Способ оценки эффективности дезинфекции микробных биоплёнок на различных поверхностях Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/18 C12N1/20 

Изобретение относится к области санитарии и гигиены производственных, медицинских и иных помещений, в частности к разработке тест-систем для оценки/верификации эффективности процедур дезинфекции химическими или физическими методами. Изобретение может быть применено при разработке и тестировании средств и мер дезинфекции как в лабораторных, так и в производственных и бытовых условиях.

Из уровня техники широко известна лабораторная модель формирования биопленок на границе раздела твердой и жидкой фаз с использованием пластиковых планшетов (O’Toole G.A, Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis // Mol Microbiol. 1998 May;28(3):449-61. doi: 10.1046/j.1365-2958.1998.00797.x), которая использована в патенте RU2621306C1. Недостатком метода является неконтролируемая степень/полнота удаления биопленок с поверхности пластика и полнота гомогенизации биопленок для количественного определения числа выживших клеток микроорганизмов. Кроме того, этот метод не позволяет исследовать биопленки на границе раздела «твёрдая фаза – воздух», а биопленки именно такого типа часто встречаются на объектах окружающей среды.

Разнообразные модели биоплёнок были созданы для изучения их различных свойств, кроме достоверного определения количества жизнеспособных клеток, определяемых по их способности образовывать колонии на плотных средах (Azeredo J., Azevedo N.F., Briandet R., Cerca N., Coenye T., Costa A.R., Desvaux M., Di Bonaventura G., Hébraud M., Jaglic Z., Meyer R.L., Nychas G., Simões M., Tresse O., Sternberg C. Critical review on biofilm methods // Crit. Rev. Microbiol. 2017. V.43 № 3. Р.313-351. doi: 10.1080/1040841X.2016.1208146).

Для увеличения площади прикрепления биопленок на границе жидкой и твёрдой фаз, что увеличивает точность исследования, было предложено увеличить площадь границы раздела фаз путем применения носителей, погруженных в жидкую фазу, например, в виде тефлоновых кубиков (Плакунов В.К., Мартьянов С.В., Тетенева Н.А., Журина М.В. Универсальный метод количественной характеристики роста и метаболической активности микробных биопленок в статических моделях // Микробиология. 2016. Т. 85. № 4. С. 484–480). Кроме того, такой подход позволяет повысить степень перехода в жидкую фазу и дисперсии (измельчения биоплёнок, что повышает точность определения количества жизнеспособных клеток в биоплёнках. В качестве показателя количества жизнеспособных клеток был использован акцептор электронов 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ). Этот способ является одним из двух прототипов настоящего способа. Недостатком этого способа является ограниченность материала, применённого авторами (техфлон), поскольку в окружающей среде биопленки формируются и на иных материалах (металле, керамике и др.). а также неопределённость оптимальных размеров частиц.

Биопленки на разделе двух иных фаз, воздушной и плотной, моделируются с использованием полупроницаемых мембран на поверхности плотной питательной среды (Peterson et al., 2011). Такие биопленки можно исследовать методами электронной микроскопии, использовать для изучения влияния антисептиков и других антибактериальных мер обработки поверхностей, геномов и протеомов биопленочного фенотипа. Важным недостатком этой экспериментальной системы является трудность диспергирования биопленок до единичных клеток для точного определения количества жизнеспособных клеток. Для преодоления этого препятствия был разработан подход, основанный на использовании стекловолоконных фильтров (Плакунов и др., 2016). Поскольку стекловолоконные фильтры весьма хрупки и могут быть разрушены при определенных механических воздействиях, не разрушающих клетки бактерий, достигается диспергирование микроорганизмов до отдельных клеток, что позволяет точно определять количество жизнеспособных клеток обычным методом высева на плотные среды. Недостатком этого подхода, также взятого за прототип, является ограниченность использованного материала подложки, стекла, поскольку в окружающей среде биопленки формируются и на иных материалах (целлюлозе, пластике, металле и др.).

