СПОСОБЫ НА ОСНОВЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ОЧАГОВ RAD51 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/574 G01N33/577 C12Q1/6886 

Настоящее изобретение относится к способам прогнозирования и мониторинга ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию, для выбора индивидуальной терапии для пациента, для классификации пациента в когорту пациентов и для прогнозирования того, способна ли опухоль пациента к репарации ДНК путем репарации с помощью гомологичной рекомбинации (HRR). Указанные способы основаны на присутствии очагов RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки от пациента, без необходимости подвергать образец воздействию какого-либо способа, индуцирующего повреждение ДНК, перед анализом образца. Кроме того, изобретение относится к применению наборов в указанных способах и к лекарственным средствам, используемым в способах лечения, указанных в этих способах.

Клетки постоянно подвергаются воздействию различных условий, которые индуцируют повреждение ДНК, включая генотоксические стрессы в результате клеточного метаболизма и воздействия окружающей среды. Могут образовываться огромные количества повреждений ДНК, таких как одноцепочечные разрывы ДНК (SSB) и двухцепочечные разрывы (DSB), которые, если не подвергаться репарации, придают токсичность и мутагенез. Для поддержания целостности генома ДНК подвергается репарации с использованием различных путей репарации ДНК. Проще говоря, они состоят из слияния сломанных концов ДНК вместе для репарации SSB или использования матричной рекомбинации из гомологичной цепи ДНК, соответственно, для репарации DSB. Кроме того, сеть ответа на повреждение ДНК (DDR) также предоставляет альтернативные или резервные механизмы для репарации ДНК, что затрудняет прогнозирование способности к репарации только на основе генетических дефектов.

Дефицит генов репарации ДНК связан с высокой чувствительностью к онкологическому заболеванию. Хорошо изученный случай - дефицит активности белков BRCA. Белки BRCA1 и BRCA2 (BRCA1/2) играют важную роль в репарации DSB ДНК путем HRR. Белковый комплекс BRCA1-PALB2-BRCA2 облегчает локализацию RAD51 в DSB ДНК, формируя ядерные агрегаты RAD51 (т.е. очаги) и опосредуя встраивание в цепь и гомологичную репарацию. Таким образом, отсутствие функции BRCA1 и BRCA2 в опухолевых клетках приводит к дефицитной репарации DSB ДНК, опосредованной RAD51, который был ассоциирован с генетически наследуемым раком молочной железы.

Противоопухолевые терапии были разработаны для специфического нацеливания на опухолевые клетки с таким дефицитом по DDR, такие как те, которые основаны на ингибиторах PARP (PARPi). Белок PARP активируется в ответ на SSB ДНК путем детектирования и связывания с SSB, чтобы инициировать репарацию ДНК. Активированный PARP затем рекрутирует другие белки репарации ДНК, чтобы облегчить репарацию ДНК. Ингибирование PARP вызывает увеличение постоянных SSB в ДНК, которые превращаются в DSB. Клетки, дефицитные по HRR, такие как клетки, лишенные BRCA1/2, не способны к репарации накопленных DSB, вызванных ингибированием PARP, что приводит к коллапсу репликативных вилок, нестабильности хромосом и клеточной смерти. Таким образом, клетки, мутантные по BRCA1/2, были идентифицированы как особенно чувствительные к ингибиторам PARP. Однако не все пациенты с онкологическим заболеванием, характеризующимся мутациями BRCA1/2, отвечают на терапию PARPi и поэтому считаются устойчивыми к PARPi. Механизмы, лежащие в основе указанной устойчивости, были изучены для улучшения лечения указанных пациентов и прогнозирования ответа опухоли перед осуществлением лечения.

Например, было показано, что реверсивные мутации BRCA1/2 или так называемые вторичные мутации вызывают восстановление функции HRR и устойчивость к ингибированию PARP. Точно так же потеря 53BP1 стимулирует устойчивость к PARPi в опухолях, дефицитных по BRCA1. Был предложен метод идентификации опухолей, дефицитных по HRR. Указанный способ заключается в анализе образования ядерных очагов RAD51 в биопсии опухоли после химиотерапии или в облученном образце ex vivo.

Однако в данной области техники существует потребность в альтернативных и более простых способах, позволяющих дифференцировать опухоли, профицитные и дефицитные по HRR, для классификации пациентов с устойчивостью к противоопухолевой терапии или без нее, такой как терапия на основе PARPi.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к способу прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не обрабатывали способом, который индуцирует повреждение ДНК, перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что пациент, по прогнозам, ответит на противоопухолевую терапию, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или более высокий, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что пациент, по прогнозам, не будет отвечать на противоопухолевую терапию.

Во втором аспекте изобретение относится к способу выбора индивидуальной терапии для пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не был обработан способом, который вызывает повреждение ДНК перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что выбранная терапия включает агенты, специфичные для лечения опухолей с дефицитом ответа на повреждение ДНК, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что выбранная терапия не содержит агентов, специфичных для лечения опухолей с дефицитом ответа на повреждение ДНК.

В третьем аспекте изобретение относится к способу классификации пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, в когорту пациентов, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не был обработан способом, который вызывает повреждение ДНК, перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- пациента классифицируют в когорту, характеризующуюся ответом на противоопухолевую терапию, если уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, или

- пациента классифицируют в когорту, для которой характерно отсутствие ответа на противоопухолевую терапию, если уровень клеток с очагами RAD51 выше, чем указанное эталонное значение.

В четвертом аспекте изобретение относится к способу прогнозирования того, способна ли опухоль пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, к репарации ДНК путем репарации с помощью гомологичной рекомбинации:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце опухоли, где опухоль была выделена у пациента, который не получал за 24 часа до выделения опухоли химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не был обработан способом, который индуцирует повреждение ДНК, до определения уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что опухоль способна к репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что опухоль не способна к репарации ДНК, опосредованной гомологичной рекомбинацией.

В пятом аспекте изобретение относится к лекарственному средству для применения при лечении онкологического заболевания у пациента, где пациент был идентифицирован как отвечающий на указанное лекарственное средство способом, как определено в первом аспекте изобретения.

В шестом аспекте изобретение относится к лекарственному средству для применения при лечении онкологического заболевания у пациента, где лечение было разработано способом, как определено во втором аспекте изобретения.

В седьмом аспекте изобретение относится к применению набора в способе, указанном в любом из первого, второго, третьего или четвертого аспекта изобретения, где набор содержит антитело, которое способно специфически распознавать белок RAD51.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показана противоопухолевая активность олапариба, ингибитора PARP (PARPi), в опухолевых ксенотрансплантатах (PDX), полученных от пациента. В частности, 6 PDX демонстрируют полный ответ (CR), 2 PDX - частичный ответ (PR), 2 PDX - стабильное заболевание (SD) и 34 - прогрессирующее заболевание (PD). На панели представлены 39 моделей PDX рака молочной железы (BrC), 3 модели PDX серозного рака яичников с высокой степенью злокачественности (HGSOC или OvC) и 2 PDX, полученных из клеток рака поджелудочной железы (PaC). Каскадная диаграмма представляет процент изменения объема опухоли по сравнению с объемом опухоли в начале лечения. Таблица ниже суммирует характеристики каждой модели PDX, включая наличие или отсутствие мутации BRCA1/2 зародышевой линии (gBRCA), наличие или отсутствие изменения репарации гомологичной рекомбинацией (HRR) (генетического или эпигенетического происхождения) и типа/подтипа онкологического заболевания. Закрашенные черным цветом квадраты указывают на положительность по этой характеристике. Следует отметить, что ни мутации gBRCA1/2, ни изменения HRR не прогнозировали ответ на PARPi олапариб. Изменения на 20%, -30% и -95% от базового уровня отмечены пунктирными линиями для обозначения диапазона PD, SD, PR и CR, соответственно. Планки погрешности указывают SEM из независимых опухолей. gBRCA, мутированный ген BRCA1/2 зародышевой линии; Изменения HRR, опухоли с изменениями в генах, связанных с HRR, отличными от BRCA1/2, и опухоли с гиперметилированием промотора BRCA1; TNBC, трижды негативный рак молочной железы; ER+BrC, рак молочной железы, положительный по рецептору эстрогена; HGSOC или OvC, серозный рак яичников высокой злокачественности; PaC, рак поджелудочной железы; Модели PDX, которые становятся устойчивыми к олапарибу при пролонгированном лечении, помечены индексом OR.

