Способ прогнозирования риска когнитивных нарушений у долгожителей Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6827 C12Q1/6869 C12Q1/6883 C12N15/11 G16B20/20 G16H50/30 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гериатрии, и может быть использовано для определения риска развития когнитивных нарушений у пожилых людей в возрасте 90 лет и старше (долгожителей) на основании данных генетического теста. Изобретение позволяет выявлять лиц с повышенным риском развития когнитивных нарушений в пожилом возрасте при проведении превентивного генетического тестирования с целью раннего начала профилактических и лечебных мероприятий.

Последние десятилетия отмечается общемировая тенденция к увеличению продолжительности жизни и старению населения. Именно пожилой возраст несет с собой бремя возраст-ассоциированных инвалидизирующих состояний, одним из которых является снижение когнитивных функций, распространенность которого неустанно растет вместе со старением населения, ''изгоняя" при этом пожилого человека из социума, семьи и экономики [1]. Таким образом, вопросы поиска потенциальных мишеней для воздействия и профилактики заболеваний когнитивной сферы в пожилом возрасте становятся все более и более актуальными.

Особый интерес представляют люди-долгожители (90 лет и старше), популяция которых также стремительно увеличивается [2]. Ведутся исследования, посвященные изучению клинических особенностей долгожителей и развития у них когнитивных расстройств, однако мало что известно о генетической природе деменции среди них. При этом долгожители представляются особенно интересной группой для изучения когнитивных нарушений также и потому, что они в некоторой степени более генетически однородны, так как крайне редко являются носителями патогенных вариаций в геноме, ассоциированных с возникновением критических для жизни заболеваний в более раннем возрасте, в том числе ассоциированных с когнитивным статусом [3]. Когнитивная сохранность долгожителей имеет не только социальные (связанные, например, с уровнем образования), но и генетические причины. Повторяющейся находкой в различных исследованиях генетики самого факта долгожительства, а также когнитивной сохранности в пожилом возрасте являются полиморфизмы в гене АРОЕ, который расположен на 19 хромосоме и кодирует Аполипопротеин Е, участвующий в метаболизме липидов в организме человека [4], нарушения транспорта и катаболизма которых лежат в основе возраст-ассоциированных нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний [5]. Гены, окружающие АРОЕ на хромосоме - ТОММ40 и АРОС1 - также ассоциированы со старением и нейродегенерацией [6],[7]. АРОЕ представлен в популяции в трех вариантах ε2, ε3 и ε4 с частотами 6,4, 78,3 и 14,5% соответственно [8]. В большинстве работ, освещающих генетику долгожителей различных популяций, фигурируют SNP rs429358 и rs7412 [9]. rs429358 формирует вариант АРОЕ ε4, а наличие этого полиморфизма соответствует меньшему шансу стать долгожителем [9]. rs7412 формирует вариант АРОЕ ε2, и эффект этого полиморфизма прямо противоположен rs429358 [9]. Эти же SNP фигурируют при анализе генетических предпосылок развития болезни Альцгеймера [10].

Однако отдельно взятых нуклеотидных полиморфизмов недостаточно, для того чтобы оценить суммарный вклад генетических вариантов в формирование фенотипа с высоким риском когнитивных нарушений у долгожителей. Решением этой проблемы является построение полигенных шкал риска (ПШР). ПШР могут быть использованы для скрининга и выявления группы риска, что поможет улучшить информирование пациентов. Богатая фенотипическая информация в крупномасштабных генотипированных когортах дает возможность систематически оценивать прогностическую эффективность ПШР по широкому спектру признаков. Подобный подход уже используется для выявления среди населения пациентов с высоким генетическим риском таких полигенных заболеваний как ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, дислипидемия [11],[12] Например, авторы Luanluan Sun et al, используя данные UK Biobank о 306 654 человек без сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в анамнезе и не получавших гиполипидемическую терапию, рассчитали полигенную шкалу риска ССЗ. Согласно результатам этой работы, добавление информации о генетическом риске, полученной на основании ПШР, увеличило меру различения риска (С-индекс) на 0,012 (95% ДИ 0,009-0,015) ипривело к постоянным чистым улучшениям реклассификации примерно на 10% и 12% в случаях и без случаев, соответственно.

