Способ оценки морфологической структуры биоплёнок микроорганизмов в динамике биоплёнкообразования Российский патент 2024 года по МПК C12N11/00 C12Q1/02 G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии, касается способа оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов в динамике биопленкообразования и может быть использовано для изучения действия химических веществ и физических факторов на биопленку и биопленкообразующую способность микроорганизмов и их ассоциаций.

Оценка биопленкообразующей способности микроорганизмов является существенным элементом биомедицинских исследований, поскольку бактериальные биопленки в результате своей убиквитарности создают проблемы при лечении инфекционных заболеваний, а также постоянно представляют собой существующую угрозу распространения и переноса нозокомиальных инфекций в лечебно-профилактических учреждениях.

Бактериальная биопленка - микробная популяция, состоящая из одного или нескольких видов бактерий, заключенная в межклеточное вещество (матрикс), где микробные клетки прикреплены друг к другу и к субстратам.

В настоящее время способность формировать биопленки рассматривается как дополнительный фактор патогенности бактерий, так как в большинстве случаев биопленка представляет собой сложноорганизованную структуру с высокой степенью толерантности к иммунной защите хозяина и повышенной устойчивости к антибиотикам и биоцидным факторам [Аджиева A.A. et al. Влияние антибиотиков на образование биопленки Streptococcus pyogenes в условиях in vitro II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2021. - Т. 98, №1- С.59-64].

Известен способ оценки биопленокоообразующей способности микроорганизмов при экспозиции в течение 40 минут в 0,1% водном растворе генцианвиолета с последующей его экстракцией спиртом в течение 10 минут с последующим фотометрическим определением элюированного красителя [O'Toole G.A. Microtiter dish biofilm formation assay // J.Vis.Exp.2011(47):2437]. Однако известный способ не обладает достаточной информативностью, поскольку зрелые биопленки, формируемые бактериальными клетками, отличаются строгой упорядоченностью и сложной структурой, обусловленной физическими и биологическими особенностями клеток, что позволяет рассматривать биопленку как единое образование, структурные особенности которого отражают его свойства [Lade Н. et al. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates is differentially affected by glucose and sodium chloride supplemented culture media //J.Clin.Med. 2019. 8(11):1853].

Для исследования морфологической структуры биопленок используют различные модификации оптической и электронной микроскопии. Современная оптическая микроскопия благодаря информационным технологиям перешла из разряда субъективных методов в группу точных, позволяющих проводить верифицируемые количественные исследования пространственно-временных и физико-химических характеристик объектов.

Помимо применения новых технологий освещения и совершенствования оптических схем, повышения информативности обеспечивается применением машинных методов обработки изображения.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов [RU 2719402, 17.04.2020], отличающийся тем, что биопленку формируют под предметным стеклом, расположенным под углом 30° в чашке Петри, окрашивают любым из доступных методов и визуализируют структуру биопленки с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай), подвергают ее морфометрическому исследованию в программе Scope Photo х86, 3.1.312 (США) для оценки морфологических особенностей структуры биопленки микроорганизмов и измерения размеров отдельных ее структурных компонентов, с последующим сохранением результата на электронном носителе в формате файлов jpg. Однако известный способ имеет ряд ограничений. Так, культивирование в течение 24 часов не обеспечивает прохождение биопленкой основных стадий биопленкообразования [Keles. А. et al. Visualization and characterization of Enterococcus faecalis biofilm structure in bovine dentin using 2D and 3D microscopic techniques // Arch.Microbiol. 2021. 203(1):269-277], помещение предметного стекла в чашку Петри строго под углом 30° затрудняет осуществление способа, т.к. требует инструментальных методов контроля, а использование открытого огня для фиксации препарата перед окраской исключает возможность осуществления способа в ламинарном боксе.

Задача заявленного изобретения - разработка способа оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов в динамике биопленкообразования.

Технический результат заключается в том, что заявленный способ обеспечивает получение достоверных сведений об отдельных структурных компонентах биопленки в динамике при разных стадиях ее формирования и создание трехмерных моделей с последующим сохранением результатов исследования в виде графических файлов, является простым в осуществлении и позволяет оценивать биопленкообразующую способность микроорганизмов и их ассоциаций.

