Способ культивирования молочнокислых бактерий с использованием в качестве стимулятора роста дезинтегрированной биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris, накопленной при очистке сточных вод Российский патент 2024 года по МПК C12P7/56 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к области биотехнологических и экологических процессов и производств, в частности, к способам культивирования биомассы бактерий. Изобретение может быть использовано в пищевой, химической и фармацевтической отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве.

Известен способ культивирования молочнокислых бактерий на основе штамма Enterococcus faecium В-2240 D (Патент на изобретение РФ №2205216, МПК C12N 1/20, С12Р 7/56, C12N 1/20, C12R 1/01, 2000 г.). Методика включает ферментацию монокультуры бактерий Enterococcus faecium на питательной среде, для приготовления которой используются отходы и вторичные ресурсы перерабатывающих отраслей промышленности, разделение культуральной жидкости на твердую и жидкую фазы и выделение целевых продуктов. Изобретение позволяет получать продукт с выходом до 98%.

К недостаткам данного изобретения можно отнести наличие стадии разделения на твердую и жидкую фазы культуральной жидкости, а также использование в качестве питательной среды белково-углеводной смеси (а именно зерновые и картофельные отходы, молочные сыворотки и др.), что сужает область использования бытовых отходов и сточных вод.

Известен способ получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза (Патент на изобретение РФ №2306340, МПК С12Р 7/56, C12N 1/20, C12R 1/225, 2005 г.). Молочную кислоту получают сбраживанием сахарсодержащей среды молочнокислыми бактериями штамма Lactobacillus delbrueckii ВКПМ В-8744 при возрасте культуры 48-72 ч в присутствии солодовых ростков в количестве 12-15 г/л, обработанных водой, подкисленной молочной кислотой до рН 4,0-5,0 и ферментным препаратом ксилоглюканофоетидином в количестве, соответствующем 200-600 ед/л ксиланазной активности. В качестве нейтрализующего агента в предлагаемом методе используется мел в количестве 60% от общего количества.

Недостатком данного метода является использование большого количества сахарного песка (в количестве 380-420 г/л) для приготовления питательной среды, что увеличивает затраты на производство готового продукта. При этом, значения водородного показателя рН поддерживаются на уровне 4,0.

Известен способ получения молочной кислоты (Патент на изобретение РФ №1243354, МПК C12P 7/56, 2002 г.). В соответствии с предлагаемым методом молочную кислоту получают при помощи продуцирующего штамма бактерий Lactobacillus delbriickii в сахаросодержащей питательной среде. Нейтрализацию проводят при помощи карбоната кальция при нагревании с последующей очисткой и выделением. Улучшение качества продукта и ускорение процесса происходит за счет введения активной кремниевой кислоты в количестве 60-80 мг/л, а затем отвода образовавшегося осадка в поле центробежных сил при факторе разделения 3500-4500, при этом надосадочная жидкость подвергается омагничиванию в поле с магнитной индукцией 0,01-0,15 Тл перед выделением целевого продукта. Предлагаемый способ получения молочной кислоты обеспечивает выход лактата кальция 1460,0 г/л после 50 ч брожения, что приводит к общей продуктивности процесса 2,92 г/(л⋅ч) и выходу молочной кислоты 93,9%.

К недостаткам данного изобретения можно отнести относительно невысокий выход молочной кислоты и использование дорогостоящих компонентов питательной среды (источники углерода и азота).

Наиболее близким к предлагаемому способу культивирования молочнокислых бактерий является патент на изобретение РФ №2700503, МПК С12Р 7/56, C12N 1/20, C12R 1/225, 2018 г. Способ предусматривает использование бактерий рода Lactobacillus в питательной среде, представляющей собой рассиропную, отстерилизованную свекловичную мелассу и сточные воды, предварительно очищенные с помощью микроорганизмов Chlorella vulgaris. Культивирование молочнокислых бактерий происходит в течение 24-35 часов при температуре 37-50°С и водородном показателе рН 6,5-7,5 при перемешивании 50-80 об/мин и аэрации суспензии газовоздушной смесью 60-80 л/ч. В качестве стимулятора роста молочнокислых бактерий применяют внеклеточные метаболиты накопленных микроводорослей. Способ позволяет повысить выход молочной кислоты до 98%.

К недостаткам данного способа получения молочной кислоты можно отнести необходимость стадии утилизации накопленной биомассы микроводорослей после очистки сточных вод, а также низкую концентрацию стимулирующих веществ, поскольку они являются внешними метаболитами.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение интенсификации процесса микробиологического синтеза молочной кислоты.