Наиболее близким аналогом предлагаемого нами способа прогнозирования риска когнитивных нарушений можно считать исследование, которое выполнено Бином Ханом и соавторами, согласно публикации «Genetic and non-genetic factors associated with the phenotype of exceptional longevity & normal cognition» {Scientific reports, 2020). Согласно методике, описанной в публикации, для создания полигенной шкалы риска (ПШР) использовались данные о 2156 индивидуумах, набранных в рамках продольного исследования здорового долголетия в Китае (Chinese longitudinal healthy longevity survey, CLHLS), данные которого открыто опубликованы в Национальном архиве компьютеризированных данных о старении (National Archive of Computerized Data on Aging, NACDA). Исследования основывались только на данных, собранных в CLHLS, собственный набор участников не проводился. Участники исследования были разделены на 2 группы следующим образом: контрольная группа включала 899 когнитивно сохранных долгожителей в возрасте 90 лет и старше, группа "случай" включала 1257 пожилых людей с когнитивными нарушениями в возрасте 65 лет и старше. По результатам проведенного полногеномного поиска ассоциаций наиболее значимыми оказались замены rsl3198061 в гене ESR1, rs56368572 в CTNND2, rs954303 около RNU4-58P и rs939432 в гене RYR3, имеющие, предположительно, протективный эффект при когнитивных нарушениях [13]. В представленную полигенную шкалу риска когнитивных нарушений с большим весовым коэффициентом вошли такие гены, как RYR3 и ESR1. Максимальная площадь под ROC-кривой составила 0,78. Полученную полигенную шкалу риска Хан и соавторы предлагают использовать для прогнозирования риска когнитивных нарушений у пожилых пациентов. Однако данные находки получены при помощи генотипирования с импутацией отдельных участков и основываются на генетически гомогенной китайской популяции, что делает невозможным использование предложенной шкалы для оценки риска когнитивных нарушений для долгожителей Российской Федерации. Учитывая генетическую неоднородность различных популяций, наиболее актуальна разработка собственных полигенных шкал риска.

Опираясь на выше представленные положения о целесообразности и актуальности разработки инструмента, который позволит выполнить качественную стратификацию по группам риска когнитивных нарушений среди долгожителей, мы построили полигенную шкалу риска когнитивных нарушений, в которую вошли обнаруженные нами варианты в генах АРОЕ, АРОС1, ТОММ40, АТР8В1, DKK3, SV2C, GRIK3 и межгенных участках. В нашем исследовании приняли участие 1155 пациентов: 296 мужчин и 859 женщин в возрасте от 90 до 107 (медианный возраст - 92 года), набранных с помощью социальных служб, пансионатов для ветеранов труда, геронтологических центров и других гериатрических служб Москвы и Московской области. Участники были разделены на две группы в зависимости от результатов тестирования по краткой шкале оценки психического статуса (англ. Mini-Mental State Examination, MMSE): долгожители с когнитивными нарушениями (MMSE<10) и когнитивно сохранные долгожители (MMSE>24). В отличие от способа предсказания риска когнитивных нарушений, предложенного Ханом и соавторами [13], наш способ разработан и протестирован на российской популяции с учетом особенностей разнообразия этнических групп и среды обитания.

Перечень рисунков

Рисунок 1. ROC-кривая конечной полигенной шкалы риска на внешней и внутренней тестовых выборках.

Задачей изобретения является расширение возможностей генетической диагностики для оценки риска когнитивных нарушений у долгожителей, а именно создание достоверного способа прогнозирования риска развития когнитивных нарушений на основании данных генетической диагностики наличия 45 полиморфизмов в генах АРОЕ, АРОС1, ТОММ40, АТР8В1, DKK.3, SV2C, GRIK3 и межгенных участках.

Технический результат изобретения - разработка способа прогнозирования риска развития когнитивных нарушений у долгожителей на основании генетической диагностики, что будет способствовать повышению эффективности прогнозирования состояния пожилого пациента и проведению своевременных профилактических мероприятий.

Поставленная задача решается тем, что в способе прогнозирования риска когнитивных нарушений у лиц в возрасте 90 лет и старше на основании данных генетической диагностики методом секвенирования следующего поколения (NGS) выявляется факт наличия однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), ассоциированных с когнитивными нарушениями по результатам GWAS. Наиболее значимые из них расположенные на генах АРОЕ, АРОС1, ТОММ40, АТР8В1, DKK3, SV2C, GRIK3 (см. Таблица 2). Таблица включает в себя позицию гена на хромосоме, номер хромосомы, нуклеотидную замену, идентификатор полиморфизма в виде rs кода, коэффициент обозначающий вес данного ОНП.

