Штамм бактерий Bacillus atrophaeus RCAM06423, проявляющий антагонизм по отношению к микроорганизмам Candida albicans, Serratia marcescens, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Shigella spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli и обладающий амилолитической активностью Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к разработке биологических препаратов, которые могут применяться в животноводстве и птицеводстве.

В настоящее время в области животноводства и птицеводства существует проблема экологизации. Повсеместное использование антибиотиков и химических средств для борьбы с инфекциями, приводит к накоплению в окружающей среде и продуктах АПК опасных соединений. Помимо этого, наблюдается рост устойчивости у патогенных и условно-патогенных микроорганизмов к применяемым средствам борьбы с ними. Повышение экологической чистоты продукции сельского хозяйства возможно при использовании биологических препаратов на основе бактерий-антагонистов возбудителей заболеваний животных и птиц [1, 2].

Бактерии Bacillus активно применяются в качестве пробиотических средств для сельского хозяйства за счет широкого спектра антагонистической активности, синтеза ферментов и устойчивости к факторам внешней среды. Средства на основе бацилл применяются не только для лечения, но и для профилактики инфекционных заболеваний животных и птиц [2].

Штаммы В. atrophaeus в России известны как антагонисты к грибным фитопатогенам и рекомендованы для включения в препараты для защиты и стимуляции роста растений [3, 4]. Помимо этого, известны штаммы В. atrophaeus обладающие способностью утилизировать нефть и нефтепродукты [5, 6]. Однако особенности биологической активности вида, важные для разработки пробиотических препаратов, освещены недостаточно. Хотя в зарубежной литературе имеются сведения о перспективности применения штаммов В. atrophaeus в биотехнологических производствах, в виду их антагонистической активности по отношению к патогенным бактериям человека и животных [7].

Вид В. atrophaeus относится к группе В. subtilis и ранее носил название В. subitilis var niger за счет пигментообразования [8]. В 2001 году вар подвергся реклассификации с вынесением в отдельный вид В. atrophaeus [7]. Поэтому наиболее близкими видами к В. atrophaeus является другие виды группы В. subtilis: В. subtilis, В. licheniformis, В. amyloliquefaciens.

Известен штамм Bacillus subtilis ВКМ B-2711D обладающий пробиотическими свойствами и способностью продуцировать α-амилазу [9]. Однако данный штамм характеризуется более узким спектром антагонистической активности, не включающим в себя фунгицидную активность в отношении Candida albicans.

Известно изобретение - штамм В. subtilis 3Н, входящий в состав препарата «Бактиспорин» и обладающий антагонизмом в отношении бактериальных и грибных патогенов животных (Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Escherichia coli, Candida albicans) [10]. Недостатком штамма является отсутствие антагонистической активности в отношении бактерии родов Salmonella, Citrobacter и Shigella, являющимися широко распространенными инфекционными агентами. Помимо этого, для данного штамма не указана амилолитическая активность.

В качестве прототипа был выбран штамм В. subtilis natto ВКПМ В-12079 [11], так как он входит в состав известного пробиотика для животных «Энзимспорин» а также относится к группе В. subtilis, как и заявленный штамм В. atrophaeus RCAM06423.

Технической задачей заявляемого изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего выраженным антагонистическим эффектом в отношении микроорганизмов, вызывающих заболевания сельскохозяйственных животных и птиц.

Поставленная задача решается тем, что из подстилки, представляющую собой смесь опилок, песка, соломы, лузги подсолнечника, сухих листьев, птичника (Алтайский край) был выделен штамм В. atrophaeus RCAM06423, перспективный для использования в биологических препаратах для сельского хозяйства.

Технический результат заключается в подавлении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов животных и синтезе амилолитических ферментов с помощью заявляемого штамма.

Он достигается тем, что заявляемый штамм Bacillus atrophaeus RCAM06423 предлагается использовать в составе биологических препаратов для сельского хозяйства.

Предлагаемый штамм В. atrophaeus RCAM06423 идентифицировали и задепонировали в «Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM)» ФГБНУ «ВНИИСХМ», находящейся по адресу: 196608 Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3. Идентификацию штамма Bacillus atrophaeus RCAM06423 до вида произвели с использованием метода мультисубстратного тестирования MicroPlate GENIII (BioLog). Вероятность верной видовой идентификации по протоколу составила 90,1% (фиг.1).

Штамм В. atrophaeus RCAM06423 характеризуется следующими признаками:

1. Культурально-морфологические признаки.

Клетки палочковидные с закругленными концами, располагаются одиночно или парами. Колонии на плотной L среде круглые 3-12 мм в диаметре, белого цвета с волнистым краем и матовой шероховатой поверхностью

2. Физиолого-биохимические признаки.

Спорообразующие грамположительные палочки с положительной реакцией на каталазу. Штамм ферментирует арабинозу, целлобиозу, маннит, маннозу, салицин, сахарозу, трегалозу, аргинин и сорбитол. Обладает способностью к восстановлению нитрата до нитрита.

Факультативный аэроб, оптимальная температура роста 30-37°С.

Штамм чувствителен к тетрациклину, доксицилину, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, стрептомицину, неомицину, левомицетину, тилозину и энрофлоксацину.

3. Антагонистическая активность штамма.

Заявленный штамм обладает антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: С.albicans, S. marcescens, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Shigella spp., Staphylococcus spp.и E.coli. Антагонизм установлен методом перпендикулярных штрихов.

4. Способ, условия и состав сред для культивирования штамма.

Заявленный штамм микроорганизма культивируется 24 ч при 30-37°С в шейкер-инкубаторе на L-бульоне (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 15,0; NaCl - 5,0, вода дистилированная - до 1,0 л. Для приготовления твердой среды необходимо добавить к указанным выше ингредиентам 15,0 г/л агара.

