и образованием мягкой агрегатной пробки. После того как происходит повреждение, происходит временное локальное сокращение гладких мышц сосудов и поток крови замедляется, способствуя адгезии и активации тромбоцитов. В пределах 20 секунд после повреждения, циркулирующий фактор фон Виллебранда присоединяется к субэндотелию в месте повреждения и прилипает к гликопротеинам на поверхности тромбоцитов. Когда тромбоциты прилипают к поврежденной поверхности, они активируются посредством контакта с коллаген-экспонирующими рецепторами, которые связывают циркулирующий фибриноген. Формируется мягкая пробка из агрегированных тромбоцитов и фибриногена. Это фаза гемостаза является короткоживущей, и мягкая пробка может легко быть сдвинута с поврежденной поверхности.

Мягкая пробка из тромбоцитов стабилизируется в ходе вторичного гемостаза с формированием сгустка. Вазоконстрикция и возникающее в результате уменьшение потока крови поддерживаются посредством секреции серотонина, простагландина и тромбоксана тромбоцитами в то время, когда инициируется каскад коагуляции. Каскад коагуляции представляет собой серию независимых реакций, включающих несколько белков плазмы, ионы кальция и тромбоциты крови, которые приводят к преобразованию фибриногена в фибрин. Факторы коагуляции продуцируются печенью и циркулируют в неактивной форме пока не инициируется каскад коагуляции. Затем каждая стадия каскада инициируется и осуществляется посредством ряда последовательных и зависимых реакций активации фактора коагуляции. На конечных стадиях, тромбин преобразует растворимый белок плазмы фибриноген в нерастворимый белок фибрин, при этом преобразуя одновременно фактор XIII в фактор XIIIa. Это преобразование фактора стабилизирует фибрин и приводит в результате к поперечной сшивке мономеров фибрина, с получением стабильного сгустка.

В ходе хирургической операции, важно поддерживать тонкий баланс между кровотечением и свертыванием так, чтобы кровь продолжала протекать в тканях в области хирургического вмешательства без избыточной потери крови, для оптимизации успеха хирургической операции и результата для пациента. Непрерывное кровотечение из диффузных малых капилляров или маленьких вен в ходе хирургической операции, может скрывать область хирургической операции, увеличивать время операции, повышать риск физиологических осложнений и экспонировать пациента для рисков, связанных с переливанием крови.

Хирурги имеют ряд возможностей для контроля кровотечения, включая механические и термические технологии и устройства, а также фармакотерапию и агенты местного применения.

Один из самых ранних гемостатических агентов местного применения представлял собой хлопок в форме марлевых губок. Хотя такие материалы концентрируют кровь и продукты коагуляции посредством физической адсорбции, они не поглощаются организмом, и при удалении, сгусток может сдвигаться, приводя к дальнейшему кровотечению. С тех пор разработаны поглощаемые гемостатические агенты местного применения, и они обеспечивают полезную вспомогательную терапию, когда обычные методы гемостаза являются неэффективными или непрактичными. Гемостатические агенты местного применения можно наносить непосредственно на область кровотечения и могут предотвращать непрерывное неослабевающее кровотечение. Гемостаз с использованием агентов местного применения также может предотвратить отрицательные воздействия системных гемостатических медицинских препаратов, такие как “нежелательные” сгустки крови. Кроме того, при хирургических процедурах, когда количество потерь крови является непредсказуемым, гемостатики местного применения можно использовать осторожно, когда потери крови минимальные, и более свободно в ходе острого кровотечения.

В настоящее время доступен ряд гемостатических агентов местного применения для использования в хирургии. Их можно разделить на две категории: те, которые обеспечивают свой механизм действия на каскад свертывания биологически активным образом, и те, которые действуют пассивно посредством контактной активации и ускорения агрегации тромбоцитов. Пассивные гемостатические агенты местного применения включают коллагены, целлюлозу и желатины, в то время как активные агенты включают тромбин и продукты, в которых тромбин объединяется с пассивным агентом для обеспечения активного объединенного продукта.

US 2003/0064109 описывает сухой гемостатический порошок, который приготавливают с помощью способа, включающего: получение водного раствора, содержащего желатин, объединенный, по меньшей мере, с одной добавкой для регидратации; сушку раствора с получением твердых продуктов; измельчение твердых продуктов с получением порошка; поперечную сшивку порошка; удаление, по меньшей мере, 50% (масс./масс.) добавки для регидратации и сушку поперечно сшитого желатина с получением порошка. Добавка для регидратации может содержать, по меньшей мере, один материал, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгиколя (PEG), поливинилпирролидона (PVP) и декстрана.

WO 2010/059280 описывает безводный волокнистый лист, содержащий первый компонент волокнистого полимера, указанный полимер содержит электрофильные группы или нуклеофильные группы, и второй компонент, который может поперечно сшиваться с первым компонентом, когда указанный лист экспонируется для водной среды в контакте с биологической тканью, с формированием поперечно сшитого гидрогеля, который является адгезивным для биологических тканей; где:

a) второй компонент представляет собой волокнистый полимер, имеющий структуру основной цепи такую же как у волокнистого полимера первого компонента или отличную от нее и содержит электрофильные группы, если первый компонент содержит нуклеофильные группы, или содержит нуклеофильные группы, если первый компонент содержит электрофильные группы;

b) второй компонент представляет собой покрытие на волокнистом полимере первого компонента и при этом указанное покрытие содержит электрофильные группы, если первый компонент содержит нуклеофильные группы, или нуклеофильные группы, если первый компонент содержит электрофильные группы; или

c) второй компонент представляет собой сухой порошок, диспергированный и удерживаемый во внутреннем пространстве волокнистого полимера первого компонента, где указанный порошок содержит электрофильные группы, если первый компонент содержит нуклеофильные группы, или нуклеофильные группы, если первый компонент содержит электрофильные группы.

US 2012/0021058 описывает способ приготовления гемостатической композиции, указанный способ включает: a) получение сухого гранулированного препарата биосовместимого полимера и b) нанесение покрытия на гранулы указанного сухого гранулированного препарата с помощью приготовления агента, вызывающего коагуляцию, такого как раствор тромбина. Биосовместимый полимер может выбираться из желатина, растворимого коллагена, альбумина, гемоглобина, фибриногена, фибрина, казеина, фибронектина, эластина, кератина, ламинина и их производных или сочетаний.

US 2013/0316974 описывает гемостатический материал, содержащий компактированный порошок ORC, содержащий частицы, имеющие среднее аспектное отношение примерно от 1 примерно до 18. Гемостатический материал может дополнительно содержать добавку, выбранную из полисахаридов, соли кальция, антибактериального агента, агента, ускоряющего гемостаз, желатина, коллагена,

US 2016/0271228 описывает гемостатическую композицию, содержащую:

гемостатический биосовместимый полимер в форме частиц, выбранный из группы, состоящей из белка, полисахарида, биологического полимера, небиологического полимера и их производных, и сочетаний, где гемостатический биосовместимый полимер в форме частиц присутствует как гранулированные частицы, имеющие медианный диаметр в пределах 50-700 мкм;

один гидрофильный агент для поперечной сшивки, содержащий электрофильные химически активные группы, где электрофильные химически активные группы поддерживают их химическую активность до тех пор, пока композиция экспонируется для крови пациента, где электрофильные химически активные группы конфигурируются для поперечной сшивки с белками крови пациента с формированием геля с изолирующими и гемостатическими свойствами; и

связующее вещество, которое не взаимодействует с электрофильными химически активными группами одного гидрофильного агента для поперечной сшивки;

где гемостатическая композиция имеет форму пасты.

WO 2012/057628 описывает набор для получения биосовместимого поперечно сшитого полимера, указанный набор содержит электрофильно активированный полиоксазолин (EL-POx), указанный EL-POX, содержит m электрофильных групп; и указанный нуклеофильный агент для поперечной сшивки содержит n нуклеофильных групп, где m электрофильных групп могут взаимодействовать с n нуклеофильными группами с образованием ковалентных связей; где m>2, n>2 и m+n >5; где, по меньшей мере, одна из m электрофильных групп представляет собой боковую электрофильную группу.

WO 2016/056901 описывает адгезивный гемостатический продукт, выбранный из сетки с покрытием, пены с покрытием или порошка с покрытием, указанный гемостатический продукт содержит:

пористую твердую подложку, имеющую пористость, по меньшей мере, 5% объем и содержащую наружную поверхность, которая содержит нуклеофильный полимер, содержащий химически активные нуклеофильные группы;

адгезивное покрытие, которое покрывает, по меньшей мере, часть твердой подложки, указанное покрытие содержит электрофильно активированный полиоксазолин (EL-POx), указанный EL-POx содержит в среднем, по меньшей мере, 1 химически активную электрофильную группу.

Сущность изобретения

Авторы разработали гемостатический порошок, который можно удобно использовать для контроля кровотечения в ходе хирургической операции, даже для крови с антикоагуляционной обработкой.

Гемостатический порошок по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, указанные агломераты частиц имеют диаметр в пределах 1-500 мкм и содержат:

частицы электрофильного полиоксазолина, содержащие электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных электрофильных группы, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и

частицы нуклеофильного полимера, содержащие водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных нуклеофильных группы, которые в присутствии воды могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером.

Когда его наносят на область кровотечения, гемостатический порошок по настоящему изобретению превращается в гель, при этом связывая в то же время белки, присутствующие в крови и в окружающей ткани. Выдающаяся способность гемостатического порошка останавливать кровотечение связана с очень активным индуцированным свертыванием крови и с формированием сгустка крови с сильным гелеобразованием, который прилипает к тканям. Гемостатический порошок можно легко распределять по области кровотечения. Дополнительный порошок можно добавлять, при необходимости, когда это будет формировать новый слой гелеобразного сгустка крови, который будет прилипать к лежащему под ним слою гелеобразных сгустков крови.

Хотя авторы не имеют желания ограничиваться теорией, считается, что, когда гемостатический порошок вступает в контакт с кровью, частицы электрофильного полиоксазолина, содержащие электрофильный полиоксазолин, быстро растворяются и одновременно с этим взаимодействуют с белками в крови и с химически активными нуклеофильными группами водорастворимого нуклеофильного полимера в частицах нуклеофильного полимера. В результате формируется слой гелеобразного сгустка крови. Растворенный электрофильный полиоксазолин будет также взаимодействовать с белками окружающей ткани в области кровотечения, тем самым фиксируя слой гелеобразного сгустка крови на ткани и изолируя область кровотечения.

По сравнению с частицами, содержащими молекулярную смесь электрофильного полиоксазолина и водорастворимого нуклеофильного полимера, агломераты частиц по настоящему изобретению дают то преимущество, что они обеспечивают лучшие свойства изоляции. Считается, что это связано с тем фактом, что, когда агломераты частиц вступают в контакт с кровью, электрофильный полиоксазолин взаимодействует с водорастворимым нуклеофильным полимером при относительно малой скорости, тем самым позволяя электрофильному полиоксазолину взаимодействовать не только с водорастворимым нуклеофильным полимером, но также с белками в крови и тканях в области кровотечения.

По сравнению с порошкообразной смесью, состоящей из частиц электрофильного полиоксазолина и частиц водорастворимого нуклеофильного полимера, агломераты частиц по настоящему изобретению дают то преимущество, что формируется более однородный, прочный гель. Считается, что очень однородная дисперсия электрофильного полиоксазолина и водорастворимого нуклеофильного полимера формируется, когда агломераты частиц вступают в контакт с кровью, и что однородный прочный гель формируется, когда полимерные компоненты растворяются в нем и начинают взаимодействовать.

Настоящее изобретение также предлагает способ приготовления гемостатических агломератов частиц из:

(a) частиц электрофильного полиоксазолина, содержащих электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных электрофильных группы, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и

(b) частиц нуклеофильного полимера, содержащих водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных нуклеофильных группы, которые могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером;

указанный способ включает стадию объединения 100 частей массовых частиц электрофильного полиоксазолина с 10-1000 частями массовыми частиц нуклеофильного полимера в присутствии неводной гранулирующей жидкости.

Авторы неожиданно обнаружили, что можно объединять электрофильный полиоксазолин и водорастворимый нуклеофильный полимер в одной частице при минимальных реакциях поперечной сшивки между ними и при минимальной деградации электрофильного полиоксазолина, с использованием неводной гранулирующей жидкости, в которой электрофильный полиоксазолин является нерастворимым и в которой нуклеофильный полимер растворим до некоторой степени. Хотя авторы не имеют желания ограничиваться теорией, считается, что использование неводной гранулирующей жидкости, в которой электрофильный полиоксазолин является нерастворимым, обеспечивает в ходе грануляции отсутствие реакций поперечной сшивки между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером. Также, и деградация (гидролиз) электрофильного полиоксазолина сводится к минимуму таким образом. В противоположность электрофильному полиоксазолину, некоторое количество нуклеофильного полимера будет растворяться в неводной гранулирующей жидкости, образуя при этом липкую массу, которая может склеивать вместе частицы электрофильного полиоксазолина и частицы нуклеофильного полимера.

Кроме того, предлагается биосовместимый гибкий гемостатический лист, содержащий:

структуру когезивного волокнистого носителя, содержащего трехмерное взаимосвязанное внутреннее пространство; и

распределенный во внутреннем пространстве гемостатический порошок по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к гемостатическому порошку, содержащему, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, указанные агломераты частиц имеют диаметр в пределах 1-500 мкм и содержат:

частицы электрофильного полиоксазолина, содержащие электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных электрофильных группы, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и

частицы нуклеофильного полимера, содержащие водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных нуклеофильных группы, которые в присутствии воды могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером.

Термин “агломерат частиц”, как используется в настоящем документе, относится к грануле, которая содержит две или больше частиц, которые все связаны вместе.

Термин "полиоксазолин", как используется в настоящем документе, относится к поли(N-ацилалкиленимину) или поли(ароилалкиленимину) и далее он упоминается как POx. Пример POx представляет собой поли(2-этил-2-оксазолин). Термин "полиоксазолин" также охватывает сополимеры POx.