Предиктивная модель

Вероятность тяжелого течения заболевания вычисляется по формуле:

где gi - количество аллелей риска, βi; - коэффициент для данного полиморфизма, β_{возраст} -коэффициент, на который умножается возраст, β₀ - свободный член (различается для мужчин и женщин); ехр - экспоненциальная функция.

Предложенная полигенная шкала риска разработана с использование данных о 1155 долгожителях и валидирована на отдельно собранной выборке из 100 пожилых людей в возрасте 90 лет и старше с известным когнитивным статусом (по данным тестирования по краткой шкале оценки психического статуса).

Критерии отбора долгожителей для исследования

Набор участников проводился с 2019 по 2021 гг.Выборка формировалась произвольным способом путем поиска участников с помощью социальных служб, пансионатов для ветеранов труда, геронтологических центров и других гериатрических служб Москвы и Московской области. Всем участникам, согласившимся принять участие в исследовании, были проведены основные методы обследования. К участникам были совершены несколько визитов врача и медицинской сестры, во время которых проводился сбор анамнеза, заполнение гериатрических шкал и опросников, а также забор биообразцов (в т.ч. цельной крови). Оценка когнитивных способностей проводилась с помощью теста MMSE (краткой шкалы оценки психического статуса). Результаты MMSE оценивались классическим образом в соответствии с рекомендациями авторов:<9 баллов - серьезное снижение когнитивных функций; >24 баллов - отсутствие снижения когнитивных функций [14,15]. Крайние группы для бинарного деления были выбраны в том числе из-за большого числа кофакторов, влияющих на результат теста в столь преклонном возрасте (сенсорные дефициты, быстрая утомляемость и др.) и сложности интерпретации пограничных значений в связи с последним. Сравнение исследуемых групп приведено в таблице 1.

Для внешней валидации разработанной полигенной шкалы риска были набраны 100 долгожителей в возрасте от 90 до 95 лет (медианный возраст 92 года), среди которых 76 женщин и 24 мужчины.

Генетическая диагностика

Кровь от пациентов получена кубитальным венозным доступом. При заборе крови исследователи руководствуются ГОСТ Р 53079.4-2008. Для получения образцов цельной крови кровь забирается с помощью закрытых систем взятия крови S-Monovette Sarstedt (K2-ЭДТА) с фиолетовой крышкой. Хранение крови проводилось при температуре -20°С.

Выделение геномной ДНК из образцов цельной крови проводилось с использованием автоматизированной станции Tecan Freedom EVO (Тесап, Швейцария) при помощи набора MagAttract HMW DNA Kit (Qiagen, Германия), а также применялась процедура ручного выделения с применением набора DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

Концентрация и чистота выделенной ДНК определялась двумя методами: в автоматическом режиме на планшетном ридере Infinite® 200 Pro с помощью программы Magellan™, а также в ручном режиме - концентрация ДНК измерялась на флуориметре Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США), оценка качества производилась на NanoDropTM One С Microvolume UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, США).

Для всех образцов выделенной ДНК отношение показателей поглощения 260/280 составило 1,8-2,0, отношение 260/230 - 2,0-2,2.

Для приготовления библиотек использовали 150-500 нг геномной ДНК. Тагментацию ДНК, очистку и амплификацию тагментированнной ДНК, очистку полученных библиотек проводили согласно протоколу Nextera DNA Flex Library Prep (Document # 1000000025416 v07, Illumina, США). Полногеномные библиотеки готовили с использованием наборареагентов Nextera DNA Flex kit (Illumina, США), согласно рекомендациям производителя, и набора индексов IDT-ILMN Nextera DNA UD Indexes Set А и Set В для предотвращения кросс-контаминации образцов. Концентрация библиотек измерялась на планшетном ридере Infinite® F Nano Plus. Размер полученных библиотек определяли при помощи набора реагентов Agilent D1000 на приборе Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies, США). Пулирование производилось автоматически с использованием роботизированной станции Tecan Freedom EVO (Tecan, Швейцария). Пул библиотек, содержащий 24 образца, перед секвенированием разводили до концентрации 2,8 нМ. Контроль качества пулов проводили при помощи набора реагентов Agilent HS D1000 ScreenTape на приборе Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies, США). Полногеномное секвенирование проводили на приборе Illumina NovaSeq 6000, используя набор реагентов S4, 300 циклов (Illumina, США) с парно-концевыми прочтениями 2×150 п. о.

Выравнивание на референсный геном (GRCh38) проводили на платформе «Dragen Bio-IT» (производства компании «Illumina», США); определение вариантов проводили на определителе Strelka2 для исследований небольших когорт {фильтрация по качеству}. Варианты, не соответствующие критерию равновесия Харди-Вайнберга (р<10е-6), мультиаллельные варианты и варианты с частотой минорного аллеля менее 1% были исключены из исследования.