Технический результат достигается способом оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов в динамике биопленкообразования путем создания микробной биопленки, в котором биопленку формируют на покровном стекле, расположенном под углом 40-50° в чашке Петри, содержащей плотную питательную среду с добавлением жидкой питательной среды, окрашивают препарат, зафиксированный в 96% этаноле и приклеенный на предметное стекло с помощью прозрачного лака, красителем для люминесцентной микроскопии, визуализируют структуру биопленки и проводят морфометрическое исследование и цифровую обработку полученных изображений с применением 3D-моделирования при помощи оптического микроскопа с люминесцентным модулем и цифровой камерой в программе ImageJ ver. 1.52а с последующим сохранением результата на электронных носителях в виде файлов формата jpg.

Способ осуществляется следующим образом.

Для формирования биопленок исследуемой культуры микроорганизмов в стерильной чашке Петри на покровных стеклах суспензию маточной культуры бактерий разводят до концентрации 0,5-3,0 по МакФарланду в любой жидкой питательной среде общего назначения (например, ГРМ-бульон), 50-200 мкл суспензии наносят на покровные стекла и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37±2°С. Стекла после инкубации отмывают от неприкрепившихся клеток бактерий забуференным фосфатами физиологическим раствором, погружают узкой гранью в любую плотную питательную среду общего назначения (например, ГРМ-агар) под углом 40-50° к поверхности среды, добавляют 10 мл любой жидкой питательной среды общего назначения (например, ГРМ-бульона), инкубируют при 37±2°С в течение 7 суток. Каждые 24 часа культивирования проводят полную замену жидкой питательной среды в чашке Петри. Извлеченное стекло отмывают забуференным фосфатами физиологическим раствором от неприкрепившихся клеток, высушивают на листе фильтровальной бумаги, препарат на покровном стекле фиксируют в течение 3 минут в 96% этаноле, удаляют спирт и приклеивают на предметное стекло с помощью любого прозрачного лака. Готовый препарат окрашивают красителем для люминесцентной микроскопии (например, раствором акридинового оранжевого) в течение 10 минут, промывают проточной водой, высушивают в темноте, а затем просматривают с использованием любого оптического микроскопа с люминесцентным модулем (например, «Микмед-6») при увеличении х10-100 в иммерсионной системе с фотофиксацией наблюдаемого в окуляре изображения цифровой камерой. При этом оценивают морфологическую структуру биопленки: наличие каналов и выступов, количество и форму внеклеточного матрикса, выраженность и толщину клеточного компонента. Проводят цифровую обработку полученных изображений с применением 3D-моделирования при помощи программного комплекса ImageJ ver. 1.52а, а полученные результаты фиксируют на электронном носителе (например, HDD, съемные USB-носители и др.) в виде файлов формата jpg.

Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг.1, 2 и 3:

На фиг.1 показаны стадии образования биопленки Staphylococcus aureus; а) 1-е сутки культивирования - первичная адгезия бактериальных клеток к поверхности; (б) 2-е сутки культивирования - окончательная адгезия бактериальных клеток к поверхности; (в) 3-и сутки культивирования - появление скоплений микробных клеток; (г) 5-е сутки культивирования -появление монослоя клеток и фрагментов внеклеточного полисахаридного матрикса; (д) 7-е сутки культивирования - появление конгломератов клеток, погруженных в интенсивно развитый матрикс;

На фиг.2 показано изменение морфологической структуры биопленки микст культур Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus в динамике: (а) 1-е сутки культивирования - адгезия бактериальных клеток к поверхности; (б) 2-е сутки культивирования - формирование матрикса; (в) на 7-е сутки культивирования - появление рельефности структуры и объема;

На фиг.3 показана биопленка Staphylococcus aureus после инкубации с амикацином: (а) биопленка после инкубации с 16 мкг/мл амикацина; (б) биопленка после инкубации с 30 мкг/мл амикацина; (в) биопленка без воздействия амикацина.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Определение стадий биопленкообразования

