Способ отмывания криоконсервированных мезенхимальных стромальных клеток Российский патент 2024 года по МПК A61K35/28 G01N1/34 G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины и касается клеточных технологий, в частности криоконсервированных культур мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека. Применение МСК является перспективным методом современной клеточной терапии. Указанные клетки при введении реципиентам оказывают иммуномодулирующее действие, способны дифференцироваться в различные клеточные типы, а также секретируют цитокины и другие медиаторы, что позволяет эффективно применять их в комплексной терапии заболеваний различного генеза [Galipeau J, Sensebe L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 2018;22(6):824-833. doi:10.1016/j.stem.2018.05.004].

Известно, что введение пациенту с онкогематологическим заболеванием недостаточного количества гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после завершения кондиционирования ведет к удлинению сроков восстановления кроветворения и риску инфекционных осложнений трансплантации. Аллогенная трансплантация ГСК, кроме того, может сопровождаться развитием реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) у 25-50 % реципиентов даже при трансплантации от полностью HLA-совместимых родственных и неродственных доноров. Введение реципиентам МСК проводятся в случае недостаточности как аутологичного, так и донорского трансплантата, а также для профилактики и/или лечения острой и хронической РТПХ, что улучшает прогноз пациентов [Le Blanc, K. Mesenchymal stem cells: properties and role in clinical bone marrow transplantation / K. Le Blanc, O. Ringdén // Curr Opin Immunol. - 2006. - V. 18(5). - P. 586-91, Rizk, M. Heterogeneity in studies of mesenchymal stromal cells to treat or prevent GVHD: a scoping review of the evidence / M. Rizk, M. Monaghan, R. Shorr, [et al.]// Biol. Blood Marrow Transplant. - 2016. - vol. 22. - №8. - pp. 1416-1423].

Применение концентратов МСК с терапевтическими целями требует создания запасов клеток, доступных к использованию в необходимый для реципиента момент. В связи с высокой пролиферативной активностью МСК, получение терапевтических доз клеток возможно путем культивирования (наращивания) клеточных элементов в условиях in vitro. Срок хранения нативного клеточного продукта при температуре от 2 до 8 °С ограничен одними сутками. Доступным способом увеличения сроков хранения МСК является их замораживание и хранение в условиях низких и ультранизких температур, поэтому важным аспектом эффективного криоконсервирования является оценка количественной и качественной сохранности МСК и установление возможного срока их низкотемпературной консервации.

Наиболее известным и более всего применяемым в настоящее время криопротектором для различных видов клеток является диметилсульфоксид (ДМСО), который используется с 60-х годов прошлого столетия. Следует отметить, что ДМСО оказывает токсическое влияние на культуры клеток, а также на организм реципиента при его введении. Общие побочные реакции, вызываемые ДМСО, включают тошноту, рвоту, боли в животе. Они имеют место более чем у 50 % пациентов. Реже сообщается о побочных эффектах со стороны сердечно-сосудистой системы в виде гипертонии и аритмии, а также со стороны дыхательной системы с остановкой дыхания и диффузным альвеолярным кровотечением. Эти эффекты могут быть обусловлены не только непосредственным действием ДМСО, но и высвобождением гистамина, индуцированным ДМСО; при этом механизмы некоторых сердечно-сосудистых побочных эффектов могут быть многофакторными [Криоконсервация гемопоэтических стволовых клеток периферической крови в трансплантологии: современное состояние и перспективы. /Кит О.И., Гненная Н.В., Филиппова С.Ю. [и др.]// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2023. - Т 22(11) : 3691. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2023-3691].

Технический результат заключается в снижении побочного действия ДМСО с помощью уменьшения концентрации криопротектора в размороженном биопродукте.

Технический результат достигается тем, что способ отмывания криоконсервированных мезенхимальных стромальных клеток обеспечивает размораживание криоконсервированного биопродукта в криопробирке от минус 196 °С до плюс 38 °С с дальнейшим переводом в стерильных условиях содержимого в центрифужную стерильную пробирку с добавлением отмывающего раствора в следующих соотношениях компонентов: раствор 6 % полиглюкина и 10 % альбумина в пропорции 1:4 и соотношении декриоконсервированных клеток к раствору 1:4, с последующим однократным центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин с удалением надосадочной жидкости и ресуспендированием клеток в растворе 6 % полиглюкина в соотношении 1:1, позволяющий сохранить жизнеспособность биопродукта и минимизировать токсическое действие криоконсерванта.

Осуществление заявленного способа

Экспериментальные исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России.

Проведена оценка серий нативных выращенных, размороженных МСК и декриоконсервированного оттаянного отмытого клеточного продукта (ООКП). Для проведения исследований МСК получали костный мозг от доноров ГСК (n=13) в возрасте от 15 до 47 лет (медиана - 30,5 лет).