Термин “водорастворимый нуклеофильный полимер”, как используется в настоящем документе, относится к нуклеофильновому полимеру, который имеет водорастворимость в деминерализованной воде при 20°C, при pH в пределах 3-7, по меньшей мере, 50 г/л. Хитозан представляет собой пример водорастворимого нуклеофильного полимера. Хитозан является водорастворимым в воде при pH<6. Для определения растворимости нуклеофильного полимера в воде при различных pH, pH деминерализованной воды регулируется с использованием хлористоводородной кислоты.

Термин “коллаген”, как используется в настоящем документе, относится к главному структурному белку во внеклеточном пространстве различных соединительных тканей организмов животных. Коллаген образует характерную тройную спираль из трех полипептидных цепей. В зависимости от степени минерализации, коллагеновые ткани могут быть либо жесткими (кости) либо податливыми (сухожилия) или иметь градиент от жесткости к податливости (хрящи). Если не указано иного, термин “коллаген” также охватывает модифицированные коллагены, иные чем желатин (например, поперечно сшитый коллаген).

Термин “желатин”, как используется в настоящем документе, относится к смеси пептидов и белков, получаемой посредством частичного гидролиза коллагена, экстрагируемого из кожи, костей и соединительных тканей животных, таких как домашний крупный рогатый скот, куры, свиньи и рыба. В ходе гидролиза, природные молекулярные связи между отдельными нитями коллагена разрушаются до формы, которая перегруппируется легче. Термин “желатин” как используется в настоящем документе также охватывает модифицированные желатины, такие как поперечно сшитые желатины и восстановленные поперечно сшитые желатины.

Термин “восстановленные поперечно сшитые желатины”, как используется в настоящем документе, относится к поперечно сшитому желатину, который частично гидролизован. Частичный гидролиз пептидных связей поперечно сшитого желатина может достигаться посредством, например, щелочной обработки. Гидролиз поперечно сшитого желатина дает в результате повышение плотности групп свободного карбоксила и свободного амина и повышенную водорастворимость.

Термин “гемостатический лист”, как используется в настоящем документе, если не указано иного, относится к листу, который может остановить кровотечение из поврежденной ткани. Гемостатический лист по настоящему изобретению может достичь гемостаза посредством превращения крови в гель и/или посредством формирования изоляции, которая закрывает область ранения.

Термин “водостойкий”, как используется в настоящем документе, по отношению к структуре волокнистого носителя, означает, что эта структура не является водонерастворимой и не разрушается в воде с образованием коллоидной дисперсии при условиях нейтрального pH (pH 7) и при температуре 37°C.

Термин “внутреннее пространство”, как используется в настоящем документе, относится к полому (“пустому”) пространству в структуре волокнистого носителя. Внутреннее пространство в структуре волокнистого носителя дает возможность для введения гемостатического порошка в структуру. Кровь и другие телесные жидкости также могут проникать во внутреннее пространство, тем самым давая возможность гемостатическому порошку для оказания его гемостатического воздействия и/или для придания гемостатическому листу адгезивности на тканях.

Термин “белок”, как используется в настоящем документе, если не указано иного, также охватывает поперечно сшитые и гидролизованные белки. Подобным же образом, если не указано иного, когда упоминаются конкретные виды белков, такие как желатин или коллаген, охватываются также гидролизованные и поперечно сшитые версии этих видов белков.

Распределение диаметров гемостатического порошка, агломератов частиц, частиц электрофильного полиоксазолина и частиц нуклеофильного полимера можно определять соответствующим образом посредством лазерной дифракции с использованием Malvern Mastersizer 2000 в сочетании с Stainless Steel Sample Dispersion Unit. Установку для диспергирования образцов заполняют приблизительно 120 мл циклогексана, который стабилизируют в течение 5-10 минут при скорости перемешивания 1800 об/мин, с последующим фоновым измерением (пустое измерение). Пробирку с образцом встряхивают и поворачивают горизонтально 20 раз. Затем примерно 50 мг диспергируют в установке для диспергирования образцов, содержащей циклогексан. После введения образца в установку для диспергирования, образец перемешивают в течение полутора минут при 1800 об/мин для обеспечения соответствующего диспергирования всех частиц, перед осуществлением измерения. Ультразвуковой обработки диспергированных частиц не производят. Средний размер частиц выражается как D[4.3], взвешенный по объему средний диаметр (Σn_iD_i⁴)/(Σn_iD_i³).

Кроме агломератов частиц, содержащих частицы электрофильного полиоксазолина и частицы нуклеофильного полимера, гемостатический порошок по настоящему изобретению, может содержать другие компоненты в виде частиц, например, биосовместимые (био)полимеры подобные Гельфоуму или крахмалу. Предпочтительно, гемостатический порошок содержит, по меньшей мере, 30% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 60% масс., а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 80% масс. агломератов частиц.

Агломераты частиц в гемостатическом порошке предпочтительно содержит, по меньшей мере, 10% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 25% масс., а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 40% масс. электрофильного полиоксазолина.

Нуклеофильный полимер предпочтительно содержится в агломератах частиц при концентрации, по меньшей мере, 10% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 12% масс., а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 30% масс.

Сочетание электрофильного полиоксазолина и нуклеофильного полимера, как правило, составляет, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц. Более предпочтительно, сочетание этих двух полимеров составляет, по меньшей мере, 50% масс., наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 75% масс. агломератов частиц.

Кроме электрофильного полиоксазолина и нуклеофильного полимера агломераты частиц могут содержать один или несколько других компонентов, например, полисахариды. Примеры полисахаридов, которые можно использовать включают амилозу, мальтодекстрин, амилопектин, крахмал, декстран, гиалуроновую кислоту, гепарин, хондроитин сульфат, дерматансульфат, гепарансульфат, кератансульфат, декстран сульфат, пентозан полисульфат, альгинат и их сочетания. Как правило, количество полисахарида в агломератах частиц не превышает 50% масс. Если полисахарид содержится в агломератах частиц, сочетание электрофильного полиоксазолина, нуклеофильного полимера и полисахарида предпочтительно составляет, по меньшей мере, 60% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 80% масс., а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% масс. агломератов частиц.

Согласно другому преимущественному варианту осуществления агломераты частиц содержат сухую буферную систему. Предпочтительно, буферная система имеет буферный pH в пределах 7-11, более предпочтительно, в пределах 8-10. Предпочтительно, буферная система имеет буферную емкость, по меньшей мере, 10 ммоль⋅л^-1⋅pH^-1. Более предпочтительно, буферная емкость составляет, по меньшей мере, 25 ммоль⋅л^-1⋅pH^-1, наиболее предпочтительно, буферная емкость составляет, по меньшей мере, 50 ммоль⋅л^-1⋅pH^-1. Примеры биосовместимых буферных систем, которые можно использовать в агломератах частиц, включают натрийфосфатный/натрийкарбонатный буфер; натрийборат-декагидратный буфер; белок в трис буфере; солевой раствор в буфере HEPES и натрийбикарбонатный/карбонатный буфер.

Как будет объясняться ниже, агломераты частиц по настоящему изобретению можно приготавливать без использования гранулирующего связующего, то есть компонента, который используют в ходе грануляции для обеспечения адгезии между частицами электрофильного полиоксазолина и частицами нуклеофильного полимера. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления, агломераты частиц не содержат гранулирующего связующего.

Гемостатический порошок по настоящему изобретению предпочтительно содержит, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, имеющих диаметр в пределах 1-200 мкм, более предпочтительно, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, имеющих диаметр в пределах 1-100 мкм, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, имеющих диаметр в пределах 1-75 мкм.

Гемостатический порошок предпочтительно имеет взвешенный по объему средний диаметр (D[4.3], (∑niD_i⁴)/(∑niD_i³)) в пределах 10-1000 мкм, более предпочтительно, в пределах 15-500 мкм, наиболее предпочтительно, в пределах 30-300 мкм.

Агломераты частиц в гемостатическом порошке предпочтительно имеют D[4.3] в пределах 10-200 мкм, более предпочтительно, в пределах 15-100 мкм, наиболее предпочтительно, в пределах 30-60 мкм.

Частицы электрофильного полиоксазолина в агломератах частиц предпочтительно имеют взвешенный по объему средний диаметр (D[4.3]) в пределах 1-100 мкм, более предпочтительно, в пределах 50-50 мкм, наиболее предпочтительно, в пределах 10-40 мкм.

Частицы нуклеофильного полимера в агломератах частиц предпочтительно имеют взвешенный по объему средний диаметр (D[4.3]) в пределах 10-300 мкм, более предпочтительно, в пределах 15-200 мкм, наиболее предпочтительно, в пределах 20-100 мкм.

Частицы электрофильного полиоксазолина предпочтительно содержит, по меньшей мере, 30% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 50% масс., а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 80% масс. электрофильного полиоксазолина.

Электрофильный полиоксазолин предпочтительно имеет растворимость в дистиллированной воде при 20°C, по меньшей мере, 100 г/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 300 г/л.

Электрофильный полиоксазолин предпочтительно имеет растворимость в изопропиловом спирте при 20°C меньше 10 мг/л, более предпочтительно, меньше 5 мг/л, а наиболее предпочтительно, меньше 1 мг/л.

Электрофильный полиоксазолин предпочтительно имеет молекулярную массу, по меньшей мере, 2 кДа. Более предпочтительно, электрофильный полиоксазолин имеет молекулярную массу от 5 до 200 кДа, наиболее предпочтительно, от 10 до 100 кДа.

Как объясняется в настоящем документе ранее, авторы обнаружили способ объединения электрофильного полиоксазолина и водорастворимого нуклеофильного полимера в одной частице при минимальных реакциях поперечной сшивки между ними, и при минимальной деградации электрофильного полиоксазолина. Соответственно, в очень предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению, электрофильный полиоксазолин в агломератах частиц имеет коэффициент полидисперсности (PDI) меньше 2,0, более предпочтительно, меньше 1,8, а наиболее предпочтительно, меньше 1,5.

Электрофильный полиоксазолин предпочтительно содержит, по меньшей мере, 4 химически активных электрофильных группы, более предпочтительно, по меньшей мере, 8 химически активных электрофильных групп, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 16 химически активных электрофильных групп, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 32 химически активных электрофильных группы.

Электрофильный полиоксазолин, как правило, несет в среднем, по меньшей мере, 10, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 химически активных электрофильных групп.

Электрофильный полиоксазолин предпочтительно получают из полиоксазолина, у которого повторяющиеся единицы представлены следующей формулой (I):

(CHR¹)_mNCOR²

где R², и каждый из R¹ независимо выбирают из H, необязательно замещенного C_1-22 алкила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного аралкила, необязательно замещенного арила; и m равен 2 или 3.

Предпочтительно, R¹ и R² в формуле (I) выбирают из H и C_1-8 алкила, еще более предпочтительно, из H и C_1-4 алкила. R¹ наиболее предпочтительно представляет собой H. Целое число m в формуле (I) предпочтительно равно 2.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, полиоксазолин представляет собой полимер, еще более предпочтительно, гомополимер 2-алкил-2-оксазолина, указанный 2-алкил-2-оксазолин выбирают из 2-метил-2-оксазолина, 2-этил-2-оксазолина, 2-пропил-2-оксазолина, 2-бутил-2-оксазолина и из их сочетания. Предпочтительно, полиоксазолин представляет собой гомополимер 2-пропил-2-оксазолина или 2-этил-оксазолина. Наиболее предпочтительно, полиоксазолин представляет собой гомополимер 2-этил-оксазолина.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, электрофильный полиоксазолин содержит, по меньшей мере, 20 единиц оксазолина, более предпочтительно, по меньшей мере, 30 единиц оксазолина, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 80 единиц оксазолина. Электрофильный полиоксазолин предпочтительно содержит в среднем, по меньшей мере, 0,05 химически активной электрофильной группы на оксазолиновый остаток. Еще более предпочтительно, электрофильный полиоксазолин содержит в среднем, по меньшей мере, 0,1 химически активной электрофильной группы на оксазолиновый остаток. Наиболее предпочтительно, электрофильный полиоксазолин содержит в среднем 0,12-0,5 химически активной электрофильной группы на оксазолиновый остаток.

Полиоксазолин может нести химически активные электрофильные группы в своих боковых цепях (боковые химически активные электрофильные группы), на своих окончаниях или там и там. Электрофильный полиоксазолин, который используется по настоящему изобретению, преимущественно содержит одну или несколько боковых химически активных электрофильных групп. Как правило, электрофильный полиоксазолин содержит 0,03-0,5 боковой химически активной электрофильной группы на мономер, более предпочтительно, 0,04-0,35 боковой химически активной электрофильной группы на мономер, еще более предпочтительно, 0,05-0,25 боковой химически активной электрофильной группы на мономер.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, химически активные электрофильные группы электрофильного полиоксазолина выбирают из сложных эфиров карбоновых кислот, сложных сульфонатных эфиров, сложных фосфонатных эфиров, сложных пентафторфениловых эфиров, сложных п-нитрофениловых эфиров, сложных п-нитротиофениловых эфиров, групп галогенангидридов, ангидридов, кетонов, альдегидов, изоцианато, тиоизоцианато, изоциано, эпоксидов, активированных гидроксильных групп, олефинов, простых глицидиловых эфиров, карбоксила, сложных сукцинимидиловых эфиров, сложных сульфосукцинимидиловых эфиров, малеимидо (малеимидил), этенсульфонила, сложных имидо эфиров, ацетоацетата, галогенацеталя, ортопиридилдисульфида, дигидроксифениловых производных, винила, акрилата, акриламида, йодацетамида и их сочетаний. Более предпочтительно, химически активные электрофильные группы выбирают из сложных эфиров карбоновых кислот, сложных сульфонатных эфиров, сложных фосфонатных эфиров, сложных пентафторфениловых эфиров, сложных п-нитрофениловых эфиров, сложных п-нитротиофениловых эфиров, групп галогенангидридов, ангидридов, кетонов, альдегидов, изоцианато, тиоизоцианато, изоциано, эпоксидов, активированных гидроксильных групп, олефинов, простых глицидиловых эфиров, карбоксила, сложных сукцинимидиловых эфиров, сложных сульфосукцинимидиловых эфиров, сложных имидо эфиров, дигидрокси-фенил производные, и их сочетания. Еще более предпочтительно, химически активные электрофильные группы выбирают из галогенацеталей, ортопиридилдисульфида, малеимидов, винилсульфона, дигидроксифениловых производных, винила, акрилата, акриламида, йодацетамида, сложных сукцинимидиловых эфиров и их сочетаний. Наиболее предпочтительно, химически активные электрофильные группы выбирают из малеимидов, винила, акрилата, акриламида, сложных сукцинимидиловых эфиров, сложных сульфосукцинимидиловых эфиров и их сочетаний.