Статистический анализ

Для проверки полногеномных ассоциаций проводили логистическую регрессию:

где β₀ - постоянная величина, β_C - коэффициент для вектора ковариант, С - вектор ковариат (возраст и пол; при учете пола мужской обозначался как 0, женский как 1), β_G - коэффициент для вектора генотипов, G - вектор генотипов. Целевой показатель (когнитивный статус долгожителей) был зашифрован в виде двоичной переменной (для когнитивных нарушений использовали код 1, для нормального когнитивного статуса - 0). Расчеты проводились с использованием библиотеки «Python» («statsmodels v0.13.5), распараллеленной на «Dask Cluster». Возраст и пол учитывали как ковариаты. После фильтрации по качеству было протестировано 9 287 600 вариантов.

Для прогнозирования риска была построена модель с гребневой регрессией (Python v3.8). Коэффициенты регрессии находятся при помощи минимизации суммы квадратов разности наблюдаемых и полученных значений и ее регуляризация методом добавления “штрафа” в виде суммы квадратов значений коэффициентов:

где у - наблюдаемые значения, , - полученные значения, β - коэффициенты модели, λ -параметр регуляризации.

Выбор итоговой величины параметра регуляризации проводился методом полного перебора по равномерной сетке λ ∈ [10^-5:10³], всего протестировано 50 значений. Оптимальная величина параметра выбиралась максимизацией значения метрики F1. Каждую модель проверяли методом перекрестной (десятикратной) проверки с учетом стратификации по целевому признаку и тестировали на 10% образцов валидационной выборки. Для выбора оптимального набора ОНП для модели рассматривали первые n ОНП при сортировке по возрастанию значений p-value по результатам GWAS для n∈[5:50]. Итоговый набор соответствует наибольшему показателю AUC (area under the curve или площадь под кривой) на тестовом наборе данных.

Полученные результаты

Для прогнозирования риска когнитивных нарушений долгожителей мы построили полигенную шкалу риска на основе 45 ОНП. Для итоговой модели было выбрано значение λ=49,4. Значение AUC конечной модели составило 0,80 (95% ДИ=(0,75; 0,83)) на обучающей выборке, 0,85 на внутренней и 0,69 на внешней тестовых выборках (Рис. 1). Коэффициенты ОНП приведены в Таблице 2.

Коэффициент регрессии для возраста составил 0,0022143176659817597. Свободный член для мужчин равен -0,9964573535614847, для женщин равен -0,751242257.

Пример 1. Женщина, 93 года, с нормальным когнитивным статусом (MMSE=28) обследуется на предмет генетической прерасположенности к развитию деменции. В результате полногеномного секвенирования образцов крови данного пациента были обнаружены замены rs73942481 и rs3990609 в гетерозиготном состоянии. Их суммирование с коэффициентами из таблицы 2 дает значение 0,250227367. С учетом возраста и пола итоговый риск когнитивных нарушений оценивается по формуле:

Полученное значение меньше 0,5, следовательно предполагается отсутствие риска когнитивных нарушений.

Пример 2. Мужчина, 90 лет, со сниженным когнитивным статусом (MMSE=7) обследуется на предмет генетической предрасположенности к развитию деменции. В результате полногеномного секвенирования образцов крови данного пациента были обнаружены 35 из 45 аллелей риска когнитивных нарушений. Их суммирование с коэффициентами из таблицы 2 даетзначение 3,73049609617863. С учетом возраста и пола итоговый риск когнитивных нарушений оценивается по формуле:

Полученное значение больше 0,5, следовательно предполагается наличие генетически обоснованного риска к наличию когнитивных нарушений в этом возрасте, что подтверждается фенотипом. По результатам оценки риска когнитивных нарушений пациенту было предложено дополнительное наблюдение гериатра и невролога, а также различные терапевтические подходы, направленные на поддержание когнитивного статуса.

Перечень литературы:

1. Peracino A, Pecorelli S. The Epidemiology of Cognitive Impairment in the Aging Population: Implications for Hearing Loss. AUD. 2016;21: 3-9.

2. Teixeira L, Araiijo L, Paul C, Ribeiro O. Centenarians. Springer International Publishing.

3. Balabanski L, Serbezov D, Nikolova D, Antonova O, Nesheva D, Hammoudeh Z, et al. Centenarian Exomes as a Tool for Evaluating the Clinical Relevance of Germline Tumor Suppressor Mutations. Technol Cancer Res Treat. 2020; 19: 1533033820911082.

