СПОСОБ КОНЪЮГИРОВАНИЯ ПОЛИМЕРНОЙ ЧАСТИЦЫ Российский патент 2017 года по МПК C12Q1/68 C08F8/40 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие, в целом, относится к способам конъюгирования подложки и к подложкам, полученным посредством таких способов.

Уровень техники

Конъюгация полинуклеотидов с подложками вызывает интерес в различных отраслях промышленности. Подложки, включающие конъюгированные полинуклеотиды, пригодны для методик разделения, определения генетических маркеров и секвенирования.

Например, подложку, конъюгированную с полинуклеотидным зондом, можно применять с целью захвата генетических маркеров для определения. Иллюстративные генетические маркеры могут быть связаны с вариантами нарушения гена, заболеванием, вызванным бактериями или вирусами, или аллелями, пригодными для определения у людей. Подложки, включающие конъюгированные зонды, которые комплементарны генетическому маркеру, могут захватывать такой генетический маркер, а для определения наличия захваченного генетического маркера можно использовать различные методики.

Согласно другому примеру конъюгированная с полинуклеотидом подложка может быть пригодна при захвате и отделении генетического материала. Согласно примеру зонды на подложке могут быть комплементарны необходимому полинуклеотиду. Зонды могут быть способны к захвату необходимого полинуклеотида, а позднее высвобождению полинуклеотида, что дает возможность выделения полинуклеотида. Согласно другому примеру полимерные частицы, конъюгированные с полинуклеотидными зондами, которые комплементарны целевым полинуклеотидам, можно применять для захвата и отделения целевого полинуклеотида от раствора. В дальнейшем целевой полинуклеотид может высвобождаться из конъюгированной частицы в другом растворе.

Согласно следующему примеру конъюгированную с полинуклеотидом подложку можно применять в различных методиках секвенирования. Например, полимерную частицу, конъюгированную с полинуклеотидом или множественном копий полинуклеотида, можно применять в методиках секвенирования, таких как методики флуоресцентного секвенирования или методики ионного секвенирования.

В то время как каждое из описанных выше применений конъюгированных подложек представляет конкретный интерес для различных отраслей промышленности, надежная конъюгация полинуклеотида с такой подложкой, как полимерная подложка, часто является недостаточной. Такие недостатки приводят к более низким плотностям конъюгированного полинуклеотида или образованию случайных участков, лишенных необходимого полинуклеотида. Такие недостатки могут в результате привести к плохим результатам разделений, низкой точности в способах определения и низкому сигналу и высокому соотношению сигнал-шум в методиках секвенирования.

В связи с этим необходим усовершенствованный способ конъюгации.

Раскрытие изобретения

Согласно первому аспекту способ конъюгирования подложки предусматривает обмен связанного с биомолекулой противоиона с липофильным противоионом с получением биомолекулярного комплекса, диспергирование биомолекулярного комплекса в неводном растворителе и связывание биомолекулярного комплекса с подложкой в присутствии неводного растворителя.

Согласно второму аспекту способ конъюгирования полимерной частицы предусматривает обмен связанного с полинуклеотидом катионного противоиона с липофильным катионным противоионом с получением полинуклеотидного комплекса, причем полинуклеотид включает нуклеофильную или электрофильную реакционноспособную группу. Способ дополнительно предусматривает диспергирование полинуклеотидного комплекса в нереакционноспособном неводном растворителе и связывание полинуклеотида с полимерной частицей посредством нуклеофильного или электрофильного замещения, причем полимерная частица включает электрофильную группу или нуклеофильную группу.

Согласно третьему аспекту полимерная частица включает полимер, конъюгированный с полинуклеотидом при помощи способа по любому из описанных выше аспектов или примеров.

Согласно четвертому аспекту способ секвенирования предусматривает амплификацию целевого полинуклеотида в присутствии конъюгированной с олигонуклеотидом полимерной частицы с получением конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частицы. Олигонуклеотид является по меньшей мере частично комплементарным целевому полинуклеотиду. Конъюгированную с олигонуклеотидом полимерную частицу получают посредством способа по любому из описанных выше аспектов или примеров. Способ дополнительно предусматривает внесение конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частицы в устройство для секвенирования, внесение праймера к конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частице, встраивание нуклеотида и детектирование встраивания.

Согласно пятому аспекту способ выделения целевого полинуклеотида предусматривает приведение первого раствора, включающего целевой полинуклеотид, в контакт с конъюгированной с зондом подложкой. Зонд у конъюгированной с зондом подложки является по меньшей мере частично комплементарным целевому полинуклеотиду. Конъюгированную с зондом подложку получают посредством способа по любому из описанных выше аспектов или примеров. Способ дополнительно предусматривает промывание конъюгированной с зондом подложки пока целевой полинуклеотид связан с зондом и высвобождение целевого полинуклеотида во втором растворе.

Согласно дополнительному аспекту способ конъюгирования олигонуклеотида с полимером предусматривает обработку содержащего функциональную аминогруппу полимера сложным бис-NHS-эфиром или дисукцинимидилкарбонатом с получением функционализированного полимера и обработку функционализированного полимера олигонуклеотидом с концевой аминогруппой с получением конъюгированного полимера, включающего олигонуклеотид.

Краткое описание чертежей

Настоящее раскрытие можно понять лучше, а его многочисленные признаки и преимущества станут наглядными для специалистов в настоящей области техники, посредством обращения к прилагаемым чертежам.

Фиг. 1 представляет собой изображение иллюстративного способа обработки полинуклеотидов.

Фиг. 2 представляет собой изображение иллюстративного способа конъюгации.

Фиг. 3 представляет собой изображение иллюстративного способа секвенирования.

Фиг. 4 представляет собой изображение иллюстративного способа прямой конъюгации.

Фиг. 5 представляет собой изображение иллюстративного способа непрямой конъюгации.

Фиг. 6 представляет собой изображение иллюстративного способа конъюгации.

Применение одинаковых условных символов для различных чертежей указывает на одинаковые или идентичные элементы.

Осуществление изобретения

Согласно варианту осуществления, способ конъюгации предусматривает обмен связанных с биомолекулой противоионов с липофильными противоионами с получением биомолекулярного комплекса. Согласно примеру противоионы являются катионными. Биомолекулярный комплекс, такой как полинуклеотидный комплекс, можно диспергировать в неводном растворителе и конъюгировать с подложкой в присутствии неводного растворителя. Иллюстративная подложка характеризуется поверхностью, такой как керамическая, металлическая или полимерная поверхность. Согласно другому примеру подложка включает поддающуюся разбуханию полимерную частицу. В частности, биомолекулу можно конъюгировать с функциональными группами поддающегося разбуханию полимера по всей полимерной частице.

Согласно примеру конъюгированную подложку можно применять для захвата целевого полинуклеотида. Согласно конкретному примеру конъюгированный полинуклеотид можно удлинять согласно захваченному целевому полинуклеотиду. В случае полимерной частицы, включающей множественные копии конъюгированного полинуклеотида, копии конъюгированного полинуклеотида можно удлинять в соответствии с целевым полинуклеотидом с получением множественных копий комплементарной целевому полинуклеотиду цепи. Такая частица может быть пригодна в методиках секвенирования, таких как методики ионного секвенирования или секвенирования на основе регистрации изменения рН.

В частности, с помощью настоящего способа осуществляют конъюгацию в неводном растворе. Было обнаружено, что вода может конкурировать с различными химическими соединениями для конъюгации или препятствовать им, уменьшая эффективность конъюгации. Например, вода может препятствовать нуклеофильному или электрофильному замещению. Вода может конкурировать с нуклеофилом за электрофил посредством гидролиза электрофила в неактивный в отношении конъюгации фрагмент. Посредством конъюгации в неводном растворе или растворителе способы конъюгации, такие как нуклеофильное или электрофильное замещение, становятся более эффективными. Кроме того, в неводной среде можно использовать новые химические соединения для конъюгации.

Биомолекула может включать нуклеозиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты (олигонуклеотиды и полинуклеотиды), полипептиды, сахариды, полисахариды, липиды и их производные или аналоги. Согласно конкретному примеру биомолекула является полипептидом или нуклеиновой кислотой, такой как полинуклеотид. Например, биомолекула может представлять собой полинуклеотид или его аналог.

Как проиллюстрировано на Фиг. 1, противоионы биомолекулы можно подвергнуть обмену на липофильные противоионы с получением биомолекулярного комплекса, который является более липофильным. Проиллюстрированной биомолекулой является полинуклеотид 102. Как проиллюстрировано, полинуклеотид 102 получают из множества полимеризированных нуклеотидов. Углеводный фрагмент (X) нуклеотида связан с фосфатной группой близлежащего нуклеотида. Каждая фосфатная группа связана с катионным противоионом (М). Согласно примеру катионный противоион (М) может представлять собой ион металла. Согласно другому примеру катионный противоион (М) может представлять собой аммоний или протон. Кроме того, полинуклеотид 102 может включать линкерную группу (L), связывающую реакционноспособную группу (W) с нуклеотидной цепью. Альтернативно, биомолекула может представлять собой аналог полинуклеотида, имеющий сходную структуру линкерной/реакционноспособной группы, и полинуклеотид может иметь реакционноспособную группу (W), удлиняющую внешнюю часть на одно или несколько оснований в дополнение к внешней части углевода (X) или вместо нее.

