Способ культивирования биопленок бактерий для исследования при оптической микроскопии Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12N11/14 C12Q1/02 G01N33/52 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной микробиологии и может быть использовано при исследовании формирования биопленок патогенными бактериями.

Способность к формированию биопленок установлена у большинства видов бактерий, существующих в природных, промышленных, клинических условиях. Патогенные бактерии продуцируют в виде биопленок гликополисахариды, обладающие защитным эффектом от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды и иммунной системы макроорганизма, что приводит к смене фенотипа в популяции в виде перехода в гетероморфизм, характеризующийся сниженным метаболизмом, и объясняет персистенцию в организме восприимчивых животных и окружающей среды. Этапы жизненного цикла патогенных бактерий, начиная с процесса адгезии до формирования биопленок недостаточно изучены, в связи с чем для детального исследования формирования биопленок необходимо совершенствование методических подходов к исследованию без нарушения архитектоники процесса формирования биопленок в жидкой и гелеобразной среде. Для оптимизации схемы бактериологического исследования актуальность представляет апробация и подбор эффективных прижизненных методов изучения формирования биопленок бактерий без нарушения архитектоники.

В настоящее время для исследования биопленок используют статические методы культивирования бактерий, позволяющие количественно оценивать процессы формирования матрикса, проводить визуализацию адгезированных бактерий (Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий. Патент RU 2688215 опубл.21.05.2019; Методы исследования биопленок. https://cyberleninka.ru/article/n/metody-kultivirovaniya-i-izucheniya-bakterialnyh-bioplenok).

Известен способ фиксации биопленок с использованием свежеприготовленного раствора глутарового альдегида. Можно использовать 1% и 2% растворы глутарового альдегида. Для 2% раствора глутарового альдегида время фиксации занимает 2-4 часа (в зависимости от пробы). Наиболее удобен для использования 1% глутарового альдегида, фиксация в котором проводится в течение 16-18 часов. При необходимости пробы можно хранить в 1% растворе глутарового альдегида до недели. При этом глутаровый альдегид разводят в натрий-фосфатном или ином буфере, или физиологическом растворе, безопасном для осмотического давления клетки. Фиксация проводится при низких температурах (4-5°С). Во избежание испарения и изменения концентрации, глутарового альдегида (исходная концентрация равна 25%) хранят в замороженном виде. Вещество достаточно токсично, поэтому работать с ним следует исключительно в перчатках. (Биопленки: Основные принципы организации и методы исследования https://kpfu.ru/portal/docs/F1250326711/posobie..Bioplenki..Mardanova.AM .Kabanov. D.A.. Sharipova.M.R.pdf).

Известен способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе (Патент RU 2484446 опубл. 10.06.2013 г.). Образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутарового альдегида на фосфатном буфере, рН 7,4, при температуре 4°С, а затем промывали в фосфатном буфере 20 минут и в дистиллированной воде 6 мин. После образец поэтапно обезвоживали в 70% 15 минут и по 10 минут в 80%, 96% и 100% этиловом спирте, пропитывали в камфене при t=60°C в течение 20 минут. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре.

Недостатком перечисленных способов является нарушение подвижных структур слизистых и гелевых компонентов биопленок при фиксации объектов исследования.

Известен способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae 01 серогруппы на поверхности хитина (Патент RU 2685878 опубл.23.04.2019). Образцы во флаконах автоклавируют 10 мин. при 120°С, а после охлаждения во флаконы вносят взвесь культур Vibrio cholerae 01 серогруппы до конечной концентрации 104 м.к./мл. Инкубирование проводят при 10°С и 28°С.

Недостатком является возможность применения данного способа только для Vibrio cholerae 01.

Известен способ фиксации препаратов парами 25,0% раствора глутарового альдегида в течение 3-5 ч, последующем контрастировании парами 2,0-4,0% водного раствора осмиевой кислоты (OsO₄) в течение 2-3 мин. (Исследование биопленок микобактерий при воздействии йодсодержащего препарата. https://cyberleninka.ru/article/n/issledovanie-bioplenok-mikobakteriy-pri-vozdeystvii-yodsoderzhaschego-preparata).

Недостатком является применение высокотоксичного концентрированного раствора глутарового альдегида.

Техническим задачей изобретения является оптимизация методов приготовления препаратов для оптической микроскопии с сохранением архитектоники биопленок патогенных бактерий.

Технический результат достигается фиксацией препаратов 1% раствором глутарового альдегида в течение 16-18 часов, последующем контрастировании парами 2,0-4,0% водного раствора осмиевой кислоты (OsO₄) в течение 2-3 мин. Раствор глутарового альдегида наносят аэрозольно пульверизатором. После обработки парами осмиевой кислоты биопленки с включенными бактериями приобретают желтоватый или коричневый цвет в зависимости от времени воздействия паров осмиевой кислоты.

Осуществляют культивирование бактерий в жидкой питательной среде (мясопептонный бульон - МПБ): в жидкой питательной среде 5,0 мл взвеси 18-часовых бульонных культур микроорганизмов в концентрации 10⁵ КОЕ/мл,

встряхивают (например, на аппарате «Vortex») и вносят в чашки Петри с 20,0 мл МПБ, на дно которых помещают обезжиренные покровные стекла. Образцы культивируют при 37°С и экспозиции 18 и 24 часов. Для исследования препаратов биопленок препараты фиксируют 1,0% раствором глутарового альдегида в течение 16-18 ч, для контрастирования препаратов применяют пары 2,0-4,0% водного раствора осмиевой кислоты (OsO₄) в течение 2-3 мин. Для фиксации парами раствор глутарового альдегида наносят аэрозольно пульверизатором. После обработки парами осмиевой кислоты биопленки с включенными бактериями приобретают желтоватый или коричневый цвет в зависимости от времени воздействия паров осмиевой кислоты.

