Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу пересборки (разборки и сборки) капсида бактериофага, в том числе бактериофага MS2, в том числе рекомбинантного. Способ включает два этапа: разборку капсида природного или рекомбинантного бактериофага, а затем сборку с различными токсическими ионами и их соединениями, например, изотоп бор-10 и без них.
Изобретение позволяет использовать бактериофаги как эффективное средство доставки, в частности, изотопа бор-10 и пептидов, в организм реципиента.
Вирусоподобные частицы VLP - это монодисперсные трехмерные структуры, капсиды вирусов, лишенные вирусного генетического материала. Они самостоятельно собираются из множества копий одного или нескольких белковых мономеров в сложные супрамолекулярные структуры и обладают четко определенными внутренними и внешними поверхностями, а также интерфейсами между строительными блоками субъединиц. Обычно они имеют размеры, структуру и антигенность подобно нативным вирусам. Во внутреннем объеме, лишенном генетического материала исходного вируса и физически отделенном от внешней среды, можно размещать нужные молекулы для целевого перемещения в определенные места. Внешняя поверхность капсидов отвечает за клеточное взаимодействие как при инфицировании, так и при иммунологической защите. Интерфейс между субъединицами играет критическую роль в сборке и разборке частицы, влияя как на пути сборки, так и на морфологию получаемых частиц, а также стабильность получившихся структур каркаса.
VLP служат уникальной платформой для синтетической химии благодаря разнообразным реакционным группам, доступным на боковых цепях аминокислот поверхностных белков (например, амины, карбоксилаты, тиолы, амиды, фенолы). Большинство VLP имеют структурные модели с разрешением, близким к атомарному (рентгенокристаллические структуры или крио-ЭМ модели высокого разрешения), и основываясь на этой структурной информации можно предсказать и выбрать на капсиде место, куда следует ввести целевой белок (например, внутри, на границе или снаружи).
Еще одним важным свойством VLP является способность переносить нуклеиновые кислоты, защищая их от деградации нуклеазами.
Также, VLP нагружают лекарственными препаратами, токсичными для клеток (например, противоопухолевые препараты), и благодаря адресной доставке их высвобождение происходит в целевых клетках.
Бактериофаги являются вирусами бактерий, полностью безопасными для эукариот. Они хорошо изучены и удобны для генетических и биохимических манипуляций. На основе бактериофага MS2 создаются новые платформы для доставки различных веществ для терапевтических, иммунологических, генетических и других целей. Предложено много методов приготовления фагоподобных частиц, в том числеMS2 (PLPMS2), подходящих для различных целей. В основном, это создание генетических конструкций, несущих 2 гена СР-белка с последовательностью His-tag для упрощения очистки экспрессированных продуктов [Mikeletal., 2017].
Качество сборки фаговых частиц и их стабильность зависят от температуры, ионной силы и рН раствора, в котором проводят выделение, очистку и сборку фага. Температура плавления фага MS2 составляет 660С [Plevkaetal., 2009].
Частицы MS2 не слипаются в присутствии одновалентных катионов вплоть до концентрации 1,0 М. При этом в растворе с двухвалентными катионами, например, Са++, происходит быстрая агрегация частиц [Fu, Li 2016].
Подобран буфер, в котором наиболее успешно происходит очистка и самосборка рекомбинантных PLPMS2 [Hashemietal., 2021]. Авторы отказались от ультрацентрифугирования в градиентах цезия или сахарозы, предпочитая осаждение преципитата ПЭГ 6000. Оказалось, что использование 1 M буфера Tris-basepH 8 c добавлением 100 мМNaNO3 при формировании PLPMS2 значительно улучшает качество и стабильность созданных частиц. Полученные таким образом PLP однородны по размерам и форме, и похожи на частицы фага MS2, также в них лучше сохранялась запакованная тестовая РНК.
Бор-нейтронзахватная терапия (БНЗТ) является перспективным методом лучевой терапии опухолей, внедряемым в настоящее время в клиническую практику в РВ. Суть метода состоит в том, что в зоне опухолевого очага создаётся концентрация изотопа бора-10 (10B), который является эффективным поглотителем нейтронов. После этого зона опухолевого очага облучается сфокусированным нейтронным пучком. Атомы бора, поглощая нейтронный поток, передают энергию опухолевым клеткам, разрушая их. Такой подход позволяет существенно повысить эффективность облучения при снижении уровня лучевого воздействия на пациента.
Одна из главных проблем БНЗТ заключается в поиске мишенных агентов, удовлетворяющих главному требованию - содержание большого количества атомов бора-10 для достижения терапевтической концентрации в пораженных тканях, а именно 20,0-35,0 мкг на 1,0 г опухоли, что соответствует ~10 миллиардам атомам бора-10 на 1,0 грамм ткани опухоли. Так, известные борсодержащие препараты, используемые в клинической практике БНЗТ - пара-борфинилаланин (ВРА) и меркаптододекаборат натрия (Na2B12H11SH) - содержат 1 и 12 атомов бора-10 соответственно. Современные борсодержащие молекулы представляют собой соединения полиэдрических гидридов бора-10 с максимальным числом атомов ~ 26. Для повышения эффективности метода БНЗТ необходимо увеличить количество атомов мишенного агента в препарате.