Решение данной задачи достигается использованием в качестве стимуляторов роста микробиологического синтеза молочной кислоты комплексов внутри- и внеклеточных веществ микроводорослей, накопленных в процессе очистки сточных вод.

Сточные воды, поступающие с очистных сооружений и содержащие поллютанты в виде катионов аммония 20-80 мг/л, в виде фосфат анионов концентрацией 5-50 мг/л, общее микробное число: 2-30 млн кл/мл, используются в культивировании и накоплении биомассы микроводорослей вида Chlorella vulgaris.

После культивирования состав вод становится следующим: катионы аммония 1 мг/л, фосфат анионы концентрацией 4,5 мг/л, общее микробное число 0,5 млн кл/мл. Концентрация микроводорослей при этом может достигать 25 млн кл/мл.

Для дальнейшего использования в микробиологическом синтезе молочной кислоты накопленную биомассу микроводорослей дезинтегрируют ферментом «Протосубтилин r3x» (0,004 мг/мл) в течение 10 минут при температуре 50°С (стадия 3 рис. 1).

Культивирование молочнокислых бактерий для микробиологического синтеза молочной кислоты заключается в создании оптимальных условий в среде, содержащей дезинтегрированные микроводоросли и высвободившиеся внеклеточные метаболиты с частично обеззараженными и очищенными сточными водами: температура 50°С, начальный уровень рН 6,5-7,5, интенсивность перемешивания 70-80 оборотов в минуту, подача посевного материала - молочнокислых бактерий рода Bacillus coagulans в количестве 10% (об.) по отношению к питательной среде. Время культивирования молочнокислых бактерий 4-5 суток.

В питательном субстрате (табл. 1) присутствуют очищенные с использованием микроводорослей сточные воды с остаточным содержанием поллютантов, накопленные микроводорослями внеклеточные и высвободившиеся (в результате дезинтеграции) внутриклеточные метаболиты: витамины группы В, полисахариды (галактоза), фитогормон - индолил-3уксусная кислота, жирные кислоты, аминокислоты (табл. 2).

В качестве посевного материала для микробиологического синтеза молочной кислоты используются бактерии рода Bacillus coagulans (штамм Bacillus coagulans В-10468).

Культивирование штамма молочнокислых бактерий осуществляется на питательном субстрате (содержание редуцирующих сахаров 5%), основой которого является очищенная сточная вода с накопленной и дезинтегрированной биомассой микроводорослей рода Chlorella vulgaris. Это позволяет обеспечить накопление максимальной концентрации молочной кислоты в культуральной среде за счет повышенного содержания стимулирующих веществ в питательном субстрате.

Использование в качестве посевного материала молочнокислых бактерий рода Bacillus coagulans и питательной среды, приведенной в табл. 1, состава смеси метаболитов, приведенных в табл. 2, позволяет обеспечить выход молочной кислоты 120 г/л к концу культивирования.

Подтверждением эффективности разработанного метода являются результаты культивирования и накопления молочной кислоты на рис 2.

Изобретение относится к биотехнологии и экологии. Предложен способ получения молочной кислоты, предусматривающий культивирование молочнокислых бактерий рода Bacillus coagulans в течение 4-5 сут при температуре 50°С, начальном уровне рН 6,5-7,5, интенсивности перемешивания 70-80 об/мин в питательной среде со следующим составом: 600 г/л рассиропная и пастеризованная свекловичная меласса, 300 г/л техническая вода, 100 г/л сточные воды, очищенные в течение 3-8 сут микроводорослями Chlorella vulgaris до содержания катионов аммония 1 мг/л, фосфат анионов 4,5 мг/л, общего микробного числа 0,5 млн кл/мл, с накопленной биомассой микроводорослей Chlorella vulgaris, которую дезинтегрируют ферментом «Протосубтилин r3x» в количестве 0,004 мг/мл в течение 10 мин при температуре 50°С. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения целевого продукта. 2 ил., 2 табл.

Способ получения молочной кислоты, предусматривающий культивирование молочнокислых бактерий рода Bacillus coagulans в течение 4-5 сут при температуре 50°С, начальном уровне рН 6,5-7,5, интенсивности перемешивания 70-80 об/мин в питательной среде со следующим составом: 600 г/л рассиропная и пастеризованная свекловичная меласса, 300 г/л техническая вода, 100 г/л сточные воды, очищенные в течение 3-8 сут микроводорослями Chlorella vulgaris до содержания катионов аммония 1 мг/л, фосфат анионов 4,5 мг/л, общего микробного числа 0,5 млн кл/мл, с накопленной биомассой микроводорослей Chlorella vulgaris, которую дезинтегрируют ферментом «Протосубтилин r3x» в количестве 0,004 мг/мл в течение 10 мин при температуре 50°С.