Согласно примеру линкерная группа (L) включает углеводородную, эфирную или полиэфирную группу или их комбинацию. Реакционноспособная группа (W) может функционировать, вступая в реакцию с функциональными группами, сформированными на подложке, такой как полимерная подложка. Согласно конкретному примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой аминогруппу, тиоловую, малеимидную, ацетиленовую, азидную или их комбинацию. Например, реакционноспособная группа (W) может представлять собой аминогруппу или тиоловую группу. В частности, реакционноспособная группа (W) может представлять собой аминогруппу. Согласно примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой малеимидную группу. Согласно следующему примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой ацетиленовую группу. Согласно следующему примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой азидную группу

Полинуклеотид 102 подвергается воздействию липофильного противоиона 104. Липофильный противоион 104 может включать положительно заряженный элемент (Y), соединенный с одной или несколькими углеводородными группами (R1, R2, R3, R4) и связанный с противоионом (Z). Согласно примеру положительно заряженный элемент (Y) может представлять собой азот, фосфор, серу, мышьяк или любую их комбинацию. В частности, положительно заряженный элемент (Y) является азотом, фосфором, серой или их комбинацией. Например, положительно заряженный элемент (Y) может представлять собой азот или фосфор. В частности, положительно заряженный элемент (Y) является азотом, образующим аминогруппу с углеводородными группами (R1, R2, R3 или R4).

Положительно заряженный элемент (Y) включает одну или несколько углеводородных групп, например по меньшей мере две углеводородные группы, по меньшей мере три углеводородные группы или по меньшей мере четыре углеводородные группы. Как проиллюстрировано, положительно заряженный элемент (Y) включает четыре углеводородные группы (R1, R2, R3 или R4). Углеводородные группы (R1, R2, R3 или R4) независимо могут представлять собой алкильную группу, арильную группу, их эфирные производные или их комбинации. Согласно примеру алкильная углеводородная группа может включать метальную, этильную, пропильную или бутильную группу, их эфирное производное или их комбинацию. Например, пропильная группа может представлять собой н-пропильную, изопропильную или их комбинацию. Согласно примеру бутильная группа может представлять собой н-бутильную, изобутильную, втор-бутильную, трет-бутильную или любую их комбинацию. Иллюстративная арильная группа может включать фенильную, толильную, ксилильную или полиарильну, такую как нафтильную, их эфирные производные или любую их комбинацию.

В частности, липофильная группа [Y(R1)(R2)(R3)(R4)] может включать липофильный ион аммония, липофильный ион фосфония, липофильный ион арсония, липофильный ион сульфония или их комбинацию. Иллюстративный липофильный ион аммония включает тетраалкиламмоний, тетраариламмоний, смешаный алкил- и ариламмоний или их комбинацию. Например, иллюстративный липофильный ион аммония выбран из группы, состоящей из тетраметиламмония, тетраэтиламмония, тетрапропиламмония, тетрабутиламмония, тетрапентиламмония, тетрагексиламмония, тетрагептиламмония, тетраоктиламмония, их алкильных и арильных смесей и их комбинаций. Иллюстративный липофильный ион фосфония включает тетрафенилфосфоний. Иллюстративный липофильный ион арсония представляет собой тетраалкиларсоний, тетраариларсоний, ион смешаного алкил- и ариларсония или их комбинацию. Например, липофильный ион арсония представляет собой тетрафениларсоний. Иллюстративным липофильным ионом сульфония является ион триалкилсульфония. Ион (Z) может представлять собой ион с противоположным липофильной группе [Y(R1)(R2)(R3)(R4)] зарядом, такой как гидроксид, галоген, нитрат, карбонат, сульфат, перхлорат, фенолят, тетраалкилборат, тетраарилборат, фосфат-ион или любую их комбинацию.

У полинуклеотидного комплекса 106 в результате обмена наблюдают липофильные свойства, и его можно диспергировать в неводном растворителе. Согласно примеру неводный растворитель является полярным. Согласно следующему примеру неводный растворитель не вступает в реакцию со связывающими группами на подложке или функциональными группами полимера, такими как реакционноспособная группа (W) полинуклеотидного комплекса 106. Согласно примеру растворитель включает амид, мочевину, карбонат, простой эфир, сульфоксид, сульфон, стерически затрудненный спирт или их комбинацию. Иллюстративные амид или мочевина включают формамид, N,N-диметилформамид, ацетамид, N,N-диметилацетамид, гексаметилфосфорамид, пирролидон, N-метилпирролидон, N,N,N',N'-тетраметилмочевину, N,N'-диметил-N,N'-триметиленмочевину или их комбинацию. Иллюстративный карбонат включает диметилкарбонат, пропиленкарбонат или их комбинацию. Иллюстративный простой эфир включает тетрагидрофуран. Иллюстративный сульфоксид или сульфон включает диметилсульфоксид, диметилсульфон или их комбинацию. Иллюстративный стерически затрудненный спирт включает трет-бутиловый спирт.

После обмена или в ходе обмена полинуклеотидный комплекс 106 может быть диспергирован в неводном растворителе. Диспергированный полинуклеотидный комплекс 106 можно применять при конъюгации подложки.

Подложка может представлять собой твердую поверхность, частицу или их комбинацию. Согласно примеру подложка может представлять собой твердую поверхность. Подложка может включать плоские, вогнутые или выпуклые поверхности или любую их комбинацию. Подложка может иметь текстуру и особенности, включая следы от протравливания, пустоты или бугорки. Альтернативно, у подложки может отсутствовать какая-либо текстура или особенности. Подложка может включать капиллярные структуры, каналы, борозды, лунки или емкости. Согласно примеру подложка может представлять собой лунку. Подложка может быть пористой, полупористой или без пор. Согласно следующему примеру подложка может представлять собой фильтр или гель. Подложка может включать верхнюю часть иглы (например, массивов игл). Подложка может быть выполнена из материалов, таких как стекло, боросиликатное стекло, силикагель, кварц, плавленный кварц, слюда, полиакриламид и N-замещенные полиакриламиды, пластиковый полистирол, поликарбонат, полиметакрилат (РМА), полиметилметакрилат (РММА), полидиметилсилоксан (PDMS), кремний, германий, графит, керамика, кремний, полупроводник, диэлектрик с высоким показателем преломления, кристаллы, гели, полимеры или пленки (например, пленки из золота, серебра, алюминия или алмаза). В частности, подложка может включать твердую подложку, имеющую металлическую пленку или металлическое покрытие.

Согласно конкретному примеру подложка включает полимерные частицы, имеющие пористость, которая позволяет полинуклеотидному комплексу 106 диффундировать в полимерную частицу. В частности, полимерная частица может включать реакционноспособные функциональные группы, которые могут вступать в реакцию с реакционноспособной группой (W) полинуклеотидного комплекса 106. Согласно примеру полимерные частицы являются гидрофильными. Полимерная частица может поддаваться разбуханию. Например, полимерная частица может представлять собой гидрогель. Гидрофильная полимерная частица может иметь внешние функциональные группы, такие как гидроксильные группы или аминогруппы. Такие группы можно заменить другими функциональными группами для облегчения конъюгации с полинуклеотидным комплексом 106.

Согласно примеру полимерную частицу можно получить из стироловых полимеров, акрилатных полимеров, полиакриламидов или их комбинации. Например, полимерную частицу можно получить из полимеризированных мономеров. Мономер может представлять собой способный к радикальной полимеризации мономер, такой как виниловый мономер. В частности, мономер может включать гидрофильный мономер. Согласно примеру гидрофильный мономер может включать акриламид, винилацетат, гидроксиалкилметакрилат или любую их комбинацию. Согласно конкретному примеру гидрофильный мономер является акриламидом, таким как акриламид, включающий гидроксильные группы, аминогруппы или их комбинацию.Согласно примеру гидрофильный мономер представляет собой аминоалкилакриламид. Согласно другому примеру акриламид может представлять собой гидроксиалкилакриламид, такой как гидроксиэтилакриламид. В частности, гидроксиалкилакриламид может включать N-[трис(гидроксиметил)метил] акриламид, М-(гидроксиметил)акриламид или их комбинацию. Согласно конкретному примеру мономер включает гидроксильные группы. Согласно следующему примеру можно включить сомономер, такой как аминоакриламид, например, акриламид, функционализированный полиэтиленгликолем с концевой аминогруппой, или акрилопиперазин.

Согласно примеру полимер полимерной частицы можно получить в результате полимеризации мономера и сшивателя. Согласно примеру сшиватель включают в массовом соотношении мономер к сшивателю в диапазоне от 15:1 до 1:2, например, в диапазоне от 10:1 до 1:1, в диапазоне от 6:1 до 1:1 или даже в диапазоне от 4:1 до 1:1. В частности, сшиватель может представлять собой дивиниловый сшиватель. Например, дивиниловый сшиватель может включать диакриламид, такой как N,N'-(этан-1,2-диил)бис(2-гидроксил этил)акриламид, N,N'-(2-гидроксипропан-1,3-диил)диакриламид или их комбинация. Согласно другому примеру дивиниловый сшиватель включает этиленгликоль диметакрилат, дивинилбензол, гексаметиленбисакриламид, триметилолпропантриметакрилат, этилендиметакрилат или их комбинацию.

Согласно примеру полимерная частица может представлять собой гидрофильную частицу, такую как частица гидрогеля. Гидрогель является полимером, который может абсорбировать по меньшей мере 20% от своей массы воды, например, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 1000%, по меньшей мере 1500% или даже по меньшей мере 2000% от своей массы воды.

Полимерные частицы могут иметь необходимый размер частиц, например размер частицы, составляющий не более 100 мкм, не более 30 мкм или не более 3 мкм. Средний размер частиц представляет собой средний диаметр частицы. Например, средний размер частицы может составлять не более 2 мкм, например не более 1,5 мкм, не более 1,1 мкм, не более 0,8 мкм, не более 0,6 мкм, не более 0,5 мкм или даже не более 0,3 мкм. Согласно конкретному примеру средний размер частицы может находиться в диапазоне от 0,1 мкм до 100 мкм, например, в диапазоне от 0,1 мкм до 50 мкм или в диапазоне от 0,1 мкм до 1,1 мкм.

