Способ прогнозирования развития рецидива после проведенного комбинированного лечения рака полости рта Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6886 G16H50/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования развития рецидива после проведенного комбинированного лечения рака полости рта.

Рак головы и шеи занимает 6 место среди злокачественных новообразований с ежегодной заболеваемостью 830000 случаев во всем мире. Плоскоклеточный рак полости рта является одной из самых распространенных злокачественных опухолей головы и шеи, и ежегодно выявляется около 350000 новых случаев [Hema K.N., 2017]. В последние годы отмечается рост заболеваемости злокачественными опухолями полости рта. Помимо высокой заболеваемости, плоскоклеточный рак полости рта характеризуется агрессивностью течения. Летальность в течение 1 года после впервые выявленного заболевания на территории РФ составляет 27,8% за 2021 год. Ежегодно, от рака полости рта, в мире погибает около 180000 человек, в том числе и лица трудоспособного возраста [Bray F., 2018].

Несмотря на визуальную доступность, в РФ в 2021 году 64,7% опухолей полости рта были выявлены на III-IV стадиях, что определяет плохой прогноз заболевания. Современная концепция выбора оптимального варианта лечения больных злокачественными опухолями полости рта основывается на междисциплинарном подходе с учетом этиологических факторов, сопутствующей патологии, ожидаемых функциональных и косметических результатов. Общепринятым методом лечения больных местно-распространенными формами рака полости рта является комбинированный, включающий в себя лучевую терапию, химиотерапию и хирургический метод лечения в различной последовательности. Хирургическое лечение в объеме радикального удаления опухоли (отступ от края опухоли - 1,5-2 см) с лимфодиссекцией шеи (по показаниям) остается ведущим методом комбинированного лечения злокачественных опухолей полости рта.

По данным статистики, в течение последних 30 лет 5-летняя выживаемость пациентов с плоскоклеточным раком полости рта после проведенного комбинированного лечения остается ниже 50%. Определение тактики лечения у больных раком полости рта осуществляется по системе классификации TNM, которая включает в себя размеры опухоли, состояние регионарных лимфатических узлов и наличие отдаленных метастазов. Однако классификация TNM основана только на клинико-морфологических особенностях опухоли и не учитывает факторы, потенциально связанные с прогнозом заболевания.

Склонность к прогрессированию опухолевого процесса может быть обусловлена повышенным инвазивным и метастатическим потенциалом злокачественных опухолей полости рта, а также малой эффективностью стандартных схем лечения без учета биологических особенностей опухоли.

Как известно, патогенез рака полости рта представляет собой сложный процесс, который запускается различными экзо- и эндогенными факторами и включает в себя различные молекулярные аберрации, такие как соматические мутации, эпигенетические модификации и изменения экспрессии генов и белков, ведущие к ускоренной пролиферации, ингибированию апоптоза, стимуляции ангиогенеза, инвазии и метастазирования. Некоторые молекулярные нарушения описаны как потенциальные диагностические и прогностические маркеры плоскоклеточного рака головы и шеи.

Однако данные маркеры не валидированы и не используются в клинической практике. В некоторых случаях концентрация маркеров остается нормальной даже на поздних стадиях рака, а выявление изменения экспрессии этих белков всегда неоднозначно и требует проведения дополнительных диагностических процедур.

Таким образом, в условиях современной стратегии лечения онкологических больных, механизмы прогрессирования плоскоклеточного рака полости рта требуют дальнейшего изучения. Необходимы дополнительные исследования молекулярного ландшафта плоскоклеточного рака полости рта, базирующиеся на комплексной информации относительно возможных факторов риска и параметров клинического течения данного заболевания, которые позволят найти новые драйверы опухолевой прогрессии и прогностические маркеры.

Известен способ мониторинга результатов радикального лечения больных со злокачественными образованиями слизистой оболочки полости рта (патент РФ №2752360, опубл. 26.07.2021), который заключается в проведении опроса, осмотра, витального окрашивания и аутофлуоресцентную стоматоскопию, данные которых оценивают в баллах. По результатам исследования определяется необходимость в консультации онколога и дальнейшем обследовании. Однако основываясь только на клинических данных, невозможно дифференцировать рецидивную опухоль и измененные ткани после проведенного лечения, требуется верификация процесса.

Так же существует способ скрининговой дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и рака слизистой оболочки рта (СОР) (патент РФ №2754295, опубл. 31.08.2021), который заключается в получении количественных значений маркеров пролиферации Ki67, Р16 и Р53 в слюне и выявление риска развития новообразований. Однако данный способ используется с диагностической целью, не используется для оценки потенциала злокачественности уже существующей опухоли.

