Штамм бактерий Bacillus mojavensis RCAM05965, обладающий антагонистической активностью по отношению к Candida albicans, Serratia marcescens, Escherichia coli и перспективный для производства пробиотика для человека и/или животных Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности касается нового природного штамма бактерий вида Bacillus mojavensis в качестве действующего компонента для разработки пробиотика, направленного на профилактику грибных и бактериальных инфекций человека и животных.

Пробиотиками называются препараты или продукты, содержащие живые полезные для макроорганизма микроскопические организмы. Если первоначально в качестве пробиотических компонентов в основном использовали бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium, то в XXI пул применяемых безопасных и эффективных микроорганизмов был расширен за счет грибов рода Saccharomyces, бактерий рода Bacillus и пр. Бациллы являются перспективными претендентами для разработки пробиотиков, так как почти все виды безопасны для человека и животных, обладают выраженными антагонистическими свойствами и характеризуются высокой биохимической активностью. В качестве их преимущества перед молочнокислыми бактериями можно рассматривать способность к спорообразованию, что увеличивает сохранность препаратов на их основе. Самым часто используемым видом для пробиотиков является Bacillus subtilis [1-4], но селекция новых штаммов и видов бацилл остается актуальной по сей день для поддержания эффективности уже существующих и разработки новых пробиотиков, удовлетворяющих меняющимся условиям среды и взаимоотношениям между живыми организмами.

Известен штамм В. subtilis subsp. subtilis ВКМ B-2711D, который характеризуется антагонистическим действием против Е. coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, а также резистентностью к стрептомицину и тетрациклину [5]. Однако для данного штамма не установлена антагонистическая активность по отношению к грибным патогенам животных и человека, например, С.albicans. Кроме того, данный штамм может передать устойчивость к ряду антибиотиков патогенным микроорганизмам в результате горизонтального переноса генов.

Ранее был запатентован штамм из группы В. subtilis вида В. licheniformis ВКМ B-2713D, обладающий антагонизмом по отношению к S. typhi, St. aureus, L. monocytogenes и устойчивостью к стрептомицину и налидиксовой кислоте [6]. Однако для данного штамма не была зафиксирована антагонистическая активность по отношению к Е. coli, и он также способен передать гены резистентности к некоторым антибиотикам.

Известен штамм В. subtilis ТРАХС - КМ-117, который проявляет антагонистическую активность по отношению к патогенным бактериям для животных и обладает множественной лекарственной резистентностью [7]. Однако для данного штамма не установлена антимикробная активность по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, и он не является природным, а получен в ходе рекомбинаций. Известен штамм В. subtilis ВКМ В-2287, который проявляет антагонистическую активность против бактериальных и грибных патогенов животных и используется для получения пробиотика [8]. Однако при хранении на скошенном агаре данный штамм необходимо пересевать не реже 1 раза в 2 месяца, и препаративная форма пробиотика на его основе - культуральная жидкость, которая менее стойка при хранении, чем лиофилизированный концентрат.

Вид В. mojavensis относится к группе В. subtilis. Следовательно, он тоже перспективен для разработки эффективных и безопасных микробных биопрепаратов. Зарубежными и отечественными учеными активно изучаются антагонистические свойства В. mojavensis по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и создаются биологические средства защиты растений на их основе [9-14]. Однако антагонизм В. mojavensis по отношению к патогенам человека и животных, как и перспективность применения данных бактерий при производстве пробиотиков изучены недостаточно. Известно лишь несколько исследований зарубежных авторов в этом направлении [15-17].

В качестве прототипа был выбран штамм В. subtilis В-2895 с известной антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам человека и животных [18].

Задачей изобретения является получение нового штамма В. mojavensis, характеризующегося антагонистическим действием против С.albicans, S. marcescens, Е. coli и перспективного для производства пробиотика для человека и/или животных в сухом виде. Задача решается путем выделения нового штамма В. mojavensis RCAM05965 из ризосферы рода Chelidonium и определением его антибиотикорезистентности, антагонистических и биотехнологически-ценных свойств.

Технический результат, получаемый от применения предлагаемого штамма, заключается в разработке нового пробиотического препарата для человека и/или животных с целью повышения их продуктивности и профилактики инфекционных заболеваний, а также экологизации сельского хозяйства.

Описание изобретения

1. Выделение заявленного штамма

Предлагаемый штамм В. mojavensis RCAM05965 был выделен из ризосферы p. Chelidonium, произрастающего в Алтайском крае, г. Бийск, осенью 2018 года. Летом 2022 года штамм был депонирован в «Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM)» ФГБНУ «ВНИИСХМ», находящейся по адресу: 196608 Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3. Регистрационный номер-RCAM05965.

2. Видовая идентификация нового штамма

Видовую идентификацию заявленного штамма до вида осуществляли с использованием метода мультисубстратного тестирования MicroPlate GENIII (BioLog). Согласно полученным данным, вероятность того, что изучаемый штамм принадлежит виду Bacillus mojavensis!subtilis составила 91,8%, а к B. subtilis ssp. subtilis - 6,1%. Следовательно, штамм RCAM05965 относится к виду В. mojavensis (фиг. 1).

3. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства предлагаемого штамма Морфолого-культуральные признаки штамма B. mojavensis RCAM05965: колонии 3-8 мм в диаметре, амебовидной формы, край неровный, бледно-белые, профиль плоский. При микроскопии палочки располагаются преимущественно одиночно, реже - парами. Физиологические и биохимические свойства штамма В. mojavensis RCAM05965: спорообразующие грамположительные палочки с положительной реакцией на каталазу, ферментируют арабинозу, целлобиозу, маннит. Не сбраживают цитрат, ксилозу, лецитин.

4. Состав питательных сред и условия культивирования и хранения нового штамма в лабораторных условиях.

На питательных бульонах штамм растет в шейкер-инкубаторе при 200-250 об/мин, а на агаризованных средах - в термостате. Культивирование производится в течение 18-24 ч при 30-37°С.

Оптимальная питательная среда - L. Состав (г/л): дрожжевой экстракт - 5, хлорид натрия - 5. пептон - 15. Она же применяется для получения посевного материала. Твердая среда имеет аналогичный состав с добавлением агара из расчета 15 г/л.

В коллекции штамм поддерживается на скошенном агаре с перевивкой не реже 1 раза в 6-12 месяцев. На глицерине при -20°С штамм сохраняет жизнеспособность в течение не менее 2 лет. В лиофилизированном состоянии может сохраняться и дольше. Глубинное культивирование в условиях биореактора производится в опытном ферментере, штамм В. mojavensis RCAM05965 выращивается на промышленной мелассно-кукурузной среде, основой которой являются меласса - 25 г/л, кукурузный экстракт - 12,5 г/л, источниками азота и углеводов дрожжевой экстракт - 1 г/л, пептон - 0,5 г/л, а также макро- и микроэлементы: MgSO₄ - 0,25 г/л, MnSO₄ - 0,03 г/л, CoCl₂ - 0,046 г/л, CaCl₂ - 1 г/л, FeSO₄ - 0,05 г/л, CuSO₄ - 0,05 г/л.

Для пеногашения используется химический пеногаситель - лапрол (2 мл/л). Условия глубинного культивирования в биоректоре: оптимальный водородный показатель (рН) - 6,8-7,4, механическое перемешивание за счет двухуровневой мешалки в диапазоне 250-700 оборотов в минуту, время ведения ферментации - около 24 ч, оптимальная температура роста культуры - 37°С, расход воздуха - до 300-700 л/ч, начало спорообразования - с 6 часа культивирования, после внесения инокулята в аппарат, к 24 часу выращивания культура полностью переходит в споры.

Для выращивания культуры, при соблюдении доли посевного материала характерно практически полное отсутствие лаг-фазы; после внесения инокулята в ферментационную среду незамедлительно следует снижение уровня растворенного кислорода и смещение стационарно-заданного водородного показателя.

5. Чувствительность к антибиотикам предлагаемого штамма.

Штамм В. mojavensis RCAM05965 высоко чувствителен к левомицетину и энрофлоксацину. К стрептомицину и бензилпенициллину проявляет малую чувствительность.

6. Антагонистическая активность нового штамма.

Новый штамм антагонистически активен по отношению к условно-патогенным микроорганизмам человека и животных: С.albicans, S. marcescens, Е. coli.

7. Показатели численности заявленного штамма в ходе ферментации и лиофилизации. Предлагаемый штамм развивает численность не менее 1×10⁹ КОЕ/мл при культивировании в биологическом реакторе. После лиофилизации В. mojavensis RCAM05965 получается концентрат с титром жизнеспособных бактерий не менее 1×10¹¹ КОЕ/г.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение чувствительности к антибиотикам у штамма В. mojavensis RCAM05965.

Устойчивость к антибиотикам заявленного штамма устанавливали с помощью диско-диффузионного метода. Для этого на поверхность газона бацилл выкладывали диски с антибиотиками и культивировали в течение суток. Эксперимент проводили в 3-кратной повторности, учитывая зоны подавления роста бактерий (табл. 1).

