Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80С с раствором Гекмодиолит Российский патент 2020 года по МПК A01N1/02 C12N5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) с комбинированным криоконсервантом Гекмодиолит (дальше - ГД)* (*Гекмодиолит (ГД) - комбинирований криоконсервант для замораживания ГСК костного мозга млекопитающих при низкой температуре (Костяев А.А. Автореф. дис. … докт. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2003. - С.4, 5, 6, 8, 14 и др.)) на основе гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) 20,0-40,0 и α-пропиленгликоля (1,2-ПД) 1,0-2,0; кроме того, в составе ГД динатриевая соль ЭДТА 0,05-0,15; лимонная кислота 0,5-1,5; бидистиллированная вода - Остальное. Имеет рН - 7,0-7,3 (см. патент RU №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995), и может быть использовано в гематологических и онкологических центрах для лечения больных трансплантацией консервированных КППК. Включает выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом ГД в равных пропорциях в полимерном криопакете (ПК), его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (T_A), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с T_A плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с T_A минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с T_A минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем проводят размораживание биообъекта. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ обеспечивает высокую сохранность морфологической и функциональной полноценности деконсервированных КППК после 100 суток хранения. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность готового криоконсерванта, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и удобен для применения (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - 80 с.).

Изобретение относится к медицине, а именно способам криоконсервирования КППК, и может найти применение в центрах лечения больных с депрессией кроветворения различного генеза. Важными составляющими в повышении эффективности замораживания КППК во всем мире являются сохранность большого процента гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), безвредность, простота выполнения и экономичность медикотехнической процедуры в целом.

В технологии замораживания КППК, костного мозга или эмбриональной кордовой крови известны способы их длительной консервации, например, техническое решение по RU 2624214 C1 03.07.2017 A01N 1/02, «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток». Опубл.: 03.07.2017 г., Бюл. №19, включающий смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ЯК в полимерном криопакете, холодовую адаптацию при температуре плюс 4°С в течение 10 мин, замораживание смеси от плюс 4°С до минус 80°С в режиме быстрой двухступенчатой программы в хладоагенте из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой плюс 4±1°С и минус 28±1°С. Недостатками такого способа криоконсервирования ГСК являются использование токсичного криопротектора ДМСО, трудоемкость медицинской технологии и другие факторы.

За прототип взят патент RU №1772911 С от 10.04.1995 г. МПК⁶ A01N 1/02 «Раствор для консервирования костного мозга млекопитающих при низкой температуре», в котором используется криоконсервант одинакового с заявляемым изобретением состава (содержит в основе ГМБТОЭМ и α-пропиленгликоль (1,2-ПД); предусматривает смешивание криоконсерванта с КЯК в ПК в соотношении 1:1, выдерживание при комнатной температуре в течение 20 мин, замораживание в жидкоазотном программном замораживателе по трехступенчатой программе до минус 80°С со скоростью: на первом этапе - минус 1°С/мин до минус 7°С, на втором - минус 10°С/мин до минус 40°С и на третьем - минус 20°С/мин до минус 90°С, после чего подвергают длительному хранению в этих условиях с последующим размораживанием. Обеспечивает сохранность 92% ядросодержащих клеточных элементов (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - С. 61).

Недостатками такой технологии замораживания КППК являются: потребность в дефицитном, токсичном жидком азоте, сложности при работе с криогенной техникой, человеческий фактор, риск инфицирования обслуживающего персонала.

Целью изобретения является исключение из технологии криоконсервирования КППК вредного для здоровья жидкого азота, снижение влияния негативного человеческого фактора, повышение сохранности деконсервированных ЯК.

Этот результат достигается тем, что суспензию клеток в присутствии раствора криоконсерванта ГД в пластиковом криопакете герметизируют, помещают в пенал-холдер и замораживают от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной T_A, причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с Т_А плюс 4±1°С, на втором этапе переносят на 10 мин в электроморозильник с T_A минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электрический морозильник с T_A минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, а затем переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем биообъект размораживают. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ способствует лучшим результатам криоконсервации КППК. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность криоконсерванта ГД, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и делает удобным для практического применения.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - предоперационное охлаждение приготовленного криоконсерванта ГД в электрическом холодильнике до плюс 4°С; Б - выделение свежезаготоаленного КЯК; В - смешивание КЯК с ГД в КП в равных пропорциях в ПК; герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной Т_А; Д - полное замораживание клеточной взвеси и длительная консервация при температуре минус 80°С, Е - размораживание биообъекта в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа замораживания КППК являются: Д - исключение из технологии криоконсервирования КППК хладоагента жидкого азота, Е - использование для холодовой адаптации смеси КЯК с ГД в качестве хладоагента морозильной камеры электрохолодильника с регулируемой T_A; И - снижение влияния негативного человеческого фактора; К - повышение сохранности деконсервированных ЯК.

Пример выполнения заявляемого способа замораживания КППК: производят охлаждение ГД в электрохолодильнике при температуре плюс 4±°С, заготовку концентрата ядерных клеток (КЯК) в полимерный криопакет (ПК), смешивание КЯК с криоконсервантом в ПК в соотношении 1:1, герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной T_A: плюс 4±1°С, минус 7±1°С; минус 28±1°С. На первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с T_A плюс 4±1°С, на втором - переносят на 10 мин в электроморозильник с T_A минус 7±1°С, на третьем - холдер переносят в электрический морозильник с ТА минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Берут пробы размороженного клеточного материала одноразовым шприцем для контрольных морфологических и функциональных тестов.

Сравнительный анализ результатов замораживания КППК с ГСК известным и заявляемым способами представлен в табл.1.

Использование технического решения «Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови» с раствором Гекмодиолит при температуре минус 80°С по сравнению с прототипом позволяет исключить осложнения криогенной природы, обеспечивает сохранность до 90,71% ядерных клеток, из которых насчитывается до 92,30% - эозинорезистентных и 87,63% - CD34+ клеток. Техническое решение доступно и безопасно при реализации в центрах, использующих трансплантации замороженных КППК.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа замораживания КППК.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Изобретение относится к консервированию культуры клеток. Для замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) производят выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом Гекмодиолит (ГД) в полимерном криопакете (ПК) в равных пропорциях, его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (T_A), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с T_A плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с T_A минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с T_A минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Изобретение позволяет повысить сохранность ядерных клеток. 1 табл. 1 пр.

Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови, включающий выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом Гекмодиолит (ГД) в полимерном криопакете (ПК) в равных пропорциях, его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание клеток-предшественников периферической крови (КППК) в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (T_A), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с T_A плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с T_A минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с T_A минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации.