СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДНОЙ ФРАКЦИИ ИЗ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ, ОБЛАДАЮЩЕЙ АНТИБИОТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/12 C12P21/00 A61K36/05 C12R1/89 

Изобретение относится к области биотехнологических процессов и производств, в частности, к способам получения метаболитов, обладающих антибиотическими свойствами.

Известен способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре Conium maculatum L. (болиголова пятнистого) (Патент на изобретение РФ №2619182, МПК C12N 5/04 (2006.01), А61Р 37/04 (2006.01), 2017 г.). Способ предусматривает культивирование на питательной среде МС каллусной культуры болиголова пятнистого в присутствии 6-бензиламинопурина в течение 30 суток, сбор биомассы и выделение биологически активных веществ, отличающийся тем, что культивирование ведут при 26±1°С, влажности 70%, в темноте; 6-бензиламинопурин вводят в питательную среду при концентрации 1-0,1 мг/л совместно с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 1-0,5 мг/л или совместно с α-нафтилуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 3-0,5 мг/л, а биологически активные вещества выделяют путем кислого и щелочного хлороформного извлечения. Изобретение позволяет получить требуемый объем биомассы каллусной культуры, который содержит БАВ-фуранокумарины и ациклические тритерпеноиды.

Недостатком данного способа является использование в качестве компонента питательной среды дихлорфеноксиуксусной кислоты, дорогостоящего вещества, являющегося гербицидом, что увеличивает себестоимость готового продукта и потенциальную опасность при реализации данной технологии.

Известен способ извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella (патент РФ №2460771, МПК C12N 1/12 (2006.01) A23K 1/00 (2006.01) A61K 8/00 (2006.01), 2012). Способ предусматривает следующее. Высушенную до влажности 10% биомассу одноклеточной водоросли рода Chlorella механически активируют в активаторах планетарного, вибрационного или виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел 60-400 м/с² при времени пребывания в зоне обработки 0,5-10 мин. Измельченную биомассу одноклеточной водоросли суспендируют в органическом растворителе, в качестве которых используют бензин или этиловый спирт, которые вносят при экстракции из расчета 5-7 литров органического растворителя на 1 кг сухой биомассы, с последующей экстракцией при комнатной температуре в течение 3-5 часов. Полученный экстракт фильтрованием разделяют на растворимую и нерастворимую части и сушат с получением сухого липидно-пигментного комплекса. Высушенную нерастворимую часть экстракта смешивают с ферментными препаратами «Целлюлокс-А» и «Протосубтилин г3х» или их смесью и проводят гидролиз в течение 4-8 часов при рН 4-6, температуре 50-65°С. При этом ферментные препараты добавляют к нерастворимой части экстракта в количестве 0,5-10 мас. %. Разделяют ферментативный гидролизат центрифугированием на растворимую и нерастворимую части с последующей их сушкой для получения сухих продуктов.

Недостатком данного способа являются высокие затраты на осушку до остаточной влажности биомассы микроводорослей 10%, что приводит к значительному повышению себестоимости готовых продуктов.

Наиболее близким к предлагаемому решению является следующий способ получения комплекса биологически активных веществ (Патент на изобретение № 2256700 РФ, МПК C12N 1/12 A23J 3/20 A23K 1/00 С12Н 1/00 C12R 1/89, 2005 г.). Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и фармакологической промышленности. Способ предусматривает культивирование Chlorella vulgaris, отделение биомассы и ее двукратное замораживание, отделение клеточного сока и экстракцию твердой фракции католитом. Полученные экстракт, клеточный сок и жидкую фракцию, полученную при культивировании Chlorella vulgaris, объединяют. Способ позволяет получить комплекс биологически активных веществ, содержащих ферменты и антибиотические вещества.

Недостатками данного способа являются: 1) применение в качестве метода дезинтеграции клеточных стенок Chlorella vulgaris двукратного замораживания-оттаивания, требующего значительных энергетических затрат и времени и являющегося низкоэффективным для данного вида микроорганизмов, обладающих прочной клеточной стенкой; 2) получение в качестве продукта комплекса биологически активных веществ, обладающих различными свойствами, - ферментов, ускоряющих биохимические реакции, а также антибиотических веществ заранее неизвестного состава, ингибирующих жизнедеятельность микроорганизмов.