Исследованы культуры МСК, полученные из костного мозга 13 доноров в клинике ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России. МСК культивировали в среде αMEM (StemCells, Канада), содержащую богатую тромбоцитами плазму (4 %), гепарин (Sigma, США, 2 Ед/мл), L-глутамин (StemCells, Канада, 2 мМ) в инкубаторе при 5 % содержании СО₂ и температуре 37 °С. Определяли концентрацию МСК и их жизнеспособность, подсчитывая клетки с использованием 0,4 % раствора трипанового синего (Биолот, Россия). Суспензию клеток соединяли с раствором криоконсерванта, содержащим 10 % диметилсульфоксида в конечной концентрации (Sigma Aldrich, США) в 6 % полиглюкине (Декстран) с молекулярной массой 50000-60000 дальтон, в объемном соотношении 1:1. Полученный продукт МСК от каждого донора делили на равные аликвоты, фасовали в криопробирки объемом 2 мл и криоконсервировали в парах жидкого азота при минус 120 °С. Криоконсервирование концентратов МСК нуждается в оценке стабильности количественных характеристик и качества клеточного продукта с установлением возможных сроков долгосрочного низкотемпературного хранения.

После хранения в течение 1 года производили размораживание аликвот, оценивали концентрацию МСК и долю жизнеспособных клеток. Декриоконсервирование осуществляли в водной среде при температуре от 38 °С. Размороженный биопродукт в стерильных условиях (ламинар II класса безопасности) переводили в центрифужную стерильную пробирку, далее добавляли отмывающий раствор, состоящий из 6 % полиглюкина и 10 % человеческого альбумина в пропорции 1:4. Далее однократно центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали в полиглюкине в соотношении 1:1. В результате получали ООКП. Количественную сохранность (концентрация стромальных клеток 10⁶/мл) определяли как отношение числа МСК и ООКП после размораживания к аналогичному показателю до криоконсервирования.

Жизнеспособность клеток оценивали путем микроскопического подсчёта в камере Горяева в 0,4 % растворе трипанового синего по стандартной методике. Данные представлены в таблице в виде медианы и интерквартильного диапазона.

Из приведенных в таблице данных видно, что после размораживания и отмывания сохранялось достаточно высокое содержание жизнеспособных клеток, это подтверждено приведенными показателями. Отмечено, что происходило снижение концентрации клеток, обусловленное удалением погибших МСК при отмывании.

Пример использования средства

Костный мозг получали путем аспирации из задней ости подвздошной кости от донора N, возраст 35 лет. Наработку культуры МСК, криоконсервацию, декриоконсервацию и отмывание клеток проводили по методике, описанной выше в разделе экспериментальные исследования. Исходная клеточность продукта до заморозки составляла 1,13×10⁶ кл/мл, жизнеспособность - 96,1 %. Через 1 год после криоконсервирования во взвеси содержание жизнеспособных клеток 93,9 %, количество клеток было ниже исходного - 1,10×10⁶ кл/мл. После отмывания клеток от криопротектора выявлено 98,5 % живых МСК, медиана концентрации клеток 0,54×10⁶ кл/мл. При отмывании МСК от криоконсерванта удалялись погибшие клетки, что обусловило рост показателя жизнеспособности. В связи с тем, что на отмывание берется 70 % биоматериала, естественно происходило снижение концентрации клеток.

Таким образом, показано, что отмывание МСК не влияет на качество биопродукта, сохраняется жизнеспособность криоконсервированных клеток.

Таблица. Характеристика нативных, размороженных и отмытых МСК

Показатель До
замораживания
n=13 После
размораживания
n=13 После размораживания и
отмывания
n=13 Жизнеспособность
МСК % 95,2-99,6
медиана –
98,2 89,2-93,9
медиана –
91,9^* 90,1-97,8
медиана –
94,5 Концентрация
стромальных
клеток 10⁶/мл 0,95-1,65
медиана –
1,18 0,90-1,30
медиана -
1,10 0,50-0,70
медиана-
0,60

Примечание: достоверность различий показателей (p<0,05).

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу отмывания криоконсервированных мезенхимальных стромальных клеток. Способ характеризуется тем, что обеспечивают размораживание криоконсервированного биопродукта в криопробирке от минус 196 °С до плюс 38 °С с дальнейшим переводом в стерильных условиях содержимого в центрифужную стерильную пробирку с добавлением отмывающего раствора в следующих соотношениях компонентов: раствор 6 % полиглюкина и 10 % альбумина в пропорции 1:4 и соотношении декриоконсервированных клеток к раствору 1:4, с последующим однократным центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин с удалением надосадочной жидкости и ресуспендированием клеток в растворе 6 % полиглюкина в соотношении 1:1. Вышеописанный способ позволяет снизить побочное действие ДМСО с помощью уменьшения концентрации криопротектора в размороженном биопродукте. 1 табл.

Способ отмывания криоконсервированных мезенхимальных стромальных клеток, характеризующийся тем, что

обеспечивают размораживание криоконсервированного биопродукта в криопробирке от минус 196 °С до плюс 38 °С с дальнейшим переводом в стерильных условиях содержимого в центрифужную стерильную пробирку с добавлением отмывающего раствора в следующих соотношениях компонентов:

раствор 6 % полиглюкина и 10 % альбумина в пропорции 1:4 и соотношении декриоконсервированных клеток к раствору 1:4,

с последующим однократным центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин с удалением надосадочной жидкости и ресуспендированием клеток в растворе 6 % полиглюкина в соотношении 1:1.