Примеры сложных сукцинимидиловых эфиров, которые можно использовать, включают сукцинимидилглутарат, сукцинимидилпропионат, сукцинимидилсукцинамид, сукцинимидилкарбонат, дисукцинимидилсуберат, бис(сульфосукцинимидил)суберат, дитиобис(сукцинимидилпропионат), бис(2-сукцинимидооксикарбонилокси)этилсульфон, 3,3'-дитиобис(сульфосукцинимидил-пропионат), сукцинимидилкарбамат, сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат, бис(сульфосукцинимидил)суберат, сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-l-карбоксилат, дитиобис-сульфосукцинимидилпропионат, дисульфо-сукцинимидилтартрат; бис[2-(сульфо-сукцинимидилоксикарбонилоксиэтилсульфон)], этиленгликоль бис(сульфосукцинимидилсукцинат), дитиобис-(сукцинимидил пропионат).

Примеры дигидроксифениловых производных, которые можно использовать, включают дигидроксифенилаланин, 3,4-дигидроксифенилаланин (DOPA), допамин, 3,4-дигидроксигидроксикоричную кислота (DOHA), норэпинефрин, эпинефрин и катехол.

Водорастворимый нуклеофильный полимер, который содержится в частицах нуклеофильного полимера, предпочтительно имеет растворимость в деминерализованной воде при 20°C, при pH в пределах от 3 до 7, по меньшей мере, 100 г/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 150 г/л, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 200 г/л. Настоящее изобретение может соответствующим образом использовать нуклеофильный полимер, который является растворимым при кислотных pH, если электрофильный полиоксазолин высвобождает кислотные вещества, когда он взаимодействует с компонентами крови, ткани и/или с нуклеофильным полимером. Это происходит, например, когда электрофильный полиоксазолин содержит N-гидроксисукцинимидные группы.

Частицы нуклеофильного полимера предпочтительно содержат, по меньшей мере, 30% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 50% масс., а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 80% масс. нуклеофильного полимера.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, водорастворимый нуклеофильный полимер, который используется в агломератах частиц, растворяется в воде относительно медленно. Как объясняется в настоящем документе ранее, считается, что, когда электрофильный полиоксазолин взаимодействует с водорастворимым нуклеофильным полимером при относительно малой скорости, электрофильный полиоксазолин может также взаимодействовать с белками в крови и ткани в области кровотечения. При использовании водорастворимого нуклеофильного полимера, который растворяется относительно медленно, растворенный электрофильный полиоксазолин имеет возможность для взаимодействия с белками в крови и тканях, а также с (медленно) водорастворимым нуклеофильным полимером, при этом образуется прочный однородный герметизирующий гель.

Водорастворимые нуклеофильные полимеры, имеющие высокую молекулярную массу, имеют тенденцию к относительно медленному растворению в воде. Соответственно, в очень предпочтительном варианте осуществления, водорастворимый нуклеофильный полимер, который содержится в частицах нуклеофильного полимера, имеет молекулярную массу, по меньшей мере, 3 кДа, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 кДа, а наиболее предпочтительно, от 20 до 3000 кДа.

Нуклеофильный полимер предпочтительно содержит, по меньшей мере, 4 химически активных нуклеофильных группы, более предпочтительно, по меньшей мере, 8 химически активных нуклеофильных групп, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10 химически активных нуклеофильных групп. Наиболее предпочтительно, эти химически активные нуклеофильные группы представляют собой аминовые группы, наиболее предпочтительно, первичные аминовые группы.

Примеры водорастворимых нуклеофильных полимеров, которые могут соответствующим образом использоваться в частицах нуклеофильного полимера, включают белок, хитозан, нуклеофильный полиоксазолин, нуклеофильный полиэтиленгиколь, полиэтиленимин и их сочетания. Более предпочтительно, нуклеофильный полимер выбирается из желатина, коллагена, хитозана, нуклеофильного полиоксазолина и их сочетаний.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, используемые частицы нуклеофильного полимера по настоящему изобретению обеспечивают гемостаз посредством ускорения процесса коагуляции. Коллаген может активировать собственный путь каскада коагуляции. Коллаген имеет большую площадь поверхности, которая действует как матрица для активации, агрегации и образования тромба из тромбоцитов. Частицы желатина могут ограничивать поток крови и обеспечивать матрицу для формирования сгустка. Соответственно, в очень предпочтительном варианте осуществления, нуклеофильный полимер выбирается из желатина, коллагена и их сочетаний. Наиболее предпочтительно, нуклеофильный полимер представляет собой желатин, еще более предпочтительно, поперечно сшитый желатин.

Поперечно сшитый желатин, предпочтительно имеет молекулярную массу в пределах 30-3000 кДа, более предпочтительно, в пределах 400-2000 кДа, наиболее предпочтительно, в пределах 500-1500 кДа.

Среднее содержание первичных аминов поперечно сшитого желатина находится в пределах 5×10^-4-2×10^-2 мкмоль, более предпочтительно, 1,0×10^-3-1,0×10^-2 мкмоль первичного амина на мкг восстановленного поперечно сшитого желатина.

Согласно другому преимущественному варианту осуществления, нуклеофильный полимер представляет собой нуклеофильный полиэтиленгиколь (PEG). Предпочтительно, нуклеофильный PEG содержит, по меньшей мере, 3, более предпочтительно, по меньшей мере, 5, а наиболее предпочтительно, 8 химически активных нуклеофильных групп.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, нуклеофильный полимер представляет собой хитозан. Хитозан представляет собой биодеградируемое нетоксичное сложное углеводное производное хитина (поли-N-ацетил-D-глюкозамин), встречающееся в природе вещество. Хитозан представляет собой деацетилированную форму хитина. Хитозан, применяемый по настоящему изобретению, предпочтительно имеет степень деацетилирования больше 70%. Хитозан, используемый по настоящему изобретению, предпочтительно имеет молекулярную массу, по меньшей мере, 5 кДа, более предпочтительно, 10-10000 кДа.

Согласно другому очень преимущественному варианту осуществления, нуклеофильный полимер представляет собой нуклеофильный полиоксазолин. Предпочтительно, нуклеофильный полиоксазолин содержит, по меньшей мере, 3 более предпочтительно, по меньшей мере, 5, а наиболее предпочтительно, 8-20 химически активных нуклеофильных групп.

По сравнению с встречающимися в природе нуклеофильными биополимерами, такими как желатин, коллаген и хитозан, использование синтетических нуклеофильных полимеров, таких как нуклеофильный полиоксазолин и нуклеофильный PEG, дает то преимущество, что агломераты частиц, содержащие эти синтетические нуклеофильные полимеры, проявляют более предсказуемое (воспроизводимые) гемостатические свойства.

Химически активные нуклеофильные группы водорастворимого нуклеофильного полимера предпочтительно выбирают из аминовых групп, тиольных групп и их сочетаний.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, водорастворимый нуклеофильный полимер содержит две или более аминовых группы и химически активные электрофильные группы в электрофильном полиоксазолине выбирают из сложных эфиров карбоновых кислот, сложных сульфонатных эфиров, сложных фосфонатных эфиров, сложных пентафторфениловых эфиров, сложных п-нитрофениловых эфиров, сложных п-нитротиофениловых эфиров, групп галогенангидридов, ангидридов, кетонов, альдегидов, изоцианато, тиоизоцианато, изоциано, эпоксидов, активированных гидроксильных групп, простых глицидиловых эфиров, карбоксила, сложных сукцинимидиловых эфиров, сложных сульфосукцинимидиловых эфиров, сложных имидо эфиров, дигидроксифениловых производных и их сочетаний.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, водорастворимый нуклеофильный полимер содержит две или более тиольных групп и химически активные электрофильные группы электрофильного полиоксазолина выбирают из галогенацеталей, ортопиридилдисульфида, малеимидов, винилсульфона, дигидроксифениловых производных, винила, акрилата, акриламида, йодацетамида, сложных сукцинимидиловых эфиров, сложных сульфосукцинимидиловых эфиров и их сочетаний. Более предпочтительно, химически активные электрофильные группы выбирают из сложных сукцинимидиловых эфиров, сложных сульфосукцинимидиловых эфиров, галогенацеталей, малеимидов или дигидроксифениловых производных и их сочетаний. Наиболее предпочтительно, химически активные электрофильные группы выбирают из малеимидов или дигидроксифениловых производных и их сочетаний.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, отношение общего количества химически активных электрофильных групп, обеспечиваемых электрофильным полиоксазолином, и общего количества химически активных нуклеофильных группы, обеспечиваемых нуклеофильный полимером, находится в пределах 1:1,5-1,5:1, более предпочтительно, в пределах 1:1,2-1,2:1, а наиболее предпочтительно, в пределах 1:1,1-1,1:1.

Авторы неожиданно обнаружили, что агломераты частиц, показывающие превосходную адгезию к органам, таким как селезенка и почки, можно получить, если агломераты частиц содержат 1-20% масс., более предпочтительно, 2,5-15% масс., а наиболее предпочтительно, 5-10% масс. химически неактивного неионного полимера. Этот химически неактивный неионный полимер не содержит химически активных электрофильных групп или химически активных нуклеофильных групп.

В очень предпочтительном варианте осуществления, агломерированные частицы покрыты химически неактивным неионным полимером.

Химически неактивный неионный полимер предпочтительно имеет температуру плавления в пределах 40-70°C, более предпочтительно, в пределах 45-65°C, а наиболее предпочтительно, в пределах 50-60°C. Здесь температура плавления относится к температуре, при которой полимер полностью расплавляется.

Примеры химически неактивных неионных полимеров, которые можно соответствующим образом применять в агломератах частиц по настоящему изобретению, включают полоксамеры, полиэтиленгликоли и их сочетаний. Полоксамер представляет собой неионный трехблоковый сополимер, состоящий из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)) с двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)) на концах, и он представлен формулой (I)

где a представляет собой целое число от 10 до 110 и b представляет собой целое число от 20 до 60. Когда a равно 80 и b равно 27, этот полимер известен как полоксамер 188. Другие известные полоксамеры пригодные для использования в настоящем изобретении представляют собой полоксамер 237 (a=64; и b=37), полоксамер 338 (a=141; и b=44) и полоксамер 407 (a=101; и b=56). Другие полоксамеры, которые известны и могут быть пригодными для использования по настоящему изобретению, включают полоксамер 108, полоксамер 182, полоксамер 183, полоксамер 212, полоксамер 217, полоксамер 238, полоксамер 288, полоксамер 331, полоксамер 338 и полоксамер 335.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, химически неактивный неионный полимер представляет собой полоксамер, еще более предпочтительно, полоксамер, имеющий среднюю молекулярную массу 2000-18000, наиболее предпочтительно полоксамер, имеющий среднюю молекулярную массу 7000-10000.

Полоксамер, наносимый на агломераты частиц, предпочтительно является твердым при комнатной температуре.

В другом преимущественном варианте осуществления, гемостатический порошок по настоящему изобретению является биопоглощаемым, делая возможным использование порошка в абдоминальной хирургии.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления агломератов гемостатических частиц из:

(a) частиц электрофильного полиоксазолина, содержащих электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных электрофильных группы, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и

(b) частиц нуклеофильного полимера, содержащих водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активных нуклеофильных группы, которые могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером;

указанный способ включает объединение 100 частей массовых частиц электрофильного полиоксазолина с 10-1000 частями массовыми частиц нуклеофильного полимера в присутствии неводной гранулирующей жидкости.

Частицы электрофильного полиоксазолина, которые используют в настоящем способе, предпочтительно являются идентичными частицам электрофильного полимера, описанным в настоящем документе ранее. Подобным же образом, частицы нуклеофильного полимера, которые используют, предпочтительно являются идентичными частицам нуклеофильного полимера, описанным в настоящем документе ранее.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, как частицы электрофильного полиоксазолина, так и частицы нуклеофильного полимера, которые используют в способе по настоящему изобретению, имеют содержание воды меньше 2% масс., более предпочтительно, меньше 1% масс. Для достижения такого низкого содержания воды, может быть необходимой сушка полимерных частиц перед грануляцией.

Электрофильный полиоксазолин предпочтительно имеет растворимость в неводной гранулирующей жидкостью при 20°C меньше 1 мг/л, более предпочтительно, меньше 0,5 мг/л, еще более предпочтительно, меньше 0,2 мг/л, а наиболее предпочтительно, меньше 0,1 мг/л.

Нуклеофильный полимер предпочтительно имеет растворимость в неводной гранулирующей жидкостью при 20°C, по меньшей мере, 5 мг/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 мг/л, еще более предпочтительно, 20-200 мг/л, а наиболее предпочтительно 40-150 мг/л.

В предпочтительном варианте осуществления, способ включает объединение 100 частей массовых частиц электрофильного полиоксазолина с 20-400 частями массовыми, более предпочтительно, 50-200 частями массовыми частиц нуклеофильного полимера, в присутствии неводной гранулирующей жидкости.