Задачей изобретения является повышение эффективности дезинтеграции клеточных стенок микроводорослей рода Chlorella, а также получение отдельной фракции биологически активных соединений, обладающих антибиотическим действием - пептидной фракции из водорастворимых белков микроводорослей.

Решение технической задачи достигается за счет дезинтеграции клеток микроводорослей в ультразвуковом поле с последующей обработкой суспензии ферментом. Получение отдельной фракции биологически активных соединений, обладающих антибиотическим действием (пептидной фракции из водорастворимых белков микроводорослей), осуществляется за счет добавления к дезинтегрированной биомассе клеток фосфатного буфера (рН 7,4), выделения водорастворимой фракции, отделения водной фракции, содержащей белки, от клеточных остатков в поле центробежных сил и обработки водной белковой фракции протеолитическими ферментами.

Между отличительными признаками и достигаемым техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь.

Технический результат достигается тем, что дезинтеграция клеток микроводорослей обеспечивается созданием ультразвукового поля мощностью 140-160 Вт на 20-30 мл суспензии микроводорослей влажностью 96-99% в течение 290-310 с и последующей обработкой ферментом, например, лизоцимом, взятом в концентрации 12-20 мг на 1 г биомассы, в течение 4 ч при температуре 37°С. Получение отдельной фракции биологически активных соединений, обладающих антибиотическим действием (пептидной фракции из водорастворимых белков микроводорослей), обеспечивается за счет добавления к дезинтегрированной биомассе клеток фосфатного буфера (рН 7,4), выделения водорастворимой белковой фракции в течение 20-24 ч при температуре 2-4°С, отделения водной фракции, содержащей водорастворимые белки, от клеточных остатков в поле центробежных сил и обработки водной белковой фракции протеолитическими ферментами.

Для культивирования микроводорослей рода Chlorella используется питательная среда, которая является стерильной и содержит азот в виде нитрата калия 3-5 г/л, фосфор в виде дигидрофосфата калия в концентрации 0,2-2 г/л, серу в виде сульфата магния и гептагидрата сульфата железа в концентрации 0,125-1,25 г/л и 0,01-0,015 г/л соответственно, а также 0,5-1,5 мл раствора микроэлементов, который содержит катионы марганца(II) в виде тетрагидрата хлорида марганца(II) в концентрации 1,0-2,0 г/л, катионы цинка в виде гептагидрата сульфата цинка - 0,1-0,3 г/л, катионы меди(II) в виде сульфата меди(II) - 0,01-0,02 г/л, оксид молибдена(VI) в концентрации 0,01-0,02 г/л, борную кислоту в концентрации 2-3 г/л, ванадат аммония в концентрации 0,01-0,02 г/л. Культивирование микроводорослей с использованием данной питательной среды осуществляется 7-8 суток при следующих условиях: 1) количество вносимого посевного материала (клеток микроводорослей), выращенного в стерильных условиях и отобранного в конце логарифмической стадии роста, составляло 8-12% от общего объема суспензии; таким образом, начальная концентрация биомассы в суспензии составляет 0,05-0,1 г/л; 2) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 80-140 мкмоль фотонов/(м²⋅с); 4) уровень рН 6.2-8.0; 5) аэрация суспензии (0,2-0,3 л/(мин⋅л)) стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%; концентрация биомассы микроводорослей в суспензии достигает величины 0,5-2 г/л, а содержание внутриклеточного водорастворимого белка - 20-35% (от сухого вещества биомассы).

Выращенная биомасса клеток отделяется от культуральной жидкости в поле центробежных сил при факторе разделения 900-1200 в течение 7-15 минут.

Дезинтеграция сконцентрированных клеток микроводорослей обеспечивается созданием ультразвукового поля мощностью 140-160 Вт на 20-30 мл суспензии микроводорослей влажностью 96-99% в течение 290-310 с и последующей обработкой ферментом, например, лизоцимом, взятом в концентрации 12-20 мг на 1 г биомассы, в течение 3,5-4 ч при температуре 37°С.

Затем к дезинтегрированной биомассе клеток микроводорослей добавляется 015М фосфатный буфер (рН 7,4) в количестве 20-30 мл на 1 г биомассы, выделение белковой водорастворимой фракции осуществляется в течение 20-24 ч при температуре 2-4°С. Отделение водорастворимой белковой фракции от клеточных остатков осуществляется в поле центробежных сил (при факторе разделения 1500-1700 в течение 10-16 минут).