Использования модифицированного бактериофага для доставки обосновано тем, что опухоль - гетерогенна: имеет плотную матрицу, патологические кровеносные и лимфатические сосуды с аномальным сосудистым барьером и междоузельным барьером. Это микроокружение препятствует эффективной доставке препаратов в опухоль, в частности, в глубокую область, удаленную от сосудистой сети. Обычно доставка таргетных наночастиц в солидные опухоли требует трех шагов. Во-первых, препараты должны проникать в опухолевую ткань через кровообращение. Затем препараты должны проходить через стенку кровеносного сосуда и в конечном итоге проходить через строму опухоли, чтобы убить опухолевые клетки. Таким образом, препараты должны иметь длительное время циркуляции, чтобы эффективно проникать сквозь стенки опухолевого сосуда и междоузельное пространство для достижения эффективной доставки и глубокого проникновения.
Препараты адресной доставки токсических соединений или радионуклидов, которые не могут выводиться из клеток помпами лекарственной устойчивости (MDR), представляют многообещающую стратегию, способную эффективно дополнить применяемые сейчас антираковые лекарства.
Из патентов РФ № 2735828 и №2599462 известен способ нагрузки бактериофага путем вакуумной сушки, когда проводили сушку смеси препарата фага с растворами изотопа бор-10.
Метод вакуумной сушки не позволяет произвести модификацию капсида пептидами, а также контролировать упаковку изотопа бор-10, уменьшить неспецифическую иммуногенность.
Наиболее близким аналогом является способ разборки-сборки бактериофага, известный из патента США № 8987173. В известном способе фаг выдерживают 24 часа в буфере ST (50 мМтрис, 100мМNaCl) в присутствии 0,25 М ТМАО и изотоп бор-10, затем раствор центрифугировают при 10,000 g 10 минут. Супернатант смешивали с ПЭГ6000 и NaCl до конечной концентрации 12,5% и 0,5 М, соответственно. Через 2 часа раствор осаждали центрифугированием (17,800 gв течении 45 минут) при 4°С. Осадок растворяли в минимальном количестве ST буфера и вновь осаждали при 10,000gв течении 10 минут. Надосадок фракционировали, и фракции, соответствующие интактным капсулам вируса MS2, собирали и после хранили в 4°С в ST буфере.
Данный способ также не позволяет в достаточной мере контролировать упаковку изотопа бор-10 уменьшить неспецифическую иммуногенность.
Способ по настоящему изобретению позволяет контролировать упаковку изотопа бор-10, уменьшить неспецифическую иммуногенность препарата за счет обеспечения отсутствия РНК бактериофага.
Таким образом, технический результат заявленного изобретения заключается в очистке препарата вирусоподобной частицы бактериофага (ВПЧ) от РНК бактериофага с целью получения низкой неспецифической иммуногенности. Также технический результат заключается в контроле упаковке изотопа бор-10, способ позволяет преодолеть барьер минимальной концентрации изотопа бор-10 при получении субстанции препарата, что важно при использовании радиоактивных изотопов в вирусоподобные частицы. При этом заявленный способ позволяет получать рекомбинантные ВПЧ бактериофага.
Для достижения данного эффекта важен этап способа, где к концентрированному MS2 добавляют 2 объема предварительно охлажденной 100 % уксусной кислоты. Смесь выдерживают в холодильнике при плюс 4°С в течение 30 минут. Колонку для обессоливания подготавливают, уравновесив ее предварительно охлажденной уксусной кислотой на фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,4. Для этого, первоначально, сливают буфер из колонки. Затем вносят на колонку уксусную кислоту на ФСБ и производят центрифугирование в течение 2 минут при 1000 g. Процедуру повторяют 4 раза. По истечение 30 минут смесь бактериофага и уксусной кислоты осаждают путем центрифугирования при 14000 g в течение 10 минут в охлажденной до плюс 4°С центрифуге. Данный этап обеспечивает разрушение капсида бактериофага до мономерных капсидных белков. Также разрушается и РНК бактериофага.
Данная методика позволяет преодолеть барьер минимальной концентрации изотопа бор-10 при получении субстанции препарата, что важно при использовании радиоактивных изотопов в вирусоподобные частицы. Для достижения данного эффекта важен этап, когда концентрат разобранного MS2 выдерживают в течение 24 часов при плюс 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО, 10 мМ тРНК дрожжей и раствора изотопов бор-10, с концентрацией 0,16 мг/мл. Для этого в эппендорфе смешать 2:1 разобранного MS2, 221 мкл 1,8 М ТМАО, 355 мкл тРНК дрожжей, с концентрацией 1мг/мл, и 27,2 мкл раствора изотопа бора-10 (10B), Бор-10 является эффективным поглотителем нейтронов. Полученный препарат обеспечивает таргетную доставку и содержание большого количества атомов бора-10 для достижения терапевтической концентрации в пораженных тканях, а именно 20,0-35,0 мкг на 1,0 г опухоли, что соответствует ~10 миллиардам атомам бора-10 на 1,0 грамм ткани опухоли. После этого зона опухолевого очага облучается сфокусированным нейтронным пучком. Атомы бора, поглощая нейтронный поток, передают энергию опухолевым клеткам, разрушая их.
В результате применения разработанной нами методики представляется возможным получение препарата, обладающего цитотоксическими свойствами за счет присутствия изотопов бор-10 внутри вирусоподобной частицы на основе бактериофага MS2. Способы синтеза PLPMS2 разняться в зависимости от цели их применения.
Для возможности проникновения частиц фага MS2 в клетки эукариот на поверхность капсида химическим методом присоединяются пептиды СРР (cell-penetrated peptide) из вируса HIV-1, а именно, пептид TАТ 47-57 c последовательностью YGRKKRRQRRR [Panetal., 2012].
В работе [Wangetal., 2016] пептид ТАТ присоединяли непосредственно к мономерам и димерам СР белка фага MS2, а далее наблюдали самосборку характерного для MS2 капсида, причем участки ТАТ были ориентированы наружу.
