Способ моделирования экспериментального хронического эндометрита у крыс Российский патент 2024 года по МПК A61M25/01 A61K31/00 A61P31/04 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной гинекологии, и касается моделирования хронического эндометрита у лабораторных животных.

Одной из самых частых причин нарушений репродуктивной функции является хронический эндометрит, распространенность которого достигает 76% и не имеет тенденции к снижению. Он выступает единственным этиологическим фактором бесплодия в 20% случаев, а при обследовании пациенток с анамнезом невынашивания на преконцепционном этапе частота гистологически верифицированного хронического воспалительного процесса в эндометрии достигает 50%, при общем обхвате прегравидарной подготовкой населения около 5%. (Яковчук Е.К., Сулима А.Н., Рыбалка А.Н., и др. Хронический эндометрит: современное состояние проблемы, основные аспекты патогенеза, влияние на репродуктивную функцию. Российский вестник акушера- гинеколога. 2016; 16(5):37-41. doi: 10.17116/rosakush201616537-41 Скворцова М.Ю., Прилуцкая С.Г. Современное состояние проблемы привычной потери беременности: дискуссионные вопросы причин и факторов риска, тактика периконцепционного ведения. Гинекология. 2017; 19 (2): 59-65; Peigen С., Panyu С., Yingchun G. et al. Interaction Between Chronic Endometritis Caused Endometrial Microbiota Disorder and Endometrial Immune Environment Change in Recurrent Implantation Failure. Front Immunol. 2021; 12:748447. doi: 10.3389/fimmu.2021.748447.). Хронический эндометрит - это клинико-морфологический синдром, при котором в результате персистирующего повреждения эндометрия инфекционным агентом возникают множественные вторичные морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую трансформацию и рецептивность слизистой оболочки тела матки (Зароченцева Н.В., Аршакян А.К., Меньшикова Н.С., Титченко Ю.П. Хронический эндометрит: этиология, клиника, диагностика, лечение. Российский вестник акушера-гинеколога.2013; 13(5):21-27). Морфологическими критериями хронического эндометрита являются лимфоплазмоцитарные инфильтраты, обнаружение очагов фиброза в строме и в стенках спиральных артерий, преимущественно в базальном слое эндометрия (Кузнецова А.В. Хронический эндометрит Архив патологии, 2000, №3, с 48-52).

Эффективным мероприятием повышения шансов зачатия и профилактики репродуктивных потерь является персонифицированная прегравидарная подготовка, направленная на выявление и коррекцию потенциальных факторов риска (Золоева И.А. Реабилитация репродуктивной функции пациенток с нарушением имплантационной способности эндометрия на фоне хронического эндометрита: автореферат дисс. канд. мед. наук: 14.01.01/Золоева И.А. - Волгоград, 2019.- 123 с.)

Многогранность проблемы восстановления репродуктивной функции, ее медицинская и социальная значимость требуют поиска новых удобных экспериментальных моделей хронического воспаления эндометрия с целью его последующей реабилитации. Среди инфекционных агентов воспалительных процессов гениталий в современных условиях отмечается возрастание роли условно-патогенных возбудителей. Среди них превалируют аэробные грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella spp.(Liu Y, Ko EY, Wong KK, Chen X, Cheung WC, Law TS, Chung JP, Tsui SK, Li TC, Chim SS. Endometrial microbiota in infertile women with and without chronic endometritis as diagnosed using a quantitative and reference range-based method. Fertil Steril. 2019; 112(4):707-717.el. doi: 10.1016/j.fertnstert.2019.05.015. Кобаидзе Е.Г., Падруль M.M. Некоторые микробиологические характеристики женщин с хроническим эндометритом и его отсутствием. Акушерство, гинекология и репродукция. 2017; №4.)