4. Apolipoprotein E: Structure and function in lipid metabolism, neurobiology, and Alzheimer's diseases. Neurobiol Dis. 2014;72: 3-12.

5. Sato N, Morishita R. The roles of lipid and glucose metabolism in modulation of P-amyloid, tau, and neurodegeneration in the pathogenesis of Alzheimer disease. Front Aging Neurosci. 2015;0. doi: 10.3389/fhagi.2015.00199.

6. The TOMM40 gene rs2075650 polymorphism contributes to Alzheimer's disease in Caucasian, and Asian populations. Neurosci Lett. 2016;628: 142-146.

7. Zhou Q, Peng D, Yuan X, Lv Z, Pang S, Jiang W, et al. APOE and APOC1 gene polymorphisms are associated with cognitive impairment progression in Chinese patients with late-onset Alzheimer's disease. Neural Regeneration Res. 2014;9: 653.

8. Eisenberg DTA, Kuzawa CW, Hayes MG. Worldwide allele frequencies of the human apolipoprotein E gene: climate, local adaptations, and evolutionary history. Am J Phys Anthropol. 2010;143: 100-111.

9. Deelen J, Evans DS, Arking DE, Tesi N, Nygaard M, Liu X, et al. A meta-analysis of genome-wide association studies identifies multiple longevity genes. Nat Commun. 2019; 10: 1-14.

10. Bertram L, McQueen MB, Mullin K, Blacker D, Tanzi RE. Systematic meta-analyses of Alzheimer disease genetic association studies: the AlzGene database. Nat Genet. 2007;39: 17-23.

11. Yun H, Noh N1, Lee EY. Genetic risk scores used in cardiovascular disease prediction models: a systematic review. Rev Cardiovasc Med. 2022;23: 8.

12. Forrest IS, Chaudhary K, Paranjpe I, Vy HMT, Marquez-Luna C, Rocheleau G, et al. Genome-wide polygenic risk score for retinopathy of type 2 diabetes. Hum Mol Genet. 2021;30: 952-960.

13. Han B, Chen H, Yao Y, Liu X, Nie C, Min J, et al. Genetic and non-genetic factors associated with the phenotype of exceptional longevity & normal cognition. Sci Rep.2020; 10: 1-15.

14. "Mini-mental state": A practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician. J Psychiatr Res. 1975;12: 189-198.

15. Upton J. Mini-Mental State Examination. Encyclopedia of Behavioral Medicine. 2013; 1248-1249.

Изобретение относится к медицине, а именно к гериатрии, и может быть использовано для прогнозирования риска когнитивных нарушений у долгожителей. Осуществляют взятие крови у пациента для полногеномного секвенирования, выявление наличия полиморфизмов в генах АРОЕ, АРОС1, ТОММ40, АТР8В1, DKK3, SV2C, GRIK3 и межгенных участках. Выявляют аллели риска когнитивных нарушений у долгожителя и суммируют их с коэффициентами из таблицы 2. При полученном значении меньше 0,5 прогнозируют отсутствие когнитивных нарушений. При полученном значении больше 0,5 прогнозируют развитие когнитивных нарушений. Способ обеспечивает возможность прогнозирования риска развития когнитивных нарушений у долгожителей за счет использования полигенной шкалы риска на основе 45 полиморфизмов в генах АРОЕ, АРОС1, ТОММ40, АТР8В1, DKK3, SV2C, GRIK3 и межгенных участках. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования риска когнитивных нарушений у долгожителей, включающий взятие крови у пациента для полногеномного секвенирования, выявление наличия полиморфизмов в генах АРОЕ, АРОС1, ТОММ40, АТР8В1, DKK3, SV2C, GRIK3 и межгенных участках, выявление аллелей риска когнитивных нарушений, суммирование выявленных у долгожителя аллелей риска когнитивных нарушений с коэффициентами из таблицы 2 по формуле:

,

где g_i - количество аллелей риска когнитивных нарушений, β_i - коэффициент для аллеля риска из таблицы 2, β_{возраст} - коэффициент регрессии для возрастной переменной, равный 0,0022, β₀ - свободный член равный -0,9965 для мужчин и -0,7513 для женщин; ехр - экспоненциальная функция; и при полученном значении меньше 0,5 прогнозируют отсутствие когнитивных нарушений у долгожителей, а при полученном значении больше 0,5 прогнозируют развитие когнитивных нарушений у долгожителей.