Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs11024031 (T>C) гена C11orf58 молекулярно-генетическим методом исследования.
Уровень техники
Ген C11orf58 кодирует белок, открытый в 2020 г. японскими учеными [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. - 2020. - Vol. 18. - №. 3. - P. e3000632]. Данный белок характеризуется высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных физических и химических факторов и способствует восстановлению нативной третичной или четвертичной структуры других белков в условиях стресса, что доказывает его выраженные шапероноподобные свойства. Потенциально значимая роль данного белка в широком спектре заболеваний (нейродегенеративных, атеросклероза и др.) определяет необходимость проведения молекулярно-генетических исследований гена C11orf58 и разработки методик генотипирования полиморфных вариантов данного гена. Ген C11orf58 (Gene ID: 10944) локализован на хромосоме 11p15.2. Полиморфный вариант rs11024031 гена C11orf58, позиция chr11:16751043 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs11024031] локализован в интроне и характеризуется заменой T>C.
Генетический вариант rs11024031 отличается высоким регуляторным потенциалом. Согласно биоинформатическим ресурсам, данный SNP влияет на уровень экспрессии гена C11orf58 посредством cis-eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs11024031]; ассоциирован с модификациями гистонов, маркирующими промоторы и энхансеры [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs11024031]. Также установлено влияние rs11024031 на связывание с транскрипционными факторами в зависимости от носительства референсного/альтернативного аллелей [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это доказывает высокую функциональную значимость данного генетического варианта и создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs11024031 (T>C) гена C11orf58.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.
За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs11024031 (C/T) гена C11orf58 (Assay ID C-3081738910; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs11024031 (T>C) гена C11orf58, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.
Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs11024031 (T>C), локализованного в позиции chr11:16751043 (GRCh38.p14) гена C11orf58 (Gene ID: 10944) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs11024031 (T>C) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs11024031 5′- CCACCTGAACTTACCATTTTG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs11024031 5′-AGGAAGCCGTCTCTCTTCTG-3′ (SEQ ID NO 2), rs11024031-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TGAGAAGATAGACACAGAGC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs11024031-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)TGAGAAGACAGACACAGAGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фиг. 1: дискриминация аллелей по локусу rs11024031 (T>C) гена C11orf58 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs11024031-T/T показаны оранжевыми кругами, генотипы rs11024031-T/C показаны зелеными треугольниками, генотипы rs11024031-C/C показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран сиквенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [T/C] rs11024031 C11orf58, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:
прямой общий праймер rs11024031 5′-CCACCTGAACTTACCATTTTG-3′ (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs11024031 5′-AGGAAGCCGTCTCTCTTCTG-3′ (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена C11orf58 составляет 151 пару нуклеотидов:
2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:
rs11024031-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)TGAGAAGATAGACACAGAGC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),
rs11024031-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)TGAGAAGACAGACACAGAGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 56°C в течение 1 минуты].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs11024031 61 человек (30,5%) оказались гомозиготами по аллелю T (генотип T/T); 94 человека (47%) - гетерозиготами (генотип T/С), 45 человек (22,5%) индивидуумов были гомозиготами по аллелю С (генотип С/С).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs11024031 (T>C) гена C11orf58 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).
Осуществление изобретения
Способ осуществляют следующим образом:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.
3. Анализ полиморфизма rs11024031 (T>C) гена C11orf58 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0,03 мM каждого dNTP, 2,0 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 56°C в течение 1 минуты].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs11024031 (T>C) гена C11orf58 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю T, зонд с красителем ROX - аллелю С (фиг. 1). На фиг. 1 видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот T/T. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот С/С. Кластер зеленых треугольников позволяет идентифицировать гетерозигот T/С.
Резюме
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs11024031 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена C11orf58, а также в научных целях.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ
генотипирования полиморфного локуса rs11024031 (T C) гена C11orf58 у
человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением
аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-18">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023135617/10(077902)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-12-27</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1841</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования
"Курский государственный медицинский университет"
Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical
University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования
полиморфного локуса rs11024031 (T>C) гена C11orf58 у человека
методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением
аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccacctgaacttaccattttg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggaagccgtctctcttctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagaagatagacacagagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagaagacagacacagagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности способу генотипирования полиморфного локуса rs11024031 (T>C) гена C11orf58 у человека. Генотипирование осуществляют методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, причем идентификацию аллельных вариантов rs11024031 (T>C) гена C11orf58 осуществляют с использованием праймеров rs11024031, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-2, и аллель-специфических флуоресцентно-меченых зондов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 3-4. Настоящее изобретение обеспечивает простой в исполнении и экономически целесообразный способ генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs11024031 (T>C) локализованного в позиции chr11:16751043 (GRCh38.p14) гена C11orf58. 1 ил.
Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024031 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs11024031 (T>C) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs11024031 5′- CCACCTGAACTTACCATTTTG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs11024031 5′-AGGAAGCCGTCTCTCTTCTG-3′ (SEQ ID NO 2), rs11024031-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TGAGAAGATAGACACAGAGC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs11024031-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)TGAGAAGACAGACACAGAGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