На Фиг. 2 показано, что опухоли, не подвергнутые лечению, имеют детектируемый уровень пролиферации клеток, повреждения ДНК и образования очагов RAD51. (A) Процент ядерных очагов γH2AX и RAD51, содержащих опухолевые клетки, детектированный иммунофлуоресценцией в небольшой подгруппе образцов, фиксированных формалином и погруженных в парафин (FFPE), из необработанных (Носитель) и обработанных (Олапариб) опухолей PDX, показанных на Фиг. 1. Мы количественно определяли очаги γH2AX в качестве маркера повреждения ДНК DSB, а очаги RAD51 в качестве маркера функциональной HRR. Опухоли классифицируют в соответствии с их ответом на олапариб, то есть устойчивые (PD) по сравнению с чувствительными (CR/PR/SD) опухолями, как конечную точку, сходную с частотой клинической эффективности, используемой в клинике. Как и ожидалось, олапариб индуцирует образование очагов γH2AX в обеих группах. Образование очагов RAD51 в значительной степени индуцируется только в моделях PDX, устойчивых к олапарибу. Важно отметить, что базовые уровни очагов γH2AX и RAD51, обнаруженные в опухолях, обработанных носителем, подтверждают идею о том, что функциональные белки HRR можно оценивать в необработанных образцах. (B) Количественная оценка геминин-положительных клеток в качестве маркера клеточного цикла S/G2 (указывает на то, что опухолевые клетки находятся в клеточном цикле синтеза ДНК) и γH2AX-положительные клетки в геминин-положительных клетках в опухолях, классифицированных в соответствии с их ответом на олапапариб. Сопоставимые уровни геминин-положительных клеток наблюдаются в обеих группах, в пределах от 20 до 70% от общего числа клеток. Обработка олапарибом значительно увеличивает образование очагов γH2AX как в чувствительных, так и в устойчивых опухолях. Ни уровни геминина, ни очаги γH2AX не отличают PARPi-чувствительные опухоли от PARPi-устойчивых опухолей. Как и на панели А, необработанные опухоли демонстрируют заметные уровни повреждения эндогенной ДНК (очаги γH2AX). (C) Количественная оценка геминин-положительных клеток с ядерными очагами RAD51, отныне также называемая показателем RAD51, дает оценку доли клеток в S/G2-фазе клеточного цикла с функциональной HRR. Процентное содержание RAD51-очаги/геминин-положительных клеток значительно увеличилось в образцах, обработанных олапарибом, из устойчивых моделей PDX. Примечательно, что базовые уровни RAD51-очаги/геминин-положительных клеток устойчивых опухолей значительно превышают базовые уровни чувствительных опухолей. Поэтому последующие анализы проводят в необработанных опухолях. (D) Уровни экспрессии мРНК RAD51 в необработанных образцах опухолей PDX, устойчивых и чувствительных к PARPi, измеренные с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Дефицит образования очагов RAD51 в PARPi-чувствительных опухолях, показанных на Фиг. 2A и 2C, не обусловлен отсутствием экспрессии RAD51. Парный t-тест: **, <0,01; *** <0,001; **** <0,0001.

На Фиг. 3 показано, что слабое формирование очагов RAD51 связано с PARPi-чувствительностью в многоцентровой панели из 71 модели PDX. (A) Процентное содержание γH2AX-положительных клеток в геминин-положительных клетках показывает, что ДНК повреждена во всех опухолях независимо от ответа на PARPi. Количественное определение очагов γH2AX необходимо, чтобы избежать ошибочной классификации опухолей с низким уровнем RAD51 из-за отсутствия повреждения ДНК вместо дефицита HRR. (B) Процент RAD51-очаги-положительных γH2AX-очаги-положительных клеток показывает более низкий уровень в чувствительных опухолях. (C) Количественная оценка RAD51-очаги/геминин-положительных клеток (показатель RAD51), показывающая, что все PARPi-чувствительные опухоли демонстрируют низкий показатель RAD51. (D) Таблица, обобщающая различные характеристики каждой модели PDX, включая обработку и дозу PARPi (1 для Олапариба 100 мг/кг, 2 для Олапариба 50 мг/кг, 3 для Нирапариба 75 мг/кг, 4 для Нирапариба 50 мг/кг и 5 для Велипариба 100 мг/кг), ответ PARPi (черный, CR/PR; серый, SD и белый, PD), опухоль происхождения, наличие мутаций в генах BRCA1 или BRCA2, наличие очагов BRCA1, детектированных с помощью антитела против BRCA1 против N-концевой (N-ter) или C-концевой (C-ter) области BRCA1 и наличия мутаций в PALB2. Закрашенные черным цветом квадраты указывают на положительность по этой характеристике. NA, нет данных; TNBC, трижды негативный рак молочной железы; ER+BrC, положительные по рецепторам эстрогенов опухоли молочной железы; HGSOC или OvC, серозный рак яичников высокой злокачественности; gBRCA, мутированный BRCA1/2 зародышевой линии.

На Фиг. 4 показано, что показатель RAD51 позволяет точно определить опухоли, которые устойчивы и чувствительны к ингибиторам PARP. (A) Точечный график, представляющий показатели, показанные на Фиг. 3C. PARPi-устойчивые опухоли демонстрируют значительно более высокий уровень RAD51-очаги/геминин-положительных клеток, чем PARPi-чувствительные опухоли. Пунктирная линия представляет отсечку (13%), которая различает опухоли, которые являются PARPi-устойчивыми или чувствительными, на основе отношения правдоподобия, которое максимизирует чувствительность и специфичность на кривой зависимости количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров (ROC). Следует отметить, что две модели PDX (то есть PDX124 и PDX384) с более высокими уровнями очагов RAD51 в чувствительной группе показали SD к PARPi. **** p <0,0001, t-критерий. (B) Кривая ROC, отображающая чувствительность в зависимости от специфичности и показатели эффективности (вставка) показателя RAD51 для прогнозирования ответа на PARPi на основе индивидуальных значений опухолей, полученных из PDX. PPV, положительная прогностическая значимость; NPV, отрицательная прогностическая значимость.