Для прогнозирования исхода рака в патенте РФ №2019104401, опубл. 11.12.2019, «Способ прогнозирования исхода плоскоклеточного рака языка и ротоглотки», проводят иммуногистохимическое определение молекулярных маркеров. Определяют уровень экспрессии молекулярных маркеров р16 и Ki-67. При экспрессии р16 более или равной 70% опухолевых клеток и Ki-67 более 50% в комплексе прогнозируют увеличение общей 3-летней выживаемости больных. Однако в данном способе не учитывается, что при раке языка ВПЧ не является одним из основных этиологических факторов. Данный метод так же применяется только для рака языка и ротоглотки, не распространяясь на рак слизистой дна полости рта, рак слизистой щеки и рак альвеолярного отростка нижней и верхней челюсти.

В способе прогнозирования риска развития новообразований слизистой оболочки полости рта у лиц старше 40 лет (патент РФ №2611343, опубл. 21.02.2017) проводится молекулярно-генетическое исследование слюны и оценивают степень риска развития новообразований у лиц с длительным стажем курения в совокупности с наличием ВПЧ или Эпштейн-Барр. Недостатками метода являются наличие обязательных критериев, таких как длительный стаж курения и наличие вирусов с онкогенным потенциалом, которые не являются обязательными в канцерогенезе рака полости рта. А также способ нацелен на прогнозирование риска развития новообразований, не используется для оценки прогноза неблагоприятного исхода онкологического заболевания.

Наиболее близким к предлагаемому способу является патент №2635535, опубл. 13.11.2017, «Способ прогнозирования развития рецидивов у больных раком слизистой оболочки», заключающийся в том, что в ткани опухоли, взятой во время оперативного вмешательства, определяют уровень транскрипционного фактора каппа-В - NF-κВ рб5 и при его значении 16,0 УЕ/мг белка в лунке и более прогнозируют высокий риск развития рецидивов в срок от 6 до 24 месяцев. Однако данный показатель не является специфичным для онкологических заболеваний и может повышаться при иных воспалительных и аутоиммунных заболеваниях.

Новый технический результат - повышение точности и достоверности способа. Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования развития рецидива после проведенного комбинированного лечения рака полости рта путем исследования ткани опухоли пациента, проводят молекулярно-генетические определение уровня экспрессии ST6GAL2, определяют наличие или отсутствие экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле и рассчитывают значение уравнения логистической регрессии по формуле:

F=3,416*[Экстранодальный рост]-0,072*[ST6GAL2]-0,658, где

ST6GAL2 - уровень относительной экспрессии гена ST6GAL2,

Экстранодальный рост опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле: при наличии экстранодального роста значение равно 0, а при отсутствии экстранодального роста равно 1,

значение вероятности развития рецидива Р рассчитывают по формуле:

где е=2,718,

и при значении Р≥0,5 прогнозируют развитие рецидива, при значении Р<0,5 - отсутствие развития рецидива.

Способ осуществляют следующим образом:

Выполняют радикальное хирургическое лечение больных раком полости рта и получают образец ткани первичной опухоли. Образец фиксируют в формалине и парафинизируют по стандартной методике, проводят молекулярно-генетические с определением уровня экспрессии ST6GAL2, определяют наличие или отсутствие экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле и рассчитывают значение уравнения логистической регрессии по формуле:

F=3,416*[Экстранодальный рост]-0,072*[ST6GAL2]-0,658, где

ST6GAL2 - уровень относительной экспрессии гена ST6GAL2,

Экстранодальный рост опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле: при наличии экстранодального роста значение равно 0, а при отсутствии экстранодального роста равно 1,

значение вероятности развития рецидива Р рассчитывают по формуле:

где е=2,718,

и при значении Р≥0,5 прогнозируют развитие рецидива, а при значении Р<0,5 - отсутствие развития рецидива.

Такой подход к оценке прогноза в отношении неблагоприятного исхода при раке полости рта основан на результатах биоинформатического анализа данных полнотранскриптомного секвенирования ткани опухоли 24 пациентов (I-III клинической стадии). Молекулярно-генетическое определение уровня экспрессии ST6GAL2 проводили следующим образом. Выделяли РНК из образцов. При этом RIN выделенных образцов должен быть больше или равен 4, проводят синтез кДНК на матрице РНК с использованием случайных гексаолигонуклеотидов. Реакцию проводят в течение 30 мин при 42°С, затем проводят инактивацию обратной транскриптазы при 95°С в течение 2 мин., проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (RT-PCR) с использованием специфичных праймеров. Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 6 мин, 40 основных циклов: денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 52°С - 35 сек. В качестве референсного гена используется GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). В качестве калибратора используют слив из не менее чем 20 образцов РНК, полученных из опухолей рака полости рта.