Далее осуществляется обработка водной белковой фракции протеолитическим ферментом пепсином, взятом в соотношении 1 (массовая единица фермента): 80-120 (массовых единиц биомассы клеток). Обработка осуществляется при рН 2-2,2 в течение 3,5-4 часов. Инактивация фермента осуществляется путем нагревания смеси до температуры 80-90°С в течение 12-16 минут. Выравнивание уровня рН осуществляется 0,8-1,2 М гидроксидом натрия до уровня 7-7,2.

Полученная пептидная фракция очищается от примесей в поле центробежных сил при факторе разделения 1500-1700 в течение 15-25 минут.

В качестве примера может быть рассмотрен технологический процесс производства пептидной фракции, обладающей антибиотическими свойствами в отношении грамположительных бактерий, на основе биомассы микроводорослей с высоким содержанием водорастворимого белка (фиг. 1).

Технологический процесс производства начинается с культивирования микроводорослей на стерильной питательной среде в автотрофных условиях в течение 7-8 суток: 1) количество вносимого посевного материала (клеток микроводорослей), выращенного в стерильных условиях и отобранного в конце логарифмической стадии роста, составляло 8-12% от общего объема суспензии, таким образом, начальная концентрация биомассы в суспензии составляет 0,05-0,1 г/л; 2) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 80-140 мкмоль фотонов/(м²⋅с); 4) уровень рН 6.2-8.0; 5) аэрация суспензии (0,2-0,3 л/(мин⋅л)) стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%.

В результате концентрация биомассы микроводорослей в суспензии достигает величины 0,5-2 г/л, а содержание внутриклеточного водорастворимого белка - 20-35% (от сухого вещества биомассы) (стадия 1).

Затем центрифугированием (при факторе разделения 900-1200 в течение 7-15 минут) от биомассы микроводорослей отделяется большая часть культуральной жидкости (стадия 2), в результате чего получается суспензия микроводорослей влажностью 96-99% (стадия 2).

Дезинтеграция сконцентрированных клеток микроводорослей обеспечивается созданием ультразвукового поля мощностью 140-160 Вт на 20-30 мл суспензии микроводорослей влажностью 96-99% в течение 290-310 с и последующей обработкой ферментом, например, лизоцимом, взятом в концентрации 12-20 мг на 1 г биомассы, в течение 3,5-4 ч при температуре 37°С (стадия 3).

Затем к дезинтегрированной биомассе клеток микроводорослей добавляется 0,15М фосфатный буфер (рН 7,4) в количестве 20-30 мл на 1 г биомассы, выделение белковой водорастворимой фракции осуществляется в течение 20-24 ч при температуре 2-4°С (стадия 4).

Отделение водорастворимой белковой фракции от клеточных остатков осуществляется в поле центробежных сил (при факторе разделения 1500-1700 в течение 10-16 минут) (стадия 5).

Далее осуществляется обработка водной белковой фракции протеолитическим ферментом пепсином, взятом в соотношении 1 (массовая единица фермента): 80-120 (массовых единиц биомассы клеток). Обработка осуществляется при рН 2-2,2 в течение 3,5-4 часов (стадия 6).

Инактивация фермента осуществляется путем нагревания смеси до температуры 80-90°С в течение 12-16 минут (стадия 7). Выравнивание уровня рН осуществляется 0,8-1,2 М гидроксидом натрия до уровня 7-7,2 (стадия 8). Полученная пептидная фракция очищается от примесей в поле центробежных сил при факторе разделения 1500-1700 в течение 15-25 минут (стадия 9).

Подтверждением эффективности предлагаемого метода являются результаты по определению минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пептидной фракции, извлеченной из биомассы Chlorella vuigaris Beijer IPPAS C-1 (Chlorella sorokiniana) в отношении грамположительных бактерий рода Bacillus и Lactobacillus, приведенные в табл. 2.