Известны несколько методик моделирования хронического воспалительного процесса в эндометрии. Аналогом заявляемого способа является способ моделирования хронического воспаления эндометрия, отличающийся тем, что лабораторной крысе в маточный рог вводят 0,1 мл взвеси аутокала, полученной смешиванием его с физиологическим раствором в пропорции 1:10 и двойным фильтрованием смеси сквозь марлевый стерильный материал, затем, начиная с третьих суток после вмешательства, проводят в течение 7 суток антибактериальную терапию препаратом широкого спектра действия и устанавливают формирование хронического воспаления эндометрия с 41 суток эксперимента (Тихаева К.Ю., Рогова Л.Н., Ткаченко Л.В. Способ моделирования экспериментального хронического воспаления эндометрия у крыс. Патент РФ №2580986, МПК G09B 23/28. от 10.04.2016. Бюл. №10. 9 с.). Однако данная методика подразумевает проведение лабораторным животным нижнесрединной лапаротомии под наркозом в асептических условиях, выведение матки в рану, прокалывание стенки яйцевода инъекционной иглой и введение каловой взвеси. Выполнение данного алгоритма технологически сложно и трудоемко, требует специального оборудования, что приводит к увеличению финансовых и технических затрат. Более того, данная методика травматична для лабораторных животных, не может обеспечивать их 100% выживаемость в эксперименте, что является очень важным фактором в случае необходимости дальнейшей оценки эффективности методик коррекции эндометрита на экспериментальной модели. Описана так же модифицированная методика с аутокаловой взвесью, где приготовленный по вышеописанному алгоритму раствор аутокалая взвесь вводится в полость матки ретроградным путем с помощью спринцевания. Однако в эксперименте оценивалась активность процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) по содержанию в плазме крови диеновых и триеновых конъюгатов, и оснований Шиффа, а не гистологические маркеры хронического эндометрита. Соответственно судить о достоверности гистологической верификации маркеров хронического воспаления в эндометрии на основании данного метода не представляется возможным (Мороз А.С., Семенникова С.В., Копылова С.В., Строганов А.Б. Изучение активности окислительных процессов при экспериментальном моделировании эндометрита у крыс. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2019; 63(4): 101-104).

Прототипом заявляемого способа является моделирование экспериментального эндометрита по методике Батоевой Е.А.: суть метода заключается в том, что у самок лабораторных крыс моделируется острый эндометрит путем однократного внутриматочного введения водного раствора формалина 2% -0,1 мл. Далее самки выдерживаются трое суток (1 эстральный цикл), для формирования ответной реакции эндометрия, приближенной к хроническому эндометриту. Однако данная методика имеет весомый недостаток, обусловленный тем, что в эндометрии формируются признаки химического поражения ткани: слизистая оболочка рога матки находится в состоянии дистрофии и некроза, отмечается увеличение размеров и формы клеток кубического эпителия (вздутие), кариорексис. Данные изменения в эндометрии не приближены к классическим гистологическим маркерам хронического эндометрита, описанным выше. (Ботоева, Е.А. Экспериментальная фармакотерапия повреждений матки и ее придатков сухим экстрактом ортилии однобокой: автореферат дисс. канд. мед. наук: 14.00.25 / Е.А. Ботоева - Улан- Удэ, 2003. - 51 с.).

Предложенное изобретение позволяет технически проще получить экспериментатору модель хронического эндометрита и изучать на ее основании различные методы лечения в эксперименте.

Для этого крысе в полость маточного рога с помощью маточного зонда вводят 1 мл суспензии агаровой суточной культуры Escherichia coli (штамм АТСС 25922) в концентрации микробного агента 10⁵ КОЕ/мл. Начиная с третьих суток после вмешательства проводят антибактериальную терапию препаратом широкого спектра действия (цефтриаксоном) в дозе 20 мг/кг однократно в течение 7 суток. Не ранее 41 суток эксперимента устанавливается формирование хронического воспаления. Способ обеспечивает развитие типичных признаков заболевания, что позволяет проводить оценку эффективности методик коррекции хронического эндометрита.