Рассчитывают уровень экспрессии генов по методу Pfaffl. Для расчета используют формулу (1):

где Е - эффективность реакции,

Ct - пороговый цикл генов-мишеней (target) и гена-рефери (ref),

ΔCt, target (calibrator - test) - Ct гена мишени в калибраторе за вычетом Ct гена мишени в опытном образце,

ΔCt, ref (calibrator - test) - Ct гена-рефери в калибраторе минус Ct гена-рефери в опытном образце.

Проводят патоморфологическое исследование:

- Гистотип опухоли устанавливают согласно классификации WHO 2020 г.

- Оценивают степень дифференцировки опухоли (высокая, умеренная, низкая) в соответствии с классификацией ВОЗ 2020 г. (ВОЗ, публикация: 2021).

- Для проводки тканевых образов стандартным способом используют автоматический гистопроцессор Leica ASP6025 с использованием раствора для гистологической обработки «Изопреп».

- Микротомию проводят с помощью санного микротома НМ 430 (Thermo Fisher). Окрашивание гистологических срезов проводят в аппарате Varistain™ Gemini (Thermo Fisher).

- Морфологическое исследование проводят с помощью светового микроскопа CarlZeissAxio Scope.Al фирмы Carl Zeiss (Германия).

Такой подход к оценке прогноза в отношении неблагоприятного исхода при раке полости рта обусловлен следующим:

В результате биоинформатического анализа данных полнотранскриптомного секвенирования ткани опухоли был выявлен ряд генов, изменение экспрессии которых, может быть ассоциировано с возникновением рецидива рака полости рта. Из 24 пациентов большинство пациентов мужского пола - 20 (83,33%). Чаще опухоли полости рта локализовались на языке (58,33%). Клиническая стадия опухоли: I - 4 (16,66%), II - 8 (33,33%), III - 12 (50%). Степень дифференцировки: G1 - 7 (29,17%), G2 - 12 (50%), G3 - 5 (20,83%).

Данные исследований представлены в таблицах 1-3:

Далее была проведена валидация полученных результатов на группе пациентов, пролеченных в условиях НИИ онкологии Томского НИМЦ. Группа включала 38 пациентов с верифицированным плоскоклеточным раком полости рта I-III стадии. Клинические характеристики пациентов представлены в таблице 2.

Материалом для исследования служили парафиновые блоки образцов тканей первичных опухолей, полученные при выполнении радикального оперативного вмешательства.

Была оценена экспрессия 11 генов в ткани опухоли пациентов с ПКПР. В ткани ПКПР была обнаружена экспрессия только 2 из 11 выбранных генов: ST6GAL2 и CD248. Также у пациентов были исследованы патоморфологические характеристики: степень дифференцировки опухоли, глубина инвазии опухли, паттерн инвазии, наличие периваскулярной и периневральной инвазии, перилимфатическая инвазия, наличие опухолевых эмболов в сосудах, наличие метастатически пораженных лимфатических узлов, экстракапсулярный рост опухоли.

Двухгодичная общая выживаемость прослежена у 38 пациентов, из которых неблагоприятный исход отмечался у 7 пациентов (18,4%).

Для построения модели прогноза рецидивирования рака полости рта был применен метод логистической регрессии.

На первом этапе были определены возможные предикторы с использованием непараметрических критериев Фишера и Манна-Уитни. Были обнаружены факторы, ассоциированные с прогрессированием рака полости рта.

Количественные показатели: уровень экспрессии ST6GAL2 (р=0,049).

Качественные показатели: наличие или отсутствие экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле (р=0,005), наличие или отсутствие перилимфатической инвазии (р=0,001), наличие или отсутствие перинервальной инвазии (р=0,051).

На втором этапе перечисленные показатели были проверены как предикторы в модели логистической регрессии для предсказания прогрессирования рака полости рта.

В модель вошли 38 пациентов с раком полости рта. Модель получилась значимая (Х2=7,590, р=0,022), качество подгонки модели по критерию Хосмера-Лемешова хорошее (р>0,05, R-квадрат Найджелкерка >0,5). Уравнение регрессии позволяет правильно классифицировать 90,4% пациентов. Чувствительность и специфичность модели высокие: 87,5% и 93,3% соответственно. Были определены предикторы, которые можно использовать для предсказания неблагоприятного исхода у больных раком полости рта (таблица 3)

Таким образом, уравнение логистической регрессии имеет вид:

F=3,416*[Экстранодальный рост]-0,072*[ST6GAL2]-0,658, где

ST6GAL2 - уровень относительной экспрессии гена ST6GAL2,

Экстранодальный рост - наличие или отсутствие экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле (принимает значение 0 или 1).