Количество неводной гранулирующей жидкости, используемой в настоящем способе, предпочтительно находится в пределах 0,5-5% масс. от объединенного количества частиц электрофильного полиоксазолина и частиц нуклеофильного полимера, которые используются в способе. Более предпочтительно, количество используемой неводной гранулирующей жидкости находится в пределах 1-4%, наиболее предпочтительно, 1,5-3% масс. от объединенного количества частиц электрофильного полиоксазолина и частиц нуклеофильного полимера.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, способ включает стадию смачивания частиц электрофильного полиоксазолина неводной гранулирующей жидкостью, с последующей стадией объединения смоченных частиц полиоксазолина с частицами нуклеофильного полимера. Этот конкретный вариант осуществления предлагает то преимущество, что он дает гранулят, который является очень однородным в терминах размеров частиц и композиции.

Частицы электрофильного полиоксазолина, используемые при приготовлении смеси порошка, предпочтительно имеют взвешенный по объему средний диаметр (D[4.3]) в пределах 1-100 мкм, более предпочтительно, в пределах 50-50 мкм, наиболее предпочтительно, в пределах 10-40 мкм.

Взвешенный по объему средний диаметр (D[4.3]) частиц нуклеофильного полимера, используемых при приготовлении смеси порошка, предпочтительно находится в пределах 10-300 мкм, более предпочтительно, в пределах 15-200 мкм, наиболее предпочтительно, в пределах 20-100 мкм.

Агломерированный порошок, который получают с помощью настоящего способа, предпочтительно имеет взвешенный по объему средний диаметр (D[4.3]) в пределах 12-1000 мкм, более предпочтительно, в пределах 20-500 мкм, наиболее предпочтительно, в пределах 30-300 мкм.

Неводная гранулирующая жидкость, используемая при влажной грануляции, предпочтительно содержит, по меньшей мере, 60% масс. органического растворителя, выбранного из изопропилового спирта, этанола, метанола, простого диэтилового эфира, гептана, гексана, пентана, циклогексана, дихлорметана, ацетона и их смесей. Более предпочтительно, неводная гранулирующая жидкость содержит, по меньшей мере, 60% масс., наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 85% масс. органического растворителя, выбранного из изопропилового спирта, этанола и их смесей. Еще более предпочтительно, неводная гранулирующая жидкость содержит, по меньшей мере, 60% масс., наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 85% масс. изопропилового спирта.

Неводная гранулирующая жидкость предпочтительно содержит не более 1% масс. воды, более предпочтительно, не более 0,1% масс. воды.

Способ по настоящему изобретению предлагает то преимущество, что он не требует использования гранулирующего связующего. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления способа, гранулирующее связующее не используется. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, единственные материалы, используемые в способе приготовления, представляют собой частицы электрофильного полиоксазолина, частицы нуклеофильного полимера и неводную гранулирующую жидкость.

Агломераты частиц по настоящему изобретению могут преимущественно наноситься на гемостатические листы для улучшения их гемостатических свойств. Соответственно, еще один аспект настоящего изобретения относится к биосовместимому гибкому гемостатическому листу, содержащему:

структуру когезивного волокнистого носителя, содержащую трехмерное взаимосвязанное внутреннее пространство и

распределенный во внутреннем пространстве гемостатический порошок, как описано в настоящем документе ранее.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, структура когезивного волокнистого носителя является водостойкой.

Электрофильный полиоксазолин в гемостатическом порошке, который распределяется по структуре волокнистого носителя, растворяется быстрее, когда лист вступает в контакт с кровью или другой водной телесной жидкостью, которая может проникать во внутреннее пространство. Таким образом, при наложении листа на область ранения, происходит быстрая ковалентная поперечная сшивка между электрофильным полиоксазолином, с одной стороны, и нуклеофильным полимером в частицах нуклеофильного полимера, белками крови и тканями, с другой стороны, приводящая к образованию геля, который изолирует поверхность раны и останавливает кровотечение, и дополнительно приводит к прочной адгезии гемостатического листа на ткани. Хитозан, наносимый по настоящему изобретению, предпочтительно имеет степень деацетилирования больше 70%. Водостойкая структура волокнистого носителя обеспечивает механическую прочность в ходе и после него, и предотвращает избыточное набухание.

Поскольку электрофильный полиоксазолин и нуклеофильный полимер содержатся в одной частице, это обеспечивает то, что эти два химически активных компонента можно однородно распределять в гемостатическом листе, что не происходит сегрегации в ходе транспортировки и манипуляций и что эти компоненты могут непосредственно взаимодействовать друг с другом, когда агломераты частиц вступают в контакт с кровью.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, гемостатический лист по настоящему изобретению является биопоглощаемым, это означает, что структура носителя, агломераты частиц и любые другие компоненты гемостатического листа в конечном счете поглощаются в организме. Поглощение структуры носителя и агломератов частиц, как правило, требует химического разложения (например, гидролиза) полимеров, содержащихся в нем. Полное биопоглощение гемостатического листа организмом человека, как правило, достигается через 1-10 недель, предпочтительно, через 2-8 недель.

Гемостатический лист по настоящему изобретению, как правило, имеет среднюю толщину без сжатия 0,5-25 мм. Более предпочтительно, средняя толщина без сжатия находится в пределах 1-10 мм, наиболее предпочтительно, в пределах 1,5-5 мм.

Размеры гемостатического листа предпочтительно являются такими, что верх и низ листа, каждый, имеет площадь поверхности, по меньшей мере, 2 см², более предпочтительно, по меньшей мере, 10 см, а наиболее предпочтительно, 25-50 см². Как правило, лист имеет прямоугольную форму и имеет длину 25-200 мм и ширину 25-200 мм.

Гемостатический лист предпочтительно имеет плотность без сжатия меньше 200 мг/см³, более предпочтительно, меньше 150 мг/см³, а наиболее предпочтительно 10-100 мг/см³.

Гемостатический лист по настоящему изобретению предпочтительно является по существу безводным. Как правило, гемостатический лист имеет содержание воды не более 5% масс., более предпочтительно, не более 2% масс., а наиболее предпочтительно, не более 1% масс.

Емкость поглощения воды гемостатического листа предпочтительно составляет, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, находится в пределах от 100% до 800%, наиболее предпочтительно, в пределах от 200% до 500%.

Гемостатический лист по настоящему изобретению является предпочтительно стерильным.

Использование структуры волокнистого носителя в гемостатическом листе по настоящему изобретению дает то преимущество, что гемостатический порошок можно однородно распределить по этой структуре носителя без сложностей. Такого однородного распределения гораздо сложнее достичь, например, в структурах вспененных носителей.

Волокна в структуре волокнистого носителя предпочтительно имеют средний диаметр 1-500 мкм, более предпочтительно, 2-300 мкм, а наиболее предпочтительно, 5-200 мкм. Средний диаметр волокон можно соответствующим образом определить с использованием микроскопа.

Как правило, по меньшей мере, 50% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 80% масс. волокон в структуре волокнистого носителя имеют диаметр 1-300 мкм и длину, по меньшей мере, 1 мм.

Предпочтительно, по меньшей мере, 50% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 80% масс. волокон в структуре волокнистого носителя имеет аспектное отношение (отношение длины к диаметру), по меньшей мере, 1000.

Структура волокнистого носителя, которая используется по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой структуру войлока, тканую структуру или вязаную структуру. Наиболее предпочтительно, структура волокнистого носителя представляет собой структуру войлока. В настоящем документе термин “структура войлока” относится к структуре, которую получают посредством валяния и прессования волокон вместе с формированием когезивных материалов.

Структура волокнистого носителя предпочтительно содержит, по меньшей мере, 50% масс., более предпочтительно, по меньшей мере, 80% масс., а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% масс. волокон, содержащих желатин, коллаген, целлюлозу, модифицированную целлюлозу, карбоксиметилдекстран, PLGA, гиалуронат натрия/карбоксиметилцеллюлозу, поливиниловый спирт, хитозан или их сочетание.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, структура волокнистого носителя не содержит окисленной регенерированной целлюлозы.

Предпочтительные структуры волокнистого носителя имеют структуру открытых пор с проницаемостью для воздуха, по меньшей мере, 0,1 л/мин × см², более предпочтительно, по меньшей мере, 0,5 л/мин × см². Проницаемость для воздуха определяется согласно EN ISO 9237:1995 (Textiles - Determination of permeability of fabrics to air).

Волокна в структуре волокнистого носителя можно получить с помощью способов, известных в данной области, таких как электропрядение, электроаэродинамическое прядение и прядение с помощью высокоскоростного роторного распылителя. Получение структуры волокнистого носителя посредством прядения с помощью высокоскоростного роторного распылителя описано в US 2015/0010612. Можно также использовать коммерчески доступные гемостатические волокнистые листы в качестве структуры волокнистого носителя.

Гемостатический порошок предпочтительно присутствует в гемостатическом листе по настоящему изобретению в количестве 5-90%, более предпочтительно, 10-80%, еще более предпочтительно, 20-75%, а наиболее предпочтительно, 50-70% масс. от структуры волокнистого носителя.

Затем настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Как правило: когда в явном виде не рассматривается содержание остаточной влажности после сушки (то есть, остаточная вода в высушенном порошке, грануляте и/или в структурах когезивных волокнистых носителей), ее уровни ниже 2,0% масс./масс.

Приготовление NHS-POx

Терполимер поли[2-(этил/гидрокси-этил-амид-этил/NHS-сложного эфира-этил-сложного эфира-этил-амид-этил)-2-оксазолина] с активированной боковой цепью NHS, содержащей 20% NHS-сложноэфирных групп (= EL-POx, 20% NHS), синтезируют следующим образом:

Сополимер поли[2-(этил/метокси-карбонил-этил)-2-оксазолина](DP=+/-100) синтезируют посредством CROP, используя 60% 2-этил-2-оксазолина (EtOx) и 40% 2-метоксикарбонил-этил-2-оксазолина (MestOx). Получают неупорядоченный сополимер, содержащий 40% 2-метоксикарбонил-этильных групп (¹H-ЯМР). Затем, полимер, содержащий 40% 2-метоксикарбонил-этильных групп (¹H-ЯМР), взаимодействует с этаноламином с получением сополимера с 40% 2-гидрокси-этил-амид-этильных групп (¹H-ЯМР). После этого, половина 2-гидрокси-этил-амид-этильных групп взаимодействует с янтарным ангидридом, с получением терполимера с 60% 2-этильных групп, 20% 2-гидрокси-этил-амид-этильных групп и 20% 2-карбокси-этил-сложноэфирных-этил-амид-этильных групп согласно ¹H-ЯМР. Наконец, 2-карбокси-этил-сложноэфирные-этил-амид-этильные группы активируются с помощью N-гидроксисукцинимида (NHS) и диизопропилкарбодиимида (DIC), с получением EL-POx, 20% NHS. NHS-POx растворяют в пределах 2-8°C в воде (60 г в 300 мл), охлаждают при минус 80°C в течение получаса и сушат вымораживанием. Высушенный вымораживанием порошок, полученный таким образом, сушат в Rotavap при 40°C до получения содержания воды ниже 0,8% масс./масс., как определено с помощью титрования Карла Фишера. Этот сухой (белый) порошок перемалывают с использованием шаровой мельницы (Retch MM400) до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 40 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Сушка порошка NHS-POx

20 г порошка NHS-POx растворяют в воде и смешивают с 50 мг Brilliant Blue FCF (Sigma Aldrich) с использованием высокопроизвоводительного диспергирующего инструмента (Ultra-Turrax, IKA). Сразу после перемешивания (2 минуты) раствор замораживают при -78°C и затем сушат вымораживанием в течение ночи. Высушенный вымораживанием порошок, полученный таким образом, сушат в Rotavap при 40°C до тех пор, пока остаточное содержание воды не станет ниже 0,8% масс./масс., как определено с помощью титрования Карла Фишера. Затем высушенный (голубой) порошок перемалывают с использованием шаровой мельницы (Retch MM400) до тех пор, пока не будет получен окрашенный голубым цветом порошок NHS-POx, имеющий средний размер частиц не больше 40 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Воздействие поперечно сшитого NHS-POx на PDI (коэффициент полидисперсности)

Приготавливают 80 мкг/мл раствора 2,2’-(этилендиокси)-бис-(этиламина) (EDEA, Aldrich, Mw 148,2) в смеси дихлорметана (DCM) и изопропанола (IPA) посредством растворения 80 мг EDEA в 10 мл DCM/IPA 95:5 (объем/объем). Этот раствор разбавляют в 10 раз DCM/IPA 95:5 (объем/объем) и добавляют 26,8 мкл раствора EDEA к 100 мкл 0,5-г/мл раствора NHS-POx в DCM/IPA 95:5 (объем/объем), что соответствует 0,05% моль аминовых групп относительно групп NHS. Непосредственно после добавления раствора EDEA, реакционную смесь тщательно перемешивают с использованием вихревого смесителя. Реакционную смесь перемешивают при 40°C в течение 3 час и удаляют все летучие продукты с помощью роторного испарителя при пониженном давлении.

Высушенный образец разбавляют в N, N-диметилацетамиде, содержащем 50 мМ хлорида лития, мобильной фазе для эксклюзионной хроматографии (SEC). SEC измеряют по сравнению с поли(метилметакрилатными) стандартами. Из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет более чем 2,5.

0,5 г/мл раствор NHS-POx в DCM/IPA 95:5 (объем/объем), без добавления EDEA, следуя такой же процедуре SEC, дает в результате PDI 1,5, указывая, что только 0,05% моль поперечной сшивки групп NHS уже дает в результате значительное увеличение PDI полимера.