Указанных недостатков – неточного определения числа жизнеспособных клеток в биопленках при неконтролируемом удалении биопленок с поверхности, степени их разрушения (дисперсии) и несоответствия материала – носителя биопленок в модельной системе материалам на объектах окружающей среды, лишен предлагаемый способ – тест-система биопленок для оценки эффективности процедур дезинфекции биоплёнок.

Техническим результатом предлагаемого решения является линейка моделей (тест-систем) биопленок для оценки эффективности процедур дезинфекции. Изобретение обеспечивает повышение точности и объективности оценки результатов дезинфекции.

Технический результат настоящего изобретения, обеспечивается тем, что в качестве материала для нанесения микроорганизмов используют стерилизованное стекловолокно или целлюлозу, в качестве микроорганизмов используют любые микроорганизмы, способные к образованию биопленок, или их сочетания, материал с нанесенными микроорганизмами размещают на поверхности плотной питательной среды для их выращивания, образованная система термостатируется до образования биопленок, полученная биопленка вводится в контакт с дезинфектантом или подвергается физическим биоцидным воздействием на заданное время для испытаний соответствующего воздействия, после чего система гомогенизируется, в образовавшейся массе определяется количество клеток микроорганизмов способных к размножению и по доле жизнеспособных клеток определяется эффективность дезинфекции.

Также технический результат настоящего изобретения обеспечивается тем, что в качестве материала для выращивания на нем биопленок микроорганизмов используют стерилизованные частички металла или пластика или керамики с размером сторон не менее 1 мм и не более 4 мм, в качестве микроорганизмов используют любые микроорганизмы, способные к образованию биопленок, или их сочетания, материал и микроорганизмы вводят в жидкую стерильную питательную среду для выращивания микроорганизмов, образованная система термостатируется до образования биопленок на поверхностях частичек материала, после чего питательная среда удаляется, затем частички материала с биопленками микроорганизмов помещаются в стерильную питательную среду или физраствор, после чего в систему вводится дезинфектант или система подвергается физическим биоцидным воздействием на заданное время для испытаний соответствующего воздействия, после чего определяется дыхательная активность в биопленках или относительная масса биопленок при связывании красителя, и по доле снижения дыхательной активности или массы биопленок определяется эффективность дезинфекции.

На фиг. 1 представлена экспериментальная система для получения биоплёнок бактерий на стекловолокне. А - нарезка фильтров на фрагменты 15х15 мм острым карандашом; Б - расположение фильтров на поверхности агаровой пластинки; В - гомогенизация стекловолоконного фильтра с использованием гомогенизатора Ultra Turrax в стаканах DT-20 с ротор-статорной вставкой (Г).

На фиг. 2 приведены электронные микрофотографии биопленочных культур Kocuria rhizophyla (А) и Salmonella typhimurium (Б) после 6 суток инкубации на стекловолоконных фильтрах, сделанные методом сканирующей электронной микроскопии. Обозначения: К - клетки бактерий; СВ - стекловолокно; ПМ - полисахаридный матрикс.

На фиг. 3 приведены фотографии фторопластовых (квадратные слева) и металлических (круглые справа) носители для формирования биопленок, используемые в разработанной тест-системе.

На фиг. 4 приведены фотографии металлических (верхний ряд), керамических (средний ряд) и фторопластовых (нижний ряд) носителей с биопленками Pseudomonas gessardii, окрашенных кристаллическим фиолетовым, в 12-луночном планшете.

На фиг. 5 представлено действие дезинфектанта ДИМАКС хлор (0,152%, 5 мин) на выживаемость бактерий E.coli и S.aureus в биопленках возрастом 2 и 9 сут.

На фиг. 6 представлено количество выживших клеток в моновидовых БП разного возраста: (1) – 2 сутки, (2) – 4 сутки, (3) – 6 сутки. А – E. coli , Б – K. rhizophila, В – S. typhimurium. Указана доля (%) выживших клеток от общей популяции клеток на фильтре.