Созданы генетические конструкции, в которых последовательности одноцепочечных вариабельных фрагментов антител (scFvs) слиты с последовательностью белка СР, такие плазмиды экспрессированы, и получившиеся в результате рекомбинантные белки собрались в PLP-частицы, причем scFvs экспонировались на поверхности фаговых частиц [Linoetal., 2017].
Пептид №1 (образец от 2017 г. и №5 от 15.11.18, смесь), анализ от 30.10.2019 г. Целевое + немного, по-видимому, изомера (с той же массой).
Пептид Р2 (вся порция), анализ от 20.11.2019 г. Чистое целевое вещество на 2 минуте (сигналы МН2+ 574,2 и МН3+383,2), остальные пики идут с колонки и дублируются в пустом заколе. Чистота ≥ 98%.
Пептид №3 (образцы №3 от 15.09.17, и №7 от 24.01.19, смесь), анализ от 30.10.2019.
Целевое (≥95%): сигналы 1-, 2- и 3-зарядных ионов (1133,5; 567,3; 378,5).
Пептид №4 (образцы №4 и №8 от 15.09.17 и от 24.04.19, смесь), анализ от 30.10.2019.
Целевое (≥97%) сигналы 2- и 3-зарядных ионов (581,3 и 387,9), а также слабый сигнал 1-зарядного иона (1164,0)
Для всех пептидов:
Аналитическая ВЭЖХ: колонка ТriartC18 (YMC) 2.1x50 мМ, 1.9 um. Градиент ацетонитрила в 0,1% водном 0,1%-ном растворе НСООН 2-80%.
Масс-спектрометрия: ионизация электрораспылением, детектор - ионная ловушка (Agilent 6340).
Материалы и методы
Бактериофаг MS2 относится к семейству Leviviridae. Это фаг с одноцепочечной смысловой РНК, он заражает только клетки Escherichiacoli, несущие фактор фертильности (Hfr-штаммы или штаммы с плазмидой F’). F-пили являются рецепторами фага [Fu, Li 2016].
Интактная фаговая частица состоит из молекулы РНК, 180 молекул белка оболочки СР и 1 молекулы белка созревания (А-белка), ответственного за прикрепление фага к F-пилям Escherichia coli. Капсид MS2 икосаэдрической формы с триангуляционным числом равным 3 и имеет размеры от 27 до 34 нм.
Использование бактериофага MS2 в качестве средства доставки различных веществ к клеткам признано очень удобным. Фаг не является инфекционным агентом для эукариот. Фаговые частицы легко создаются с помощью технологии рекомбинантных белков. В капсиды MS2 можно упаковать целевую ДНК или РНК с рас-сайтом на 5’-конце, и тем защитить препараты от нуклеазной деградации. Давая возможность эффективно и удобно упаковать все виды веществ и обеспечивая доставку в целевые клетки, частицы фага MS2 имеют большие перспективы в качестве новой платформы для терапевтических, иммунологических и диагностических целей.
Материалы Таблица 1 Список необходимых материалов и реагентов
Примечание: реактивы и материалы должны иметь паспорта или сертификаты, подтверждающие их пригодность.
Допускается применение других средств измерения, вспомогательных устройств, посуды, реактивов и материалов с метрологическими и техническими характеристиками не хуже, чем у приведенных.
Оборудование Таблица 2 Cписок необходимого оборудования
Приготовление растворов, проведение анализа проводилось при следующих условиях:
- температура окружающего воздуха - плюс (20±5)°С;
- атмосферное давление - (от 84,0 до 106,7) кПа;
- относительная влажность воздуха - не более 80 %.
Перед проведением анализа проводят следующие работы: подготовку стеклянной посуды, приготовление растворов необходимых реактивов.
Посуду, используемую для приготовления растворов, замачивают на 3-4 часа в свежеприготовленном 3% растворе клиндезина-специаль (3мл на 100мл концентрированной серной кислоты) и отмывают в проточной воде с последующим ополаскиванием дистиллированной водой и высушиванием в сушильном шкафу при температуре плюс 150°С.
Подготовка используемых реагентов:
а) Уксусную кислоту предварительно охладить при плюс 4°С.
б) Подготовить фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) с рН 7,4. Для этого 5 таблеток ФСБ растворить в 500 мл дистиллированной воды.
в) Для получения 1 мМ уксусной кислоты на 50 мл ФСБ добавить 3 мкл концентрированной уксусной кислоты.
г) Приготовить 50 мл 50 мМ Tris (рН 7). Для этого 1,25 мл 2 М Tris разбавить 48,75 мл дистиллированной воды.
д) Приготовить 50 мл 50 мМ Tris (рН 8,8). Для этого 1,25 мл 2 М Tris разбавить 48,75 мл дистиллированной воды. Довести рН до 8 с помощью 10 М NaOH.
е) Для приготовления 5 мл 1,8 М ТМАО на 50 мМ Tris использовать навеску в 1 г.
ж) Подготовить раствор изотопа бор-10
и) Подготовить тРНК дрожжей на 50 мМ Tris с концентрацией 1 мг/мл.
Структура пептидов, использованных для модификации капсида ВПЧ:
Пептид iRGD-P1 первичной структуры GGGcyclo(CRGDKGPDC) - пептид №1
Пептид iRGD-P2 первичной структуры GGGcyclo(CRGDRGPDC) - пептид №2
Пептид iRGD-P3 первичной структуры GGGcyclo(CRGDKGPEC) - пептид №3
Пептид iRGD-P4 первичной структуры GGGcyclo(CRGDRGPEC) - пептид №4
Далее решение поясняется с помощью примеров.