Согласно следующему примеру множество частиц является монодисперсным и может иметь необходимый низкий коэффициент вариации, например коэффициент вариации, составляющий не более 20%. Коэффициент вариации (CV) определяют как 100-кратное стандартное среднеквадратическое отклонение, деленное на среднее, причем "среднее" представляет собой средний диаметр частицы, а стандартное отклонение представляет собой стандартное отклонение размера частицы. Альтернативно, "среднее" может представлять собой либо z-средний, либо модовый диаметр частицы. В соответствии с обычной практикой CV рассчитывают по основной моде, т.е. основному пику, таким образом исключая неосновные пики, относящиеся к агрегатам. Таким образом, некоторые частицы с более низким или превышающим моду размером можно исключить при расчете, который, например, может быть основан на приблизительно 90% от общего числа детектируемых частиц. Такое определение CV можно осуществить на дисковой центрифуге CPS или счетчике Культера. Например, коэффициент вариации (CV) полимерных частиц может составлять не более 15%, например, не более 10%, не более 5%, не более 4,5%, не более 4,0%, не более 3,5% или даже не более 3,0%.

Согласно следующему примеру гидрофильная полимерная частица в воде может составлять не более 50 мас.% полимера, например, не более 30 мас.% полимера, не более 20 мас.% полимера, не более 10 мас.% полимера, не более 5 мас.% полимера или даже не более 2 мас.% полимера.

Согласно дополнительному примеру полимерная частица может иметь пористость, позволяющую диффузию полинуклеотидов, белков или ферментов. Согласно примеру полимерные частицы могут иметь пористость, позволяющую проникновение белков, имеющих размер, составляющий по меньшей мере 50 килодальтон, например, по меньшей мере 100 килодальтон, по меньшей мере 200 килодальтон, по меньшей мере 250 килодальтон или даже по меньшей мере 350 килодальтон.

Независимо от того твердая поверхность или полимерная частица, такие как описанные выше полимерные частицы, полинуклеотидный комплекс 106, проиллюстрированный на Фиг. 1, можно конъюгировать с подложкой в присутствии неводного растворителя. Например, полимер подложки может включать гидроксильные группы. Часть гидроксильных групп можно заменить на альтернативные функциональные группы для облегчения конъюгации с полинуклеотидным комплексом, таким как полинуклеотидный комплекс 106, проиллюстрированный на Фиг. 1.

Подложку можно подвергнуть прямой конъюгации или непрямой конъюгации. Согласно конкретному примеру функциональные группы полимера, такие как гидроксильная группа, могут подвергаться нуклеофильному или электрофильному замещению для конъюгации полимера с полинуклеотидом. Например, связывающая группа подложки может включать один нуклеофил или электрофил, а концевая реакционноспособная группа полинуклеотида может включать другой нуклеофил или электрофил. Полинуклеотид можно связать с полимерной частицей посредством нуклеофильного или электрофильного замещения. Согласно примеру прямая конъюгация полимера, включающего гидроксильную группу, может включать замену гидроксильной группы на сульфоэфирную, которую затем конъюгируют с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, включающим реакционноспособную аминогруппу или тиоловую группу. Например, гидроксильные группы на полимерной частице можно активировать посредством замены по меньшей мере части гидроксильных групп на сульфоэфирную группу. Иллюстративные сульфоэфирные группы могут быть получены от трезил-, метилсульфонил-, тозил- или фторбензолсульфонилхлорида или любой их комбинации, с получением функциональной сульфоэфирной группы вместо по меньшей мере части гидроксильных групп. Сульфоэфиры могут содействовать замене нуклеофиллами сульфоэфира. Сульфоэфир дополнительно может вступать в реакцию с высвобожденным хлором с образованием хлор-содержащих групп, которые можно применять в процессе конъюгации частиц. В соответствии с другим вариантом, гидроксильные группы можно заменить на галогеновые группы, которые могут вступать в реакцию с реакционноспособными группами полинуклеотидного комплекса. Согласно следующему примеру аминогруппы сомономеров полимерного полимера могут вступать в реакцию с реакционноспособными группами полинуклеотидного комплекса.

В соответствии с другим вариантом, конъюгация может быть непрямой, при которой функциональные группы полимера, такие как гидроксильные группы, заменяют посредством серии замещений, что в результате приводит к образованию функциональной группы (связывающей группы), которая может вступать в реакцию с реакционноспособной группой полинуклеотидного комплекса. Например, на Фиг. 2 проиллюстрирован полимер 202, который включает гидроксильные группы, которые могут быть замещены функциональными группами посредством серии из одного или нескольких замещений.

Например, в 204 по меньшей мере часть гидроксильных групп может быть заменена функциональной группой (А), такой как сульфоэфирная, отличный от фтора галоген или их комбинация. Такие функциональные группы (А) затем можно заменить, как проиллюстрировано на 206, на функциональную группу (В), такую как азидная, фталимидная, тиоэфирная, диаминогруппа с защищенным N, аминотиоэфирная группа с защищенным N, группа амино(олигонуклеотида) или их комбинация. Необязательно, такие функциональные группы (В) затем можно активировать, как проиллюстрировано на 208, при помощи функциональной группы (С), такой как аминогруппа, тиоловая или их комбинация. Кроме того, такие проиллюстрированные на 208 функциональные группы (С) можно заменить на функциональные группы (D), которые проиллюстрированы на 210, такие как группа моноамид-моно(сложный NHS-эфир)дикарбоновой кислоты, сукцинимидтиоэфир(олигонуклеотида) или их комбинация. Более того, проиллюстрированную на 210 функциональную группу (D) можно заменить, как проиллюстрировано на 212, на функциональную группу (Е), такую как группа моноамид-(амино-олигонуклеотид)-моноамиддикарбоновой кислоты. В связи с этим, функциональные группы исходного полимера можно подвергнуть одной или нескольким сериям замещений, что делает реакционные центры пригодными для вступления в реакцию с полинуклеотидным комплексом.

Альтернативно, вместо полимера, включающего гидроксильные группы, можно применять полиакриламид, имеющий функциональную аминогруппу. Например, проиллюстрированные гидроксильные группы можно заменить на группу простого полиэфира с концевой аминогруппой (например, PEG с концевой аминогруппой). Вместе с функциональной аминогруппой иллюстрированный способ можно начинать, например, на (С).

Согласно конкретному примеру функциональная группа (А) на 204 может представлять собой сульфоэфирную группу, галоген или их комбинацию. В частности, галогеном является отличный от фтора галоген, такой как хлор. Функциональная группа (А) может вступать в реакцию с полинуклеотидным комплексом 106, где линкерная группа (L) представляет собой углеводородную или полиэфирную группу, а реакционноспособная группа (Р) представляет собой аминогруппу в неводном растворителе, с получением функциональной группы (В) в 206, такой как группа амино(олигонуклеотида). Согласно другому примеру, в котором функциональную группу (А) в 204 заменяют функциональной группой (В) в 206, функциональная группа (А) может представлять собой сульфоэфирную группу, галоген или их комбинацию, функциональная группа (В) может представлять собой азидную, фталимидную, диаминогруппу с одним защищенным N или аминотиоэфирную группу с защищенным N. Функциональную группу (В) дополнительно можно активировать до функциональной группы (С), такой как аминогруппа. Функциональную аминогруппу (C) можно дополнительно активировать при помощи функциональной группы (D), такой как (моно-амид)-(моно-NHS-эфир)дикарбоновая кислота. Функциональную группу (D) можно дополнительно заместить на функциональную группу (Е), такую как группа (амино(олигонуклеотид))-дикарбоновой кислоты, посредством реакции с полинуклеотидным комплексом 106, который включает линкерную группу (L), представляющую собой углеводород или простой полиэфир, и реакционноспособную функциональную группу (Р), представляющую собой аминогруппу в неводном растворителе. Альтернативно, полимерная частица может представлять собой сополимер, включающий сомономер, который включает функциональные аминогруппы. Такие функциональные аминогруппы могут вступать в реакцию с

Согласно следующему примеру функциональная группа (А) представляет собой сульфоэфирную группу, галоген или их комбинацию. Функциональной группой (В) является азидная группа. В этом случае функциональную группу (В) можно заместить на функциональную группу (С), такую как группу (олигонуклеотид)триазола. Полинуклеотидный комплекс включает линкерную группу (L), представляющую собой углеводород или простой полиэфир, и реакционноспособную функциональную группу (Р), представляющую собой ацетиленовую группу.

Согласно дополнительному примеру функциональная группа (А) может представлять собой сульфоэфир, галоген или их комбинацию. Функциональную группу (А) замещают на функциональную группу (В), такую как тиоэфирная группа. Тиоэфирную функциональную группу (В) можно заместить на функциональную группу (С), такую как тиоловая, которую затем замещают функциональной группой (D), такой как группа сукцинимидтиоэфир(олигонуклеотида). Согласно такому примеру полинуклеотидный комплекс может включать линкер (L), такой как углеводород или простой полиэфир, и реакционноспособную группу (Р), такую как малеимидная.