Технический результат достигается благодаря тому, что у крыс в качестве доказательных предикторов хронического эндометрита определяется в макропрепарате диффузная лимфоцитарная инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя полости матки, фиброз стромы эндометрия и перивезикулярный фиброз, и, таким образом, представляется возможность дальнейшей оценки динамики изменений данных маркеров под воздействием различных лечебных методик.

Изолированную бактериальную культуру Escherichia coli (штамм АТСС 25922) культивируют на агаризированной питательной среде (в чашках Петри или на скошенном агаре) в течении 18 - 24 часов при температуре 37°С. Из суточной культуры готовят суспензию в стерильном физиологическом растворе, доводя оптическую плотность до 1 единицы по стандарту МакФарленда, что соответствует 3×10⁸ КОЕ/мл. Выполняя последующие разведения стерильным физиологическим раствором, получают конечные концентрации: 10⁷КОЕ/мл, 10⁶КОЕ/мл, 10⁵КОЕ/мл и 10⁴КОЕ/мл соответственно.

Эксперимент проводился на самках лабораторных крыс линии Wistar, возрастом 3 месяца, массой тела 180-200 г. Животные содержались в стандартных условиях сертифицированного вивария при температуре воздуха в помещении 20-22°С при свободном доступе к пище и воде. Эксперимент выполнялся с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах или иных научных целых (Страсбург, 1986 г.).

Животные были разделены на четыре группы (n=20) в зависимости от концентрации КОЕ Escherichia coli в взвеси, вводимой в полость маточного рога: животным группа 1 (n=5) в полость маточного рога ретроградно с помощью маточного зонда методом спринцевания вводилась взвесь Escherichia coli в концентрации 10⁴ КОЕ/мл, группе 2 (n=5) - в концентрации 10⁵ КОЕ/мл, группе 3 (n=5) - в концентрации 10⁶ КОЕ/мл, группе 4 (n=5) - в концентрации 10⁷ КОЕ/мл.

На основании имеющихся данных об анатомии репродуктивных органов крысы известно, что полость маточного рога небеременной крысы вмещает не более 1 мл. (Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Д. Анатомия крысы. СПб, 2001). В связи с этим методом спринцевания вводилась взвесь объемом 1 мл.

С третьих суток после манипуляции животные начинали получать антибактериальную терапию препаратом широкого спектра действия (Цефтриаксон) в соответствии с весом животного в течение 7 дней (из расчета 20 мг на 1 кг массы в сутки.

На основании ранее полученных экспериментальных данных (Самородинова Л.А. Методика создания экспериментального инфекционного сальпингита. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1966; 2: 123-124), хронический эндометрит начинает формироваться не ранее чем через 40 дней после введения аутокаловой взвеси. Соответственно с 50 дня после введение культуры бактерий животным под эфирным наркозом проводилась лапаротомия с гистерэктомией и кранио-цервикальная декапитация.

Полученный препарат (тело матки) фиксировали в нейтральном забуференном формалине.

Вырезка образцов материала производилась на уровне тела матки (в области бифуркации) и в средней части правого и левого рога.

Препараты изготавливались по стандартной методике с использованием изопропилового спирта. Толщина срезов 7 мкм, окраска гематоксилин-эозином. Срезы заключены под покровное стекло при помощи синтетической монтирующей среды (Биовитрум). Гистологические методы включали окраску Гематоксилин-Эозином.

Статистическая обработка полученных данных проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 10.0. и пакета статистического анализа программы MS EXEL 2010. Для каждой из величин высчитывали среднее (М) и ошибку среднего (т). Гипотезу о нормальности распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t-test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка W=0,89, р<0,01), то применяли тест Колмогорова-Смирнова или U-тест Манна-Уитни. Данные считали достоверными при р<0,05. При множественных сравнениях применяли поправку Бонферрони.

Патоморфологические изменения наиболее ярко выражены в рогах матки, в связи с этим представлено их описание. Выявленные патологии однотипны в правом и левом роге соответственно.