Приготовление NU-POx

Полиоксазолин, содержащий этильные и аминовые группы в алкильной боковой цепи, синтезируют с помощью CROP из EtOx и MestOx и последующего амидирования боковых цепей сложного метилового эфира с помощью этилендиамина с получением сополимера поли(2-этил/аминоэтиламидоэтил-2-оксазолина) (NU-POx). NU-POx содержит 10% NH₂ согласно ¹H-ЯМР. NU-POx растворяют в пределах 2-8°C в воде (60 г в 300 мл), охлаждают при минус 80°C в течение получаса и сушат вымораживанием. Высушенный вымораживанием порошок, полученный таким образом, сушат в Rotavap при 40°C до получения содержания воды ниже 0,8% масс./масс., как определено с помощью титрования Карла Фишера. Этот сухой порошок измельчают в настольном устройстве для измельчения до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 100 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Приготовление химически активных гранул NHS-POx/NU-POx

Голубой или белый (неокрашенный) порошок NHS-POx смачивают изопропиловым спиртом (IPA) в высокосдвиговом смесителе, пока не будет получен однородный похожий на снег порошок, содержащий примерно 1-2% масс./масс. IPA. После этого, добавляют порошок NU-POx и перемешивают. Смоченный голубой порошок NHS-POx смешивают с порошком NU-POx при молярном отношении 1:0,6, указанное молярное отношение относится к отношению количества групп NHS, обеспечиваемых NHS-POx, к количеству аминовых групп, обеспечиваемых NU-POx. Смоченный неокрашенный порошок NHS-POx также перемешивают с порошком NU-POx при других молярных отношениях (1:0,8; 1:1 и 1:1,2).

После перемешивания, влажные грануляты сушат при пониженном давлении до тех пор, пока содержание IPA не станет меньше 0,1% масс./масс., как определено с помощью ¹H-ЯМР. Высушенные грануляты перемалывают с использованием шаровой мельницы (Retch MM400) до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 50 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Распределение размеров частиц гранулятов, полученных таким образом, приблизительно представляет собой: 90% объем <90 мкм, 50% объем <45 мкм и 10% объем <15 мкм.

Гранулят NHS-POX/NU-POx (1:1) анализируют с использованием спектроскопии ¹H-ЯМР. 25 мг гранулята растворяют в трифторуксусной кислоте (0,20 мл) посредством обработки ультразвуком в течение 20 минут. После полного растворения гранулята, образец разбавляют дейтерированным диметилсульфоксидомом (DMSO-d₆), содержащим малеиновую кислоту (2,5 мг/мл), в качестве внутреннего стандарта (0,80 мл), переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра можно вычислить количество NHS, связанного с NHS-POx, вместе с молярным отношением NHS и аминовых групп, присутствующих в грануляте. Количество NHS, связанного с NHS-POx, в грануляте равно количеству NHS, связанного с исходным материалом NHS-POx, указывая на отсутствие разложения или поперечной сшивки в ходе грануляци.

Общий выход полимера, то есть сочетания NHS-POx и NU-POx, в образце для ЯМР определяют с использованием известного количества внутреннего стандарта (малеиновой кислоты) и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР, зарегистрированным для NHS-POx и NU-POx при различных концентрациях. Общий выход полимера, как измерено, составляет 99 процентов, что указывает на то, что нерастворимого поперечно сшитого материала не образуется.

Гранулят NHS-POX/NU-POx (1:1) дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. 20 мг гранулята обрабатывают уксусным ангидридом (1,00 мл) в течение 1 часа при 50°C. Затем добавляют метанол (2,00 мл) и смесь перемешивают в течение дополнительного часа при 50°C. Отбирают аликвоту (0,75 мл) и удаляют все летучие продукты при пониженном давлении. Образец отбирают в N, N-диметилацетамиде, содержащем 50 мМ хлорида лития (2,50 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет не больше 1,5, что указывает на то, что в ходе грануляции не происходит поперечной сшивки. Аналитическая проверка этого метода эксклюзионной хроматографии указывает на то, что намеренная поперечная сшивка NHS-POx с NU-POx на уровне 0,05% моль повышает PDI до более 2,5.

Приготовление смесей NHS-POx/NU-POx с помощью совместной сушки вымораживанием

Совместно высушенные вымораживанием порошки NHS-POx/NU-POx приготавливают следующим образом: 2,4 г NU-POx растворяют в 40 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения полимера, добавляют 2,0 г NHS-POx и образец обрабатывают ультразвуком в течение 30 минут. Раствор быстро замораживают в жидком азоте и сушат вымораживанием. Полученный в результате липкий твердый продукт дополнительно сушат при пониженном давлении (<1 кПа) и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Совместно высушенные вымораживанием образцы NHS-POx/NU-POx нельзя анализировать с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР и эксклюзионной хроматографии, поскольку образцы нерастворимы ни в трифторуксусной кислоте, ни в уксусном ангидриде из-за высокой степени поперечной сшивки между NHS-POx и NU-POx.

Приготовление смесей NHS-POx/NU-POx посредством сухого перемешивания

Смеси NHS-POx/NU-POx приготавливают следующим образом: 2 г NHS-POx и 2 г NU-POx перемешивают всухую посредством перемешивания во вращающемся барабане в течение 30 минут. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении (<1 кПа), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Порошок анализируют с использованием спектроскопии ¹H-ЯМР. 25 мг порошка растворяют в трифторуксусной кислоте (0,20 мл) посредством обработки ультразвуком в течение 20 минут. После полного растворения порошка, образец разбавляют дейтерированным диметилсульфоксидомом (DMSO-d₆), содержащим малеиновую кислоту (2,5 мг/мл), в качестве внутреннего стандарта (0,80 мл), переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 99 процентов по сравнению с NHS-POx.

Общий выход полимера, то есть сочетания NHS-POx и NU-POx, в образце для ЯМР определяют с использованием известного количества внутреннего стандарта (малеиновой кислоты) и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР, зарегистрированным для NHS-POx и NU-POx при различных концентрациях. Общий выход полимера, как измерено, составляет 101 процент, что указывает на то, что нерастворимого поперечно сшитого материала не образуется.

Порошок дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. 20 мг порошка обрабатывают уксусным ангидридом (1,00 мл) в течение 1 часа при 50°C. Затем добавляют метанол (2,00 мл) и смесь перемешивают в течение дополнительного часа при 50°C. Отбирают аликвоту (0,75 мл) и удаляют все летучие продукты при пониженном давлении. Образец отбирают в N, N-диметилацетамиде, содержащем 50 мМ хлорида лития (2,50 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет не больше 1,5, что указывает на то, что поперечной сшивки не происходит в ходе сухого перемешивания.

Приготовление (секвестрированных) гранул NHS-POx/NU-POx

С помощью сушки вымораживанием получают следующие порошки:

Фосфатный порошок

42,66 г фосфата натрия двухосновного дигидрата и 26,56 г фосфата натрия моноосновного моногидрата растворяют в 170 мл ультрачистой воды. После полного растворения, pH доводят до 7 посредством добавления 62 мл 0,1-молярного водного раствора гидроксида натрия. Раствор замораживают в жидком азоте и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Карбонатный порошок

Смесь 1:1 моль/моль карбоната натрия и бикарбоната натрия приготавливают посредством растворения 25,31 г карбоната натрия и 20,06 г бикарбоната натрия в 350 мл ультрачистой воды Раствор быстро замораживают в жидком азоте и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Порошок NHS-POx/лимонная кислота

3,08 г лимонной кислоты растворяют в 10 мл ультрачистой воды. Раствор охлаждают в пределах 2-8°C. Затем добавляют 7,00 г NHS-POx и растворяют с помощью высокопроизводительного диспергирующего инструмента (Ultra-Turrax, IKA). Непосредственно после перемешивания (2 минуты), раствор быстро замораживают с использованием жидкого азота и сушат вымораживанием в течение ночи. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Порошок NU-POx/карбонат

Затем получают карбонат-содержащий порошок NU-POx, следующим образом: 9,60 г NU-POx и 0,80 г порошка карбоната растворяют в 40 мл ультрачистой воды. Раствор быстро замораживают с использованием жидкого азота и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

(Секвестрированный) гранулят NHS-POx/NU-POx приготавливают следующим образом: 6,50 г порошка NHS-POx/лимонная кислота и 5,50 г фосфатного порошка перемешивают в высокосдвиговом смесителе. После получения однородной смеси медленно добавляют 0,40 мл IPA, при этом перемешивание продолжается, пока не образуется однородный похожий на снег порошок. Затем добавляют 5,41 г порошка NU-POx/карбонат и перемешивание прекращают после образования однородного гранулята. Гранулят сушат при пониженном давлении, пока содержание IPA не станет меньше 0,1% масс./масс. Высушенный гранулят перемалывают в кофемолке до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 100 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Приготовление химически активных гранул NHS-POx/NU-POx/P188

Химически активные гранулы NHS-POx/NU-Pox, как описано ранее, покрывают Pluronic P188. 2,5% масс./масс. химически активного гранулята NHS-POx/NU-POx с покрытием из P188 приготавливают посредством нагрева гранулята NHS-POx/NU-POx вместе с порошком P188 в высокосдвиговом смесителе при 65°C в течение 10 минут с последующим охлаждением до условий окружающей среды. Гранулят с покрытием перемалывают с использованием шаровой мельницы (Retch MM400) до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 40 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Распределение размеров частиц гранулятов, полученных таким образом, приблизительно представляет собой: 90% объем <80 мкм, 50% объем <40 мкм и 10% объем <10 мкм.

Гранулят NHS-POx/NU-POx/P188 анализируют с использованием спектроскопии ¹H-ЯМР. 25 мг порошка растворяют в трифторуксусной кислоте (0,20 мл) посредством обработки ультразвуком в течение 20 минут. После полного растворения гранулята, образец разбавляют дейтерированным диметилсульфоксидомом (DMSO-d₆) (0,80 мл), переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 98 процентов по сравнению с NHS-POx.

Гранулят NHS-POx/NU-POx/P188 дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. 20 мг гранулята обрабатывают уксусным ангидридом (1,00 мл) в течение 1 часа при 50°C. Затем добавляют метанол (2,00 мл) и смесь перемешивают в течение дополнительного часа при 50°C. Отбирают аликвоту (0,75 мл) и удаляют все летучие продукты при пониженном давлении. Образец отбирают в N, N-диметилацетамиде, содержащем 50 мМ хлорида лития (2,50 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет не больше 1,5, что указывает на то, что в ходе грануляции не происходит поперечной сшивки.

Приготовление восстановленного поперечно сшитого желатина (RXL)

Восстановленный поперечно сшитый желатин (RXL) приготавливают согласно трем процедурам:

12 грамм порошка желатина (Gelita-SPON®, Gelita Medical GmbH) растворяют в 350 мл 0,1-молярного водного раствора гидроксида натрия посредством перемешивания в течение 2 часов при 40°C. После получения прозрачного раствора, смеси дают возможность для охлаждения до температуры окружающей среды и доводят pH до 7 посредством добавления 32,5 мл 0,1-молярного водного раствора хлористоводородной кислоты. Раствор быстро замораживают с использованием жидкого азота и сушат вымораживанием в течение ночи. Затем порошок перемалывают в кофемолке, сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги. Далее, этот восстановленный поперечно сшитый желатин будет упоминаться как RXL-LS (с низким содержанием соли).

12 грамм порошка желатина (Gelita-SPON®, Gelita Medical GmbH) растворяют в 360 мл 0,1-молярного водного раствора гидроксида натрия посредством перемешивания в течение 10 минут при 40°C. Полученный прозрачный раствор охлаждают до температуры окружающей среды и понижают pH до 7 посредством добавления 30 мл концентрированного раствора хлористоводородной кислоты (37% масс./масс.). Раствор быстро замораживают с использованием жидкого азота и сушат вымораживанием в течение ночи. Затем порошок перемалывают в кофемолке, сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги. Далее, этот восстановленный поперечно сшитый желатин будет упоминаться как RXL-HS (с высоким содержанием соли).

12 г порошка желатина (Gelita-SPON®, Gelita Medical GmbH) растворяют в 350 мл 0,1-молярного водного раствора гидроксида натрия посредством перемешивания в течение 2 час при 40°C. После получения прозрачного раствора, смеси дают возможность для охлаждения до температуры окружающей среды и pH доводят до 7 посредством добавления 32,5 мл 0,1-молярного водного раствора хлористоводородной кислоты. Затем добавляют 400 мл метанола к раствору, который помещают в морозилку при -20°C на 16 часов, что приводит в результате к преципитации RXL, который изолируют посредством декантирования жидкой фазы. RXL промывают три раза 100-мл порциями метанола и сушат после этого в вакууме. Сырой продукт растворяют в 200 мл ультрачистой воды, быстро замораживают в жидком азоте и сушат вымораживанием. Порошок перемалывают в кофемолке, сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги. Ниже, этот восстановленный поперечно сшитый желатин будет упоминаться как RXL (без соли).

Приготовление химически активных гранул NHS-POx/RXL (без соли, с низким содержанием соли и с высоким содержанием соли)

Химически активные гранулы NHS-POx/RXL приготавливают следующим образом: 5 г голубого порошка NHS-POx смачивают IPA в высокосдвиговом смесителе до тех пор, пока не получат однородный похожий на снег порошок, содержащий примерно 1-2% масс./масс. IPA. После этого, добавляют 5 г порошка RXL, RXL-LS или RXL-HS и перемешивают. После перемешивания, влажные грануляты сушат при пониженном давлении до тех пор, пока содержание IPA станет меньше 0,1% масс./масс., как определено с помощью ¹H-ЯМР. Высушенные грануляты перемалывают в кофемолке до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 90 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Распределение размеров частиц гранулятов, полученных таким образом, приблизительно представляет собой: 90% объем <190 мкм, 50% объем <60 мкм и 10% объем <15 мкм.

Гранулят, содержащий RXL, анализируют посредством анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Для этого добавляют дейтерированный хлороформ (CDCl3), содержащий 5% (объем/объем) уксусной кислоты (1,0 мл), к 25 мг гранулята. NHS-POx селективно извлекают посредством обработки ультразвуком образца в течение 20 минут. Дисперсию пропускают через 0,22-мкм фильтр, переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 98 процентов по сравнению с NHS-POx.

Выход NHS-POx в образце для ЯМР определяют с использованием триметилсилана в качестве внутреннего стандарта и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР NHS-POx при различных концентрациях. Общий выход NHS-Pox, как измерено, составляет 100 процентов, что указывает на то, что нерастворимого поперечно сшитого материала не образуется.