На Фиг. 5 показана клиническая валидация анализа RAD51 в когорте пациентов с раком молочной железы. (A) Уровень образования очагов RAD51 в геминин-положительных клетках отличает пациентов, опухоли которых были чувствительны к олапарибу, от опухолей, которые были устойчивы. Данные включают образцы от двух пациентов (Pt) с первичной PARPi-устойчивостью (один образец из метастазов кожи пациента gBRCA1BrC и другой образец из метастазов в лимфатических узлах пациента gBRCA2BrC) и четырех PARPi-чувствительных пациентов (один образец из метастазов в печени). Pt310pre с gBRCA2BrC, один образец из мастэктомии Pt124pre с gBRCA1BrC, один образец из метастазов в лимфатических узлах пациента gBRCA1BrC и другой образец из брюшинного имплантата пациента gBRCA1 HGSOC). В отношении приобретенной устойчивости данные включают образцы, полученные от трех пациентов с прогрессированием PARPi (образец из метастаза печени из Pt310post с gBRCA2BrC, другой образец из кожного метастаза пациента gBRCA1BrC и последний образец из кожного метастаза пациента gBRCA2BrC). Непарный критерий Стьюдента: ***, <0,001. (B) Положительность RAD51-очагов/геминина в образцах опухоли FFPE от пациентов с наследственным раком молочной железы или яичников. В рамке внизу суммированы различные характеристики каждого пациента и наличие или отсутствие ядерных очагов BRCA1 в проанализированных опухолях. Следует отметить, что опухоли от пациентов с мутацией PALB2 и опухоли без очагов BRCA1 показали низкие показатели RAD51, подтверждая прогностическую ценность RAD51 при выявлении функциональных изменений HRR в клинических образцах. FH, Семейная история болезни; * Опухоли с патогенной мутацией в гене PALB2 (C) и (D) Количественная оценка формирования очагов RAD51 и γH2AX в «обработанных» образцах опухоли пациента (т.е. у пациентов, которые никогда не получали пртивоопухолевой терапии) и в образцах опухоли «с предшествующим лечением». Десять «наивных» первичных опухолей молочной железы от пациентов с gBRCA1/2 либо из диагностической биопсии (n=6), либо из опухоли, подвергнутой хирургической операции (n=4), были оценены на предмет очагов RAD51 и γH2AX. Десять первичных или метастатических опухолей молочной железы «с предшествующим лечением» от пациентов с gBRCA1/2, либо из их хирургического образца после получения неоадъювантной терапии, включая агент, повреждающий ДНК, (n=3), либо из метастатического параметра (n=7), были оценены на предмет очагов RAD51 и γH2AX. Всего было проанализировано 10 BRCA1- плюс 10 опухолей с мутированным BRCA2. Эти данные подтверждают, что RAD51 оценивается в образцах опухолей, не получавших лечения, а также в образцах пациентов, получавших химиотерапию.

На Фиг. 6 показано, что показатель RAD51 выше у пациентов с рецидивом заболевания, чем у пациентов без рецидива, у ретроспективной когорты пациентов раком молочной железы с мутированным gBRCA (n=19). У всех пациентов были радикальные хирургические операции с первичными опухолями и стандартная химиотерапия (CTx), как с неоадъювантными (NeoAdj), так и с адъювантнными (Adj) условиями. Анализ RAD51 проводился в диагностических биопсиях или хирургических образцах из наивных опухолей, не подвергавшихся лечению. Группы с рецидивами и без рецидивов были сбалансированы по классическим прогностическим факторам. (A) Точечный график, показывающий показатель RAD51 у пациентов, стратифицированных по частоте проявления рецидивов заболевания или по его отсутствию. Опухоли пациентов с хорошим исходом заболевания (т.е. без рецидивов после ≥ 5 лет наблюдения) имели низкие уровни очагов RAD51, то есть показатель RAD51 ниже 3,7% (пунктирная линия). Пациенты с плохим исходом заболевания (т.е. рецидивирующие) демонстрировали переменные уровни, при наличии пациента с самым ранним рецидивом (через 11 месяцев после постановки диагноза) и показавшим наивысший показатель RAD51 (53% RAD51 очаги/геминин-положительных клеток). Пунктирная линия представляет отсечение, которое отличает опухоли пациентов, которые рецидивировали или нет, на основе отношения правдоподобия, которое максимизирует чувствительность и специфичность на кривой зависимости количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров (ROC). *, p=0,026, t-критерий. (B) Кривая ROC чувствительности в сравнении со специфичностью и показателями эффективности (вставка) показателя RAD51 для прогнозирования исхода заболевания. PPV, положительная прогностическая значимость; NPV, отрицательная прогностическая значимость.

На Фиг. 7 представлен показатель RAD51 в образцах пациентов с раком предстательной железы (n=8). Анализ RAD51 был успешно проведен при первичной простатэктомии (n=3) и в метастатических тканях (n=5), включая метастатические биопсии печени, костного мозга и лимфатических узлов. Три образца (PrC-003, PrC-004 и PrC-017) показывают низкие уровни очагов RAD51 в связи с геномными изменениями в BRCA2 (две опухоли с мутацией BRCA2 зародышевой линии -gBRCA2- и одна потеря соматического BRCA2 -sBRCA2-). Следует отметить, что образец PrC-021 (*), полученный от пациента с мутированным gBRCA2, был получен после развития устойчивости к карбоплатину (через семь месяцев после лечения). Высокий уровень очагов RAD51 в этом образце свидетельствует о реверсии дефицита HRR, который, вероятно, является результатом длительного воздействия этого препарата, повреждающего ДНК. Таким образом, показатель RAD51 стратифицирует опухоли предстательной железы, основываясь на уровне HRR (n=5) и дефиците (n=3), в клинической практике.

На Фиг. 8 показано, как мы установили оптимальное отсечение положительности RAD51 на основе количества ядерных очагов в геминин-положительных клетках. Диаграммы рассеяния, показывающие количество очагов RAD51 в отдельных геминин-положительных клетках (было количественно определено 100 клеток для каждой модели) в (A) образцах, обработанных носителем или (B) олапарибом, из девяти репрезентативных моделей PDX: шесть PARPi-устойчивых (PDX098, PDX060, PDX094, PDX044, PDX102 и PDX270) и три PARPi-чувствительных (PDX197, STG201 и PDX302). Пунктирная линия указывает на отсечку 5 RAD51 очагов на ядро. (C) Гистограмма, показывающая, что в PARPi-чувствительных опухолях 96-100% геминин-положительных клеток не имеют очагов RAD51. Вместо этого PARPi-устойчивые опухолевые клетки демонстрируют бимодальное распределение частот очагов RAD51 на геминин-положительную клетку, при этом 35-75% геминин-положительных клеток демонстрируют отсутствие очагов RAD51 и второй самый высокий пик частоты, обнаруженный при 5 очагах RAD51 на геминин-положительную клетку. В этом смысле анализ точности и специфичности с использованием увеличивающегося количества очагов RAD51 на геминин-положительную клетку в необработанных образцах показывает, что отсечение 5 очагов на клетку является наивысшим количеством очагов RAD51 на геминин-положительную клетку, что обеспечивает наиболее точный и конкретный прогноз: (D) анализ лесовидных графиков и коэффициентов нечетности и (E) точность и специфичность показателя RAD51 с использованием различных отсечек от 1 до 10 очагов на ядро. Эти данные демонстрируют, что несколько отсечек дают точные результаты, и выбор 5 очагов на ядро (отсечка, используемая для генерации всех данных, представленных в настоящем описании) является самым лучшим (то есть самым строгим) и все еще очень точным.

На Фиг. 9 показана валидация двух дополнительных коммерческих антител против RAD51 и разработка анализа RAD51 с помощью иммуногистохимии. (A) Количественная оценка RAD51 с двумя различными коммерческими антителами против RAD51 (Santa Cruz Biotechnology 8349 и Abcam 133534) в PDX, обработанных как носителем, так и олапарибом. Корреляционный анализ Спирмена для количественного определения очагов RAD51 с двумя различными антителами демонстрирует воспроизводимость анализа RAD51. (B-C) Репрезентативные изображения, показывающие валидацию третьего антитела против RAD51 (Cell Signaling Technology, CST 8875) с помощью иммунофлуоресцентного анализа (верхние изображения) и иммуногистохимического анализа (нижние изображения). Показаны изображения из (B) клеточных линий HeLa (экспонированных с контрольной киРНК -слева- или с киРНК RAD51 для нокдауна его экспрессии -справа-) и (C) необработанных PDX с высоким, умеренным (mod) и низким уровнем образования очагов RAD51. Эти результаты демонстрируют сравнимые результаты с анализами как IF, так и IHC.