Значение вероятности развития рецидива рассчитывают, учитывая значение регрессионной функции F и основание натурального логарифма (е):

е=2,718,

При значении Р≥0,5 прогнозируют развитие рецидива, при значении Р<0,5 - отсутствие развития рецидива.

Изобретение соответствует критерию «новизна», так как в отличие от прототипа обладает следующими существенными отличительными признаками:

1. Впервые в ткани опухоли были выявлены гены, изменение экспрессии которых ассоциирована с прогрессированием рака полости рта

2. В предложенном способе прогнозирования определяется риск неблагопряитного исхода заболевания в зависимости от уровня экспрессии гена ST6GAL2 в сочетании с наличием экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле шеи

Изобретение соответствует критерию «промышленно применимо», т.к. оно может быть использовано в клинической практике для прогнозирования течения рака полости рта после проведенного комбинированного лечения.

Клинические примеры использования способа

Пример №1

Больной К., 1957 г. р., госпитализирован в отделение опухолей головы и шеи НИИ онкологии Томского НИМЦ 11.01.2022 г. с диагнозом: Рак языка, St.Ill T4N0M0, кл. гр. 2.

Первым этапом 18.01.2022 выполнено хирургическое лечение в объеме: лимфодиссекция шеи слева (уровень I-IV). Глоссэктомия с реконструктивно-пластическим компонентом. Трахеостомия.

Гистологическое исследование операционного материала: №803-20/22 от 25.01.2022: Гематоксилин-эозин. В препаратах из макроскопически определяющихся изменений - разрастание опухолевой ткани, представленной солидными полями, ячейками и тяжами плоскоклеточной карциномы с умеренно выраженным полиморфизмом клеточных элементов, с наличием кератогиалина в центре части структур. В строме выраженная воспалительная инфильтрация. Определяется лимфоваскулярная и периневральная инвазия. Опухоль врастает в мышечную ткань. Глубина инвазии 17 мм. По линиям резекции опухоли нет. В 6 исследованных лимфоузлах метастазов нет. Слюнная железа обычного строения.

Заключение: Плоскоклеточная карцинома умеренной степени диференцировки, с ороговением, с лимфоваскулярной и периневральной инвазией, с врастанием в мышечную ткань (глубина инвазии 17 мм). По линиям резекции опухоли нет.В 6 исследованных лимфоузлах метастазов нет.

Вторым этапом комбинированного лечения 02.2022-03.2022 проведен курс дистанционной гамма терапии СОД 50 Гр.

В настоящее время без рецидива и метастазов. Уровень экспрессии гена ST6GAL2 0,355 Рассчитанное значение функции F=-0,684. Таким образом вероятность развития рецидива р=0,34.

Пример №2

Пациентка А., 1958 г. р., госпитализирована в отделение опухолей головы и шеи НИИ онкологии Томского НИМЦ 01.04.2021 г. с диагнозом: Рак слизистой альвеолярного отростка нижней челюсти справа, St.IV T4N1M0, кл. гр. 2.

Пациентка осмотрена коллегиально, рекомендовано проведение хирургического лечения первым этапом. 16.04.21 г. пациентке выполнена операция в объеме: Трахеостомия. Лимфодиссекция шеи справа (уровни I-IV). Резекция нижней челюсти с реконструктивно-пластическим компонентом (микрохирургическая пластика кожно-мышечным перфорантным лоскутом с передне-боковой поверхности левого бедра.

Гистологическое исследование операционного материала №10844-80/21 от 28.04.2021: 1. Образование представлено полями и тяжами полиморфных опухолевых клеток с неравномерно выраженной цитоплазмой, с участками ороговения. В строме опухоли выраженная воспалительная инфильтрация. Опухоль прорастает в жировую клетчатку, мышечную ткань, не врастает в кость. Признаков периневральной и сосудистой инвазии не обнаруживается. По линиям резекции опухоли нет. В 4 из 29 исследованных лимфоузлов - субтотальное или замещение ткани лимфоузлов метастазами, с распадом опухолевой ткани.

Заключение: 1. Плоскоклеточная карцинома умеренной степени дифференцировки, с ороговением, без периневральной и сосудистой инвазии, с врастанием в жировую клетчатку и мышечную ткань, без врастания в кость. По линиям резекции опухоли нет. 2. В 4 из 29 исследованных лимфоузлов - метастазы.