Гранулят NHS-POx/RXL дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. Для этого, отбирают аликвоту (0,15 мл) раствора, используемого для анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Этот раствор разбавляют N, N-диметилацетамидом, содержащим 50 мМ хлорида лития (1,00 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI снова составляет не больше 1,5, что указывает на то, что в ходе грануляции не происходит поперечной сшивки.

Приготовление смесей NHS-POx/RXL с помощью совместной сушки вымораживанием

Совместно высушенные вымораживанием NHS-POx/RXL порошки приготавливают следующим образом: 2,5 г порошка RXL растворяют в 200 мл ультрачистой воды. pH доводят до 4,5 посредством добавления уксусной кислоты и раствор охлаждают до 4°C. Затем добавляют 2,5 г NHS-POx и растворяют с помощью высокосдвигового перемешивания. Непосредственно после полного растворения NHS-POx, раствор быстро замораживают в жидком азоте и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Совместно высушенный вымораживанием порошок NHS-POx/RXL анализируют посредством анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Для этого дейтерированный хлороформ (CDCl₃), содержащий 5% (объем/объем) уксусной кислоты (1,0 мл), добавляют к 25 мг гранулята. NHS-POx селективно извлекают посредством обработки ультразвуком образца в течение 20 минут. Дисперсию пропускают через 0,22-мкм фильтр, переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 93 процента по сравнению с NHS-POx.

Выход NHS-POx в образце для ЯМР определяют с использованием триметилсилана в качестве внутреннего стандарта и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР NHS-POx при различных концентрациях. Общий выход NHS-POx, как измерено, составляет 81 процент, указывая на то, что до некоторой степени нерастворимый поперечно сшитый материал образуется.

Порошок NHS-POx/RXL дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. Отбирают аликвоту (0,15 мл) раствора, используемого для анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Этот раствор разбавляют N, N-диметилацетамидом, содержащим 50 мМ хлорида лития (1,00 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет 3,3 что указывает на то, что происходит поперечная сшивка обоих компонентов в ходе совместной сушки вымораживанием.

Приготовление смеси NHS-POx/RXL посредством сухого перемешивания

Смеси NHS-POx/RXL приготавливают следующим образом: 2 г порошка RXL и 2 г NHS-POx перемешивают всухую посредством перемешивания во вращающемся барабане в течение 30 минут. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Порошок анализируют посредством анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Для этого дейтерированный хлороформ (CDCl₃), содержащий 5% (объем/объем) уксусной кислоты (1,0 мл), добавляют к 25 мг гранулята. NHS-POx селективно извлекают посредством обработки ультразвуком образца в течение 20 минут. Дисперсию пропускают через 0,22-мкм фильтр, переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 100 процентов по сравнению с NHS-POx.

Выход NHS-POx в образце для ЯМР определяют с использованием триметилсилана в качестве внутреннего стандарта и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР NHS-POx при различных концентрациях. Общий выход NHS-POx, как измерено, составляет 104 процента, что указывает на то, что нерастворимого поперечно сшитого материала не образуется.

Порошок NHS-POX/RXL дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. Для этого отбирают аликвоту (0,15 мл) раствора, используемого для анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Этот раствор разбавляют N, N-диметилацетамидом, содержащим 50 мМ хлорида лития (1,00 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет не больше 1,5, что указывает на то, что поперечной сшивки не происходит в ходе перемешивания всухую.

Приготовление химически активных гранул NHS-POx/RXL, содержащих карбонат

Сначала, приготавливают смесь 1:1 моль/моль карбоната натрия и бикарбоната натрия посредством растворения 25,31 г карбоната натрия и 20,06 г бикарбоната натрия в 350 мл ультрачистой воды. Раствор быстро замораживают в жидком азоте и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Грануляты NHS-POx/RXL/карбонат приготавливают следующим образом: 5 г RXL-LS или RXL-HS и 0,178 г карбоната натрия/бикарбоната натрия перемешивают с использованием высокосдвигового смесителя. Затем добавляют 5 г голубого NHS-Pox, содержащего примерно 1-2% масс./масс. IPA, и перемешивают, пока не будет получен однородный порошок. После перемешивания, влажные грануляты сушат при пониженном давлении до тех пор, пока содержание IPA не станет меньше 0,1% масс./масс., как определено с помощью ¹H-ЯМР. Высушенные грануляты перемалывают в кофемолке до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 100 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Приготовление химически активных гранул NHS-POx/NH₂-PEG

NHS-POx (6,9 г) смачивают IPA в высокосдвиговом смесителе, пока не будет получен однородный похожий на снег порошок, содержащий примерно 1-2% масс./масс. IPA. Затем добавляют 8,1 г амин-PEG-амина, 2-лучевого, MW 2k (от Creative PEGWorks) (молярное отношение 1:1,16, указанное молярное отношение относится к отношению количества групп NHS, обеспечиваемых NHS-POx, к количеству аминовых групп, обеспечиваемых PEG-амином). Образовавшийся гранулят сушат при пониженном давлении до тех пор, пока содержание IPA не станет меньше 0,1% масс./масс., как определено с помощью ¹H-ЯМР. Высушенный гранулят перемалывают в кофемолке до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 100 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Гранулят NHS-POX/NH₂-PEG анализируют с использованием спектроскопии ¹H-ЯМР. 25 мг гранулята растворяют в трифторуксусной кислоте (0,20 мл) посредством обработки ультразвуком в течение 20 минут. После полного растворения гранулята, образец разбавляют дейтерированным диметилсульфоксидомом (DMSO-d₆) (0,80 мл), переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 97 процентов по сравнению с NHS-POx.

Гранулят NHS-POX/NH₂-PEG дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. 20 мг гранулята обрабатывают уксусным ангидридом (1,00 мл) в течение 1 часа при 50°C. Затем добавляют метанол (2,00 мл) и смесь перемешивают в течение дополнительного часа при 50°C. Отбирают аликвоту (0,75 мл) и удаляют все летучие продукты при пониженном давлении. Образец отбирают в N, N-диметилацетамиде, содержащем 50 мМ хлорида лития (2,50 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет не больше 1,5, что указывает на то, что в ходе грануляции не происходит поперечной сшивки.

Приготовление гранул крахмал/NHS-POx/NU-POx

Посредством сушки вымораживанием получают следующие порошки крахмала:

Порошок NHS-POx/крахмала

2,79 г крахмала (Arista™ AH, BARD) диспергируют в 50 мл ультрачистой воды с использованием высокосдвигового смесителя. Дисперсию охлаждают в пределах 2-8°C и добавляют 0,71 г NHS-POx, и растворяют с помощью высокосдвигового перемешивания.

Непосредственно после растворения NHS-POx, раствор быстро замораживают с использованием жидкого азота и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Порошок NU-POx/крахмал

1,45 г крахмала (Arista™ AH, BARD) диспергируют в 30 мл ультрачистой воды с использованием высокосдвигового смесителя. Затем добавляют 0,36 г NU-POx и дают возможность для растворения. После полного растворения NU-POx, дисперсию быстро замораживают с использованием жидкого азота и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Порошок NU-POx/крахмал/карбонат натрия

2,25 г крахмала (Arista™ AH, BARD) диспергируют в 50 мл ультрачистой воды с использованием высокосдвигового смесителя. Затем добавляют 0,58 г NU-POx и 0,25 г карбоната натрия и дают возможность для растворения. После полного растворения NU-POx, дисперсию быстро замораживают с использованием жидкого азота и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Из этих трех порошков приготавливают два гранулята. Грануляты крахмал/NHS-POx/NU-POx приготавливают следующим образом:

Гранулят крахмала 1:

1,41 г порошка NHS-POx/крахмала, 1,68 г порошка NU-POx/крахмала и 0,20 мл IPA перемешивают с использованием пестика и ступки. После получения однородного гранулята, остаток IPA удаляют при пониженном давлении до тех пор, пока содержание IPA не станет меньше 0,1% масс./масс. Высушенный гранулят перемалывают в кофемолке до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 100 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Гранулят крахмала 2:

1,20 г порошка NHS-POx/крахмала, 1,45 г порошка NU-POx/крахмал/карбонат натрия 3 и 0,15 мл IPA перемешивают с использованием пестика и ступки. После получения однородного гранулята, остаток IPA удаляют при пониженном давлении до тех пор, пока содержание IPA не станет меньше 0,1% масс./масс. Высушенный гранулят перемалывают в кофемолке до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 100 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги

Приготовление химически активных гранул NHS-POx/Gelita Spon

7,01 г предварительно высушенного порошка желатина (Gelita-SPON®, от Gelita Medical GmbH), имеющего содержание воды меньше 0,2% масс./масс., диспергируют в дихлорметане (200 мл) с использованием высокосдвигового смесителя, работающего при 20000 об/мин, в течение 20 минут. Затем добавляют NHS-POx (7,02 г) и перемешивание продолжают в течение 5 минут. NHS-POx не растворяется. Удаляют из суспензии все летучие продукты при пониженном давлении. Полученный порошок перемалывают с использованием кофемолки до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 95 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги, дополнительно сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Распределение размеров частиц гранулятов, полученных таким образом, приблизительно представляет собой: 90% объем <190 мкм, 50% объем <80 мкм и 10% объем <15 мкм.

Гранулят анализируют посредством анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Для этого дейтерированный хлороформ (CDCl₃), содержащий 5% (объем/объем) уксусной кислоты (1,0 мл), добавляют к 25 мг гранулята. NHS-POx селективно извлекают посредством обработки ультразвуком образца в течение 20 минут. Дисперсию пропускают через 0,22-мкм фильтр, переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 97 процентов по сравнению с NHS-POx.

Гранулят дополнительно анализируют посредством анализа с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Аликвоту (0,15 мл) отфильтрованного экстракта NHS-POx, описанного выше, разбавляют N,N-диметилацетамидом, содержащим 50 мМ хлорида лития (1,00 мл), который является элюентом для анализа SEC. Образец анализируют с помощью SEC в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и PDI составляет 1,45, указывая на то, что поперечной сшивки не происходит.

Приготовление химически активных гранул NHS-POx/хитозана

Химически активные гранулы NHS-POx/хитозана приготавливают следующим образом: 5 г порошка NHS-POx смачивают IPA в высокосдвиговом смесителе до тех пор, пока не получат однородный похожий на снег порошок, содержащий примерно 1-2% масс./масс. IPA. После этого, добавляют 5 г порошка хитозана (Shanghai Waseta International, уровень DAC (УДК) 85%) и перемешивают. После перемешивания, влажные грануляты сушат при пониженном давлении до тех пор, пока содержание IPA не станет меньше 0,1% масс./масс. как определено с помощью ¹H-ЯМР. Высушенные грануляты перемалывают в кофемолке до тех пор, пока средний размер частиц не станет не больше 200 мкм (D[4.3]), и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Распределение размеров частиц гранулятов, полученных таким образом, приблизительно представляет собой: 90% объем <350 мкм, 50% объем <180 мкм и 10% объем <60 мкм.

Гранулят анализируют посредством анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Для этого дейтерированный хлороформ (CDCl₃), содержащий 5% (объем/объем) уксусной кислоты (1,0 мл), добавляют к 25 мг гранулята. NHS-POx селективно извлекают посредством обработки ультразвуком образца в течение 20 минут. Дисперсию пропускают через 0,22-мкм фильтр, переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 95 процентов по сравнению с NHS-POx.

Выход NHS-POx в образце для ЯМР определяют с использованием триметилсилана в качестве внутреннего стандарта и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР NHS-POx при различных концентрациях. Общий выход NHS-POx, как измерено, составляет 103 процента, что указывает на то, что нерастворимого поперечно сшитого материала не образуется.

Гранулят NHS-POX/хитозан дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. Для этого отбирают аликвоту (0,15 мл) раствора, используемого для анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Этот раствор разбавляют N, N-диметилацетамидом, содержащим 50 мМ хлорида лития (1,00 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет не больше 1,5, что указывает на то, что в ходе грануляции не происходит поперечной сшивки.

Приготовление смесей NHS-POx/хитозана посредством совместной сушки вымораживанием

Совместно высушенные вымораживанием порошки NHS-POx/хитозана приготавливают следующим образом: 2,5 г порошка хитозана (Shanghai Waseta International, уровень DAC 85%) растворяют в 200 мл 0,2% объем/объем раствора уксусной кислоты в ультрачистой воде. pH доводят до 4,5 посредством добавления уксусной кислоты и раствор охлаждают до 4°C. Затем добавляют 2,5 г NHS-POx и растворяют с помощью высокосдвигового перемешивания. Непосредственно после полного растворения NHS-POx, раствор быстро замораживают в жидком азоте и сушат вымораживанием. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Гранулят анализируют посредством анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Для этого дейтерированный хлороформ (CDCl₃), содержащий 5% (объем/объем) уксусной кислоты (1,0 мл), добавляют к 25 мг гранулята. NHS-POx селективно извлекают посредством обработки ультразвуком образца в течение 20 минут. Дисперсию пропускают через 0,22-мкм фильтр, переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 12 процентов по сравнению с NHS-POx, это говорит, что осуществляется поперечная сшивка и/или гидролиз.

Выход NHS-POx в образце для ЯМР определяют с использованием триметилсилана в качестве внутреннего стандарта и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР NHS-POx при различных концентрациях. Общий выход NHS-Pox, как измерено, составляет 11 процентов (в соответствии с результатами ЯМР), указывая на то, что образуется нерастворимый поперечно сшитый материал.

Гранулят NHS-POX/хитозана дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. Для этого отбирают аликвоту (0,15 мл) раствора, используемого для анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Этот раствор разбавляют N, N-диметилацетамидом, содержащим 50 мМ хлорида лития (1,00 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI, как определено, составляет 5,4, что указывает на то, что имеет место поперечная сшивка.