На Фиг. 10 показана осуществимость анализа RAD51 для разных типов опухолей. Представлены репрезентативные изображения окрашенных образцов человека из (А) рака молочной железы, рака яичников и метастазов в мозг, а также из (В) рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, детской нейробластомы и метастазов в печени. Образцы опухоли окрашивали либо антителом (A) против RAD51 от Cell Signaling Technology (CST 8875, зеленого цвета) и антителом против RAD51 от Abcam (ab-133534, красного цвета) и геминином (зеленый). Кроме того, DAPI (синий) был использован в качестве ядерного контр-окрашивания. Эти изображения демонстрируют, что анализ RAD51 может проводиться при различных типах опухолей и может идентифицировать присутствие или отсутствие очагов RAD51 в различных тканях.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что определение уровня клеток с ядерными очагами RAD51 в образце с опухолевыми клетками, выделенными у пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, связано с ответом пациента на противоопухолевую терапию, при которой клетки образца не подвергался воздействию способа, индуцирующего повреждение ДНК, до анализа уровня клеток с ядерными очагами RAD51. Указанный способ может быть осуществлен ex vivo, то есть после выделения опухолевых клеток от пациента, и заключается в воздействии на образец клеток ионизирующего излучения. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что способ также эффективен в образцах от пациентов, которых не подвергали или подвергали лечению противоопухолевой терапией. Введение химиотерапевтических препаратов приводит к тому, что опухолевые клетки подвергаются воздействию соединений химиотерапии, которые вызывают повреждение ДНК, и последующее быстрое (в течение нескольких минут) рекрутирование белков, участвующих в репарации повреждений ДНК.

Способы по изобретению

А. Способ прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию

В первом аспекте изобретение относится к способу прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не обрабатывали способом, который индуцирует повреждение ДНК перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что пациент, по прогнозам, ответит на противоопухолевую терапию, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что пациент, по прогнозам, не ответит на противоопухолевую терапию.

Используемый в настоящем описании термин «прогнозирование ответа» относится к вероятностям, с помощью которых пациент может ответить на лечение. Как поймут специалисты в данной области, и хотя это не является предпочтительным, прогноз не обязательно должен быть верным для 100% пациентов, которые могут быть подвергнуты диагностике или оценке. Однако выражение требует, чтобы прогноз давал правильные результаты для статистически значимой части пациентов. Определение того, обеспечивает ли прогноз по изобретению статистически значимые результаты, может быть выполнено с использованием стандартных статистических методов, таких как определение доверительных интервалов, определение значения p, t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, как описано в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Подходящие доверительные интервалы составляют, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%. Значения P предпочтительно составляют 0,05, 0,001, 0,0005 или менее.

Термин «субъект» или «пациент» в контексте настоящего описания относится ко всем животным, классифицированным как млекопитающие, и включает, но не ограничивается ими, домашних и сельскохозяйственных животных, приматов и человека; например, человека, приматов, отличных от человека, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или грызунов. Предпочтительно пациент представляет собой мужчину или женщину любого возраста или этнической принадлежности.

Используемый в настоящем описании термин «диагностированный» относится к определению и/или идентификации заболевания у пациента, то есть к заключению о состоянии заболевания у пациента, то есть к диагностическому заключению. Кроме того, это может также рассматриваться как попытка классифицировать индивидуумов в зависимости от их заболевания. Как будет понятно специалистам в данной области, диагностика онкологического заболевания, хотя и предпочтительна, не обязательно должна быть правильной для 100% пациентов, подлежащих диагностике или оценке. Термин однако требует, чтобы статистически значимая часть пациентов, идентифицированных как таковые, страдала от онкологического заболевания. Специалист в данной области без лишних слов может определить, является ли пациент статистически значимым, используя различные хорошо известные инструменты статистической оценки, например, определение доверительных интервалов, определение значения p, t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни и т. д. Подробности можно найти в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или, по меньшей мере 95%. Значения р предпочтительно равны 0,05, 0,01, 0,005 или ниже.

Термин «онкологическое заболевание» относится к группе заболеваний, включающих аномальный, неконтролируемый рост и пролиферацию (неоплазию) клеток, которые образуют одну или более злокачественных опухолей у пациента, страдающего онкологическим заболеванием, с возможностью проникновения или распространения (метастазирования) в другие ткани, органы или вообще отдаленные части организма; метастазирование является одним из признаков злокачественных новообразований и злокачественных опухолей. Термин «онкологическое заболевание» включает, но не ограничивается ими, рак молочной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак легких, колоректальный рак, рак желудка/желудочно-кишечного тракта, рак эндометрия/матки/шейки матки, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, лейкоз, рак сердца, тонкой кишки, селезенки, почек, мозга, кожи, кости, костного мозга, гемобластоз, тимуса, матки, яичек, гепатобилиарной системы и печени, саркому, холангиокарциному, глиобластому, множественную миелому, лимфому, аденому, ангиосаркому, астроцитому, эпителиальную карциному, герминому, глиому, гемангиоэндотелиому, гемангиосаркому, гематому, гепатобластому, медуллобластому, меланому, нейробластому, гепатобиллиарный рак, остеосаркому, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому и тератому. Кроме того, этот термин включает в себя акральную лентигинозную меланому, актинический кератоз, аденокарциному, аденокистозную карциному, аденому, аденосаркому, железисто-плоскоклеточную карциному, астроцитарные опухоли, рак бартолиновой железы, базальноклеточную карциному, карциному бронхиальной железы, капиллярный карциноид, карциному, карциносаркому, цистаденому, опухоль эндодермального синуса, гиперплазию эндометрия, стромальную саркому эндометрия, аденокарциному эндометриоида, эпендимальную саркому, саркому Юинга, фокальную нодулярную гиперплазию, опухоли зародышевых клеток, глюкагоному, гемангиобластому, гемагиоэндотелиому, гемангиому, аденому печени, гепатоцеллюлярную карциному, гепатобиллиарный рак, инсулиному, интраэпителиальную неоплазию, плоскоклеточную интраэпителиальную неоплазию, инвазивную плоскоклеточную карциному, крупноклеточную карциному, лейомиосаркому, меланому, злокачественную мелоному, злокачественную опухоль мезотелия, медуллобастому, медуллоэпителиому, мукоэпидермоидную карциному, нейробластому, нейроэпителиальную аденокарциному, нодулярную меланому, остеосаркому, папиллярную серозную аденокарциному, опухоли гипофиза, плазмоцитому, псевдосаркому, легочную бластому, почечно-клеточную карциному, ретинобластому, рабдомиосаркому, серозный рак, микроцитарную карциному, карциному мягких тканей, опухоль, секретирующую соматостатин, плоскоклеточную карциному, недифференцированный рак, увеальную меланому, бородавчатую карциному, випому, опухоль Вильма, интрацеребральный рак, рак прямой кишки, астроцитому, микроцитарный рак и немикроцитарный рак, метастатическую меланому, андроген-независимый метастатический рак предстательной железы, андроген-зависимый метастатический рак предстательной железы. Термин рак включает как первичные опухоли, так и метастатические опухоли.