Вторым этапом комбинированного лечения с 05.07.2021 по 10.08.2021 проведен курс дистанционной гамма-терапии СОД 44 Гр. Лечение перенесла удовлетворительно, с явлениями лучевого эпителиита II ст.

При контрольном обследовании по данным КТ от 11.08.21 г. выявлены признаки продолженного роста опухоли в подвисочной и крылонебной ямке справа. 31.08.21 г. пациентке выполнена операция в объеме: Трахеостомия. Удаление рецидивной опухоли с реконструктивно-пластическим компонентом.

В марте 2022 года отмечает появление язвенного дефекта в полости рта. Выполнена биопсия образования в полости рта: Гистологическое исследование №7424/22 от 18.03.2023: Плоскоклеточная карцинома (8070/3) высокой степени дифференцировки, мелкие скопления опухолевых клеток среди детрита и микробной флоры.

По данным КТ лицевого скелета, шеи от 18.03.2022: Участок накопления контраста в проекции слизистой альвеолярного отростка левых отделов нижней челюсти и возможно мышц дна полости рта слева в этой проекции. В передних отделах дна полости рта в проекции опила челюсти дефект тканей 18×20 с накоплением контраста по краю дефекта. В крылонебной ямке справа определяется дополнительный объем тканей неоднородной структуры, охватывающих латеральный крыловидный отросток клиновидной кости без признаков деструкции.

Консультация химиотерапевта от 30.03.2022: Учитывая распространенность опухолевого процесса пациентке показано проведение паллиативной XT по схеме DC+Cet: Доцетаксел 75 мг/м² в/в в 1-й день+цисплатин 75 мг/м² в/в в 1-й день, каждые 3 нед.+цетуксимаб 400 мг/м² (нагрузочная доза) в/в, далее - 250 мг/м2 в/в еженедельно ЛИБО Pacli+Carbo+Cet: Паклитаксел 100 мг/м² в/в+карбоплатин AUC 2,5 в/в в 1-й и 8-й дни+цетуксимаб 400 мг/м² в/в (2-часовая инфузия) в 1-й день 1-го цикла (нагрузочная доза), далее - 250 мг/м² в/в (1-часовая инфузия) в 8-й и 15-й дни 1-го цикла и 1-й день последующих циклов.

Не получила ПХТ.

Умерла 26.06.2022 от прогрессирования заболевания.

Рассчитанное значение функции F=2,868. Таким образом, вероятность развития рецидива р=0,95.

Всего с помощью предлагаемого способа проведено прогнозирование течения заболевания у 38 пациентов с раком полости рта. Уравнение регрессии позволяет правильно классифицировать 90,4% пациентов. Чувствительность и специфичность способа оставила: 87,5% и 93,3% соответственно.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования развития рецидива после проведенного комбинированного лечения рака полости рта путем исследования ткани опухоли пациента. Определяют уровень экспрессии ST6GAL2 и наличие или отсутствие экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле. Полученные значения подставляют в формулу расчета значения F уравнения логистической регрессии. Далее рассчитывают значение вероятности развития рецидива Р. При значении Р, равном или более 0,5, прогнозируют развитие рецидива. При Р менее 0,5 прогнозируют отсутствие развития рецидива. Способ обеспечивает повышение точности и достоверности прогнозирования развития рецидива после проведенного комбинированного лечения рака полости рта за счет определения уровня экспрессии гена ST6GAL2 и наличия или отсутствия экстранодального роста опухоли. 3 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования развития рецидива после проведенного комбинированного лечения рака полости рта путем исследования ткани опухоли пациента, отличающийся тем, что проводят молекулярно-генетическое определение уровня экспрессии ST6GAL2, определяют наличие или отсутствие экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле и рассчитывают значение F уравнения логистической регрессии по формуле:

F=3,416*[Экстранодальный рост]-0,072*[ST6GAL2]-0,658, где

ST6GAL2 - уровень относительной экспрессии гена ST6GAL2,

Экстранодальный рост опухоли - наличие или отсутствие экстранодального роста опухоли в метастатически пораженном лимфатическом узле: при наличии экстранодального роста значение равно 0, а при отсутствии экстранодального роста равно 1,

далее рассчитывают значение вероятности развития рецидива Р по формуле:

где е=2,718,

и при значении Р, равном или более 0,5, прогнозируют развитие рецидива, при значении Р менее 0,5 - отсутствие развития рецидива.