Пример 1
Получение фага MS2
Получение высокого титра фага MS2 проводили по методу, описанному ранее (Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. РНК-трансдукция неинфекционными вирионами фага MS2 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2002, №3, стр. 56 -63). Контролями служили секвенирование ОТ-ПЦР фрагмента геномной РНК, а также определение титра методом агаровых слоев (Gratia A. Numerical Relations between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage // Ann. Inst. Pasteur 1936, v.57, p. 652). Концентрирование вирионов фага, проводили после осветления клеточного лизата Стр.: 8 RU 2 599 462 C1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 центрифугированием (15000 об/мин) с последующим осаждением ПЭГ-6000 в присутствии NaCl, как известно специалистам. Концентрирование препарата фага так же проводили обезвоживанием сухим сефадексом G-10.
Пример 2
Процедура разборки/сборки бактериофага
MS2 (с концентрацией 5×1011 БОЕ) сконцентрируют до 1 мл с помощью центрифужного концентратора на 15 мл в течение часа при плюс 4°С, 3600 об/мин.
К 1 мл концентрированного MS2 добавляют 2 объема предварительно охлажденной до температуры 4°С 100 % уксусной кислоты (2 мл). Смесь выдерживают в холодильнике при плюс 4°С в течение 30 минут. Готовят колонку для обессоливания PD-10, уравновесив ее предварительно охлажденной 1 мМ уксусной кислотой на фосфатносолевом буфере (ФСБ) с рН 7,4. Для этого, первоначально, сливают буфер из колонки. Затем вносят на колонку 4 мл 1 мМ уксусной кислоты на ФСБ и производят центрифугирование в течение 2 минут при 1000 g. Процедуру повторяют 4 раза.
По истечение 30 минут смесь бактериофага и уксусной кислоты осаждают путем центрифугирования при 14000 g в течение 10 минут в охлажденной до плюс 4°С центрифуге. Супернатант после осаждения наносят на предварительно подготовленную колонку для обессоливания и производят центрифугирование в течение 2 минут при 1000 g. После чего собрают проскок, содержащий разобранный бактериофаг.
5 мл разобранного бактериофага разбавляют в 3 раз 50 мМ Tris с рН 7. Доводят рН до 7,3 с помощью добавления 10 М NaOH. 15 мл разобранного MS2 концентрируют в 7,5 раз с помощью центрифужного концентратора на 15 мл в течение 45 минут при 3600 об/мин в охлажденной до плюс 4°С центрифуге. Таким образом, получают 2 мл разобранного бактериофага.
Первую половину (1 мл) концентрата разобранного MS2 выдерживают в течение 24 часов при плюс 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО на 50мМ Tris с рН 7, 10 мМ тРНК дрожжей на 50мМ Tris с рН 7. Для этого в эппендорфе на 2 мл смешивают 1 мл разобранного MS2, 221 мкл 1,8 М ТМАО, 355 мкл тРНК дрожжей (с концентрацией 1мг/мл).
Вторую половину (1 мл) концентрата разобранного MS2 выдерживают в течение 24 часов при плюс 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО, 10 мМ тРНК дрожжей и раствора изотопа бор-10. Для этого в эппендорфе на 2 мл смешивают 1 мл разобранного MS2, 221 мкл 1,8 М ТМАО, 355 мкл тРНК дрожжей с концентрацией 1 мг/мл и раствор бор-10. По истечению 24 часов пробы с собранным бактериофагом обессоливают с помощью колонок PD-10, предварительно уравновешенных 50 мМ Tris с рН 8,8. Таким образом, в ходе проведенных работ получают 1 мл бактериофага, собранного без изотопа бор-10 и 1 мл - собранного с изотопом бор-10.
Пример 3
Модификация поверхности вирионов пептидами
А. Синтез пептидов со структурой (NH2)GGGCRGDK/RGPD/EC(COOH). Пептид синтезировали методом твердофазного пептидного синтеза исходя из Fmocаминокислот на автоматическом пептидном синтезаторе 433А Applied Biosystems на смоле с присоединенным остатком Fmoc-Cys(Acm). Использовали следующие производные аминокислот: Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro. Снятие Fmoc-защитной группы с N-концевой альфааминогруппы растущей пептидной цепи проводили 22%-ным раствором 4-метилпиперидина в N-диметилформамиде (Алешина Е.Ю., Пындык Н.В., Мойса А.А., Санжаков М.А., Харыбин О.Н., Николаев Е.Н., Колесанова Е.Ф. Синтез фрагмента P-амилоида 5RHDSGY10 и его изомеров. Биомед. химия, 2008, т. 54, №2, 154-166). Присоединение аминокислот к растущей пептидной цепи (кроме Fmoc-Cys(Acm)) осуществляли с предварительной активацией Fmoc-аминокислот гексафторфосфатом 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния в присутствии 1-гидроксибензотриазола и 2,4,6-коллидина согласно процедуре FastMoc, описанной в инструкции к синтезатору. Fmoc-Cys(Acm) присоединяли с активацией in situ, используя в качестве активатора диизопропилкарбодиимид в присутствии 1-гидроксибензотриазола. По окончании синтеза пептид снимали со смолы обработкой смесью трифторуксусной кислоты, три-(изопропил)-силана, 3,6-диокса-1,8-октандитиола и воды (в объемном соотношении 94:1:2,5:2,5) и осаждали метил-трет-бутиловым эфиром. Осадок пептида растворяли в 10%-ном водном ацетонитриле с 0,1% трифторуксусной кислоты, и полученный раствор подвергали очистке методом ВЭЖХ на колонке Zorbax SB-C8, 21,2×250 мм, 7 мкм в градиенте концентрации ацетонитрила в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты. Фракцию, содержащую целевой пептид, собирали и упаривали под вакуумом и затем проводили удаление защитных Acm-групп с остатков цистеина с одновременным формированием дисульфидного мостика по известной методике (Fernando Albericio et al. Preparation and handling of peptides containing methionine and cysteine // In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Eds. W.C. Chang and P.D. White. Oxford University Press, 2000). Пептид подвергали повторной очистке методом ВЭЖХ на той же колонке, фракцию целевого пептида упаривали под вакуумом.