Другие химические способы активации предусматривают включение множества этапов для преобразования определенной функциональной группы с целью образования конкретных необходимых связей. Например, модифицированную сульфонатом гидроксильную группу можно преобразовывать в нуклеофильную группу посредством нескольких способов. Согласно примеру реакция сульфоэфира с азидным анионом дает в результате замещенный азидом гидрофильный полимер. Азид можно непосредственно использовать для конъюгации с замещенной ацетиленом биомолекулой посредством "клик-химии", такую реакцию можно осуществить с медным катализом или без него. Необязательно, азид можно преобразовать до амина посредством, например, каталитического восстановления при помощи водорода или восстановления при помощи органического фосфина. Полученный в результате амин можно затем преобразовать в электрофильную группу при помощи различных реагентов, таких как диизоцианаты, сложные бис-NHS-эфиры, хлорангидрид циануровой кислоты или их комбинация. Согласно примеру применение диизоцианатов приводит к образованию группировки мочевины между полимером и линкером, что приводит в результате к образованию остаточной изоцианатной группы, которая может вступать в реакцию с замещенной амином биомолекулой с образованием группировки мочевины между линкером и биомолекулой. Согласно другому примеру применение сложных бис-NHS-эфиров приводит к образованию амидной связи между полимером и линкером и остаточной группы сложного NHS-эфира, которая способна вступать в реакцию с замещенной амином биомолекулой с образованием амидной связи между линкером и биомолекулой. Иллюстративный сложный бис-NHS-эфир включает сложные бис-сукцинимидил-С2-С12-алкиловые эфиры, такие как бис-сукцинимидилсуберат или бис-сукцинимидилглутарат. Согласно следующему примеру применение хлорангидрида циануровой кислоты приводит к образованию аминотриазинового мостика между полимером и линкером и двух остаточных хлортриазиновых групп, одна из которых способна вступать в реакцию с замещенной амином биомолекулой с образованием аминотриазинового мостика между линкером и биомолекулой. Другие нуклеофильные группы можно включить в частицу посредством сульфонатной активации. Например, с помощью реакции сульфированных частиц с анионом тиобензойной кислоты и гидролиза последующего тиобензоата включают тиол в частицу, который может в дальнейшем вступать в реакцию с замещенной малеимидом биомолекулой с образованием тиосукцинимидного мостика с биомолекулой. Тиол также может вступать в реакцию с бромацетильной группой.

Согласно следующему примеру полимерную частицу можно обработать с получением функциональной аминогруппы, которую можно конъюгировать посредством применения сложного бис-NHS-эфира или дисукцинимидилкарбоната. Иллюстративный сложный бис-NHS-эфир включает сложные бис-сукцинимидил-С2-С12-алкиловые эфиры, такие как бис-сукцинимидилсуберат или бис-сукцинимидилглутарат. Например, полимерную частицу, такую как частица, включающая доступные гидроксильные группы, можно обработать с заменой гидроксильных групп на галоген, такой как хлор. Частицу дополнительно можно обработать в кислотных условиях посредством полиэфира с концевой аминогруппой, защищенной tBOC (N-трет-бутоксикарбонилом), таким как полиэтиленгликоль (PEG), с получением функциональной аминогруппы, которую можно в дальнейшем использовать для конъюгации полимерной частицы. В соответствии с другим вариантом, полимерную частицу можно полимеризировать с использованием мономеров, которые обеспечивают функциональную аминогруппу. Полимерную частицу, включающую аминогруппу можно дополнительно обработать с применением бис-NHS-эфира или дисукцинимидилкарбоната, который дополнительно подвергают воздействию олигонуклеотида с концевой аминогруппой, с получением в результате конъюгированной с олигонуклеотидом полимерной частицы.

После конъюгации полимерная частица может иметь плотность полинуклеотидов, называемую нуклеотидной плотностью, составляющую по меньшей мере 7×10⁴ на мкм³. Например, нуклеотидная плотность может составлять по меньшей мере 10⁵ на мкм³, например, по меньшей мере 10⁶ на мкм³, по меньшей мере 2×10⁶ на мкм³, по меньшей мере 5×10⁶ на мкм³, по меньшей мере 8×10⁶ на мкм³, по меньшей мере 1×10⁷ на мкм³ или даже по меньшей мере 3×107 на мкм³.

Согласно конкретному примеру конъюгированные частицы можно применять в методиках разделения или методиках секвенирования. Например, конъюгированные частицы можно применять для захвата целевых полинуклеотидов. Согласно примеру конъюгированные с полимером полинуклеотиды можно удлинять согласно захваченным целевым полинуклеотидам. Такие конъюгированные частицы можно применять в методиках секвенирования, таких как методики ионного секвенированния или секвенирования на основе регистрации изменения рН. Как проиллюстрировано на Фиг. 3, множество конъюгированных полимерных частиц 304 может быть расположено в растворе одновременно со множеством целевых полинуклеотидов 302. Множество частиц 304 можно конъюгировать с полинуклеотидами-зондами, связывающимися с целевыми полинуклеотидами 302. Например, конъюгированные частицы 304 могут включать олигонуклеотидную цепь, комплементарную части целевых полинуклеотидов 302.

Согласно конкретному варианту осуществления, частицы 304 и полинуклеотиды 302 подвергают амплификации в ходе полимеразной цепной реакции (PCR). Например, капли 306 или 308 дисперсной фазы получают как часть эмульсии, и они могут включать гидрофильную частицу или полинуклеотид. Согласно примеру целевые полинуклеотиды 302 и гидрофильные частицы 304 вносят в низкой концентрации и соотношениях относительно друг к другу так, чтобы отдельный полинуклеотид 302 мог располагаться в той же капле дисперсной фазы, что и отдельная гидрофильная частица 304. Другие капли, такие как капля 308, могут включать отдельную гидрофильную частицу и не включать полинуклеотид. Каждая капля 306 или 308 может включать ферменты, нуклеотиды, соли или другие компоненты, достаточные для облегчения дупликации полинуклеотида.

Дупликация целевого полинуклеотида может включать модулирование условий дупликации. Модулирование может необязательно включать повышение или понижение концентрации полимеразы, повышение или понижение концентрации нуклеотидов, повышение или понижение концентрации катионов, повышение или понижение температуры, времени или рН реакции и т.п. Модулирование может включать повышение или понижение скорости реакции, повышение или понижение выхода продукта реакции и т.п. Дупликацию можно осуществлять в присутствии соответствующих буферов или нуклеотидов (включая нуклеотидные аналоги или биотинилированные нуклеотиды).

В частности, подлежащий амплификации полинуклеотид можно захватывать полимерной частицей. Иллюстративные способы захвата нуклеиновой кислоты могут включать гибридизацию полинуклеотида с олигонуклеотидом, который присоединен к полимерной частице. Способы захвата нуклеиновых кислот могут предусматривать: (а) внесение полимерной частицы, прикрепленной к одноцепочечному олигонуклеотиду (например, олигонуклеотиду для захвата), (b) внесение одноцепочечного полинуклеотида и (с) гибридизацию одноцепочечного олигонуклеотида с одноцепочечными полинуклеотидами с захватом, таким образом, одноцепочечного полинуклеотида полимерной частицей. Каждая из полимерных частиц может быть прикреплена к множеству одноцепочечных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотидов для захвата). Согласно некоторым вариантам осуществления, этап (с) можно выполнять со множеством одноцепочечных полинуклеотидов. Согласно некоторым вариантам осуществления, по меньшей мере часть одноцепочечного олигонуклеотида включает нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной (или частично комплементарной) по меньшей мере части одноцепочечного полинуклеотида.

Согласно примеру способ может дополнительно предусматривать амплификацию полинуклеотида во множество полинуклеотидов и прикрепление по меньшей мере части множества полинуклеотидов к гидрофильной частице с получением, таким образом, гидрофильной частицы, включающей множество прикрепленных полинуклеотидов. В соответствии с другим вариантом, способ может предусматривать амплификацию полинуклеотида во множество комплементарных полинуклеотидов посредством удлинения конъюгированного олигонуклеотида с получением, таким образом, частицы гидрогеля, включающей множество прикрепленных полинуклеотидов.

Согласно следующему примеру способы нуклеотидного встраивания могут предусматривать: проведение реакции нуклеотидной полимеризации на полинуклеотиде, который гибридизирован с олигонуклеотидом, который прикреплен к полимерной частице. Согласно некоторым вариантам осуществления, способы нуклеотидного встраивания предусматривают: (а) внесение полимерной частицы, прикрепленной к одноцепочечному олигонуклеотиду (например, праймерному олигонуклеотиду), (b) внесение одноцепочечного матричного полинуклеотида, (с) гибридизацию одноцепочечного олигонуклеотида с одноцепочечным матричным полинуклеотидом и (d) приведение одноцепочечного матричного полинуклеотида в контакт с полимеразой и по меньшей мере одним нуклеотидом в условиях, подходящих для того, чтобы полимераза катализировала полимеризацию по меньшей мере одного нуклеотида на одноцепочечном олигонуклеотиде, с осуществлением, таким образом, нуклеотидного встраивания. Согласно некоторым вариантам осуществления, каждая из полимерных частиц может быть прикреплена ко множеству одноцепочечных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотидов для захвата). Согласно некоторым вариантам осуществления, этапы (b), (с) или (d) можно выполнять со множеством одноцепочечных полинуклеотидов. Согласно некоторым вариантам осуществления, по меньшей мере часть одноцепочечного олигонуклеотида содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной (или частично комплементарной) по меньшей мере части одноцепочечного полинуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления, система содержит одноцепочечный полинуклеотид, гибридизированный с одноцепочечным олигонуклеотидом, который прикреплен к полимерной частице, причем по меньшей мере один нуклеотид полимеризируют на конце одноцепочечного олигонуклеотида.