Приготовление смесей NHS-POx/хитозана посредством сухого перемешивания

Смеси NHS-POx/хитозан приготавливают следующим образом: 2 г порошка хитозана (Shanghai Waseta International, уровень DAC 85%) и 2 г NHS-POx перемешивают всухую посредством перемешивания во вращающемся барабане в течение 30 минут. Полученный в результате порошок сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Порошок анализируют посредством анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Для этого дейтерированный хлороформ (CDCl₃), содержащий 5% (объем/объем) уксусной кислоты (1,0 мл), добавляют к 25 мг гранулята. NHS-POx селективно извлекают посредством обработки ультразвуком образца в течение 20 минут. Дисперсию пропускают через 0,22-мкм фильтр, переносят в пробирку для ЯМР и регистрируют спектр ¹H-ЯМР. Из полученного спектра, количество непрореагировавшего NHS, согласно вычислениям, составляет 99 процентов по сравнению с NHS-POx.

Выход NHS-POx в образце для ЯМР определяют с использованием триметилсилана в качестве внутреннего стандарта и калибровочной кривой, построенной по спектрам ¹H-ЯМР NHS-POx при различных концентрациях. Общий выход NHS-POx, как измерено, составляет 96 процентов, что указывает на то, что нерастворимого поперечно сшитого материала не образуется.

Порошок NHS-POX/хитозана дополнительно анализируют посредством эксклюзионной хроматографии. Для этого отбирают аликвоту (0,15 мл) раствора, используемого для анализа с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР. Этот раствор разбавляют N, N-диметилацетамидом, содержащим 50 мМ хлорида лития (1,00 мл), который является элюентом для анализа SEC. SEC измеряют в сравнении с поли(метилметакрилатными) стандартами и из полученной эксклюзионной хроматограммы определяют M_n, M_w и PDI. PDI составляет не больше 1,5, что указывает на то, что поперечной сшивки не происходит в ходе перемешивания всухую.

Структуры когезивного волокнистого носителя

Следующие коммерчески доступные гемостатические продукты выбирают для использования в качестве структур волокнистых носителей при приготовлении адгезивных для ткани листов по настоящему изобретению:

Gelita Tuft-It®: структура когезивного волокнистого носителя, состоящая из восьми слоев из восстановленных поперечно сшитых волокон Гельфоум. Восемь слоев, каждый толщиной примерно 2 мм, имеют размеры 50 мм на 75 мм. Содержание воды Gelita Tuft-It® не больше 15%. Продукт сушат в вакуумной печи в течение нескольких часов при 40°C для уменьшения содержания воды до не более 2,0% масс./масс. (определяется гравиметрически), до их пропитки частицами агломератов.

Эксперименты с кровотечением

Стандартизированные модели ex-vivo и in vivo кровотечения свинообразных используют для оценки гемостатической эффективности. Все модели используют гепарин для увеличения времени свертывания крови примерно в 2-3 раза по сравнению с временем активированной коагуляции (ACT).

Модель ex-vivo: живая модель ex-vivo свиньи со свежей печенью, перфузированной гепаринизированной свежей кровью со скотобойни, для воспроизведения реальных ситуаций in vivo настолько близко, насколько это возможно. Печени устанавливают в перфузионном устройстве, с помощью которого оксигенация, pH крови, температура и давление крови поддерживаются в границах in vivo. На скотобойне собирают две печени, 10 литров гепаринизированной крови (5000 единиц/л). Печени транспортируют на льду; кровь при температуре окружающей среды. В пределах двух часов после сбора, печени инспектируют на повреждения, которые закрывают с помощью перчаток и цианоакрилатного клея;

Параметры перфузии: поток 600 мл/мин; давление 10-12 мм.рт.ст.; температура 37°C (+/-1°C); карбоген 0,25 литр минут

С помощью плоского круглого вращающегося абразивного инструмента круговая кровоточащая рана (диаметром 8 мм) создается на поверхности печени, с каучуковой накладкой, так что глубина перфорированного кровотечения всегда составляет 3 мм

После соответствующей перфузии печени (проверяют цвет и температуру) образцы исследуют согласно следующей процедуре: вырезают образец соответствующего размера (2,7 на 2,7 см); включают камеру; регистрируют номер области на камеру; перфорируют биопсию 8 мм; отделяют ткань от биопсии; удаляют кровь из области кровотечения с помощью марли (2x); собирают кровь в течение 30 сек в предварительно взвешенную марлю; оценивают кровотечение (2 исследователя); насыпают гемостатический порошок на область кровотечения и используют шпатель из нержавеющей стали для равномерного распределения порошка; наблюдают в течение 5 мин (проверяют и оценивают адгезию и гемостаз) и повторяют через после 30 минут.

Модель in vivo: осуществляют стандартную сочетанную проникающую перфорацию селезенки на анестезированной свинье (домашняя свинья, самец, масса тела в пределах: 40 кг, взрослая особь). Осуществляют срединную лапаротомию для доступа к селезенке и другим органам. Используя скальпель, n=3 (S1…S3), осуществляют подкапсулярные стандартные повреждения (10 мм × 10 мм). Гемостатические продукты накладывают при легком давлении с помощью предварительно смоченной марли (солевой раствор) и выдерживают в течение 1 мин. После наложения продукта оценивают время до гемостаза (TTH). Если TTH равно нулю, это означает, что после 1-минутного давления уже достигается гемостаз.

Система оценок для гранулятов: коагуляция

++++ Достигается непосредственно после приложения

+++ Достигается через <10 секунд после приложения

++ Достигается через <30 секунд после приложения

+ Достигается в пределах 3 минут после приложения

- Не достигается

Система оценок для гранулятов: адгезия через 10 минут после приложения

++++ Очень прочная адгезия (коагулировавшие грануляты можно удалить с большим трудом)

+++ Прочная адгезия (коагулировавшие грануляты сложно удалять)

++ Прочная адгезия (коагулировавшие грануляты можно удалять)

+ Умеренная адгезия (коагулировавшие грануляты легко удалять)

+/- Прочная адгезия (коагулировавшие грануляты удаляются потоком крови)

- Не достигается

Система оценок для пластырей: коагуляция

++++ Достигается непосредственно после тампонады

+++ Достигается через <10 секунд после тампонады

++ Достигается через <30 секунд после тампонады

+ Достигается в пределах 3 минут после тампонады

+/- Достигается через 3 минут, применяется вторая тампонада

- Не достигается

Система оценок для пластырей: адгезия через 10 минут после приложения

++++ Очень прочная адгезия (пластырь разрушается при удалении)

+++ Прочная адгезия (пластырь разрушается при удалении)

++ Прочная адгезия (пластырь можно удалить без разрушения)

+ Умеренная адгезия (пластырь можно удалить без разрушения)

+/- Прочная адгезия (пластырь можно удалить без разрушения)

- Не достигается

Гемостатические свойства различных химически активных гранулятов оценивают в исследованиях кровотечения ex vivo и in vivo, описанных выше. Результаты приводятся в Таблице 1 и Таблице 2.

Таблица 2

Гранулят/
порошок Непрореагировавший NHS
(%) Выход
(%) PDI Ex vivo Коагуляция Адгезия Гранулят NHS-POx/NU-POx 98 99 < 1,5 +++ +++ Перемешанный всухую NHS-POx/NU-POx 99 101 < 1,5 + + Высушенный совместным вымораживанием NHS-POx/NU-POx n.d.^[1] n.d.^[1] n.d.^[1] n.d. n.d. Гранулят NHS-POx/RXL 98 105 < 1,5 ++ +++ Перемешанный всухую NHS-POx/RXL 100 104 < 1,5 + +/- Высушенный совместным вымораживанием NHS-POx/RXL 93 81 3,3 - - Гранулят NHS-POx/хитозан 93 103 < 1,5 +++ +++ Перемешанный всухую NHS-POx/хитозан 99 96 < 1,5 + ++ Высушенный совместным вымораживанием NHS-POx/хитозан 12 11 5,4 - +/-

Примечание: ^[1] не определено (порошок нерастворим из-за высокой степени поперечной сшивки)

Пример 2

Пропитка структуры носителей агломератами частиц

Используя механическое встряхивание, пластыри Gelita Tuft-It® (50×75 мм, приблизительно 0,71 г) пропитывают окрашенным в голубой цвет гранулятом NHS-POx/NU-POx (1:0,6). Используют устройство для встряхивания красок (VIBA PRO V, Collomix GmbH) для введения порошка (примерно 0,75 г) в пластырь. Матрица с держателем структур носителей зажимается в устройстве. Матрица вибрирует вертикально.

Пропитанные образцы помещают на пластинку PMMA и помещают в печь, в которой образцы подвергаются различным видам термической обработки. Для оценки фиксации порошка, образцами постукивают дважды по белой пластинке из PMMA. Если голубой порошок не высвобождается, результат считается как фиксированный. Результаты показаны в Таблице 3.

Гранулят NHS-POX/NU-POx является гигроскопичным. При температуре и относительной влажности (RH) окружающей среды ниже 40% структуры волокнистых носителей могут воспроизводимо пропитываться в течение получаса экспонирования. Однако, если пропитка осуществляется, например, при RH 75% и при 25°C, грануляты становятся липкими в пределах минут, что приводит к невоспроизводимым, неоднородным характеристикам пропитки.

Пример 3

Гемостатические пластыри (Gelita Tuft-It®; 50×75 мм, приблизительно 0,7 г) пропитывают химически активным гранулятом NHS-POx/NU-POx (1:0,6), описанным ранее. Один грамм гранулята распределяют в пластырях, как описано в Примере 2. Затем гемостатические пластыри упаковывают в пакеты из алюминиевой фольги, содержащей 1 г диоксида кремния, и герметизируют в вакууме.

Пластыри разрезают на куски 2 см × 2 см и исследуют в трех экземплярах на модели перфузии печени ex vivo. Время до гемостаза (TTH) составляет 0 минут (после 1-минутного давления) и повторного кровотечения не наблюдается в течение времени наблюдения 30 минут. Также, пластырь, как обнаружено, имеет хорошие свойства гибкости и изгибные свойства.

Пластыри также оценивают на модели гепаринизированных свинообразных in vivo. Они, как обнаружено, имеют очень хорошие коагуляционные и адгезивные свойства. Активные кровотечения эффективно останавливаются при резекции различных органов: селезенки, печени и почек. Сводка результатов показана в Таблице 4.

Пример 4

Гемостатические пластыри (Gelita Tuft-It®; 50×75 мм, приблизительно 0,7 г) пропитывают NHS-POx/NU-POx/P188, 2,5%. Один грамм гранулята распределяют в пластырях, как описано в Примере 2. Затем гемостатические пластыри упаковывают в пакеты из алюминиевой фольги, содержащей 1 г диоксида кремния, и герметизируют в вакууме.

Пластыри оценивают на модели гепаринизированных свинообразных in vivo. Они, как обнаружено, имеют очень хорошие коагуляционные и достаточные адгезивные свойства - уменьшенные адгезивные свойства дают возможность для удаления пластыря одним куском в противоположность идентичным пластырям, которые не содержат P188. Активные кровотечения эффективно останавливаются при резекции различных органов: селезенки, печени и почек. Сводка результатов показана в Таблице 5.

Пример 5

Gelita Tuft-It® (50×75 мм, приблизительно 0,7 г) пропитывают различными химически активными полимерными порошками. Гемостатические свойства пластырей, полученных таким образом, исследуют на моделях кровотечения свинообразных ex-vivo и in vivo, описанных ранее в настоящем документе.

Структуру волокнистого носителя пропитывают 1,4 г порошка с использованием пневматического встряхивающего устройства. Лист волокнистого носителя вибрирует вертикально. Устройство типа устройства с большой длиной хода (NTK 25 AL L, от Netter Vibration GmbH) работает при 6 бар, 11 Гц и с амплитудой 30 мм. Четыре цикла по 15 секунд используют для диспергирования порошка в листе. Грануляты распределяются по всей толщине листов. Также, распределение по поверхности листов является однородным.

Исследуют семь различных химически активных гранулятов. Эти грануляты содержат NHS-POx в сочетании с водорастворимым нуклеофильным полимером. Приготовление этих гранулятов описано в настоящем документе, ранее.

Грануляты, которые исследуют, перечислены ниже:

NHS-POx/Gelita Spon

NHS-POx/RXL (с высоким содержанием соли)

NHS-POx/RXL-содержащий карбонат (с высоким содержанием соли)

NHS-POx/RXL (с низким содержанием соли)

NHS-POx/NH₂-PEG

Различные сочетания структуры волокнистого носителя и химически активных полимерных порошков, которые исследуют, показаны в Таблице 6.

Результаты, полученные для этих пластырей на моделях кровотечения свинообразных ex-vivo и in-vivo, приводятся в Таблице 7.

Сравнительный пример A

7,03 г NHS-POx диспергируют в 50 мл дихлорметана (DCM). Образуется мутная смесь и медленно добавляют IPA (4 мл) до получения прозрачного раствора; 7,00 г предварительно высушенного желатина (Gelita-SPON®, Gelita Medical GmbH) диспергируют в DCM/IPA (150 мл/12 мл) с использованием высокосдвигового смесителя, работающего при 20000 об/мин, при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавляют приготовленный раствор NHS-POx и дисперсию перемешивают при 20000 об/мин в течение 5 минут. Затем удаляют все летучие продукты при пониженном давлении. Образовавшийся гранулят перемалывают с использованием кофемолки, сушат при пониженном давлении и герметизируют в вакууме в мешках из алюминиевой фольги.

Гранулят анализируют с использованием спектроскопии ¹H-ЯМР и эксклюзионной хроматографии. Результаты, полученные таким образом, показывают, что NHS-POx не присутствует в грануляте желатин/NHS-POx, это указывает на то, что происходит полная поперечная сшивка между NHS-POx и желатином.

Пример 6

Осуществляют эксперименты для определения воздействия содержания NU-POx химически активного гранулята NHS-POx/NU-POx на характеристики in vivo гемостатического пластыря.