Сущность способа и его техническая реализуемость иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение моделей биопленок на границе раздела фаз «твёрдая поверхность/воздух»

Биопленки данного типа могут быть получены с использованием волокнистых легкоразрушаемых (диспергируемых) материалов разной природы в зависимости от целей исследования. Главное требование к материалу – способность к диспергированию при воздействиях, не разрушающих клетки бактерий.

Биопленки на стекловолокне . Данный материал, стекловолокно, является моделью таких применяемых в производстве материалов, как стекло и керамика.

Суточные планктонные культуры Грамотрицательных бактерий Escherichia coli, Salmonella typhimurium и других, или Грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Kocuria rhizophyla и других, доводят до оптической плотности 0.5 (ОП540) и аликвоту чистых культур бактерий или их смеси суммарным объемом 20 мкл наносят на расположенные на агаризованной среде LB стерильные стекловолоконные фильтры (15х15 мм). Фильтры изготавливали путем их вырезания из стекловолоконных фильтров (Whatman GF/F) (фиг. 1 А и Б). После стерилизации автоклоавированием (20 мин, 121°С) фильтры располагают на поверхности агаровых пластинок. Бактериальную суспензию равномерно распределяют по поверхности фильтра с помощью автоматической пипетки капельным методом. После нанесения суспензий чашки переворачивают, инкубируют при 30°С в термостате в течение 1-6 суток, отбирая образцы на исследование по мере надобности.

В результате выращивания получают типичные биоплёнки (фиг. 2), являющиеся хорошей моделью для испытания эффективности дезинфектантов.

Для определения количества жизнеспособных клеток стекловолоконный фильтр гомогенизуют с использованием гомогенизатора Ultra Turax, IKA (Германия). Для гомогенизации используют стаканы серии DT-20 c ротор-статорной вставкой (фиг 1 В, Г) в 10 мл стерильного физраствора (0.9% хлорида натрия). Стерильным пинцетом фильтр переносят в стакан и гомогенизируют в режиме: 10 сек при 4000 об/мин, 10 сек при 6000 об/мин и остальное время до 2 минут в режиме 8000 об/мин. Первый этап гомогенизации позволяет смывать бактериальные клетки в мягком режиме, второй этап позволяет мягко дефрагментировать стекловолоконный фильтр, а третий этап позволял провести тонкую и эффективную гомогенизацию всего фильтра до отдельных фрагментов волокон. Полученную суспензию разбавляют методом десятичных разведений. Для этого 100 мкл гомогената переносят в 900 мкл стерильного изотонического раствора 0.9% NaCl и далее аналогично разбавляют суспензии до значений 10^-8. Для определения численности жизнеспособных клеток, определяемых как колониеобразующие единицы, КОЕ, пользуют метод десятичных разведений с последующим высевом на плотную среду LB.

Результаты оценки эффективности противомикробного действия представляют в виде процентов или долей относительно содержания жизнеспособных клеток в контрольных образцах (не подвергавшихся воздействию дезинфектантов или иных стрессоров). Выражение результатов в относительных единицах позволяет сравнивать действие различных дезинфектантов между собой.

Биопленки на волокнах целлюлозы . Данный материал, целлюлоза, является моделью таких применяемых в производстве материалов, как дерево, бумага, натуральные ткани из растительных волокон.

Методика формирования, диспергирования и анализа биоплёнок аналогична описанной выше для стекловолоконных фильтров. В качестве материала для выращивания биоплёнок используют бумажные фильтры из целлюлозы неплотных сортов, легко диспергируемые, например, фильтры чёрная лента, белая лента, желтая лента. Фильтры нарезаются на квадратики со стороной 15 мм, стерилизуются при 1 ати, и далее используются, как описано выше для стекловолоконных фильтров.

Данный пример 1 показывает возможность культивирования моно- и мультивидовых биопленок грамотрицательных и грамположительных бактерий на границе раздела фаз «воздух-твёрдая поверхность» на материалах, аналогичных таковым в окружающей природной, производственной или бытовой среде. Модель может использоваться для исследования действия на биопленки различных стрессоров: антибиотиков, дезинфектантов, а также действия на биопленки физических факторов (температуры, высушивания, изменение кислотности и т.д.), что будет продемонстрировано в нижепредставленных примерах 3-6.