Предлагаемый штамм не обладает абсолютной резистентностью ни к одному исследуемому антибиотику, следовательно, он не может передать эту способность патогенным микроорганизмам в результате горизонтального переноса генов. Штамм В. mojavensis RCAM05965 наименее чувствителен к бензилпенициллину - антибиотику пенициллинового ряда. И наиболее чувствителен к левомицетину (хлорамфениколу) и энрофлоксацину (фторхинолу). Поэтому совместное применение любого из двух данных антибиотиков с предлагаемым пробиотическим штаммом будет не эффективно.

Пример 2. Установление антагонистической активности штамма В. mojavensis RCAM05965 по отношению к условно-патогенным микроорганизмам человека и животных. Антагонистическую активность заявленного штамма и прототипа устанавливали методом отсроченного антагонизма (перпендикулярных штрихов). Для этого первоначально выращивали вертикально штрих штамма-антагониста в течение суток, а затем к нему перпендикулярно в 3-кратной повторности подсевали тест-культуры и вновь культивировали чашки Петри в течение 24 часов. О наличии антагонистического действия судили по зонам отсутствия или послабления роста тест-культур, а также по нарастанию антагонистов поверх штрихов условных патогенов (табл. 2).

Оба штамма антагонистически активны по отношению к С.albicans, также как и к Е. coli. Однако степень подавления роста Е. coli заявленным штаммом выше, чем у прототипа. Кроме того, антагонизмом по отношению к используемому штамму S. marcescens обладает только В. mojavensis RCAM05965.

Пример 3. Определение показателей ферментации и лиофилизации штамма В. mojavensis RCAM05965.

Доля посевного материала штамма В. mojavensis RCAM05965 для культивирования в биологическом реакторе на 250 л составляла 1%. Ферментацию проводили в течение 24 часов, периодически отбирая пробы для контроля за чистотой и динамикой роста культуры. Оптическую плотность (ОП) устанавливали при длине волны 490 нм, предварительно разводя культуральную жидкость в 10 раз. Первоначальная плотность среды - 0,519 (табл. 3).

Заявленный штамм в соответствии с показателем ОП в промежутке 2-4 ч ферментации двукратно увеличивает свою численность. Дальнейший рост продолжается, но уже менее стремительными темпами. Переход большинства клеток в споры через сутки ферментации сигнализирует об остановке роста культуры. Численность клеток в культуральной жидкости В. mojavensis RCAM05965 с ферментера - 6,4×10⁹ КОЕ/мл. После центрифугирования биомасса бацилл смешивается с криопротекторной средой, замораживается и лиофильно высушивается в течение около 2-х суток. Выход концентрата по массе составляет около 1 кг с численностью жизнеспособных клеток - 6,3×10¹¹ КОЕ/г. Быстрый рост культуры и высокий выход биомассы штамма В. mojavensis RCAM05965 после ферментации и лиофилизации позволяют рассматривать его в качестве перспективного для разработки пробиотика для человека и/или животных с высоким титром антагонистический активных бацилл.

Литература

1. Савустьяненко А.В. Механизмы действия пробиотиков на основе Bacillus subtilis // Актуальная инфектология, 2016. - №2 (11). - С. 35-44.

2. Успенский Ю.П., Фоминых Ю.А., Наджафова К.Н., Полюшкин С.В. Пробиотики и их место в современном мире // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2020. - №30(3). - С. 24-35. doi: 10.22416/1382-4376-2020-30-3-24-35

3. Kimelman Н., Shemesh М. Probiotic Bifunctionality of Bacillus subtilis-Rescuing Lactic Acid Bacteria from Desiccation and Antagonizing Pathogenic Staphylococcus aureus // Microorganisms, 2019. - Vol. 7(10). -Ar. 407. doi:10.3390/microorganisms7100407

4. Su Y., Liu C, Fang H., Zhang D. Bacillus subtilis: a universal cell factory for industry, agriculture, biomaterials and medicine // Microbial Cell Factories, 2020. - Vol. 19(1). - Ar. 173. doi: 10.1186/s 12934-020-01436-8

5. Иваненко A.A., Самойленко B.A., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Пат. 2509149, МПК51 C12N 1/20. Штамм Bacillus subtilis subsp.Subtilis ВКМ B-2711D, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к стрептомицину и тетрациклину, 2014.