Суспензию маточной культуры Staphylococcus aureus разводили до концентрации 1,5 по МакФарланду в ГРМ-бульоне, 50 мкл суспензии наносили на покровные стекла и инкубировали при температуре 37±2°С в течение 1 часа. Стекла после инкубации отмывали от неприкрепившихся клеток бактерий забуференным фосфатами физиологическим раствором, погружали узкой гранью в ГРМ-агар под углом 40-50° к поверхности агара в чашке Петри и заливали в чашку 10 мл ГРМ-бульона, инкубировали при температуре 37±2°С в течение 7 суток. Каждые 24 часа культивирования проводили полную замену жидкой питательной среды в чашке Петри. На 1-е, 2-е, 3-й, 5-е и 7-е сутки периода инкубации из чашки Петри извлекали одно из стекол, отмывали забуференным фосфатами физиологическим раствором от неприкрепившихся клеток и высушивали на листе фильтровальной бумаги. Препарат на покровном стекле фиксировали в 96% этаноле в течение 3 минут, после удаления спирта приклеивали на предметное стекло с помощью прозрачного лака. Готовый препарат окрашивали 20 мкг/мл раствора акридинового оранжевого в течение 10 минут, промывали проточной водой, высушивали в темноте, а затем просматривали с использованием оптического микроскопа с люминесцентным модулем при увеличении х 10-100 в иммерсионной системе с фотофиксацией наблюдаемого в окуляре изображения цифровой камерой. Наблюдали на 1-е сутки культивирования - первичную адгезию бактериальных клеток к поверхности; на 2-е сутки культивирования - окончательную адгезию бактериальных клеток к поверхности; на 3-й сутки культивирования - появление скоплений микробных клеток; на 5-е сутки культивирования - появление монослоя клеток и фрагментов внеклеточного полисахаридного матрикса; на 7-е сутки культивирования - появление конгломератов клеток, погруженных в интенсивно развитый матрикс.

Пример 2. Определение изменений морфологической структуры бинарной биопленки в динамике биопленкообразования

Суспензию маточных культур Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus разводили до концентрации 2,5 по МакФарланду в ГРМ-бульоне, 100 мкл суспензии наносили на покровные стекла и инкубировали при температуре 37±2°С в течение 1 часа. Стекла после инкубации отмывали от неприкрепившихся клеток бактерий забуференным фосфатами физиологическим раствором, погружали узкой гранью в ГРМ-агар под углом 40-50° к поверхности агара в чашке Петри, заливали в чашку 10 мл ГРМ-бульона, инкубировали при температуре 37±2°С в течение 7 суток. Каждые 24 часа культивирования проводили полную замену жидкой питательной среды в чашке Петри. На 1-е, 2-е, и 7-е сутки инкубации из чашки Петри извлекали одно из стекол, отмывали забуференным фосфатами физиологическим раствором от неприкрепившихся клеток и высушивали на листе фильтровальной бумаги. Далее препарат на покровном стекле фиксировали в 96% этаноле, в течение 3 минут, удаляли спирт, приклеивали на предметное стекло с помощью прозрачного лака. Готовый препарат окрашивали 20 мкг/мл раствора акридинового оранжевого в течение 10 минут, промывали проточной водой, высушивали в темноте, а затем просматривали с использованием оптического микроскопа с люминесцентным модулем при увеличении х10-100 в иммерсионной системе с фотофиксацией наблюдаемого в окуляре изображения цифровой камерой. Установили, что на 1-е сутки культивирования бактерии активно прикреплялись к поверхности, продуцировали элементы матрикса и формировали основы биопленочных элементов; на 2-е сутки культивирования бактерии формировали матрикс, но основу биопленки составлял только один слой клеток; на 7-е сутки культивирования биопленка приобретала рельефность структуры и объем и продолжала активно развиваться.

Пример 3. Определение устойчивости биопленок культуры Staphylococcus aureus к воздействию амикацина

Суспензию маточной культуры Staphylococcus aureus разводили до концентрации 3,0 по МакФарланду в ГРМ-бульоне, по 150 мкл суспензии наносили на покровные стекла в одном контрольном и двух опытных вариантах и инкубировали при температуре 37±2°С в течение 1 часа. Стекла после инкубации отмывали от неприкрепившихся клеток бактерий забуференным фосфатами физиологическим раствором, погружали узкой гранью в ГРМ-агар под углом 40-50° к поверхности агара в чашке Петри, заливали в чашку 10 мл ГРМ-бульона, инкубировали при 37±2°С в течение 7 суток. Каждые 24 часа культивирования проводили полную замену жидкой питательной среды в чашке Петри. На 3-и сутки инкубации в опытные варианты вносился ГРМ-бульон, содержащий раствор амикацина в дозе 16 и 30 мкг/мл. На 4-е сутки инкубации в контрольном и опытных вариантах стекла извлекали из чашки Петри, отмывали забуференным фосфатами физиологическим раствором от неприкрепившихся клеток и высушивали на листе фильтровальной бумаги. Препараты на покровном стекле фиксировали в 96% этаноле в течение 3 минут, удаляли спирт, приклеивали на предметное стекло с помощью прозрачного лака. Готовые препараты окрашивали 20 мкг/мл раствора акридинового оранжевого в течение 10 минут, промывали проточной \ водой, высушивали в темноте, а затем просматривали с использованием оптического микроскопа с люминесцентным модулем при увеличении х10-100 в иммерсионной системе с фотофиксацией наблюдаемого в окуляре изображения цифровой камерой. При воздействии амикацина в концентрации 16 мкг/мл наблюдали частичное разрушение бактериальных клеток и деградацию биопленочного матрикса, при увеличении концентрации амикацина до 30 мкг/мл процесс деградации биопленочного матрикса усиливался, в структуре биопленки появлялись каверны и раковины, местами она утрачивала многослойную структуру.