Б. Чистоту препарата синтезированного пептида подтверждали массспектрометрическим анализом с ионизацией электрораспылением и детекцией методом ионной ловушки, а также аналитической ВЭЖХ в соответствии с протоколами, описанными ранее (M.H.V. Van Regenmortel, S. Muller. Synthetic peptides as antigens. Elsevier 1999, pp.88-90).
В. Конъюгацию пептида с фаговыми частицами проводили с использованием диметиладипимидата в соответствии со стандартной процедурой, известной специалистам (M.H.V. Van Regenmortel, S. Muller. Synthetic peptides as antigens. Elsevier, 1999, pp. 88-90).
Пример 4
Создание вирусоподбной таргетной частицы на основе бактериофага MS2
1) Разборка вирусных капсидов MS2
MS2 (с концентрацией 5×1011 БОЕ) сконцентрировали до 1 мл
с помощью центрифужного концентратора на 15 мл (Corning 431487) в течение часа при плюс 4°С, 3600 об/мин.
К 1 объему концентрированного MS2 добавили 2 объема предварительно охлажденной 100 % уксусной кислоты. Смесь выдерживали
в холодильнике при плюс 4°С в течение 30 минут.
Подготовили колонку для обессоливания PD-10 (GEHealthcare, Германия), уравновесив ее предварительно охлажденной 1 мМ уксусной кислотой (Ленреактив, Россия) на фосфатно-солевом буфере (PBS), (Росмедбио, Россия) с рН 7,4. Для этого, первоначально, слили буфер из колонки. Затем внесли на колонку 4 объема 1 мМ уксусной кислоты на PBS и произвели центрифугирование в течение 2 минут при 1000 g. Процедуру повторили 4 раза.
По истечение 30 минут смесь бактериофага и уксусной кислоты осадили путем центрифугирования при 14000 g в течение 10 минут в охлажденной
до плюс 4°С центрифуге.
Супернатант после осаждения нанесли на предварительно подготовленную колонку для обессоливания и произвели центрифугирование в течение 2 минут при 1000 g. После чего собрали проскок, содержащий мономер капсидного белка бактериофага.
2) Получение рекомбинантного капсидного белка, конъюгация с пептидом IRGDили другими таргетными пептидными молекулами
Получение плазмиды pL1118 на основе вектора pR1504 (3), содержащей нуклеотидную последовательность гена капсидного белка MS2 из Escherichia virus и 6-His в N-концевой области.
Полученный штамм продуцент использовали для наработки рекомбинатного белка MS2 в клетках Escherichia coli.
3) Получение рекомбинантного капсидного белка сшитого с пептидом IRGDили другими таргетными пептидными молекулами
Получение плазмиды pL1120 на основе вектора pR1504 (3), содержащей нуклеотидную последовательность гена капсидного белка MS2 из Escherichia virus, участок связывания с клеткой RGD в С-концевой области и 6-His в N-концевой области.
Получение плазмиды pL1145 на основе вектора pR1504 (3), содержащей нуклеотидную последовательность гена капсидного белка MS2 из Escherichia virus, участок связывания с клеткой RGD в петле нуклеотидной последовательности капсидного белка MS2 и 6-His в N-концевой области.
Получение плазмиды pL1146 на основе вектора pR1504 (3), содержащей нуклеотидную последовательность гена капсидного белка MS2 из Escherichia virus, участок связывания с клеткой RGD в петле нуклеотидной последовательности капсидного белка MS2 и 6-His в N-концевой области.
Полученные штаммы продуценты использовали для наработки рекомбинатного белка MS2 сшитого с таргетной молекулой в клетках Escherichia coli.
4) Обработка перед сборкой
Проводили перевод рекомбинантного капсидного белка 1118/1120/1145/1146 в мономерную форму.
К 1 объему очищенного рекомбинантного капсидного белка 1118/1120 добавили 2 объема предварительно охлажденной 100 % уксусной кислоты. Смесь выдерживали
в холодильнике при плюс 4°С в течение 30 минут.
Подготовили колонку для обессоливания PD-10 (GEHealthcare, Германия), уравновесив ее предварительно охлажденной 1 мМ уксусной кислотой (Ленреактив, Россия) на фосфатно-солевом буфере (PBS), (Росмедбио, Россия) с рН 7,4. Для этого, первоначально, слили буфер из колонки. Затем внесли на колонку 4 мл 1 мМ уксусной кислоты на PBS и произвели центрифугирование в течение 2 минут при 1000 g. Процедуру повторили 4 раза.
По истечение 30 минут смесь рекомбинантного капсидного белка 1118/1120 и уксусной кислоты осадили путем центрифугирования при 14000 g в течение 10 минут в охлажденной до плюс 4°С центрифуге.
Супернатант после осаждения нанесли на предварительно подготовленную колонку для обессоливания и произвели центрифугирование в течение 2 минут при 1000 g. После чего собрали проскок, содержащий рекомбинантный капсидный белок 1118/1120 в виде мономера.
Пример 5
Создание вирусоподбной таргетной частицы на основе бактериофага MS2 согласно примеру 4, где на стадиях 2) и 3) использован пептид TАТ 47-57 c последовательностью YGRKKRRQRRR.