В качестве сравнения представлены препараты, изготовленные из маток интактных крыс (n=5):

У интактных крыс (без моделирования экспериментального эндометрита) эндометрий имеет нормальное строение. Эндометрий маточного рога крысы не четко разделен на функциональной и базальный слой, занимает 2/3 толщены матки и по поверхности выслан уплощенным однослойным эпителием, ядра которого имеют округлую или вытянутую форму. Железы в фиброзной строме располагаются редко или в виде скоплений, эпителий желез, как правило, однорядный цилиндрический с гиперхромными округлыми ядрами. Строма эндометрия образована тонкими коллагеновыми волокнами, веретенообразными мезенхимальными и лимфоцитоподобными клеточными элементами. Число лейкоцитов в эндометрии составляет 18,6±2,4 в 3 полях зрения при увеличении х 400. Сосуды находятся в состоянии умеренно выраженного полнокровия.

В эндометрии животных экспериментальной группы 1 (Escherichia coli 10⁴ КОЕ/мл) слизистая оболочка полости матки представлена призматическим эпителием. Хорошо визуализируются маточные железы, выстланные однослойным кубическим эпителием. В подслизистом слое определяется умеренный диффузный воспалительный инфильтрат, представленный преимущественно лимфоцитами и эозинофилами, плотностью 93,28±1,7 (р<0,001 в сравнении с интактными животными), а так же слабо выраженный перивезикулярный фиброз.

В эндометрии животных экспериментальной группы 2 (Escherichia coli 10⁵ КОЕ/мл) слизистая оболочка полости матки представлена призматическим эпителием, находящимся в состоянии атрофии. В подслизистом слое отмечается незначительная деформация желез, в просвете которых содержится слизь. В эндометрии определяется выраженный диффузный воспалительный инфильтрат, представленный преимущественно лимофоцитами, макрофагами и эозинофилами, плотностью 125,7±12,0 (р<0,001 в сравнении с интактными животными). Определяется диффузный умеренно выраженный фиброз стромы и стенок сосудов.

В эндометрии животных экспериментальной группы 3 (Escherichia coli 10⁶ КОЕ/мл) в слизистой оболочке полости матки определяется умеренно выраженный отек призматического эпителия, кровоизлияния, диффузная обильная воспалительная инфильтрация, плотностью 181,6±9,0 (р<0,001 в сравнении с интактными животными), представленная преимущественно нейтрофилами и эозинофилами. В подслизистом слое маточные железы сохранены, набухшие, содержат секрет. Мышечный слой набухший, кровенаполнен.

В микропрепаратах животных экспериментальной группы 4 (Escherichia coli 10⁷ КОЕ/мл) определялось выраженное расширение просвета рога матки. Призматический эпителий слизистой оболочки местами разрушенный. Отмечается выраженный отек подслизистого слоя, а также гистиоцитарная инфильтрация, плотностью 186,7±6,3 (р<0,001 в сравнении с интактными животными). Маточные железы деформировны, расширены, набухшие. Мышечный слой набухший, кровенаполнен.

Таким образом, полученные результаты гистологического исследования микропрепаратов эндометрия крыс после моделирования хронического эндометрита различными концентрациями Escherichia coli говорят о том, что минимальная концентрация, приводящая к формирования слабо выраженного хронического эндометрита по исследуемой методике составляет 10⁴ КОЕ/мл: в эндометрии определяются характерные гистологические маркеры хронического эндометрита (лимфоцитарная инфильтрация плотностью 93,28±1,7, фиброз стромы и стенок сосудов). При введении в полость маточного рога Escherichia coli 10⁵ КОЕ/мл так же визуализируются характерная гистологическая картина хронического эндометрита, однако плотность воспалительной инфильтрации более выраженная, нежели в группе 1, и составляет 125,7±12,0 (р=0,03). В группах с более высокими концентрациями инфицирующего агента гистологическая картина более напоминает подострую стадию эндометрита, с вовлечением в воспалительный процесс всех слоев матки: слизистого, подслизистого, мышечного и серозного, без признаков фиброзирования. При этом отмечаются признаки деструкции эндометрия, деформация и нарушение структуры маточных желез, что не характерно для классических гистологических маркеров хронического воспаления эндометрия. Следует отметить, что выживаемость животных в исследуемых группах до выведения из эксперимента методом кранио-цервикальной декапитации под эфирным наркозом составила 100%, что создает удобные условия экспериментатору для дальнейшего изучения влияния различных факторов на выраженность гистологических маркеров эндометрита.