6. Иваненко А.А., Самойленко В.А., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Пат. 2501849, МПК51 C12N 1/20. Штамм Bacillus licheniformis ВКМ B-2713D, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphyloccus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к стрептомицину и налидиксовой кислоте, 2013.

7. Буланцев А.Л., Тихонов Н.Г., Липницкий А.В. Пат. 2118364, МПК51 C12N 1/20. Штамм Bacillus subtilis ТРАХС, резистентный к тетрациклину, рифампицину, ампициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов, 1998.

8. Кулаков Г.В., Иренков И.П., Илиеш В.Д. Пат. 2246537, МПК51 C12N 1/20. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы, 2005.

9. Дунайцев И.А., Лев И.О., Клыкова М.В., Жиглецова С.К., Сосна И.М., Торгонина И.В., Варламова Т.А., Зайцева С.Д. Пат. 2648163, МПК51 C12N 1/20. Штамм Bacillus mojavensis Lhv-97, обладающий фунгицидной и бактерицидной активностью, 2018.

10. Сафин Р.И., Каримова Л.З., Валидов Ш.З., Комиссаров Э.Н., Диабанкана Р.Ж.К. Пат. 2737208, МПК51 C12N 1/20. Штамм бактерий Bacillus mojavensis ps17 для повышения урожайности и защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, 2020.

11. Масленникова С.Н., Каракотов С.Д. Пат. 2752903, МПК51 C12N 1/20. Смесь бактериальных штаммов, обладающая целлюлозолитической и фунгицидной активностью, 2021.

12. Агиева Г.Н., Диабанкана Р.Ж.К, Шаймуллина Г.Х., Абрамова А.А., Сафин Р.И. Пат.2774687, МПК51 C12N 1/20. Способ получения жидких бактериальных биопрепаратов с диатомитом для защиты сельскохозяйственных культур от болезней, 2022.

13. Bacon C.W., Hinton D.M. Bacillus mojavensis: Its Endophytic Nature, the Surfactins, and Their Role in the Plant Response to Infection by Fusarium verticillioides. Bacteria in Agrobiology. Plant Growth Responses, 2011. - Ch. 2. - P. 21-39. doi:10.1007/978-3-642-20332-9_2

14. Mohammad D., Mohammad A., Merajul I.R., Mohammad S., Salim M., Shaik A.H., Hisamuddin S. Bacillus mojavensis, a Metal-Tolerant Plant Growth-Promoting Bacterium, Improves Growth, Photosynthetic Attributes, Gas Exchange Parameters, and Alkalo-Polyphenol Contents in Silver Nanoparticle (Ag-NP)-Treated Withania somnifera L. (Ashwagandha) // ACS Omega, 2022. - Vol. 7. - P. 13878-13893. doi:10.1021/acsomega.2c00262

15. Hamza A., Fdhila K., Zouiten D., Masmoudi A.S. Virgibacillus proomii and Bacillus mojavensis as probiotics in sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae: effects on growth performance and digestive enzyme activities // Fish Physiology and Biochemistry, 2015. - Vol. 42(2). - P. 495-507. doi: 10.1007/s10695-015-0154-6

16. Бьерре К., Кантор М.Д., Янсен Т., Деркс П. Пат. 2751166, МПК51 C12N 1/20. Способ получения молочного продукта, ферментированного с помощью молочнокислых бактерий и бактерий Bacillus, бактериальная композиция и ее применение в данном способе, 2021.

17. Miray Е.В., Ibrahim С, Jose L.B., Ibrahim D. Effects of two host-associated probiotics Bacillus mojavensis B191 and Bacillus subtilis MRS 11 on growth performance, intestinal morphology, expression of immune-related genes and disease resistance of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) against Streptococcusiniae // Developmental and Comparative Immunology, 2023.-Vol. 138.-Ar. 104553. doi: 10.1016/j.dci.2022.104553

18. Забокрицкий H.A. Фармако-микробиологические аспекты разработки, конструирования и создания экспериментального образца биогепатопротектора // Здоровье и образование в XXI веке, 2014. - Т. 16.-№3. - С. 81-85.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактерий Bacillus mojavensis, обладающий антагонистическим действием против условно-патогенных для человека и животных микроорганизмов: Candida albicans, Serratia marcescens, Escherichia coli, задепонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) под регистрационным номером RCAM05965. Штамм бактерий Bacillus mojavensis RCAM05965 может быть использован для разработки пробиотиков для человека и животных с целью профилактики от грибных и бактериальных инфекций. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Bacillus mojavensis RCAM05965, характеризующийся антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным грибам Candida albicans и бактериям Serratia marcescens, Escherichia coli.