Пример 2. Получение моделей биопленок на границе раздела фаз «твёрдая поверхность/жидкость» на фрагментах материалов разной природы

Биопленки данного типа моделируют биопленки, формирующиеся в производственных или медицинских ситуациях, а также в быту, когда поверхность объектов постоянно влажная, смачивается или находится в жидкости. Для формирования биоплёнок используются соответствующие целям испытаний микроорганизмы и питательные среды.

Для оценки количества выживших (жизнеспособных) клеток определяют метаболически активные клетки бактерии по скорости восстановления акцептора электронов 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромидом (МТТ) в электрон-транспортных цепях бактерий, как это описано в способе-прототипе (Плакунов с соавт., 2016). Можно также использовать краситель кристаллический фиолетовый (КФ) – для определения относительного количества биоплёнок, которое прямо пропорционально количеству связанного КФ.

Для отработки предложенной тест-системы выбраны наиболее распространенные материалы - металл, фторопласт и керамика. Металл и керамика имели форму шариков диаметром 3 мм, фторопласт – форму кубиков с ребром 4 мм. Предварительные опыты показали, что частицы большего диаметра имели слишком низкую удельную площадь поверхности, а шарики меньшего диаметра более сложны для манипуляций. Материалом служили: металл - нержавеющая сталь AISI 316, керамика - оксид циркония (частично стабилизированный оксидом иттрия), пластик – фторопласт типа Ф-4 (политетрафторэтилен). На фиг. 3 представлены носители из фторопласта и металла.

Биоплёнки получали по следующей методике.

Стерилизовать 5-10 г материала (1 ати, 15 мин), перенести в лунку стерильного планшета (NUNC, 12 лунок)), инокулировать каждую лунку посевным материалом (50-100 мкл суточной культуры или их смесью в этом же объёме, разбавленной до ОП540=0,1). Далее культивировать планшеты в одинаковых условиях на качалке или в планшетном культиваторе-спектрофотометре Biorad xMark. Рекомендуется использовать скорость перемешивания 100 об/мин. Температуру культивирования устанавливают в зависимости от свойств – тест-организмов. После выращивания биоплёнок в лунки планшета добавляют испытуемые вещества.

Для оценки роста культур и антимикробного действия испытываемых веществ используют функциональный краситель МТТ. При покраске МТТ сразу после удаления планктонной культуры или среды из всех лунок внести в каждую лунку 3 мл 0.1% раствора МТТ в среде роста. Инкубировать 30-240 мин (в среднем рекомендуем 1 час). Удалить не связанный с биопленками краситель, промывая носители водой до прекращения окраски промывных вод (медленно и плавно, не допускать резкого движения носителей). Воду удалить фильтровальной бумагой, прижав ее сверху к планшету крышкой и плавно переворачивая. Перенести носители в другой планшет (допускается использование нестерильных планшетов, не содержащих красителей). Планшеты выглядят, как представлено на фиг. 4.

При покраске кристаллическим фиолетовым фиксировать биопленки на носителях добавлением в каждую лунку 4 мл этанола на 15 минут при комнатной температуре, далее этанол удалить, подсушить носители 5 минут и покрасить 0.1% водным раствором КФ при комнатной температуре в общем случае 30 минут (для некоторых культур время окраски надо подбирать индивидуально от 5 минут до 60 минут).

Экстрагировать краситель из биопленок диметилсульфоксидом для МТТ или этанолом для КФ (2 мл). В общем случае растворитель должен целиком покрывать носитель. Экстракцию продолжать до обесцвечивания образцов (перехода красителя в объем растворителя) в отсутствии света, до 24 часов (допустимо использовать орбитальный шейкер, при этом время экстракции снижается) при комнатной температуре, в общем случае 1-2 часа для КФ и 2-5 часов для МТТ. Измерить оптическую плотность экстрактов при 590-595 нм (допускается как измерение в кюветах при небольшом количестве образцов, так и перенос экстрактов в 96 луночный планшет и измерение на ридере). Произвести обработку полученных данных, представив результаты в виде процентов от контроля.