Согласно другому примеру способы удлинения праймера могут предусматривать: проведение реакции удлинения праймера на полинуклеотиде, который гибридизирован с олигонуклеотидом, который прикреплен к полимерной частице. Согласно некоторым вариантам осуществления, способы удлинения праймера нуклеиновой кислоты предусматривают: (а) внесение полимерной частицы, прикрепленной к одноцепочечному олигонуклеотиду (например, праймерному олигонуклеотиду), (b) внесение одноцепочечного матричного полинуклеотида, (с) гибридизацию одноцепочечного олигонуклеотида с одноцепочечным матричным полинуклеотидом и (d) приведение одноцепочечного матричного полинуклеотида в контакт с полимеразой и по меньшей мере одним нуклеотидом в условиях, подходящих для того, чтобы полимераза катализировала полимеризацию по меньшей мере одного нуклеотида на одноцепочечном олигонуклеотиде, с удлинением, таким образом, праймера. Согласно некоторым вариантам осуществления, каждая из полимерных частиц может быть прикреплена ко множеству одноцепочечных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотидов для захвата). Согласно некоторым вариантам осуществления, этап (b), (с) или (d) можно выполнять со множеством одноцепочечных полинуклеотидов. Согласно некоторым вариантам осуществления, по меньшей мере часть одноцепочечного олигонуклеотида содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной (или частично комплементарной) по меньшей мере части одноцепочечного полинуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления, система содержит одноцепочечный полинуклеотид, гибридизированный с одноцепочечным олигонуклеотидом, который прикреплен к полимерной частице, причем одноцепочечный олигонуклеотид удлиняют на один или несколько нуклеотидов.

Согласно дополнительным примерам, способы амплификации нуклеиновой кислоты предусматривают: проведение реакции удлинения праймера на полинуклеотиде, который гибридизирован с олигонуклеотидом, который прикреплен к полимерной частице. Согласно некоторым вариантам осуществления, способы амплификации нуклеиновой кислоты предусматривают: (а) внесение полимерной частицы, прикрепленной к одноцепочечному олигонуклеотиду (например, праймерному олигонуклеотиду), (b) внесение одноцепочечного матричного полинуклеотида, (с) гибридизацию одноцепочечного олигонуклеотида с одноцепочечным матричным полинуклеотидом, (d) приведение одноцепочечного матричного полинуклеотида в контакт с полимеразой и по меньшей мере одним нуклеотидом в условиях, подходящих для того, чтобы полимераза катализировала полимеризацию по меньшей мере одного нуклеотида на одноцепочечном олигонуклеотиде, с образованием, таким образом, удлиненного одноцепочечного олигонуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления, способ дополнительно предусматривает: (е) удаление (например, денатурацию) одноцепочечного матричного полинуклеотида из удлиненного одноцепочечного олигонуклеотида так, чтобы одноцепочечный олигонуклеотид оставался прикрепленным к полимерной частице, (f) гибридизацию оставшегося одноцепочечного олигонуклеотида со вторым одноцепочечным матричным полинуклеотидом и (g) приведение второго одноцепочечного матричного полинуклеотида в контакт со второй полимеразой и вторым по меньшей мере одним нуклеотидом в условиях, подходящих для того, чтобы вторая полимераза катализировала полимеризацию второго по меньшей мере одного нуклеотида на одноцепочечном олигонуклеотиде, с образованием, таким образом, очередного удлиненного одноцепочечного олигонуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления, этапы (е), (f) и (g) можно повторить по меньшей мере один раз. Согласно некоторым вариантам осуществления, полимераза и вторая полимераза включают термоустойчивую полимеразу. Согласно некоторым вариантам осуществления, условия, подходящие для нуклеотидной полимеризации, включают выполнение этапов нуклеотидной полимеризации (например, этапов (d) или (g)) при повышенной температуре. Согласно некоторым вариантам осуществления, условия, подходящие для нуклеотидной полимеризации, включают выполнение этапов нуклеотидной полимеризации (например, этапов (d) или (g)) при переменных температурах (например, повышенной температуре и относительно более низкой температуре). Согласно некоторым вариантам осуществления, переменная температура варьирует в диапазоне от 60 до 95°С. Согласно некоторым вариантам осуществления, температурные циклы могут составлять от приблизительно 10 секунд до приблизительно 5 минут, или приблизительно 10 минут, или приблизительно 15 минут, или дольше. Согласно некоторым вариантам осуществления, при помощи способов амплификации нуклеиновых кислот можно получить одну или несколько полимерных частиц, каждая из которых прикреплена ко множеству матричных полинуклеотидов, содержащих последовательности, которые являются комплементарными одноцепочечному матричному полинуклеотиду или второму одноцепочечному матричному полинуклеотиду. Согласно некоторым вариантам осуществления, каждая из полимерных частиц может быть прикреплена ко множеству одноцепочечных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотидов для захвата). Согласно некоторым вариантам осуществления, этап (b), (с), (d), (е), (f) или (g) можно выполнять со множеством одноцепочечных полинуклеотидов. Согласно некоторым вариантам осуществления, по меньшей мере часть одноцепочечного олигонуклеотида содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной (или частично комплементарной) по меньшей мере части одноцепочечного полинуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления, способы амплификаци нуклеиновых кислот (которые описаны выше) можно осуществлять в растворе водной фазы в масляной фазе (например, капле дисперсной фазы).

После PCR получают частицы, такие как частица 310, которые могут включать гидрофильную частицу 312 и множество копий 314 целевого полинуклеотида или комплементарных ему цепей. Несмотря на то, что полинуклеотиды 314 проиллюстрированы как находящиеся на поверхности частицы 310, полинуклеотиды 314 можно удлинять внутри частицы 310. Частицы гидрогеля и гидрофильные частицы, имеющие низкую концентрацию полимера по отношению к воде, могут включать полинуклеотидные сегменты на внутренней части частицы и по всей частице 310, или полинуклеотиды могут располагаться в порах и других отверстиях. В частности, частица 310 может допускать диффузию ферментов, нуклеотидов, праймеров и продуктов реакции, используемых для наблюдения за реакцией. Высокое число полинуклеотидов на частицу дает более хороший сигнал в конкретных методиках секвенирования.

Согласно иллюстративному варианту осуществления частицу 310 можно использовать в устройстве для секвенирования. Например, устройство 316 для секвенирования может включать матрицу 318 с лунками. Частицу 310 можно поместить в лунку 318.

Согласно примеру в лунки 318 можно добавить праймер или частицу 310 можно предварительно подвергнуть действию праймера перед размещением в лунке 318. Праймер и полинуклеотид образуют дуплекс нуклеиновой кислоты, включающий полинуклеотид (например, матричную нуклеиновую кислоту), гибридизированный с праймером. Дуплекс нуклеиновой кислоты по меньшей мере частично является двухцепочечным полинуклеотидом. В лунке 318 могут быть предусмотрены ферменты и нуклеотиды для облегчения прохождения детектируемых реакций, таких как нуклеотидное встраивание.

Секвенирование можно осуществлять посредством детектирования присоединения нуклеотида. Присоединение нуклеотида можно детектировать с применением таких способов, как способы на основе флуоресцентного излучения или способы детектирования ионов. Например, для системы 316 может быть предусмотрен набор нуклеотидов с флуоресцентной меткой, и он может быть перенесен в лунку 318. Лунку 318 также можно подвергнуть действию энергии возбуждения. При захвате нуклеотида полимеразой и присоединении его к концу удлиняющегося праймера метка нуклеотида может флуоресцировать, указывая какой тип нуклеотида присоединен.

Согласно альтернативному примеру растворы, содержащие один тип нуклеотида, можно подавать последовательно. В ответ на присоединение нуклеотида рН локальной среды лунки 318 может изменяться. Такое изменение рН можно детектировать посредством ионно-чувствительных полевых транзисторов (ISFET). В этой связи, изменение рН можно использовать для создания сигнала, указывающего порядок нуклеотидов, комплементарных полинуклеотиду 314 частицы 310.

В частности, система для секвенирования может включать лунку или множество лунок, расположенные над панелью с ионным датчиком, таким как транзистор на эффекте поля (FET). Согласно некоторым вариантам осуществления, система включает одну или несколько полимерных частиц, загруженных в лунку, которая расположена над панелью с ионным датчиком (например, FET), или одну или несколько полимерных частиц, загруженных во множество лунок, которые расположены над панелями с ионными датчиками (например, FET). Согласно некоторым вариантам осуществления, FET может представлять собой chemFET или ISFET. "ChemFET" или химический транзистор на эффекте поля включает тип транзистора на эффекте поля, который действует как химический датчик. Он представляет собой структурный аналог транзистора MOSFET, в котором заряд на электроде затвора подается в результате химического процесса. "ISFET" или ионно-селективный полевой транзистор можно применять для измерения концентраций ионов в растворе, при изменении концентрации ионов (таких как Н+) ток через транзистор изменяется соответственно.

FET может представлять собой матрицу FET. Применяемый в настоящем документе термин "матрица" представляет собой планарное упорядочивание элементов, таких как датчики или лунки. Матрица может быть одномерной или двухмерной. Одномерная матрица может представлять собой матрицу, имеющую одну колонку (или ряд) элементов в первой координате и множество рядов (или колонок) во второй координате. Число колонок (или рядов) в первой или второй координате может быть одинаковым или не быть одинаковым.

Над матрицей FET-датчиков могут быть сформированы одна или несколько микропотоковых структур, предназначенных для сдерживания или ограничения биологической или химической реакции. Например, согласно одному осуществлению, микрожидкостная структура(структуры) может быть сконфигурирована в виде одной или нескольких лунок (или микролунок, или реакционных камер, или реакционных лунок, названия которых в настоящем документе используют взаимозаменяемо), размещенных над одним или несколькими датчиками матрицы, так, чтобы один или несколько датчиков, над которыми размещена указанная лунка, детектировали и измеряли наличие аналита, уровень или концентрацию в указанной лунке. Согласно некоторым вариантам осуществления, соответствие FET-датчиков и реакционных лунок может составлять 1:1.

Обратимся к Фиг. 3, согласно другому примеру лунку 318 в матрице лунок можно функционально связать с измерительными устройствами. Например, для способов на основе флуоресцентного излучения лунку 318 можно функционально связать с устройством для детектирования света. Что касается ионного детектирования, нижнюю поверхность лунки 318 можно расположить поверх панели с ионным датчиком, таким как транзистор на эффекте поля.