Используемый в настоящем описании термин «противоопухолевая терапия» относится к любому лечению, включающему воздействие на пациента, которого лечат любым способом, используемым для индукции гибели опухолевых клеток. Указанный способ не ограничивается введением химических агентов, он может состоять из хирургического вмешательства, химиотерапии, лучевой терапии, гормональной терапии, таргетной терапии, включая иммунотерапию, или их комбинации.

Термин «хирургическое вмешательство» применительно к онкологическому заболеванию относится к серьезному хирургическому вмешательству, при котором по меньшей мере часть первичной опухоли и/или по меньшей мере часть по меньшей мере одного метастаза удаляются.

Используемый в настоящем описании термин «лучевая терапия», «радиотерапия» или «ионизирующее излучение» относится к терапии с использованием ионизирующего излучения, обычно как часть лечения онкологического заболевания для контроля или уничтожения опухолевых клеток и обычно доставляемого линейным ускорителем. Гамма-лучи, рентгеновское излучение и ультрафиолетовая часть электромагнитного спектра являются ионизирующим излучением, тогда как нижняя часть спектра ниже ультрафиолетового, включая видимый свет (включая почти все типы лазерного излучения), инфракрасный свет, микроволны и радиоволны, все считаются неионизирующим излучением. Лучевая терапия может быть излечивающей при ряде типов злокачественных новообразований, если они локализованы в одной области тела. Лучевая терапия обычно применяется к злокачественной опухоли из-за способности контролировать рост клеток. Ионизирующее излучение работает, повреждая ДНК опухолевой ткани, что приводит к гибели клеток.

Используемый в настоящем описании термин «таргетная терапия» относится к терапии, которая блокирует рост опухолевых клеток путем взаимодействия со специфическими таргетными молекулами, необходимыми для канцерогенеза и роста опухоли, а не путем простого препятствия для всех быстро делящихся клеток. Поскольку большинство агентов для таргетной терапии представляют собой биофармацевтические препараты, термин «биологическая терапия» иногда является синонимом таргетной терапии при использовании в контексте терапии злокачественного новообразования (и, таким образом, отличается от химиотерапии, то есть цитотоксической терапии). Тем не менее, условия могут быть объединены. Другая форма таргетной терапии включает использование наноинженерных ферментов для связывания с опухолевой клеткой, так что естественный процесс деградации клеток организма может гидролизовать клетку, эффективно выводя ее из организма. Многие таргетные терапии являются примерами иммунотерапии.

Используемый в настоящем описании термин «иммунотерапия» относится к иммунотерапии злокачественного новообразования, состоящей из подходов, которые модифицируют иммунную систему хозяина, и/или к использованию компонентов иммунной системы в качестве лечения злокачественного новообразования. Неограничивающие примеры иммунотерапии включают неспецифические иммуностимуляторы BCG и левамизол; цитокины интерферон-α и интерлейкин-2; моноклональные антитела против PD1, против PDL1, против CTLA-4, ритуксимаб, офатумумаб, алемтузумаб, трастузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб и панитумумаб; радиоактивно меченные антитела Y-90 ибритумомабтиуксетан и I-131 тозитумомаб; иммунотоксин денилеукиндифтитокс и антитело гемтузумабозогамицин; немиелоабляционные аллогенные трансплантаты с инфузиями донорских лимфоцитов; и противоопухолевую терапию против рака предстательной железы на основе клеток sipuleucel-T. Другие примеры иммунотерапии, такие как вакцины DC, CART-t-клеточная терапия или терапия NK-клетками. Некоторые иммунотерапии включают удаление иммунных клеток из крови или опухоли, а клетки, специфичные для опухоли, культивируют и возвращают пациенту, где они атакуют опухоль; альтернативно, иммунные клетки могут быть генетически сконструированы для экспрессии опухолеспецифического рецептора, культивированы и возвращены пациенту. Типы клеток, которые могут быть использованы таким образом, представляют собой клетки-натуральные киллеры, лимфокино-активированные клетки-киллеры, цитотоксические Т-клетки и дендритные клетки.

Термин «химиотерапия», используемый в настоящем описании, относится к любому лечению, состоящему из введения одного или более противоопухолевых агентов, без ограничений химической структуры, подходящих для терапии и/или лечения онкологического заболевания, отдельно или в комбинации с другими соединения.

Используемое в настоящем описании выражение «AC» относится к химиотерапии, состоящей из комбинации двух препаратов для химиотерапии: адриамицина/доксорубицина и циклофосфамида.

Используемое в настоящем описании выражение «FEC» относится к химиотерапии, состоящей из комбинации трех лекарственных средств для химиотерапии: 5 фторурацила (также известного как 5FU), эпирубицина и циклофосфамида.

Используемое в настоящем описании выражение «ECF» относится к химиотерапии, состоящей из комбинации трех лекарственных средств для химиотерапии: эпирубицина, цисплатина и фторурацила.

Используемый в настоящем описании термин «противоопухолевый агент» представляет собой агент, который, по меньшей мере частично ингибирует развитие или прогрессирование онкологического заболевания, включая ингибирование полностью или частично симптомов, связанных с онкологическим заболеванием, даже если только на короткий срок. Противоопухолевые агенты включают средства, используемые в любой из описанных выше терапий, которые включают введение соединения, то есть гормональную терапию, таргетную терапию, иммунотерапию, химиотерапию.

Несколько примеров противоопухолевых агентов включают без ограничения Ацивицин; Акларубицин; Гидрохлорид акодазола; Акронин; Адозелезин; Алдеслейкин; Алтретамин; Амбомицин; Аметантрон ацетат; Аминоглютетимид; Амсакрин; Анастрозол; Антрамицин; Аспарагиназу; Асперлин; Азацитидин; Азетепа; Азотомицин; Батимастат; Бензодепа; Бикалутамид; Бисантрен гидрохлорид; Биснафид димезилат; Бизелезин; Блеомицин сульфат; Бортезомиб (VELCADE); Бреквинар натрия; Бропиримин; Бусульфан; Кактиномицин; Калустерон; Карацемид; Карбетимер; Карбоплатин (платиносодержащий режим); Кармустин; Карубицин гидрохлорид; Карзелезин; Цедефингол; Хлорамбуцил; Циролемицин; Цисплатин (платиносодержащий режим); Кладрибин; Криснатол мезилат; Циклофосфамид; Цитарабин; Дакарбазин; Дактиномицин; Даунорубицин; Децитабин; Дексормаплатин; Дезагуанин; Диазиквон; Доцетаксел (TAXOTERE); Доксорубицин; Пегилированный липосомальный доксорубицин; Дролоксифен; Дромостанолон; Дуазомицин; Эдатрексат; Эфлорнитин; Элсамитруцин; Энлоплатин; Энпромат; Эпиполпидин; Эпирубицин; Эрбулозол; Эрлотиниб (TARCEVA), Эсорубицин; Эстрамустин; Этанидазол; Этопозид; Этоприн; Фадрозол; Фазарабин; Фенретинид; Флоксуридин; Флударабин; 5-фторурацил; Флуроцитабин; Фосквидон; Фостриецин; Гефитиниб (IRESSA), Гемцитабин; Гидроксимочевину; Идаруцибин; Изофосфамид; Илмофозин; Иматинибмезилат (GLEEVEC); Интерферон альфа-2 а; Интерферон альфа-2 b; Интерферон альфа-n1; Интерферон альфа-n3; Интерферон бета-1 а; Интерферон гамма-I b; Ипроплатин; Иринотекан; Ланреотид; Леналидомид (REVLLMlD, REVIMID); Летрозол; Леупролид; Лиарозол; Лометрексол; Ломустин; Лозоксантрон; Мазопркол; Майтансин; Мехлорэтамин; Мегестрол; Меленгестрол; Мелфалан; Меногарил; Меркаптопурин; Метотрексат; Метоприн; Метуредепа; Митиндомид; Митокарцин; Митокромин; Митогиллин; Митомалцин; Митомицин; Митоспер; Митотан; Митоксантрон; Микофеноловая кислота; Нокодазол; Ногаламицин; Ормаплатин; Оксисуран; Паклитаксел; Пеметрексед (ALIMTA), Пегаспаргазу; Пелиомицин; Пентамустин; Пентомон; Пепломицин; Перфосфамид; Пипоброман; Пипосульфан; Пиритрексим изетионат; Пироксантрон; Пликамидин; Пломестан; Порфимер; Порфиромицин; Преднимустин; Прокарбазин; Пуромицин; Пиразофурин; Рибоприн; Роглетимид; Сафингол; Семустин; Симтразен; Ситоглусид; Спарфосат; Спарзомицин; Спирогерманий; Спиромустин; Спироплатин; Стрептонигрин; Стрептозоцин; Сулофенур; Талисомицин; Тамсулозин; Таксол; Таксотер; Текогалан; Тегафур; Телоксантрон; Темопорфин; Темозоломид (TEMODAR); Тенипозид; Тероксирон; Тестолактон; Талидомид (таломид) и его производные; Тиамиприн; Тиогуанин; Тиотепа; Тиазофурин; Тирапазамин; Топотекан; Торемифен; Трестолон; Трицирибин; Триметрексат; Трипторелин; Тубулозол; Урацил; Иприт; Уредепа; Вапреотид; Вертепорфин; Винбластин; Винкристин; Виндезин; Винепидин; Винглицинат; Винлейрозин; Винорелбин; Винрозидин; Винзолидин; Ворозол; Зениплатин; Зиностатин; Зорубицин.