Пример 3. Испытание эффективности биоцидов с применением разработанной тест-системы на стекловолоконном материале

Тест-система была получена, как описано в примере 1.1. Тест-объекты - E.coli и S.aureus. Испытывали действие дезинфектанта ДИМАКС хлор в концентрации 0,152% в течение 5 минут на моно- и бинарные БП. Высокая чувствительность тест-системы позволила выявить, что чувствительность молодой 2-суточной биоплёнки E. coli к дезинфектанту была ниже, чем старой 9-суточной БП, что Е.coli более устойчива, чем S.aureus, что в бинарной БП устойчивость бактерий к биоциду не возрастает относительно моновидовых БП (фиг. 5).

Пример 4. Испытание эффективности антибиотика ципрофлоксацина против биоплёнок с применением разработанной тест-системы на стекловолоконном материале

Было исследовано действие антибиотика цирофлоксацина на культуры E. coli, Kocuria rhizophila и Salmonella typhimurium, находящихся в состоянии БП. БП получали, как описано в примере 1.1., к БП добавляли антибиотик ципрофлоксацин до концентрации 10 мкг/мл, инкубировали в течение 7 ч, после чего определяли долю (%) выживших клеток (фиг. 6). Обнаружено, что наиболее устойчивым организмом является K. rhizophila, наиболее чувствительным - S. typhimurium. При старении БП их устойчивость к антибиотику возрастает.

Пример 5. Испытание эффективности биоцидов с применением разработанной тест-системы, основанной на использовании металлических, пластиковых и керамических элементов в жидкой среде

Биопленки получали, как описано в примере 2 с использованием фторопластовых элементов. Для детекции количества метаболически активных клеток использовали тетразолиевый краситель МТТ. Испытывали дезинфектанты надуксусную кислоту (1.5%), этанол (30%), перекись водорода (30%), ДЕМАКС хлор (0.2%). Время воздействия – 5 минут. Результаты представлены в табл. 1. При использовании всех испытанных биоцидов против планктонных культур происходит снижение численности жизнеспособных клеток на 3-4 порядка за 5 минут. Однако, в состоянии БП те же биоциды снижали численность жизнеспособных клеток в 10-20 раз. Тем самым подтвержден известный факт, что в состоянии биопленки бактерии повышенной устойчивостью к воздействию дезинфектантов.

Таблица 1. Эффект дезинфектантов на количество выживших клеток бактерий (в %).

Культура Надуксус-ная к-та Этанол Перекись водорода ДИМАКС хлор Pseudomonas extremorientailis 9 8 6 5 Pseudomonas gessardii 12 11 9 7 Kocuria rhizophila 10 7 3 4

Пример 6. Испытание эффективности стерилизации паром с применением разработанной тест-системы на бумажном фильтре

Обработка биоплёнок паром была испытана как пример физической стерилизации, подхода, сочетающего очищающий и стерилизующий эффекты.

Биопленки были подготовлены, как описано в примере 1.2. Фильтры изготавливали путем их вырезания из фильтровальной бумаги (фильтр белая лента). Биопленки, состоящие из S. aureus и S. typhimurium, выращивали при 28°С в течение 2 сут.

Для обработки использовали парогенератор Bort BDR-1400. Для обработки использовали смесь этанола (96%) с дистиллированной водой. Были протестированы три концентрации этанола (30%, 50% и 70%). Смесь заливали в контейнер пароочистителя и доводили до кипения по индикатору устройства. Пар направляли на биопленки, расположенные на агаровой пластине в чашке Петри с расстояния 5 см. Время экспозиции составляло 5 и 10 секунд.

Для определения численности клеток фильтры с выросшими на их поверхности биопленками (в контроле) или после воздействия пара обрабатывала, как описано в примере 1.1. Для высева на плотную среду LB пользовались микрометодом для определения численности КОЕ (5 мкл суспензии соответствующего разведения, количество повторностей 5‒10). Рассчитывали количество КОЕ на один фильтр, после чего рассчитывали эффективность стерилизации, как величину снижения количества КОЕ относительно контроля (таблица 2).