Пример 6
Упаковка в вирусоподобные частицы, полученные по примеру 4 и 5
1) упаковка изотопа бор-10
5 мл разобранного бактериофага разбавили в 3 раза 50 мМ Tris с рН 7. Довели рН до 7,3 с помощью добавления 10 М NaOH.
15 мл разобранного MS2 сконцентрировали в 7,5 раз с помощью центрифужного концентратора на 15 мл (Corning 431487) в течение 45 минут при 3600 об/мин в охлажденной до плюс 4°С центрифуге. Таким образом, получили 2 мл разобранного бактериофага.
1 мл концентрата разобранного MS2 выдерживали в течение 24 часов при плюс 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО, 10 мМ тРНК дрожжей и раствора изотопа бор-10 (SigmaAldrich, США) с концентрацией 0,16 мг/мл или РНК конц. 50 нг/мл и 5 нг/мл.
По истечению 1 - 24 часов пробы с собранным бактериофагом обессоливали с помощью колонок PD-10, предварительно уравновешенных 50 мМ Tris
с рН 8,8. Таким образом, получили 1 мл вирусоподобных частиц с упакованным в них изотопом бор-10.
Степень упаковки изотопа бор-10 бактериофаг определяли методом ИСП-АЭС (табл. 3).
Табл. 3. Результаты ИСП-АЭС исследований третей серии экспериментов.
3) упаковка иных изотопов
Пример 7
Конъюгация пептида с ВПЧ
Конъюгацию пептида с ВПЧ проводили с использованием диметиладипимидата в соответствии со описанной ниже процедурой. Раствор 5 мкг пептида в 0.1 мл PBS перемешивали с 25 мкг фага 30 мин, затем в течение 1 ч добавляли 0.25 мл 0.25% водного глутарового альдегида. Реакционную массу перемешивали 15 ч, а затем диализовали против PBS с трехкратной сменой буфера. N,N-бис(4-метилфенилсульфонил)-адипамид получали смешивая 10 мМ (CH2)4(COOH)2 с 20мМ пара-толуенсульфонамидом и избытком оксихлоридом фосфора, инкубировали смесь 1 час на кипящей водяной бане. Осадок получали фильтрованием и промывали горячим этиловым спиртом. Полученное соединение использовали для конъюгации мономерной формы пептида с фагом.
Пептид (30мкМ) растворяли в безводном-диоксане с избытком изобутил хлороформата и триэтиламина. Раствор перемешивали при комнатной температуре 30 минут. 50 мкг фага растворили в 30 мл в 0.2 M боратном буфере pH=8. Раствор охлаждали льдом. Для активации пептида в растворе с фагом, 2 мл p-диоксана были добавлены к раствору. Сложение p-диоксана к белковому раствору вызвало небольшую мутность. Активизированный раствор пептида добавляли к фагу по каплям с перемешиванием. Перемешивание было продолжено на льду в течение 30 минут к часу. Чтобы удалить непрореагировавшие молекулы фаг осаждали ледяным 100%-ым этанолом. Преципитат осаждали центрифугированием при 4°C в течение 10 минут при 4500g. Супернатант, содержащий непрореагировавшие малые молекулы, удаляли. Осадок повторно суспендировали холодным этанолом три раза и осаждали центрифугированием. В заключении, осадок разводили дистиллированной водой до концентрации около 5 мг белка/мл.
Пептид растворяли в безводном DMF и реакцию проводили под азотом. После добавления изобутилхлороформата и три-n-бутиламин смесь размешивалась в 4°C в течение 10 минут, затем в комнатной температуре в течение еще 20 минут. Приблизительно 1 мл активизированного раствора для пептида (содержащий приблизительно 2.5 мкмоль) был добавлен к каждому разведению ВПЧ (буфер бората мл на 14 мг/2) и размешан в 4-10°C для 1 ч. Перемешивание было продолжено в комнатной температуре быстро. Конъюгаты очищали диализом в фосфатно-солевом растворе буфере(PBS). Конъюгаты анализировали по содержанию белка, разливали по небольшим объёмам (25 мкл) и хранили при -80°C до использования.
Далее проводили реакцию между амидными группами (высокоэффективная). Реакция была выполнена с перемешиванием под азотом в колбе, охлажденной в водяной бане при приблизительно 19-20°C. Нитрит бутила (417 мкл 30 мМ в безводном ДМСО) был добавлен каплями в общем объёме 12.5 мкмоль к фаголизату (3.0 мкг). Для контроля замерзания реакции, которое происходит при 18°С, добавляли 12.5 мкмоль раствор H2SO4 (625 мкл 20 мМ в безводном ДМСО). Общий объём реакции не превышал 4.2 мл. После 30 минут раствор с диазонием разделяли. Малое количество из смеси добавили к избытку раствора n-крезолав 0.2 М борнокислом буфере pH=8.7. Эту смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, концентрировали в вакууме, а затем подвергали подготовительному HPLC (гексан/ацетон 9:1). Были выделены несколько изоамирфных продуктов желтого цвета, с характеристиками: EI-MSm/z (относительная интенсивность) M+420 (8), 424 (3), 422 (8), 389 (1), 387 (4), 385 (7), 135 (16), 107 (100). Последний из указанных продуктов (пик 107) соли диазония разделён на две равные части*. Каждая половина (по 2.5 мл) была добавлена каплями к энергично размешиваемому раствору фага - носителя в 0.2 М борнокис-лом буфере pH=8.7 (120 мкг фаголизата в 3 мл буфере), при 19-20°C. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре смесь быстро перемешали. Желтый осадок конъюгата очищали диализом с PBS.
