Способ генотипирования полиморфного локуса rs7928675 (A>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs7928675 (A>C) гена C11orf58 молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники

Ген C11orf58 кодирует белок, открытый в 2020 г. японскими учеными [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. – 2020. – Vol. 18. – №. 3. – P. e3000632]. Данный белок характеризуется высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных физических и химических факторов и способствует восстановлению нативной третичной или четвертичной структуры других белков  в условиях стресса, что доказывает его выраженные шапероноподобные свойства. Потенциально значимая роль данного белка в широком спектре заболеваний (нейродегенеративных, атеросклероза и др.) определяет необходимость проведения молекулярно-генетических исследований гена C11orf58 и разработки методик генотипирования полиморфных вариантов данного гена. Ген C11orf58 (Gene ID: 10944) локализован на хромосоме 11p15.2. Полиморфный вариант rs7928675 гена C19orf53, позиция chr11:16740259 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs7928675] локализован в интроне и характеризуется заменой A>C,G,T. Однако аллели G и T встречаются популяциях мира с частотой <0.00001 в популяциях мира, в связи с чем именно замена A>C является актуальной для исследований многофакторных болезней человека. Генетический вариант rs7928675 (A>C) характеризуется высоким регуляторным потенциалом. Согласно биоинформатическим ресурсам, данный генетический вариант ассоциирован с модификациями гистонов, маркирующими промоторы в 22 тканях, энхансеры в 13 тканях, влияет на чувствительность к ДНКазе I в клетках крови человека [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs7928675]. Также установлено влияние rs7928675 на связывание с транскрипционными факторами в зависимости от носительства референсного/альтернативного аллелей [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это доказывает высокую функциональную значимость данного генетического варианта и создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs7928675 (A>C) гена C11orf58.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006–2016 //Nature protocols. – 2017. – Vol. 12. – №. 2. – P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. – 2022. – Vol. 2. – №. 5. – P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран  коммерческий набор по генотипированию rs7928675 (А/С) гена C11orf58 (Assay ID C__29001911_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs7928675 (A>C) гена C11orf58, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs7928675 (A>C), локализованного в позиции chr11:16740259 (GRCh38.p14) гена C11orf58 (Gene ID: 10944) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs7928675 (A>C) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs7928675 5′-GCTGTTACATTGTTTTCCTCCTG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs7928675 5′-GACCTCTTCCGAAGCTGTAAA-3′ (SEQ ID NO 2), rs7928675-А-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CGTGACAGAAAACTCCA(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),

rs7928675-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CGTGACAGCAAACTCCA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs7928675 (A>C) гена C11orf58 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs7928675-А/А показаны оранжевыми кругами, генотипы rs7928675-А/С показаны зелеными треугольниками, генотипы rs7928675-С/С показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран сиквенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [А/С] rs7928675 C11orf58, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs7928675 5′-GCTGTTACATTGTTTTCCTCCTG-3′ (SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs7928675 5′-GACCTCTTCCGAAGCTGTAAA-3′ (SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена C11orf58 составляет 164 пары нуклеотидов:

GCTGTTACATTGTTTTCCTCCTGATCTTTAAATGTGACTTGATTGCTAGGATATCAGACACCTGTTTGGAAATATCTTTTAGCGTGACAG[А/С]AAACTCCAGGTGATATGAAATTTAACAAAGTTAAAGGGATTAAGTCATTAAGTTTACAGCTTCGGAAGAGGTC.

2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. – New York : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs7928675-А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)CGTGACAGAAAACTCCA(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),

rs7928675-С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)CGTGACAGCAAACTCCA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 56°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs7928675 139 человек (69,5%) оказались гомозиготами по аллелю А (генотип А/А); 53 человека (26,5%) - гетерозиготами (генотип А/С), 8 человек (4%) индивидуумов были гомозиготами по аллелю С (генотип С/С).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs7928675 (A>C) гена C11orf58 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37˚C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs7928675 (A>C) гена C11orf58 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0,03 мM каждого dNTP, 3,0 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 56°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs7928675 (A>C) гена C11orf58 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю А, зонд с красителем ROX - аллелю С (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов – соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот А/А. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот С/С. Кластер зеленых треугольников характеризует накопление уровня флуоресценции по обоим зондам позволяет идентифицировать гетерозигот А/С.

Резюме

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs7928675 (A>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена C11orf58, а также в научных целях.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

генотипирования полиморфного локуса rs7928675 (A C) гена C11orf58 у

человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-11-28">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1836</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Курский государственный медицинский университет&quot;

Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

полиморфного локуса rs7928675 (A&gt;C) гена C11orf58 у человека

методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctgttacattgttttcctcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacctcttccgaagctgtaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgtgacagaaaactcca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgtgacagcaaactcca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу генотипирования полиморфного локуса rs7928675 (A>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени». Указанный способ предусматривает идентификацию аллельных вариантов rs7928675 (A>C) гена C11orf58 с использованием прямого и обратного праймеров rs7928675 с последовательностями SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2, соответственно, а также rs7928675-А-аллель-специфичного и rs7928675-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченых зондов с последовательностями SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4, соответственно. Изобретение обеспечивает простой в исполнении и экономически целесообразный способ генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs7928675 (A>C), локализованного в позиции chr11:16740259 (GRCh38.p14) гена C11orf58. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs7928675 (A>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs7928675 (A>C) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs7928675 5′-GCTGTTACATTGTTTTCCTCCTG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs7928675 5′-GACCTCTTCCGAAGCTGTAAA-3′ (SEQ ID NO 2), rs7928675-А-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CGTGACAGAAAACTCCA(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs7928675-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CGTGACAGCAAACTCCA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).