Проведенные исследования показали, что заявленный способ прост и безопасен в осуществлении, обеспечивает повышение информативности получением более контрастного изображения благодаря использованию технологии люминесцентной микроскопии, визуализацией временной динамики и стадийности процесса биопленкообразования у монокультур и микробных ассоциаций, что позволяет на любой стадии образования биопленки отдифференцировать отдельные ее структурные части, изучить их размеры и расположение относительно друг друга. Применение заявленного способа обеспечивает получение дополнительной информации, способствующей повышению эффективности антимикробной терапии хронических инфекционных заболеваний, осложненных персистирующими в биопленочной форме возбудителями, позволяет приблизить рекомендации по созданию локальных протоколов антимикробной терапии к реальной ситуации, а также повышать эффективность проведения дезинфекционных мероприятий в ЛПУ за счет объективного контроля за воздействием дезинфектантов на бактерии в биопленочной форме.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов, включающий формирование биопленки микроорганизмов на покровном стекле, для чего 50-200 мкл суспензии маточной культуры бактерий, разведенной до концентрации 0,5-3,0 по МакФарланду, наносят на покровное стекло, инкубируют 1 ч при 37±2°С, затем стекла отмывают забуференным фосфатами физиологическим раствором, погружают узкой гранью в плотную питательную среду под углом 40-50° к поверхности, заливают в чашку 10 мл жидкой питательной среды, инкубируют 7 сут при 37±2°С с полной заменой жидкой питательной среды каждые 24 ч; перед окрашиванием препарат фиксируют в течение 3 мин в 96% этаноле с последующим удалением спирта и приклеиванием прозрачным лаком на предметное стекло, окрашивают красителем для люминесцентной микроскопии. Структуру биопленки визуализируют с помощью оптического микроскопа с люминесцентным модулем при увеличении х10-100 в иммерсионной системе, а морфометрическое исследование проводят в программе ImageJ ver. 1.52а. Изобретение обеспечивает оценку морфологии биопленки микроорганизмов на разных стадиях ее формирования, создание трехмерных моделей с сохранением результатов исследования в виде графических файлов. 3 ил., 3 пр.

Способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов в динамике биопленкообразования, включающий формирование биопленки микроорганизмов в чашке Петри, окрашивание, визуализацию структуры биопленки, морфометрическое исследование и сохранение результата на электронном носителе в виде файлов в формате jpg, отличающийся тем, что биопленку микроорганизмов формируют на покровном стекле, для чего суспензию маточной культуры бактерий разводят до концентрации 0,5-3,0 по МакФарланду в любой жидкой питательной среде общего назначения, 50-200 мкл суспензии наносят на покровное стекло и инкубируют при температуре 37±2°С в течение 1 ч, стекла после инкубации отмывают от неприкрепившихся клеток бактерий забуференным фосфатами физиологическим раствором, погружают узкой гранью в любую плотную питательную среду общего назначения под углом 40-50° к поверхности и заливают в чашку 10 мл любой жидкой питательной среды общего назначения с последующей инкубацией при температуре 37±2°С в течение 7 суток с полной заменой жидкой питательной среды каждые 24 ч, перед окрашиванием препарат фиксируют в течение 3 мин в 96% этаноле с последующим удалением спирта и приклеиванием на предметное стекло с помощью прозрачного лака, окрашивают красителем для люминесцентной микроскопии, структуру биопленки визуализируют с помощью оптического микроскопа с люминесцентным модулем при увеличении х10-100 в иммерсионной системе, а морфометрическое исследование проводят в программе ImageJ ver. 1.52а.