После модификации поверхности ВПЧ на основе бактериофага MS2 пептидами и завершения сборки получили модифицированный фаг, состоящий из оболочки, содержащей циклический лиганд iRGD, ковалентно связанный с оболочкой, и сердцевины, содержащей геномную РНК вириона и изотоп бор-10.
Эффективность коньюгации оценивали посредством определения количества пептида Р1 (iRGD-P1)первичной структуры GGGcyclo(CRGDKGPDC)), конъюгированного с ВПЧ на основе MS2, методом Эллмана (определение свободных SH-групп).
Чистота препарата подтверждена аналитической ВЭЖХ на обращенной фазе и масс-спектрометрическим анализом с ионизацией электрораспылением (рабочая станция Agilent 1100, колонка YMC-Pack C4 150×3.0 мМ ID, S - 5 μm, градиент ацетонитрила 2%-98% за 10 мин в 0,3%-ной гептафтормасляной кислоте, скорость элюции 0,7 мл/мин; масс-спектрометрический детектор IonTrap LC/MS 6340 (Agilent)).
Пример 8
Осуществляют аналогично примеру 7, используя пептид iRGD-P2 первичной структуры GGGcyclo(CRGDRGPDC).
Пример 9
Осуществляют аналогично примеру 7, используя пептид iRGD-P3 первичной структуры GGGcyclo(CRGDKGPEC).
Пример 10
Осуществляют аналогично примеру 7, используя пептид iRGD-P4 первичной структуры GGGcyclo(CRGDRGPEC)
ВПЧ бактериофагов, полученные способами по изобретению, могут представлять собой ВПЧ, содержащие следующие последовательности и иметь следующие характеристики:
Вариант 6His-MS2 (pL1144)
MRGSHHHHHHGSMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNP IPSAIAANSG IY*.......
6His 5- 10 a.o., MS2 13-142 a.o.
Вариант 6His-RGD1-MS2(pL1145)
MRGSHHHHHH GSMASNFTQF VLVDNRGDGD VTVAPSNFAN GVAEWISSNS RSQAYKVTCSVRQSSAQNRK YTIKVEVPKV ATQTVGGVEL PVAAWRSYLN MELTIPIFAT NSDCELIVKAMQGLLKDGNP IPSAIAANSG IY*
6His 5- 10 a.o., MS2 13-142 a.o.
Вариант 6His-RGD2-MS2(pL1146)
MRGSHHHHHHGSMASNFTQFVLVDNGRGDTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDG NPIPSAIAAN SGIY*.....
6His 5- 10 a.o., MS2 13-144 a.o.
Вариант 6His-MS2 (pL1118)
MASNFTQFVLVDNGHHHHHHGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAAN SGIY*.....
MS2 1-14, 21-134 a.o., 6His 15-20 a.o.
Молекулярная масса белка 6His-MS2cоставляет 14,5кДа.
Вариант 6His-MS2-IRGD (pL1120)
MASNFTQFVLVDNGHHHHHHGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAAN SGIYGGSGGS CRGDKGPDC*
MS2 1-14, 21-134a.o., 6His 15-20a.o., spacer RGD 135-149a.o.
Молекулярная масса белка 6His-MS2-RGD3cоставляет 15,8кДа.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ получения
вирусоподобной частицы бактериофага.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-13">
<ApplicantFileReference>23/12/2023</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Вологодский Андрей Николаевич
</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Vologodskij Andrej
Nikolaevich</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения вирусоподобной
частицы бактериофага</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>142</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..142</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MRGSHHHHHHGSMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSN
SRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVK
AMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>142</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..142</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MRGSHHHHHHGSMASNFTQFVLVDNRGDGDVTVAPSNFANGVAEWISSN
SRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVK
AMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>144</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..144</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MRGSHHHHHHGSMASNFTQFVLVDNGRGDTGDVTVAPSNFANGVAEWIS
SNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELI
VKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>134</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..134</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MASNFTQFVLVDNGHHHHHHGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKV
TCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKD
GNPIPSAIAANSGIY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>149</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..149</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MASNFTQFVLVDNGHHHHHHGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKV
TCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKD
GNPIPSAIAANSGIYGGSGGSCRGDKGPDC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения ВПЧ бактериофага и способ получения модифицированного ВПЧ бактериофага | 2022 |
|
RU2790451C1 |
| СПОСОБ ПОЛИСИГНАЛЬНОЙ АКТИВАЦИИ АПОПТОЗА КЛЕТОК ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ | 2015 |
|
RU2599462C1 |
| Онколитический способ терапии рака молочной железы. | 2018 |
|
RU2695136C1 |
| БЕЛКИ, СЛИТЫЕ С КОШАЧЬИМ АЛЛЕРГЕНОМ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2006 |
|
RU2414239C2 |
| КОНЪЮГАТЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2006 |
|
RU2441067C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ, СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ НЕПРИРОДНОГО, УПОРЯДОЧЕННОГО И ПОВТОРЯЮЩЕГОСЯ МАССИВА АНТИГЕНОВ И ОБОЛОЧЕЧНЫЙ БЕЛОК | 2002 |
|
RU2295973C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ, СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ НЕПРИРОДНОГО, УПОРЯДОЧЕННОГО И ПОВТОРЯЮЩЕГОСЯ МАССИВА АНТИГЕНОВ | 2002 |
|
RU2294211C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ, СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ НЕПРИРОДНОГО УПОРЯДОЧЕННОГО И ПОВТОРЯЮЩЕГОСЯ МАССИВА АНТИГЕНОВ | 2002 |
|
RU2438701C2 |
| КОНЪЮГАТЫ ГРЕЛИН-НОСИТЕЛЬ | 2003 |
|
RU2325202C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧАСТИЦ БАКТЕРИОФАГОВ СЕМЕЙСТВА LEVIVIRUS | 2020 |
|
RU2811106C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ пересборки (разборки и сборки) капсида бактериофага, в том числе бактериофага MS2, в том числе рекомбинантного. Способ включает два этапа: разборку капсида природного или рекомбинантного бактериофага, а затем сборку с различными токсическими ионами и их соединениями, например, изотоп бор-10 и без них. Таким образом, технический результат заявленного изобретения заключается в очистке препарата вирусоподобной частицы бактериофага (ВПЧ) от РНК бактериофага с целью получения низкой неспецифической иммуногенности. Также технический результат заключается в контроле упаковке изотопа бор-10, способ позволяет преодолеть барьер минимальной концентрации изотопа бор-10 при получении субстанции препарата, что важно при использовании радиоактивных изотопов в вирусоподобные частицы. При этом заявленный способ позволяет получать рекомбинантные ВПЧ бактериофага. Изобретение позволяет использовать бактериофаги как эффективное средство доставки, в частности, изотопа бор-10 и пептидов, в организм реципиента.