Одна иллюстративная система, включающая секвенирование посредством детектирования ионных побочных продуктов нуклеотидного встраивания, представляет собой секвенатор Ion Torrent PGM™ (Life Technologies), который является системой ионного секвенирования, которая секвенирует матрицы нуклеиновой кислоты посредством детектирование ионов водорода, вырабатываемых в виде побочного продукта нуклеотидного встраивания. Как правило, ионы водорода выделяются в виде побочных продуктов нуклеотидных встраиваний, происходящих в ходе матричного синтеза нуклеиновых кислот посредством полимеразы. Секвенатор Ion Torrent PGM™ детектирует нуклеотидные встраивания посредством детекции водородных ионных побочных продуктов нуклеотидных встраиваний. Секвенатор Ion Torrent PGM™ может включать множество подлежащих секвенированию матричных полинуклеотидов, причем каждый матричный полинуклеотид расположен в соответственной лунке для реакции секвенирования в матрице. Каждая из лунок матрицы может быть связана по меньшей мере с одним ионным датчиком, который может детектировать высвобождение ионов Н+ или изменения рН раствора, получаемых в качестве побочного продукта нуклеотидного встраивания. Ионный датчик включает транзистор на эффекте поля (FET), соединенный с ионно-чувствительным слоем для детекции, который может воспринимать наличие ионов Н+ или изменения рН раствора. Ионный датчик может подавать выходные сигналы, указывающие на нуклеотидное встраивание, которые можно представить как скачкообразное изменение напряжения, величина которого коррелирует с концентрацией ионов Н+в соответствующей лунке или реакционной камере. В реакционную камеру можно последовательно подавать потоком различные типы нуклеотидов, а они могут встраиваться полимеразой в удлиняющийся праймер (или участок полимеризации) в порядке, определяемом последовательностью матричного полинуклеотида. Каждое нуклеотидное встраивание может сопровождаться высвобождением ионов Н+ в реакционной лунке вместе с сопутствующим изменением локального рН. Высвобождение ионов Н+ можно регистрировать посредством FET-датчика, который производит сигналы, указывающие на осуществление нуклеотидного встраивания. Нуклеотиды, которые не встроились в ходе потока конкретного нуклеотида, не могут производить сигналы. Амплитуда сигналов от FET также может коррелировать с числом нуклеотидов конкретного типа, встраивающихся в удлиняющуюся молекулу нуклеиновой кислоты, что, таким образом, позволяет анализировать гомополимерные участки. Таким образом, отслеживание встраивания по многочисленным лункам или реакционным камерам в ходе цикла множества потоков нуклеотидов секвенатора в реакционную камеру может позволить прибору осуществлять одновременный анализ последовательности множества полинуклеотидов. Дополнительные детали касательно композиций, схемы и принципа действия секвенатора Ion Torrent PGM™ можно найти, например, в заявке на выдачу патента США №12/002781, в настоящее время опубликованной как патентная публикация США №2009/0026082, заявке на выдачу патента США №12/474897, в настоящее время опубликованной как патентная публикация США №2010/0137143, и заявке на выдачу патента США №12/492844, в настоящее время опубликованной как патентная публикация США №2010/0282617, все из которых включены с помощью ссылки в настоящий документ в полном их объеме.

Примеры

Пример 1

Олигонуклеотид непосредственно конъюгировали с активированной метилсульфонилом частицей Dynal, как проиллюстрировано на Фиг. 4. Несмотря на то, что функциональные группы проиллюстрированы как находящиеся на поверхности частицы, функциональные группы могут встречаться по всей частице. Активированные метилсульфонилхлоридом микрогели получали с помощью способа Угельстад, посевной эмульсионной полимеризации. Полученные таким образом частицы промывали в N-метил-2-пирролидоне (NMP) в препарате для конъюгации с подвергающейся ионообмену одноцепочечной ДНК.

Натриевую соль 5'-NH2-C6-30-мерного олигонуклеотида растворяли в 0,1 М тетрабутиламмония ацетате и вводили на колонку для обращенно-фазовой HPLC. Элюирование осуществляли с помощью подвижной фазы, представлявшей собой 0,1 М тетрабутиламмония ацетат. Содержавшую нуклеиновые кислоты фракцию собирали, лиофилизировали до сухого порошка и ресуспендировали в сухом N-метил-2-пирролидоне (NMP).

Пять миллионов частиц (5,0×10⁹) диспергировали в 350 мкл безводного NMP и для диспергирования встряхивали на вортексе. К смеси частиц непосредственно добавляли 124 мкл Bu4NAc-ДНК (5'-NH2-C6-30-мерного олигонуклеотида) в NMP (4,10 мМ). Затем к реакционной смеси добавляли 19,5 мкл тетраэтиламмония бората (26,14 мМ) до конечного объема, составлявшего 500 мкл.

Реакционную смесь быстро перемешивали на вортексе и аккуратно перемешивали при 70°С в течение 16 часов. Смесь центрифугировали, надосадочную жидкость декантировали, а частицы ресуспендировали в 1 мл NMP. После перемешивания на вортексе ресуспендированные частицы микрогеля осаждали за два цикла осаждения/диспергирования в NMP. После второго промывания NMP осадки вносили в 1 мл 2x SSPE/0,1% додецилсульфата натрия (SDS), перемешивали и центрифугировали с получением осадков. Наконец, частицы вносили в 1 мл 1x PBS/0,1% Triton Х-100, перемешивали и центрифугировали с получением плотного осадка, повторяя этот процесс три раза. После конечного цикла конъюгированные микрогели ресуспендировали в 500 мкл 1x PBS/0,1% Triton Х-100.

Конъюгированные материалы затем подсчитывали после мечения красителем SYBR-золотой при помощи проточного цитометра. Материалы готовы для PCR-амплификации ДНК-матрицы при подготовке к секвенированию.

Пример 2

Частицу конъюгировали посредством серии замещений, как проиллюстрировано на Фиг. 5. Несмотря на то, что функциональные группы проиллюстрированы как находящиеся на поверхности частицы, функциональные группы могут встречаться по всей частице.

К раствору активированных метилсульфонхлоридом гидрогелей в NMP (2 миллиарда, 1 мл) в 2-мл пробирке для центрифугирования добавляли раствор насыщенного азида тетрабутиламмония в NMP (800 мкл) и реакционную смесь помешивали при 60°С на протяжении ночи. Реакционную смесь в течение 10 мин центрифугировали при 21300 rcf и надосадочную жидкость удаляли. Полученный осадок ресуспендировали в NMP и центрифугировали с удалением надосадочной жидкости. Процесс повторяли два раза.

Полученный в результате осадок ресуспендировали в деионизированной (DI) воде (1 мл). Реакционную смесь в течение 10 мин центрифугировали при 21300 rcf и надосадочную жидкость удаляли. Процесс повторяли еще 2 раза.

К осадку добавляли 1 мл раствора ТСЕР (DI вода, 1 М) и реакционную смесь помешивали при комнатное температуре на протяжении ночи. Для удаления надосадочной жидкости реакционную смесь центрифугироали в течение 10 мин при 21300 rcf. Полученный в результате осадок ресуспендировали в DI воде и для удаления надосадочной жидкости еще два раза центрифугировали в течение 10 минут при 21300 rcf. Реакционную смесь ресуспендировали в безводном NMP (1 мл) и центрифугировали в течение 10 мин при 21300 rcf. Удаляли надосадочную жидкость и процесс повторяли еще 3 раза.

Полученный в результате осадок ресуспендировали в безводном NMP (500 мкл) и к реакционной смеси добавляли раствор Bis-NHS-суберата в безводном NMP (200 мкл, 20 мг). Реакционную смесь помешивали на протяжении ночи при 70°С. Для удаления надосадочной жидкости реакционную смесь центрифугироали в течение 10 мин при 21300 rcf. Реакционную смесь ресуспендировали в безводном NMP (1 мл) и для удаления надосадочной жидкости центрифугировали в течение 10 мин при 21300 rcf. Процесс повторяли еще пять раз и полученный в результате осадок ресуспендировали в безводном NMP (200 мкл).

К реакционной смеси добавляли раствор олигонуклеотида (Bu4NAc-ДНК (5'-NH2-C6-30-мерный олигонуклеотид) в NMP) (0,6 мкмоль, 200 мкл) и раствор тетрабутиламмония бората в безводном NMP (60 мкл, 1 мг в 200 мкл) и реакционную смесь помешивали на протяжении ночи при 70°С.

Для удаления надосадочной жидкости реакционную смесь центрифугировали в течение 10 мин при 21300 rcf, а полученный в результате осадок ресуспендировали в NMP (1 мл). В течение 10 мин реакционную смесь центрифугировали при 21300 rcf и полученный в результате осадок ресуспендировали в NMP. Процесс повторяли еще три раза и осадок ресуспендировали в растворе 2x SSPE + 0,2% SDS (1 мл) и в течение 10 мин центрифугировали при 21300 rcf. Полученный в результате осадок ресуспендировали в 1х ТЕ-буфере с 0,1% Triton X100 (1 мл). В течение 10 мин реакционную смесь центрифугировали при 21300 rcf. Осадок ресуспендировали в 1х ТЕ-буфере и помешивали в течение 1 ч. при 80°С. В течение 10 мин для удаления надосадочной жидкости смесь центрифугировали при 21300 rcf. Осадок ресуспендировали в 1х ТЕ-буфере с 0,1% Triton X100 (1 мл) и для удаления надосадочной жидкости центрифугировали в течение 10 мин при 21300 rcf. Процесс повторяли еще раз. Осадок ресуспендировали в 30% растворе аммония (1 мл) и помешивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Для удаления надосадочной жидкости реакционную смесь центрифугировали в течение 10 мин при 21300 rcf, а осадок ресуспендировали в DI воде (1 мл). Для удаления надосадочной жидкости реакционную смесь в течение 10 мин центрифугировали при 21300 rcf и повторяли процесс еще два раза. Осадок ресуспендировали в 1х ТЕ-буфере с 0,1% Triton X100 (1 мл). Для удаления надосадочной жидкости реакционную смесь в течение 10 мин центрифугировали при 21300 rcf и повторяли процесс еще один раз. Осадок ресуспендировали в 1х ТЕ-буфере с 0,1% Triton X100 и для удаления надосадочной жидкости реакционную смесь в течение 10 мин центрифугировали при 21300 rcf. Повторяли процесс еще один раз и осадок ресуспендировали в 1х ТЕ-буфере с 0,1% Triton Х100 (500 мкл).

Пример 3

Активация аминогидрогеля и конъюгация гидрогеля с ДНК-зондом с концевой аминогруппой.

К раствору 100 миллиардов частиц аминогидрогеля (диаметр=0,55 микрона, 23 миллиона аминогрупп/микрон3) в безводном, не содержащем аминогруппы N-метилпирролидоне (NMP) (600 мкл) добавляли твердый бис-сукцинимидилсуберат (22, 1 мг, 60 мкмоль) с последующим добавлением трибутиламина (14 мкл, 60 мкмоль). После помешивания при 60°С в течение 1 часа гидрогели выделяли с помощью центрифугирования (30 мин при 21300 rcf). Осадок гидрогеля разбавляли не содержащим аминогруппы безводным NMP (1 мл) и выделяли с помощью центрифугирования; такой процесс промывания повторяли 2 раза и конечный осадок ресуспендировали в NMP (600 мкл). Такую суспензию гидрогеля обрабатывали ангидридом уксусной кислоты (30 мкл, 317 мкмоль) и трибутиламином (30 мкл, 126 мкмоль) и помешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Полученный гидрогель выделяли путем центрифугирования (30 мин при 21300 rcf), а осадок разбавляли не содержащим аминогруппы безводным NMP (1 мл) и выделяли с помощью центрифугирования; такой процесс промывания повторяли 2 раза, и конечный активированный, блокированный осадок разбавляли 1 мкмолем 3 мкмолярного раствора в NMP тетрабутиламмоний-5'-амино-олигонуклеотида, трибутиламина (1 мкмоль) и не содержащим аминогруппы NMP до конечного объема, составлявшего 600 мкл. После помешивания при 70°С в течение 16 часов конъюгированный с ДНК гидрогель выделяли с помощью центрифугирования (30 мин при 21300 rcf). Осадок промывали посредством NMP (1 мл) с последующим промыванием деионизированной водой (1 мл) с применением центрифугирования для выделения осадков. Конечный осадок гидрогеля разбавляли посредством 1X ТЕ-буфера (1,6 мл) и помешивали при 80°С в течение 1 часа. Гидрогели выделяли с помощью центрифугирования (30 мин при 21300 rcf) и дважды промывали посредством DI воды (1 мл) (с помощью центрифугирования для выделения осадка). К конечному осадку добавляли 30% водный аммоний, спустя 15 минут при комнатной температуре выделяли гидрогель с помощью центрифугирования (20 мин при 21300 rcf) и 3Х промывали посредством DI воды (1 мл) с помощью центрифугирования для выделения. Конечный осадок повторно диспергировали в буфере для проведения целевой амплификации.

Пример 4

На Фиг. 6 проиллюстрирована функционализация метилсульфонилированного гидрогеля при помощи монозащищенного диамина с последующим удалением защитной группы, активацией и конъюгацией с растворяемым в органическом растворителе ДНК-зондом.

К осадку из 200 миллиардов частиц метилсульфонилированного гидрогеля (диаметр=0,6 микрона) (концентрированного посредством центрифугирования в безводном, не содержащем аминогруппы N-метилпирролидоне (NMP)) добавляли 1 мл диамина с одной защитной t-Boc-группой: O-(2-аминоэтил)-O'-[2-(Вос-амино)этил]гексаэтиленгликоля в виде 50 мМ раствора. После встряхивания в течение 12 часов при 70°С гидрогель выделяли посредством центрифугирования, один раз промывали деионизированной водой и удаляли защитную группу при комнатной температуре в 1 мл 30% водной HCl; спустя 1 час гидрогель выделяли посредством центрифугирования и 5 раз промывали 5-мл порциями деионизированной воды. Гидрогель обезвоживали путем центрифугирования водной суспензии и разбавления посредством 1 мл безводного, не содержащего аминогруппы NMP, этот процесс повторяли еще три раза. После конечного центрифугирования осадок активировали при помощи 0,6 мл 125 мМ раствора в NMP дисукцинимидилкарбоната, к которому добавляли 30 мкл трибутиламина, спустя 2 часа при комнатной температуре активированный гидрогель выделяли посредством центрифугирования и осадок 5 раз промывали 1-мл порциями безводного, не содержащего аминогруппы NMP. К полученному в результате осадку добавляли 0,5 мл 3 мкмолярного раствора в NMP тетрабутиламмония 5'-амино-олигонуклеотида и трибутиламина (30 мкл), после встряхивания в течение 12 часов при 70°С конъюгированный гидрогель концентрировали посредством центрифугирования и 3 раза промывали 1-мл порциями NMP. Конъюгированный осадок гидрогеля разбавляли посредством 1X ТЕ-буфера (1,6 мл) и помешивали при 80°С в течение 1 часа, а затем выделяли посредством центрифугирования. После двухкратного промывания деионизированной водой конечный осадок повторно диспергировали в буфере, необходимом для проведения целевой амплификации.

Согласно первому аспекту способ конъюгирования подложки предусматривает обмен связанного с биомолекулой противоиона с липофильным противоионом с получением биомолекулярного комплекса, диспергирование биомолекулярного комплекса в неводном растворителе и связывание биомолекулярного комплекса с подложкой в присутствии неводного растворителя.

Согласно примеру по первому аспекту биомолекула представляет собой полинуклеотид.

Согласно другому примеру по первому аспекту и описанному выше примеру липофильный противоион является липофильным ионом аммония, липофильным ионом фосфония, липофильным ионом арсония, липофильным ионом сульфония или их комбинацией. Например, липофильный ион аммония представляет собой тетраалкиламмоний, тетраариламмоний, смешаный алкил- и ариламмоний или их комбинацию. Согласно примеру липофильный ион аммония выбран из группы, состоящей из тетраметиламмония, тетраэтиламмония, тетрапропиламмония, тетрабутиламмония, тетрапентиламмония, тетрагексиламмония, тетрагептиламмония, тетраоктиламмония, их алкиловых и ариловьгх смесей и их комбинации. Согласно следующему примеру липофильный ион фосфония представляет собой тетрафенилфосфоний. Согласно дополнительному примеру липофильный ион арсония представляет собой тетраалкиларсоний, тетраариларсоний, ион смешаного алкил- и ариларсония или их комбинацию. Согласно другому примеру липофильный ион арсония представляет собой тетрафениларсоний. Согласно примеру липофильный ион сульфония представляет собой ион триалкилсульфония.

Согласно следующему примеру по первому аспекту и описанным выше примерам, неводный растворитель не вступает в реакцию со связывающими группами на подложке и биомолекуле.

Согласно дополнительному примеру по первому аспекту и приведенным выше примерам, неводный растворитель является полярным.

Согласно другому примеру по первому аспекту и описанным выше примерам, неводный растворитель представляет собой амид, мочевину, карбонат, простой эфир, сульфоксид, сульфон, стерически затрудненный спирт или их комбинацию. Например, амид или мочевина выбраны из группы, состоящей из формамида, N,N-диметилформамида, ацетамида, N,N-диметилацетамида, гексаметилфосфорамида, пирролидона, N-метилпирролидона, N,N,N',N'-тетраметилмочевины, N,N'-диметил-N,N'-триметиленмочевины и их комбинации. Согласно другому примеру карбонат выбран из группы, состоящей из диметилкарбоната, пропиленкарбоната и их комбинации. Согласно дополнительному примеру простой эфир представляет собой тетрагидрофуран. Согласно следующему примеру сульфоксид или сульфон выбран из группы, состоящей из диметилсульфоксида, диметилсульфона и их комбинации. Согласно другому примеру стерически затрудненный спирт включает трет-бутиловый спирт.

Согласно следующему примеру по первому аспекту и приведенным выше примерам, подложка включает полимерную частицу.

Согласно дополнительному примеру по первому аспекту и описанным выше примерам, полимерная частица включает связывающую группу, способную вступать в реакцию с реакционноспособной группой биомолекулы.

Согласно примеру по первому аспекту и описанным выше примерам, связывающая группа включает один из нуклеофила или электрофила, а реакционноспособная группа включает другой из нуклеофила или электрофила.

Согласно второму аспекту способ конъюгирования полимерной частицы предусматривает обмен связанного с полинуклеотидом катионного противоиона с липофильным катионным противоионом с получением полинуклеотидного комплекса, причем полинуклеотид включает нуклеофильную или электрофильную реакционноспособную группу. Способ дополнительно предусматривает диспергирование полинуклеотидного комплекса в нереакционноспособном неводном растворителе и связывание полинуклеотида с полимерной частицей посредством нуклеофильного или электрофильного замещения, причем полимерная частица включает электрофильную группу или нуклеофильную группу.

Согласно третьему аспекту полимерная частица включает полимер, конъюгированный с полинуклеотидом при помощи способа по любому из описанных выше аспектов или примеров.

Согласно четвертому аспекту способ секвенирования предусматривает амплификацию целевого полинуклеотида в присутствии конъюгированной с олигонуклеотидом полимерной частицы с получением конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частицы. Олигонуклеотид является по меньшей мере частично комплементарным целевому полинуклеотиду. Конъюгированную с олигонуклеотидом полимерную частицу получают посредством способа по любому из описанных выше аспектов или примеров. Способ дополнительно предусматривает внесение конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частицы в устройство для секвенирования, внесение праймера к конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частице, встраивание нуклеотида и детектирование встраивания.