В ферментационных установках штамм В. atrophaeus RCAM06423 культивируется на мелассно-кукурузной среде следующего состава (г/л): меласса- 25; кукурузный экстракт - 12,5; дрожжевой экстракт - 1; триптон - 0,5; MgSO₄ - 0,25; MnSO₄ - 0,03; CoCl₂ - 0,046; CaCl₂ - 1, солевой сток - 10 мкл; лапрол (мл/л) - 2. Для приготовления солевого стока в дистиллированной воде растворить 1 г FeSO₄ и 1 г CuSO₄ и довести объем до 100 мл. Условия культивирования:

-рН-6,8-7,7;

- Количество оборотов двухуровневой мешалки - 250 об/мин;

- рО₂ - не менее 50%;

- Время ведения ферментации - 24 ч;

- Температура роста культуры - 37°С;

- Расход воздуха - 0-500 л/ч.

Начало спорообразования через 6-8 часов, с момента внесения посевной культуры в аппарат, к 24 часам культивирования культура полностью переходит в споры.

Во всех случаях культивирования фаза экспоненциального роста начинается, примерно, через 2, соответственно, длительность лаг-фазы составляет 1,5-2 часов.

5. Хранение штамма.

Штамм хранят на скошенной твердой L среде с пересевами раз в 3-6 месяцев. Долгосрочное хранение осуществляют в морозильной камере с использованием криопротектора - глицерина.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Определение спектра антагонистической активности штамма В. atrophaeus RCAM06423.

Отсроченный антагонистическую активность штаммов В. subtilis ВКПМ В-12079 (прототип) и В. atrophaeus RCAM06423 (заявленный штамм) определяли методом перпендикулярных штрихов. В качестве тест-культур использовали штаммы Е. coli, S. enterica, Shigella spp., Staphylococcus spp.и С.albicans.

Исследуемые штаммы высевали на поверхность твердой L среды или среды YEP (при определении антагонизма к С.albicans) в виде прямого штриха, проходящего по диаметру чашки, и культивировали 24 часа при 37°С. По истечению времени к штриху исследуемого штамма подсевали перпендикулярно штрих тест-культуры и инкубировали в течение 24 часов при 37°С. О наличии антагонизма судили по зоне лизиса на границе контакта штамма-антагониста и тест-культуры (Табл. 1).

Из данных, представленных в таблице 1 следует, что заявленный штамм В. atrophaeus RCAM06423 обладает более широким спектром действия на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, чем прототип В. subtilis ВКПМ В-12079.

Пример 2. Определение уровня антагонистического действия штамма В. atrophaeus RCAM06423.

Антагонистическую активность В. atrophaeus RCAM06423 определяли методом перпендикулярных штрихов. Силу антагонизма оценивали по зоне задержки роста на границе контакта тест-культуры и исследуемого штамма (Табл. 2).

Показатели, приведенные в таблице 2 указывают на то что штамм В. atrophaeus RCAM06423 проявляет более выраженный антагонизм к тест-культурам, чем В. subtilis ВКПМ В-12079.

Пример 3. Амилолитическая активность штамма В. atrophaeus RCAM06423

Определение амилолитической активности В. atrophaeus RCAM06423 проводили на твердой питательной среде, содержащей 1% крахмала и 1,5% агара от объема среды. Исследуемый штамм наносили каплями по 10 мкл на поверхность подсушенной среды и культивировали 24 часа при 37°С. Гидролиз крахмала выявляли по наличию бесцветной зон вокруг колонии при добавлении 10% раствора Люголя (Табл. 3).

Данные, представленные в таблице 3, демонстрируют наличие у В. atrophaeus RCAM06423 амилолитической активности, которая отсутствует у прототипа.

Таким образом, штамм В. atrophaeus RCAM06423 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и отличается наличием амилолитической активности. В связи с этим штамм может быть использован в составе биологических препаратов для сельского хозяйства. Литература.

1. Коноваленко Л. Ю. Развитие органического животноводства в России // Проблемы современно аграрной науки. Материалы международной научной конференции (15 октября 2021, г. Красноярск). - Красноярский государственный аграрный университет, 2021 - С.117-120.

2. Сверчкова Н. В. Пробиотические препараты на основе бактерий рода Bacillus для животноводства, птицеводства и промышленного рыбоводства // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты, 2020. - Т. 12. - С.252-264.

3. Патент РФ 2570624.

4. Патент РФ 2791332.

5. Патент РФ 2482179.

6. Патент РФ 2668789.

7. Sella S. R. В. R., Vandenberghe, L. P. S., Soccol С.R. Bacillus atrophaeus: main characteristics and biotechnological applications - a review // Critical Reviews in Biotechnology, 2014.-V. 35(4)-P. 533-545.

8. De Vos P, Garrity G, Jones D, et al. Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 3. Springer - New York, 2009. - 1422 p.

9. Патент РФ 2509149.

10. Патент РФ 2067616.

11. Патент РФ 2675934.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм Bacillus atrophaeus RCAM06423, обладающий антагонистической активностью по отношению к микроорганизмам, вызывающим заболевания сельскохозяйственных животных и птиц - Candida albicans, Serratia marcescens, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Shigella spp., Staphylococcus spp. и Escherichia coli, а также амилолитической активностью. Штамм задепонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) под регистрационным номером RCAM06423. Штамм может найти применение для создания биологических препаратов для сельского хозяйства. 1 ил., 3 табл.

Штамм Bacillus atrophaeus, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского (RCAM) под регистрационным номером RCAM06423, обладающий антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов Candida albicans, Serratia marcescens, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Shigella spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli и амилолитической активностью.