Способ пропитки

Гемостатические пластыри (Gelita Tuft-It®; 50×75 мм, приблизительно 0,7 г) пропитывают химически активными гранулами NHS-POx/NU-Pox, полученными посредством грануляции в ацетоне при молярных отношениях 1:0,10, 1:0,20 и 1:0,40, указанное молярное отношение относится к отношению количества групп NHS, обеспечиваемых NHS-POx, к количеству аминовых групп, обеспечиваемых NU-POx. Такие же гемостатические пластыри пропитывают также химически активным порошком NHS-POx.

Один грамм гранулята/порошка распределяют в пластырях с использованием лабораторного устройства Fibroline SL-Preg. Затем гемостатические пластыри фиксируют, сушат и упаковывают в пакеты из алюминиевой фольги, содержащие 1 г диоксида кремния, и герметизируют в вакууме.

Устройство

Лабораторное устройство Fibroline SL-Preg перемещает частицы между электродами посредством приложения напряжения до 40 кВ при частотах до 200 Гц в течение периода до 60 секунд. Две электродных пластины имеют размер примерно 50×40 см. Верхняя пластина заземляется.

Используют следующие стандартные настройки: 40 кВ, 100 Гц, 20 секунд.

Матрицы

Порошки дозируют гравиметрически в полученную с помощью 3D печати матрицу из PMMA, после чего матрица устанавливается на нижней электродной пластине. Матрицу заполняют химически активными полимерными порошками с использованием картонного скребка или металлического шпателя. Матрица имеет размеры 50×75×4 мм и содержит 22×33=726 квадратных лунок (внутренние размеры каждой лунок: 2×2×2 мм). Объединенный объем 726 лунок составляет приблизительно 5,8 мл.

Спейсер

Спейсерную маску помещают поверх матрицы. Спейсер используют, чтобы дать возможность частицам для движения вверх и вниз, когда на них действует переменное электрическое поле. Если спейсера не использовать, проникновение и распределение сквозь носитель ограничивается. Для TUFT-IT этому соответствует маска 3 мм. Это дает в результате расстояние между электродами 3+4 мм=7 мм.

Характеристики in vivo гемостатических пластырей, содержащих гранулят NHS-POx:NU-POx (0, 10, 20 и 40 процентов аминовых групп из NU-POx, процент вычисляют по отношению к количеству групп NHS, обеспечиваемых NHS-POx) или порошок NHS-POx, оценивают на модели негепаринизированных свинообразных in vivo. Детали для пластырей, которые исследуют, показаны в Таблице 8.

Исследования in vivo

Исследования осуществляют на взрослых самках домашних свиней (40-50 кг). Антикоагуляционного агента не применяют. Характеристики пластыря исследуют как на селезенке, так и на печени. Селезенку или печень локализуют и экстернализуют при необходимости в ходе периода исследования и их естественную влажность поддерживают, покрывая их губками, пропитанными солевым раствором.

Создают различные типы повреждений:

Печень: соскабливания, перфорации для биопсии и резекции

Селезенка: резекции

Секции паренхимы печени соответствующих размеров соскабливают/перфорируют, чтобы вызвать кровотечение, от умеренного до острого. Соскабливания печени создают с помощью хирургического скальпеля и шаблона 1×1 см², а круговые перфорации с использованием 8 мм круглого перфоратора для биопсий. Резекцию печени и селезенки осуществляют с использованием хирургического ножа.

Пластырь накладывают непосредственно после резекции тканей или скарификации:

- куски 2×2 см для перфораций для биопсии и соскабливаний

- Целый пластырь 7,5×5 см для резекций

Исследуемые пластыри накладывают на кровоточащую ткань и осторожно прижимают посредством нажатия с использованием марли, предварительно смоченной солевым раствором. Тампонаду применяют в течение начального периода 10 секунд с последующими 30-секундными интервалами, в целом до 5 минут.

Пластырь TUFT-IT, который не пропитывается, используют для сравнения (упоминается как TUFT-IT).

Результаты исследования in vivo приводятся в Таблице 9.

Пластыри 1-4 показывают очень прочную адгезию на ткани, в то время как для пластыря TUFT-IT наблюдается только прочная адгезия.

Пластыри 1 и 2 показывают не более чем очень ограниченное набухание после наложения. Пластыри 3-4 показывают большее, но по-прежнему приемлемое набухание.

Пример 7

Гемостатические пластыри (Gelita Tuft-It®; 50×75 мм, приблизительно 0,7 г) пропитывают либо раствором NHS-POx, либо порошком NHS-Pox, либо гранулятом NHS-POx/NU-POx. Используемый гранулят NHS-POX/NU-POx получают посредством грануляции в ацетоне при молярном отношении 1:0,20 (смотри Пример 8).

Распыление раствора, содержащего NHS-Pox, осуществляют посредством растворения NHS-POx в смеси изопропилового спирта и дихлорметана (200 г/л) 1:1. Пластыри пропитывают 5 мл этого распыляемого раствора с использованием стеклянного лабораторного распылителя и воздуха под давлением в одном цикле распыления. Общее количество NHS-POx, доставляемого таким образом, составляет 1 грамм на пластырь. После пропитки пластырям дают возможность для сушки внутри печи при 40°C в течение 2 час, после чего их хранят в десикаторе в течение 2 дней до упаковки в пакеты из алюминиевой фольги, содержащей 1 г диоксида кремния, и герметизируют в вакууме.

В дополнение к этому, пластыри пропитывают 1 граммом порошка NHS-POx или 1 граммом гранулята NHS-POx/NU-POx с использованием процедуры, описанной в Примере 8.

Характеристики пластырей, приготовленных таким образом, исследуют в трех экземплярах на модели перфузированной печени ex vivo при условиях слабого (<20 мл/мин) и острого кровотечения (>50 мл/мин). С помощью плоского круглого вращающегося абразивного инструмента на поверхности печени создается круговая кровоточащая рана (диаметр 8 мм) с каучуковой накладкой, так что глубина перфорированного кровотечения всегда составляет 3 мм. Результаты показаны в Таблице 10.

Пример 8

Гемостатические порошки приготавливают посредством смешивания гранулята NHS-POx/NU-POx с порошком гемостатического крахмала (Arista™ AH, от BARD). Используемый гранулят NHS-POX/NU-POx получают с помощью грануляции в ацетоне при молярном отношении 1:0,20 (смотри Пример 8).

Гранулят NHS-POX/NU-POx перемешивают с помощью пестика и ступки с порошком крахмала при отношении 80/20 и 90/10 масс./масс.

Способность гелеобразования этих смесей порошков, порошка чистого крахмала и чистого гранулята NHS-POx/NU-POx оценивают следующим образом:

В пробирки для исследований загружают 20 мг образца порошка

добавляют 250 мкл гепаринизированной овечьей крови и смесь перемешивают непосредственно в течение 10 секунд с использованием вихревого смесителя

Через 2 минуты, пробирки для исследований переворачивают вверх дном для определения того, образовался ли гель

В случае, если гель образовался, в гель добавляют 1 мл воды и через 30 минут определяют, остается ли гель по-прежнему интактным.

Результаты показаны в Таблице 11.

Группа изобретений относится к гемостатическому порошку, содержащему, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, указанные агломераты частиц имеют диаметр в пределах 1-500 мкм и содержат: (a) частицы электрофильного полиоксазолина, содержащие электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные электрофильные группы и представляющий собой терполимер поли[2-(этил/гидрокси-этил-амид-этил/NHS-сложного эфира-этил-сложного эфира-этил-амид-этил)-2-оксазолина] с активированной боковой цепью NHS (N-гидроксисукцинимид), содержащей 20% NHS-сложноэфирных групп, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и (b) частицы нуклеофильного полимера, содержащие водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные нуклеофильные группы и представляющий собой нуклеофильный полиоксазолин, восстановленный поперечно сшитый желатин, нуклеофильный полиэтиленгликоль, такой как NH₂-PEG, желатин или хитозан, которые в присутствии воды могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером, также относится к способу приготовления агломератов гемостатических частиц из: (a) частиц электрофильного полиоксазолина, содержащих электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные электрофильные группы и представляющий собой терполимер поли[2-(этил/гидрокси-этил-амид-этил/NHS-сложного эфира-этил-сложного эфира-этил-амид-этил)-2-оксазолина] с активированной боковой цепью NHS (N-гидроксисукцинимид), содержащей 20% NHS-сложноэфирных групп, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и (b) частиц нуклеофильного полимера, содержащих водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные нуклеофильные группы и представляющий собой нуклеофильный полиоксазолин, восстановленный поперечно сшитый желатин, нуклеофильный полиэтиленгликоль, такой как NH₂-PEG, желатин или хитозан, которые могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером; где указанный способ включает стадию объединения 100 частей массовых частиц электрофильного полиоксазолина с 10-1000 частями массовыми частиц нуклеофильного полимера в присутствии неводной гранулирующей жидкости. Группа изобретений обеспечивает разработку гемостатического порошка, содержащего агломераты частиц, за счет которых формируется более однородный, прочный гель, который обеспечивает улучшенные герметизирующие свойства. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 11 табл., 7 пр.

1. Гемостатический порошок, содержащий, по меньшей мере, 10% масс. агломератов частиц, указанные агломераты частиц имеют диаметр в пределах 1-500 мкм и содержат: (a) частицы электрофильного полиоксазолина, содержащие электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные электрофильные группы и представляющий собой терполимер поли[2-(этил/гидрокси-этил-амид-этил/NHS-сложного эфира-этил-сложного эфира-этил-амид-этил)-2-оксазолина] с активированной боковой цепью NHS (N-гидроксисукцинимид), содержащей 20% NHS-сложноэфирных групп, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и (b) частицы нуклеофильного полимера, содержащие водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные нуклеофильные группы и представляющий собой нуклеофильный полиоксазолин, восстановленный поперечно сшитый желатин, нуклеофильный полиэтиленгликоль, такой как NH₂-PEG, желатин или хитозан, которые в присутствии воды могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером.

2. Гемостатический порошок по п.1, где нуклеофильный полимер представляет собой нуклеофильный полиэтиленгликоль.

3. Гемостатический порошок по п.1, где нуклеофильный полимер представляет собой желатин.

4. Гемостатический порошок по п.1, где нуклеофильный полимер представляет собой восстановленный поперечно сшитый желатин.

5. Гемостатический порошок по п.1, где нуклеофильный полимер представляет собой нуклеофильный полиоксазолин.

6. Гемостатический порошок по п.1, где нуклеофильный полимер представляет собой хитозан.

7. Гемостатический порошок по любому из предыдущих пунктов, где электрофильный полиоксазолин содержит, по меньшей мере, 8 химически активных электрофильных групп.

8. Гемостатический порошок по любому из предыдущих пунктов, где химически активные электрофильные группы электрофильного полиоксазолина выбирают из сложных эфиров карбоновых кислот, сложных сульфонатных эфиров, сложных фосфонатных эфиров, сложных пентафторфениловых эфиров, сложных п-нитрофениловых эфиров, сложных п-нитротиофениловых эфиров, групп галогенангидридов, ангидридов, кетонов, альдегидов, изоцианато, тиоизоцианато, изоциано, эпоксидов, активированных гидроксильных групп, олефинов, простых глицидиловых эфиров, карбоксила, сложных сукцинимидиловых эфиров, сложных сульфосукцинимидиловых эфиров, малеимидо (малеимидила), этенсульфонила, сложных имидо эфиров, ацетоацетата, галогенацеталя, ортопиридилдисульфида, дигидроксифениловых производных, винила, акрилата, акриламида, йодацетамида и их сочетаний.

9. Гемостатический порошок по любому из предыдущих пунктов, где агломераты частиц содержат, по меньшей мере, 10% масс. электрофильного полиоксазолина и, по меньшей мере, 10% масс. нуклеофильного полимера.

10. Гемостатический порошок по любому из предыдущих пунктов, где сочетание электрофильного полиоксазолина и нуклеофильного полимера составляет, по меньшей мере, 50% масс. агломератов частиц.

11. Гемостатический порошок по любому из предыдущих пунктов, где отношение общего количества химически активных электрофильных групп, обеспечиваемых электрофильным полиоксазолином, и общего количества химически активных нуклеофильных групп, обеспечиваемых нуклеофильным полимером, лежит в пределах от 1:1,5 до 1,5:1.

12. Способ приготовления агломератов гемостатических частиц из:

(a) частиц электрофильного полиоксазолина, содержащих электрофильный полиоксазолин, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные электрофильные группы и представляющий собой терполимер поли[2-(этил/гидрокси-этил-амид-этил/NHS-сложного эфира-этил-сложного эфира-этил-амид-этил)-2-оксазолина] с активированной боковой цепью NHS (N-гидроксисукцинимид), содержащей 20% NHS-сложноэфирных групп, которые могут взаимодействовать с аминовыми группами в крови с образованием ковалентной связи; и

(b) частиц нуклеофильного полимера, содержащих водорастворимый нуклеофильный полимер, несущий, по меньшей мере, 3 химически активные нуклеофильные группы и представляющий собой нуклеофильный полиоксазолин, восстановленный поперечно сшитый желатин, нуклеофильный полиэтиленгликоль, такой как NH₂-PEG, желатин или хитозан, которые могут взаимодействовать с химически активными электрофильными группами электрофильного полиоксазолина с образованием ковалентной связи между электрофильным полиоксазолином и нуклеофильным полимером; указанный способ включает стадию объединения 100 частей массовых частиц электрофильного полиоксазолина с 10-1000 частями массовыми частиц нуклеофильного полимера в присутствии неводной гранулирующей жидкости.

13. Способ по п.12, где неводная гранулирующая жидкость содержит, по меньшей мере, 60% масс. органического растворителя, выбранного из изопропилового спирта, этанола, метанола, простого диэтилового эфира, гептана, гексана, пентана, циклогексана, дихлорметана, ацетона и их смесей.

14. Способ по п.12 или 13, где способ включает стадию смачивания частиц электрофильного полиоксазолина неводной гранулирующей жидкостью, с последующей стадией объединения смоченных частиц электрофильного полиоксазолина с частицами нуклеофильного полимера.