Согласно примеру по четвертому аспекту детектирование включает детектирование изменения концентрации ионов, связанного со встраиванием нуклеотида.

Согласно пятому аспекту способ выделения целевого полинуклеотида предусматривает приведение первого раствора, включающего целевой полинуклеотид, в контакт с конъюгированной с зондом подложкой. Зонд у конъюгированной с зондом подложки является по меньшей мере частично комплементарным целевому полинуклеотиду. Конъюгированная с зондом подложка, полученная посредством способа по любому из приведенных выше аспектов или примеров. Способ дополнительно предусматривает промывание конъюгированной с зондом подложки пока целевой полинуклеотид связан с зондом и высвобождение целевого полинуклеотида во втором растворе.

Согласно дополнительному аспекту способ конъюгирования олигонуклеотида с полимером предусматривает обработку содержащего функциональную аминогруппу полимера сложным бис-NHS-эфиром или дисукцинимидилкарбонатом с получением функционализированного полимера и обработку функционализированного полимера олигонуклеотидом с концевой аминогруппой с получением конъюгированного полимера, включающего олигонуклеотид.

Согласно примеру по дополнительному аспекту способ дополнительно предусматривает обеспечение наличия исходного полимера, включающего гидроксильную функциональную группу, обработку исходного полимера для замещения гидроксильной функциональной группы на галоген и дополнительную обработку исходного полимера полиэфиром с защищенной концевой аминогруппой с получением полимера, содержащего функциональную аминогруппу.

Согласно другому примеру по дополнительному аспекту и приведенному выше примеру полимер представлен в форме полимерной частицы.

Согласно следующему примеру олигонуклеотид подвергают обработке в соответствии со способами по описанным выше аспектам и их примерам.

Несмотря на то, что выше описана конъюгация с полимерными частицами, такие способы конъюгации можно использовать по отношению к аналогично функционализированному полимеру в различных формах, таких как гранулы, подложки, покрытия, бруски, разновидные формы полимера или любая их комбинация.

Следует отметить, что не все описанные выше в общем описании или примерах действия являются необходимыми, что часть конкретного действия может не быть необходимой, и что помимо описанных можно осуществлять одно или несколько дополнительных действий. Кроме того, порядок, в котором перечислены действия, не является обязательным порядком, в котором их осуществляют.

В приведенном выше описании идеи были описаны на основании конкретных вариантов осуществления. Тем не менее, специалист в настоящей области технике поймет, что различные модификации и изменения можно осуществить без отклонения от объема настоящего изобретения, который изложен в приведенной ниже формуле изобретения. Соответственно, описание и фигуры необходимо рассматривать в иллюстративном, а не в ограничивающем смысле, и все такие модификации подразумевают включенными в объем настоящего изобретения.

Применяемые в настоящем документе термины "содержит", "содержащий", "включает", "включающий", "имеет", "имеющий" или любые их варианты подразумевают как охватывающие неисключающее включение. Например, процесс, способ, изделие или устройство, которые включают перечень признаков, не обязательно ограничены только такими признаками, но могут включать другие признаки, которые в прямой форме не перечислены или присущи такому процессу, способу, изделию или устройству. Кроме того, если в прямой форме не указано иное, "или" относится к включительному "или", а не исключительному "или". Например, условие А или В удовлетворяют по любому из следующих: А является истинным (или присутствует), а В является ложным (или отсутствует), А является ложным (или отсутствует), а В является истинным (или присутствует), и А и В являются истинными (или присутствуют).

Также для описания описанных в настоящем описании элементов и компонентов используют формы единственного числа. Это делают только для удобства и для передачи общего смысла объема настоящего изобретения. Это описание необходимо понимать как включающее одно или по меньшей мере одно, а форма единственного числа также включает форму множественного числа, если не очевидно, что это не означает иное.

Выше были описаны преимущества, другие положительные качества и решения задач с привязкой к конкретным вариантам осуществления. Тем не менее, преимущества, положительные качестве, решения задач и любой признак(и), который может привести к появлению или большему проявлению любого преимущества, положительного качестве или решения, не следует понимать в качестве критического, необходимого или обязательного признака любого или всех пунктов формулы изобретения.

После прочтения описания специалисты в настоящей области техники поймут, что определенные признаки для наглядности описаны в настоящем документе в контексте отдельных вариантов осуществления, и их также можно объединить в одном варианте осуществления. С другой стороны, различные признаки, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, можно также реализовать отдельно или в любой подкомбинации. Кроме того, отсылки к указанным в диапазонах значениям включают абсолютно все значения в пределах такого диапазона.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ конъюгирования подложки с биомолекулярным комплексом и способ конъюгирования полимерной частицы с полинуклеотидным комплексом. Способ конъюгирования подложки с биомолекулярным комплексом включает обмен связанного с полинуклеотидом противоиона с липофильным противоионом для получения биомолекулярного комплекса, диспергирование биомолекулярного комплекса в нереакционноспособном полярном неводном растворителе и связывание биомолекулярного комплекса с подложкой в присутствии нереакционноспособного полярного неводного растворителя. Способ конъюгирования полимерной частицы с полинуклеотидным комплексом включает обмен связанного с полинуклеотидом катионного противоиона с липофильным катионным противоионом для получения полинуклеотидного комплекса, диспергирование полинуклеотидного комплекса в нереакционноспособном полярном неводном растворителе и связывание полинуклеотида с полимерной частицей посредством нуклеофильного или электрофильного замещения. Изобретения обеспечивают усовершенствование способа конъюгации. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

1. Способ конъюгирования подложки с биомолекулярным комплексом, предусматривающий:

обмен связанного с полинуклеотидом противоиона с липофильным противоионом с получением биомолекулярного комплекса, причем полинуклеотид включает реакционноспособную группу, липофильный противоион включает положительно заряженный элемент, соединенный с одной или несколькими углеводородными группами;

диспергирование биомолекулярного комплекса в нереакционноспособном полярном неводном растворителе и

связывание биомолекулярного комплекса с подложкой в присутствии нереакционноспособного полярного неводного растворителя, при этом подложка включает связывающую группу, способную вступать в реакцию с реакционноспособной группой полинуклеотида, при этом связывающая группа включает один из нуклеофила или электрофила, и реакционноспособная группа включает другой из нуклеофила или электрофила;

таким образом биомолекулярный комплекс конъюгирует с подложкой.

2. Способ по п. 1, в котором липофильный противоион представляет собой липофильный ион аммония, липофильный ион фосфония, липофильный ион арсония, липофильный ион сульфония или их комбинацию.

3. Способ по п. 2, в котором липофильный ион аммония представляет собой тетраалкиламмоний, тетраариламмоний, смешаный алкил- и ариламмоний или их комбинацию.

4. Способ по п. 3, в котором липофильный ион аммония выбран из группы, состоящей из тетраметиламмония, тетраэтиламмония, тетрапропиламмония, тетрабутиламмония, тетрапентиламмония, тетрагексиламмония, тетрагептиламмония, тетраоктиламмония, их алкиловых и ариловых смесей и их комбинации.

5. Способ по п. 2, в котором липофильный ион фосфония представляет собой тетрафенилфосфоний.

6. Способ по п. 2, в котором липофильный ион арсония представляет собой тетраалкиларсоний, тетраариларсоний, ион смешанного алкил- и ариларсония или их комбинацию.

7. Способ по п. 6, в котором липофильный ион арсония представляет собой тетрафениларсоний.

8. Способ по п. 2, в котором липофильный ион сульфония представляет собой ион триалкилсульфония.

9. Способ по любому из пп. 1, 3-8, в котором неводный растворитель не вступает в реакцию с указанной связывающей группой на подложке и реакционноспособной группой полинуклеотида.

10. Способ по любому из пп. 1, 3-8, в котором неводный растворитель представляет собой амид, мочевину, карбонат, простой эфир, сульфоксид, сульфон, стерически затрудненный спирт или их комбинацию.

11. Способ по п. 10, в котором амид или мочевина выбраны из группы, состоящей из формамида, N,N-диметилформамида, ацетамида, N,N-диметилацетамида, гексаметилфосфорамида, пирролидона, N-метилпирролидона, N,N,N',N'-тетраметилмочевины, N,N'-диметил-N,N'-триметиленмочевины и их комбинации.

12. Способ по п. 10, в котором карбонат выбран из группы, состоящей из диметилкарбоната, пропиленкарбоната и их комбинации.

13. Способ по п. 10, в котором простой эфир представляет собой тетрагидрофуран.

14. Способ по п. 10, в котором сульфоксид или сульфон выбран из группы, состоящей из диметилсульфоксида, диметилсульфона и их комбинации.

15. Способ по п. 10, в котором стерически затрудненный спирт включает трет-бутиловый спирт.

16. Способ по любому из пп. 1, 3-8 и 11-15, в котором подложка представляет собой полимерную частицу.

17. Способ конъюгирования полимерной частицы с полинуклеотидным комплексом, предусматривающий:

обмен связанного с полинуклеотидом катионного противоиона с липофильным катионным противоионом с получением полинуклеотидного комплекса, причем полинуклеотид включает нуклеофильную или электрофильную реакционноспособную группу, при этом липофильный противоион включает положительно заряженный элемент, соединенный с одной или несколькими углеводородными группами;

диспергирование полинуклеотидного комплекса в нереакционноспособном полярном неводном растворителе и

связывание полинуклеотида с полимерной частицей посредством нуклеофильного или электрофильного замещения,

причем полимерная частица включает электрофильную группу или нуклеофильную связывающую группу;

таким образом полинуклеотидный комплекс конъюгирует с подложкой.