Предлагаемый способ приготовления препаратов биопленок для оптической микроскопии позволяет изучить морфологию популяции бактерий и процесс формирования биопленок без нарушения архитектоники.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение биопленок бактерий S. enteritidis.

Для изучения формирования биопленок бактерии культивировали в жидкой питательной среде МПБ. При использовании способа культивирования в жидкой питательной среде 5,0 мл взвеси 18-часовых бульонных культур микроорганизмов S. enteritidis в концентрации 10⁵ КОЕ/мл, встряхивали на аппарате «Vortex» и вносили в чашки Петри с 20,0 мл МПБ, на дно которых помещали обезжиренные покровные стекла. Образцы культивировали при 37°С и экспозиции 18 и 24 часов. Для исследования препаратов биопленок препараты фиксируют 1,0% раствором глутарового альдегида в течение 16-18 ч, для контрастирования препаратов применяют пары 2,0-4,0%) водного раствора осмиевой кислоты в течение 2-3 мин. Для фиксации парами раствор глутарового альдегида наносят аэрозольно пульверизатором. После обработки парами осмиевой кислоты биопленки с включенными бактериями приобретали желтовато-коричневый цвет. При формировании биопленок бактерий S. enteritidis наблюдали образование замкнутых структур различной величины, состоящих из закрытых межклеточным матриксом бактериальных клеток. Такие нитевидные структуры впоследствии сопровождаются образованием кластеров, Фиг. 1.

Пример 2. Изучение биопленок бактерий Е. coll

Для изучения формирования биопленок бактерии культивировали в жидкой питательной среде МПБ. При использовании способа культивирования в жидкой питательной среде 5,0 мл взвеси 18-часовых бульонных культур микроорганизмов Е. coli в концентрации 10⁵ КОЕ/мл, встряхивали на аппарате «Vortex» и вносили в чашки Петри с 20,0 мл МПБ, на дно которых помещали обезжиренные покровные стекла. Образцы культивировали при 37°С и экспозиции 18 и 24 часов. Для исследования препаратов биопленок препараты фиксируют 1,0%) раствором глутарового альдегида в течение 16-18 ч, для контрастирования препаратов применяют пары 2,0-4,0%) водного раствора осмиевой кислоты в течение 2-3 мин. Для фиксации парами раствор глутарового альдегида наносят аэрозольно пульверизатором. После обработки парами осмиевой кислоты биопленки с включенными бактериями приобретали желтовато-коричневый цвет. Исследование формирования биопленок бактерий Е. coli показало сходство с иерсиниями в морфологии расположения бактерий в виде ветвистых структур, объединенных межклеточным матриксом, Фиг. 2.

Пример 3. Изучение биопленок бактерий P. aeruginosa. При проведении анализа применяли два способа.

Для изучения формирования биопленок бактерии культивировали в жидкой питательной среде МПБ. При использовании способа культивирования в жидкой питательной среде 5,0 мл взвеси 18-часовых бульонных культур микроорганизмов P. aeruginosa в концентрации 10⁵ КОЕ/мл, встряхивали на аппарате «Vortex» и вносили в чашки Петри с 20,0 мл МПБ, на дно которых помещали обезжиренные покровные стекла. Образцы культивировали при 37°С и экспозиции 18 и 24 часов. Для исследования препаратов биопленок препараты фиксируют 1,0% раствором глутарового альдегида в течение 16-18 ч, для контрастирования препаратов применяют пары 2,0-4,0%) водного раствора осмиевой кислоты в течение 2-3 мин. Для фиксации парами раствор глутарового альдегида наносят аэрозольно пульверизатором. После обработки парами осмиевой кислоты био пленки с включенными бактериями приобретали желтовато-коричневый цвет. Адгезия и формирование биопленок бактерий Р. aeruginosa происходит в виде длинных нитей и коротких цепочек, отмечено, что под тонкой пленкой прослеживались бактериальные формы клеток, которые располагались в виде единичных округлых или коротких и удлиненных палочек. Выявлялись также уплотненные участки биопленки, в которой отмечено большое скопление клеток как палочковидной, так и округлой формы, хорошо окрашиваемые парами осмиевой кислоты. Биопленки бактерий P. aeruginosa имеют более сложную подвижную структуру в виде геля, Фиг. 3.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения препаратов биопленок бактерий для исследования в оптической микроскопии, заключающийся в фиксации препаратов 1,0% раствором глутарового альдегида в течение 16-18 ч, последующем контрастировании парами 2,0-4,0% водного раствора осмиевой кислоты в течение 2-3 мин; для фиксации раствор глутарового альдегида наносят аэрозольно. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения препаратов для оптической микроскопии с сохранением архитектоники биопленок патогенных бактерий. 3 ил., 3 пр.

Способ получения препаратов биопленок бактерий для исследования в оптической микроскопии, заключающийся в фиксации препаратов 1,0% раствором глутарового альдегида в течение 16-18 ч, последующем контрастировании парами 2,0-4,0% водного раствора осмиевой кислоты в течение 2-3 мин, отличающийся тем, что для фиксации раствор глутарового альдегида наносят аэрозольно.