Противоопухолевый агент также может представлять собой ингибитор фермента, включая, без ограничения, ингибитор тирозинкиназы, ингибитор CDK, ингибитор MAP-киназы или ингибитор EGFR. Ингибитором тирозинкиназы могут быть, без ограничения, генистеин (4',5,7-тригидроксиизофлавон), тирфостин 25 (3,4,5-тригидроксифенил),метилен]пропандинитрил, гербимицин А, даидзеин(4',7-дигидроксиизофлавон), AG-126, транс-1-(3'-карбокси-4'-гидроксифенил)-2-(2",5"-дигидроксифенил)этан или HDBA (2-гидрокси5-(2,5-дигидроксибензиламино)-2-гидроксибензойная кислота. Ингибитор CDK может представлять собой без ограничения p21, p27, p57, pl5, pl6, pl8 или pl9. Ингибитором MAP-киназы может быть, без ограничения, KY12420 (C23H24O8), CNI-1493, PD98059 или 4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5-(4-пиридил)1H-имидазол. Ингибитором EGFR могут быть без ограничения эрлотиниб (TARCEVA), гефитиниб (IRESSA), WHI-P97 (производное хиназолина), LFM-A12 (аналог метаболита лефлуномида), ABX-EGF, лапатиниб, канертиниб, ZD-6474 (ZACTIMA), AEE7 и AG1458.

Кроме того, некоторые пртивоопухолевые агенты могут быть классифицированы как агенты, повреждающие ДНК, и они включают агенты, которые непосредственно индуцируют повреждение ДНК, и агенты, которые косвенно индуцируют повреждение ДНК путем нацеливания на белок, участвующий в ответе клетки на повреждение ДНК, что приводит к увеличению количества повреждения ДНК в клетке. Агенты, которые непосредственно вызывают повреждение ДНК, могут представлять собой: ДНК-алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, дакарбазин, прокарбазин, кармустин, ломустин, ифосфамид, мелфалан, бусульфан, тиотепа), агенты, подобные ДНК-алкилирующим агентам (например, карбоплатин, цисплатин), агенты, индуцирующие разрыв цепи ДНК (например, блеомицин, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, митомицин С), антиметаболические агенты (например, цитарабин, метотрексат, гидроксимочевина, 5-фторурацил, флоксуридин, 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин, флуодарадозо-диазидо-хлордозо-тиозо-дифторбензоальдегид, флудараоксидозо-дифторбензоальдегид), ингибиторы топоизомеразы (например, этопосид, рамптотецин, топотекан, тенипозид, митоксантрон) или эпиподофиллотоксины.

Агенты, которые нацелены на белок, участвующий в ответе клеток на повреждения ДНК, могут представлять собой: ингибиторы PARP (PARPi; например, олапариб, талазопариб, рукапариб, нирапариб, велипариб, CEP-8983, E7016 и BGB-290), антимикротрубочковые агенты (например, винкристин, винбластин) и антрациклины.

Используемый в настоящем описании термин «образец» или «биологический образец» относится к биологическому материалу, выделенному у пациента. Биологический образец содержит любой биологический материал, подходящий для детектирования желаемых белковых маркеров. Биологический образец может содержать клеточный и/или не клеточный материал пациента. Образец может быть выделен из любой подходящей ткани или биологической жидкости, такой как, например, кровь, слюна, спинномозговая жидкость, моча, стул, костный мозг, аспират соска, биопсия солидной опухоли, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость (CSF), кал, щечный или щечно-глоточный мазок, хирургический образец, образец, полученный при биопсии, и образец ткани, залитый в парафин. Способы выделения образцов хорошо известны специалистам в данной области. В конкретном варианте осуществления указанный образец содержит опухолевые клетки, предпочтительно клетки рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака легких, колоректального рака, рака желудка/желудочно-кишечного тракта, рака эндометрия/матки/шейки матки, рака мочевого пузыря, рака головы и шеи, лейкоза, саркомы, холангиокарциномы, глиобластомы, множественной миеломы, лимфомы. Более предпочтительно, образец содержит клетки рака молочной железы, клетки рака яичников, клетки рака предстательной железы, клетки рака желудка или клетки рака поджелудочной железы, еще более предпочтительно клетки рака молочной железы, клетки рака яичника или клетки рака предстательной железы, еще более предпочтительно клетки рака молочной железы. В предпочтительном варианте осуществления это образец опухолевой ткани или его часть. Предпочтительно, указанный образец опухолевой ткани представляет собой опухоль молочной железы, опухоль яичника, опухоль предстательной железы, опухоль желудка, опухоль поджелудочной железы, опухоль легкого, колоректальную опухоль, опухоль желудка/желудочно-кишечного тракта, опухоль эндометрия/матки/шейки матки, опухоль мочевого пузыря, опухоль головы и шеи, опухоль саркомы, опухоль холангиокарциномы, опухоль глиобластомы, опухоль множественной миеломы, ткань опухоли лимфомы или ее часть, образец. Более предпочтительно, образец представляет собой образец опухоли молочной железы, опухоли яичника, опухоли предстательной железы, опухоли желудка и ткани поджелудочной железы или ее части; еще более предпочтительно, указанный образец представляет собой опухоль молочной железы, опухоль яичника или опухоль предстательной железы или ее часть, образец ткани; еще более предпочтительно указанный образец опухолевой ткани представляет собой образец ткани опухоли молочной железы или ее часть.