Конкретные примеры выполнения эксперимента

Пример 1.

Половозрелой самке, массой 210 гр., находившейся на стандартной диете, с помощью маточного зонда в полость маточного рога ввели бактериальную взвесь Escherichia coli 10⁵ КОЕ/мл.

Через 3 суток начали антибактериальную терапию препаратом Цефтриаксон в дозе 20 мг/кг внутримышечно 1 раз в сутки в течение 7-ми дней. Далее крыса находилась в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище.

На 50 сутки после введения бактериальной массы под эфирным наркозом произведена срединная лапаротомия, гистерэктомия, кранио-цервикальная декапитация.

Макропрепарат направлен на гистологическое исследование.

Описание микропрепарата: в слизистой оболочке и подслизистом слое определяется умеренная лимфоплазмоцитарная инфильтрация, единичные нейтрофилы, гистиоциты, умеренный склероз стромы и спиральных артерий.

Заключение: Хронический эндометрит.

Пример 2.

Половозрелой самке, массой 200 гр., находившейся на стандартной диете, с помощью маточного зонда в полость маточного рога ввели бактериальную взвесь Escherichia coli 10⁵ КОЕ/мл.

Через 3 суток начали антибактериальную терапию препаратом Цефтриаксон в дозе 20 мг/кг внутримышечно 1 раз в сутки в течение 7-ми дней. Далее крыса находилась в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище.

На 50 сутки после введения бактериальной массы под эфирным наркозом произведена срединная лапаротомия, гистерэктомия, кранио-цервикальная декапитация.

Макропрепарат направлен на гистологическое исследование.

Описание микропрепарата: в слизистой оболочке и подслизистом слое определяется умеренная лимфоцитарная инфильтрация, единичные нейтрофилы, гистиоциты, умеренно выраженный перивезикулярный фиброз.

Заключение: Хронический эндометрит.

Полученные данные демонстрируют, что данная методика позволяет смоделировать хронический воспалительный процесс в эндометрии. Данная методика обеспечивает выживаемость лабораторных животных в эксперименте, дает возможность оценивать эффективность различных методик лечения хронического эндометрита на экспериментальной модели.

Изобретение относится медицине, а именно к экспериментальной гинекологии. Крысе в полость маточного рога через влагалище с помощью маточного зонда вводят 1 мл взвеси Escherichia coli 10⁵ KOE/мл. Через 3 суток после вмешательства проводят в течение 7 суток антибактериальную терапию препаратом Цефтриаксон внутримышечно в дозе 20 мг на 1 кг массы животного в сутки. Способ позволяет технически проще смоделировать хронический воспалительный процесс в эндометрии, обеспечивая выживаемость лабораторных животных в эксперименте, что в свою очередь обеспечивает возможность оценивать эффективность различных методик лечения хронического эндометрита на экспериментальной модели. 2 пр.

Способ моделирования экспериментального хронического эндометрита у крыс, отличающийся тем, что крысе в полость маточного рога через влагалище с помощью маточного зонда вводится 1 мл взвеси Escherichia coli 10⁵ KOE/мл, затем через 3 суток после вмешательства проводят в течение 7 суток антибактериальную терапию препаратом Цефтриаксон внутримышечно в дозе 20 мг на 1 кг массы животного в сутки.