1. Способ получения ВПЧ бактериофага, характеризующийся тем, что включает следующие стадии:
A) концентрируют бактериофаг до требуемого объема и добавляют два объема предварительно охлажденной до 4°С 100% уксусной кислоты;
Б) смесь выдерживают при плюс 4°С в течение 30 мин;
В) на подготовленную колонку для обессоливания вносят уксусную кислоту на ФСБ и производят центрифугирование 2 мин при 1000 g, процедуру повторяют 4 раза;
Г) по истечению 30 минут смесь бактериофага и уксусной кислоты осаждают путем центрифугирования при 14000 g 10 мин при 4°С;
Д) супернатант наносят на предварительно подготовленную колонку для обессоливания и производят центрифугирование 2 мин при 1000 g;
Е) собирают проскок, содержащий разобранный бактериофаг;
Ж) проскок разбавляют в 3 раза 50 мМ Tris с рН 7;
З) смесь доводят до рН 7,3 и концентрируют в 7,5 раз при 3600 об/мин при 4°С;
И) концентрат делят на две части: одну часть концентрата выдерживают в течение 24 часов при 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО на 50мМ Tris с рН 7, 10 мМ тРНК дрожжей на 50мМ Tris с рН 7; вторую часть концентрата выдерживают в течение 24 ч при 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО, 10 мМ тРНК дрожжей и раствора изотопа бор-10;
К) по истечении 24 ч обессоливают, таким образом, получая ВПЧ бактериофага.
2. Способ по п. 1, где ВПЧ получают из рекомбинантных капсидных белков.
3. Способ по п. 1, где введена дополнительная стадия конъюгации ВПЧ с пептидом или сшивания ВПЧ с пептидом, при этом пептид может представлять собой пептид iRGD или пептидом YGRKKRRQRRR.
4. Способ по п. 3, где пептид iRGD представляет собой пептид первичной структуры: GGGcyclo(CRGDKGPDC), GGGcyclo(CRGDRGPDC), GGGcyclo(CRGDKGPEC) или GGGcyclo(CRGDRGPEC).
5. Способ получения модифицированного ВПЧ бактериофага, характеризующийся тем, что включает следующие стадии:
A) концентрируют бактериофаг до требуемого объема и добавляют два объема предварительно охлажденной до 4°С 100% уксусной кислоты;
Б) смесь выдерживают при плюс 4°С в течение 30 мин;
В) на подготовленную колонку для обессоливания вносят уксусную кислоту на ФСБ и производят центрифугирование 2 мин при 1000 g, процедуру повторяют 4 раза;
Г) по истечению 30 минут смесь бактериофага и уксусной кислоты осаждают путем центрифугирования при 14000 g 10 мин при 4°С;
Д) супернатант наносят на предварительно подготовленную колонку для обессоливания и производят центрифугирование 2 мин при 1000 g;
Е) собирают проскок, содержащий разобранный бактериофаг;
Ж) проскок разбавляют в 3 раза 50 мМ Tris с рН 7;
З) смесь доводят до рН 7,3 и концентрируют в 7,5 раз при 3600 об/мин при 4°С;
И) концентрат делят на две части: одну часть концентрата выдерживают в течение 24 часов при 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО на 50мМ Tris с рН 7, 10 мМ тРНК дрожжей на 50мМ Tris с рН 7; вторую часть концентрата выдерживают в течение 24 ч при 4°С в присутствии 25 мМ ТМАО, 10 мМ тРНК дрожжей и раствора изотопа бор-10;
К) по истечении 24 ч обессоливают, таким образом, получая ВПЧ бактериофага;
Л) проводят модификацию поверхности ВПЧ пептидами.
6. Способ по п. 5, где пептид может быть пептидом iRGD или пептидом YGRKKRRQRRR.
7. Способ по п. 6, где пептид iRGD представляет собой пептид первичной структуры: GGGcyclo(CRGDKGPDC), GGGcyclo(CRGDRGPDC), GGGcyclo(CRGDKGPEC) или GGGcyclo(CRGDRGPEC).
8. Способ по любому из пп. 5-7, где ВПЧ получают из рекомбинантных капсидных белков, а модификация пептидами представляет собой конъюгацию или сшивание ВПЧ с пептидом.
| Способ получения ВПЧ бактериофага и способ получения модифицированного ВПЧ бактериофага | 2022 |
|
RU2790451C1 |
| WO 2006032674 A1, 30.03.2006 | |||
| Ректальные суппозитории на основе модифицированного бактериофага MS2 для таргетной терапии злокачественных солидных опухолей | 2019 |
|
RU2735828C1 |