Указанный образец может быть получен обычными способами, например биопсией, с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Способы получения образца из биопсии включают грубое распределение массы, или микродиссекцию, или другие известные в данной области методы разделения клеток. Опухолевые клетки могут быть дополнительно получены из тонкоигольной аспирационной цитологии. Чтобы упростить сохранение и обработку образцов, они могут представлять собой фиксированную ткань, залитую в парафин ткань, гистологический препарат, клеточную суспензию, клеточный осадок, клеточный препарат, биопсию замороженной солидной опухоли и/или сначала замороженную, а затем залитую в среде, способной затвердевать в криогенных условиях, такой как OCT-соединение, путем погружения в высококриогенную среду, которая обеспечивает быстрое замораживание.

Используемое в настоящем описании выражение «повреждение ДНК» хорошо известно специалистам в данной области. Это относится к изменению химической структуры ДНК, такому как разрыв в одной или обеих цепях ДНК, основание, отсутствующее в остове ДНК, или химически измененное основание. Разрыв в одной цепи ДНК известен как одноцепочечный разрыв (SSB), а разрыв в обеих цепях ДНК известен как двухцепочечный разрыв (DSB). Повреждение ДНК также может заключаться в застопоривании репликативной вилки. Если отсутствует репарация повреждений ДНК клеточным аппаратом ответа на повреждение ДНК, то повреждение ДНК приводит к накоплению повреждения ДНК и к функциональным геномным изменениям (то есть, к нестабильности генома). Указанное изменение в ДНК может, например, обеспечивать избирательное преимущество для пораженной клетки, так что она может непрерывно размножаться и выживать, приводя к образованию опухолевой клетки.

Используемое в настоящем описании выражение «ответ на повреждение ДНК» относится к клеточным путям, которые контролируют и подвергают репарации повреждение ДНК для поддержания целостности генома клетки. Тип ответа на повреждения ДНК зависит от типа повреждения ДНК. В общих чертах, это зависит от того, состоит ли повреждение ДНК из SSB или DSB.

Используемое в настоящем описании выражение «способ, который индуцирует повреждение ДНК» относится практически к любому традиционному способу, который можно использовать для индукции повреждения ДНК в образце. Фактически любой традиционный способ может быть использован в рамках изобретения, чтобы индуцировать повреждение ДНК. Например, хорошо известным способом, который индуцирует повреждение ДНК, является ионизирующее излучение, которое представляет собой тип высокоэнергетического излучения, способного освобождать электроны из атомов и молекул, генерируя ионы, которые могут разрывать ковалентные связи. Ионизирующее излучение напрямую влияет на структуру ДНК, вызывая разрывы ДНК, особенно DSB. Другой пример способа состоит в воздействии на клетки окислительного стресса, главным образом индуцирующего DSB, метилметансульфоната, который является алкилирующим агентом, способным вызывать повреждения ДНК и последующие SSB и DSB, или УФ-света, который может индуцировать SSB и DSB.

Используемый в настоящем описании термин «RAD51» относится к ферменту, играющему главную роль в гомологичной рекомбинации ДНК во время репарации DSB. Последовательность белка хранится в UniProt (22 ноября 2017 года) с номером доступа Q06609.

Используемый в настоящем описании термин «очаги» относится к локальным скоплениям специфических белков в сайте клетки. При упоминании «ядерных очагов» указанные очаги локализуются в ядре клетки. Например, во время репарации повреждения ДНК очаги репарации ДНК образуются в результате локальных скоплений или модификаций белков ответа на повреждение ДНК, образующихся в местах двухцепочечных разрывов ДНК. Очаги можно визуализировать с помощью микроскопического изображения после иммуноокрашивания или флуоресцентного мечения белка.

Выражение «эталонное значение» относится к лабораторному значению, используемому в качестве эталона для значений/данных, полученных с помощью образцов, полученных у пациентов. Контрольное значение или контрольный уровень может быть абсолютным значением, относительным значением, значением, имеющим верхний и/или нижний предел, серией значений, средним значением, медианой, средним значением или значением, выраженным посредством ссылки на контрольное или эталонное значение. Эталонное значение может быть основано на значении, полученном от группы пациентов, которые считаются репрезентативными, например, на значениях, полученных в популяции пациентов из хронологической возрастной группы, совпадающей со значением для объекта исследования - пациента, или на основе набора включений или исключений из образцов для анализа. Альтернативно, эталонное значение может быть основано на отдельном образце, таком как, например, значение, полученное из образца от объекта исследования - пациента, но полученное в предыдущий момент времени.

Эталонное значение изобретения является эталонным для уровня клеток с очагами RAD51 в анализируемом образце. Используемое в настоящем описании выражение «уровень клеток» относится к абсолютному значению или относительному значению, используемому для определения количества клеток. В предпочтительном варианте осуществления уровень клеток с очагами RAD51 в образце определяется как относительный уровень клеток с очагами RAD51 по отношению к:

- количеству опухолевых клеток в образце,

- количеству клеток в образце, которые пролиферируют,

- количеству клеток в образце, которые демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК и

- количеству клеток в образце, которые пролиферируют и демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК.

Указанный относительный уровень может быть рассчитан как отношение или как процент.

Когда уровень клеток с очагами RAD51 рассчитывают относительно количества опухолевых клеток в образце, эталонное значение, выраженное в процентах, составляет, по меньшей мере 0,1%, по меньшей мере 0,25%, по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19%, по меньшей мере 20%, где 100 соответствует общему количеству клеток в образце. В предпочтительном варианте осуществления эталонное значение составляет, по меньшей мере 0,5%, более предпочтительно, по меньшей мере 1%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 2%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 5%.

Когда уровень клеток с очагами RAD51 рассчитывают относительно количества клеток в образце, которые пролиферируют, эталонное значение, выраженное в процентах, составляет, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 21%, по меньшей мере 22%, по меньшей мере 23%, по меньшей мере 24%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, где 100 представляет общее количество клеток в образце, которые пролиферируют. В предпочтительном варианте осуществления эталонное значение составляет, по меньшей мере 1%, более предпочтительно, по меньшей мере 5%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 10%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 11%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 20%.

Используемое в настоящем описании выражение «клетки (…), которые пролиферируют» относится к клеткам в образце, которые делятся, что приводит к увеличению числа клеток в образце. Клетки, которые пролиферируют, идентифицируют путем определения экспрессии белков, участвующих в делении клеток. Неограничивающими примерами таких белков являются: Геминин, Ki-67, ядерный антиген пролиферирующих клеток, Циклин A2.

Используемый в настоящем описании термин «геминин» представляет собой ядерный белок, который отсутствует во время фазы G1 и накапливается в фазах S, G2 и М клеточного цикла. Уровни геминина снижаются при метафазном/анафазном переходе митоза, когда он расщепляется анафазно-стимулирующим комплексом (APC/C).

Используемый в настоящем описании термин «Ki-67», «MKI67» или «антиген KI-67» относится к ядерному белку Ki-67, который присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2 и митоз), но отсутствует в покоящихся клетках (G0). Клеточное содержание белка Ki-67 заметно увеличивается во время клеточной прогрессии через S-фазу клеточного цикла.

Используемый в настоящем описании термин «ядерный антиген пролиферирующих клеток» или «PCNA» относится к белку с указанным названием, который представляет собой зажим ДНК, который действует как фактор процессивности для ДНК-полимеразы δ в эукариотических клетках и важен для репликации. PCNA является гомотримером и достигает своей процессивности, окружая ДНК, где она действует в качестве основы для рекрутирования белков, участвующих в репликации ДНК, репарации ДНК, ремоделировании хроматина и эпигенетике. Первоначально PCNA был идентифицирован как антиген, который экспрессируется в ядрах клеток во время фазы синтеза ДНК клеточного цикла.