При использовании пара 30% смеси этанола с водой эффект был минимальный и число выживших клеток составляло 75-100% от контроля (биопленки без обработки паром). Снижение численности КОЕ обоих микроорганизмов при обработке этанолом в концентрации 70% в течение 10 секунд достигало 2 порядков. При воздействии паром в аналогичных условиях на биопленки более старого возраста – 4 и 21 суток, биоцидный эффект от воздействия паром во всех случаях не превышал 5%.

Приведенные примеры 3-7 демонстрируют пригодность, удобство и точность применения новой тест-системы для оценки эффективности различных способов дезинфекции – с применением антибиотиков, химических дезинфектантов, пара.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ оценки эффективности дезинфекции микробных биоплёнок на поверхности материала, включающий стерилизацию материала для нанесения микроорганизмов, нанесение на его поверхность микроорганизмов, выращивание микроорганизмов до состояния биопленок на поверхности материала; полученную биопленку вводят в контакт с дезинфектантом или подвергают физическому биоцидному воздействию; результаты оценки эффективности противомикробного действия представляют в виде процентов или долей относительно содержания жизнеспособных клеток в контрольных образцах, не подвергавшихся дезинфекции (варианты). В качестве материала для нанесения микроорганизмов используют стерилизованное стекловолокно или целлюлозу, и материал с нанесенными микроорганизмами размещают на поверхности плотной питательной среды для их выращивания; или используют стерилизованные частички металла, или пластика, или керамики с размером сторон не менее 1 мм и не более 4 мм, материал и микроорганизмы вводят в жидкую стерильную питательную среду для выращивания микроорганизмов. Изобретения обеспечивают расширение арсенала способов оценки эффективности процедур дезинфекции микробных биопленок на поверхности материала. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 6 пр.

1. Способ оценки эффективности дезинфекции микробных биоплёнок на поверхности материала, включающий стерилизацию материала для нанесения микроорганизмов, нанесение микроорганизмов на поверхность стерилизованного материала, выращивание микроорганизмов до состояния биопленок на поверхности материала, отличающийся тем, что в качестве материала для нанесения микроорганизмов используют стерилизованное стекловолокно или целлюлозу, материал с нанесенными микроорганизмами размещают на поверхности плотной питательной среды для их выращивания, образованную систему термостатируют до образования биопленок, полученную биопленку вводят в контакт с дезинфектантом или подвергают физическому биоцидному воздействию на заданное время для испытаний соответствующего воздействия, после чего систему гомогенизируют, результаты оценки эффективности противомикробного действия представляют в виде процентов или долей относительно содержания жизнеспособных клеток в контрольных образцах, не подвергавшихся дезинфекции.

2. Способ оценки эффективности дезинфекции микробных биоплёнок на поверхности материала, включающий стерилизацию материала для выращивания на нем биопленок микроорганизмов, внесение его в жидкую стерильную питательную среду для выращивания микроорганизмов, внесение микроорганизмов в образованную систему и их выращивание до состояния биопленок, отличающийся тем, что в качестве материала для выращивания на нем биопленок микроорганизмов используют стерилизованные частички металла, или пластика, или керамики с размером сторон не менее 1 мм и не более 4 мм, материал и микроорганизмы вводят в жидкую стерильную питательную среду для выращивания микроорганизмов, образованную систему термостатируют до образования биопленок на поверхностях частичек материала, после чего питательную среду удаляют, затем частички материала с биопленками микроорганизмов помещают в стерильную питательную среду или физраствор, после чего в систему вводят дезинфектант или систему подвергают физическому биоцидному воздействию на заданное время для испытаний соответствующего воздействия, результаты оценки эффективности противомикробного действия представляют в виде процентов или долей относительно содержания жизнеспособных клеток в контрольных образцах, не подвергавшихся дезинфекции.