Полученные данные позволяют заключить, что предлагаемый способ обработки биомассы микроводорослей позволяет получить пептидную фракцию из водорастворимых белков микроводорослей, обладающую антибиотическими свойствами в отношении грамположительных бактерий.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения пептидной фракции из водорастворимых белков микроводорослей, включающий культивирование микроводорослей Chlorella vulgaris в течение 7-8 сут при 30±2°С на стерильной питательной среде заданного состава при фотосинтетически активной радиации 80-140 мкмоль фотонов/м²⋅с рН 6,2-8,0 аэрации суспензии 0,2-0,3 л/мин⋅л стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%; количество вносимого посевного материала клеток микроводорослей 8-12% от общего объема суспензии. Выращенную биомассу клеток отделяют в поле центробежных сил при факторе разделения 900-1200 в течение 7-15 мин; дезинтегрируют 290-310 с в ультразвуковом поле мощностью 140-160 Вт на 20-30 мл суспензии микроводорослей влажностью 96-99% с последующей обработкой лизоцимом в заданной концентрации в течение 3,5-4 ч при 37°С; экстракцию внутриклеточных водорастворимых белков осуществляют 0,15 М фосфатным буфером рН 7,4 в количестве 20-30 мл на 1 г биомассы в течение 20-24 ч при 2-4°С; отделение водорастворимой белковой фракции проводят в поле центробежных сил при факторе разделения 1500-1700 в течение 10-16 мин; обработку водной белковой фракции осуществляют пепсином, взятом в заданном соотношении при рН 2-2,2 в течение 3,5-4 ч; фермент инактивируют нагреванием смеси до 80-90°С в течение 12-16 мин, выравнивают уровень рН до 7-7,2 и очищают пептидную фракцию от примесей в поле центробежных сил при факторе разделения 1500-1700 в течение 15-25 мин. Изобретение обеспечивает получение фракции биологически активных соединений, обладающих антибиотическим действием в отношении грамположительных бактерий. 1 ил., 2 табл.

Способ получения пептидной фракции из водорастворимых белков микроводорослей, обладающей антибиотическими свойствами в отношении грамположительных бактерий, отличающийся тем, что культивирование микроводорослей Chlorella vulgaris осуществляют в течение 7-8 суток на стерильной питательной среде, содержащей нитрат калия 3-5 г/л, дигидрофосфат калия 0,2-2 г/л, сульфат магния и гептагидрат сульфата железа 0,125-1,25 г/л и 0,01-0,015 г/л, соответственно, а также 0,5-1,5 мл раствора микроэлементов, включающего тетрагидрат хлорида марганца(II) 1,0-2,0 г/л, гептагидрат сульфата цинка - 0,1-0,3 г/л, сульфат меди(II) - 0,01-0,02 г/л, оксид молибдена(VI) 0,01-0,02 г/л, борную кислоту 2-3 г/л, ванадат аммония 0,01-0,02 г/л; при температуре 30±2°С; при уровне фотосинтетически активной радиации 80-140 мкмоль фотонов/м²⋅с; при уровне рН 6,2-8,0; при аэрации суспензии 0,2-0,3 л/мин⋅л стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%; количество вносимого посевного материала клеток микроводорослей, выращенного в стерильных условиях и отобранного в конце логарифмической стадии роста, составляет 8-12% от общего объема суспензии; отделение выращенной биомассы клеток от культуральной жидкости осуществляют в поле центробежных сил при факторе разделения 900-1200 в течение 7-15 мин; дезинтеграцию сконцентрированных клеток микроводорослей проводят с применением ультразвукового поля мощностью 140-160 Вт на 20-30 мл суспензии микроводорослей влажностью 96-99% в течение 290-310 с с последующей обработкой ферментом лизоцимом в концентрации 12-20 мг на 1 г биомассы в течение 3,5-4 ч при температуре 37°С; экстракцию внутриклеточных водорастворимых белков из дезинтегрированной биомассы микроводорослей осуществляют с помощью 0,15 М фосфатного буфера рН 7,4 в количестве 20-30 мл на 1 г биомассы, в течение 20-24 ч при температуре 2-4°С; отделение водорастворимой белковой фракции от клеточных остатков проводят в поле центробежных сил при факторе разделения 1500-1700 в течение 10-16 мин; обработку водной белковой фракции осуществляют протеолитическим ферментом пепсином, взятым в соотношении 1 массовая единица фермента: 80-120 массовых единиц биомассы клеток, при рН 2-2,2 в течение 3,5-4 ч; инактивацию фермента проводят путем нагревания смеси до температуры 80-90°С в течение 12-16 мин, затем выравнивают уровень рН с помощью 0,8-1,2 М гидроксида натрия до уровня 7-7,2 и осуществляют очистку полученной пептидной фракции от примесей в поле центробежных сил при факторе разделения 1500-1700 в течение 15-25 мин.