Используемый в настоящем описании термин «циклин А2» относится к белку циклин А2, который экспрессируется в делящихся соматических клетках. Уровни циклина А2 тесно синхронизированы с прогрессией клеточного цикла. Транскрипция начинается в конце G1, пики и плато в середине S, и снижается в G2.

Когда уровень клеток с очагами RAD51 рассчитывают относительно количества клеток в образце, которые показывают повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК, эталонное значение, выраженное в процентах, составляет, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 21%, по меньшей мере 22%, по меньшей мере 23%, по меньшей мере 24%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, где 100 представляет общее количество клеток в образце, который демонстрирует повреждение ДНК, предпочтительно DSB. В предпочтительном варианте осуществления эталонное значение составляет по меньшей мере 10%, еще более предпочтительно по меньшей мере 16%, еще более предпочтительно по меньшей мере 17%, еще более предпочтительно по меньшей мере 20%, еще более предпочтительно по меньшей мере 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере 50%.

Используемое в настоящем описании выражение «клетки (…), которые демонстрируют повреждение ДНК» относится к клеткам, имеющим повреждения ДНК, как определено выше, предпочтительно состоящие из DSB. Они идентифицируются в образце путем определения экспрессии, предпочтительно в виде ядерных очагов, белков, участвующих в репарации повреждения ДНК, предпочтительно в репарации DSB. Неограничивающими примерами таких белков являются: γH2AX, белок репликации A (pRPA), p53-связывающий белок 1 (53BP1), белок восстановления двухцепочечного разрыва (MRE11).

Используемый в настоящем описании термин «γH2AX» относится к фосфорилированному гистону H2AX (γH2AX). Он используется в качестве биомаркера клеточного ответа на DSB. На ранней стадии после образования DSB большое количество молекул γH2AX образуется в хроматине вокруг места разрыва, создавая очаг, где накапливаются белки, участвующие в репарации ДНК и ремоделировании хроматина. Эта амплификация позволяет детектировать отдельные DSB с антителом к γH2AX.

Термин «белок репликации A», «pRPA» или «RPA» относится к белку с указанным названием, который является основным белком, который связывается с одноцепочечной ДНК (ssДНК) в эукариотических клетках. Во время репликации ДНК RPA предотвращает разматывание одноцепочечной ДНК (ssДНК) на себя или образование вторичных структур. Это позволяет разматывать ДНК для полимеразы, чтобы реплицироваться. RPA также связывается с ssДНК во время начальной фазы гомологичной рекомбинации для репарации DSB. Как и его роль в репликации ДНК, связывание RPA удерживает ssДНК от связывания с самой собой (самокомплементация), так что получающийся в результате нуклеопротеиновый филамент может затем связываться с RAD51 и его кофакторами. RPA также связывается с ДНК во время процесса репарации нуклеотидов. Это связывание стабилизирует комплекс репарации в процессе репарации. Бактериальный гомолог называется одноцепочечным связывающим белком (SSB).

Используемый в настоящем описании термин «р53-связывающий белок» или «53BP1» относится к белку, который функционирует в выборе пути репарации двухцепочечного разрыва ДНК, стимулируя пути негомологичного соединения концов (NHEJ) и ограничивая гомологичную рекомбинацию. Этот белок играет несколько ролей в ответе на повреждение ДНК, включая стимулирование передачи сигналов контрольной точки после повреждения ДНК, выступая в качестве основы для рекрутирования белков ответа на повреждение ДНК в поврежденный хроматин, и стимулируя пути NHEJ путем ограничения резекции конца после двухцепочечного разрыва. Эти роли также важны во время рекомбинации V (D) J, рекомбинации с переключением классов и на незащищенных теломерах. Альтернативный сплайсинг приводит к множественным вариантам транскрипции, кодирующим разные изоформы.

Термин «белок репарации двухцепочечного разрыва» или «MRE11» в контексте настоящего описания относится к белковой части комплекса MRN, которая играет центральную роль в репарации двухцепочечных разрывов (DSB), рекомбинации ДНК, поддержании целостности теломер и в мейозе. Комплекс обладает одноцепочечной эндонуклеазной активностью и двухцепочечной специфической 3'-5'-экзонуклеазной активностью, которые обеспечиваются MRE11. RAD50 может потребоваться для связывания концов ДНК и удержания их в непосредственной близости. Это может облегчить поиск коротких или длинных областей гомологии последовательностей в рекомбинирующих матрицах ДНК, а также может стимулировать активность ДНК-лигаз и/или ограничить нуклеазную активность MRE11, чтобы предотвратить нуклеолитическую деградацию после данной точки. Комплекс также может быть необходим для передачи сигналов повреждения ДНК посредством активации киназы АТМ.

Когда уровень клеток с очагами RAD51 рассчитывают относительно количества клеток в образце, которые пролиферируют и демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно разрывы двухцепочечной ДНК, эталонное значение, выраженное в процентах, составляет по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2% по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12% по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 21%, по меньшей мере 22%, по меньшей мере 23%, по меньшей мере 24%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, где 100 представляет собой общее количество клеток, которые пролиферируют и которые также демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно DSB. В предпочтительном варианте осуществления эталонное значение составляет, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, еще более предпочтительно, оно составляет, по меньшей мере 20%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 30%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 50%.

Используемое в настоящем описании выражение «отвечать на противоопухолевую терапию» относится к благоприятному ответу на противоопухолевую терапию, который квалифицированный специалист понимает как стабилизацию или уменьшение размера опухоли/опухолей и/или количества опухолей у пациента и/или ингибирование метастатического процесса. В этом случае специалист должен также называть пациента «чувствительным к противоопухолевой терапии». Напротив, если ответ не является благоприятным, как только что указано, квалифицированный специалист также назвал бы пациента «устойчивым к противоопухолевой терапии». Указанный ответ может быть определен по меньшей мере одним критерием, выбранным из группы, состоящей из показателя клинической пользы, общей выживаемости, выживаемости без прогрессирования заболевания, выживаемости без заболевания, полной патологии, полной клинической ремиссии, частичной клинической ремиссии, клинически стабильной болезни, рецидива, выживания без метастазирование, уменьшения циркулирующих опухолевых клеток, ответа циркулирующих маркеров и критериев RECIST для оценки ответа опухоли. Момент после начала терапии, в котором оценивается ответ, особо никак не ограничен. Таким образом, ответ на терапию можно определить по меньшей мере через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 месяцев после начала первой терапии или по меньшей мере через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более лет после начала первой терапии.

Кроме того, тип и количество линий терапии, применяемых к пациенту до определения ответа, также конкретно ничем не ограничено. Таким образом, ответ может быть определен у пациентов после того, как пациент прошел терапию первой линии, включая хирургическую терапию, химиотерапию или хирургическое вмешательство в комбинации с адъювантной или неадъювантной химиотерапией или любым типом терапии, или после того, как пациент прошел лечение двумя или более последовательных или одновременных линий терапии.

Выражение «коэффициент клинической пользы» в том виде, как оно используется в настоящем описании, относится к проценту пациентов с онкологическим заболеванием, у которых наблюдается улучшение по меньшей мере одного важного симптома или элемента качества жизни, который напрямую связан с лечением, без какого-либо снижения какого-либо другого элемент качества жизни пациента. Указанное улучшение понимается как полная ремиссия, частичная ремиссия или стабилизация заболевания.

Используемое в настоящем описании выражение «общая выживаемость» относится к промежутку времени от даты постановки диагноза или начала лечения заболевания, такого как онкологическое заболевание, до тех пор, пока пациенты, у которых диагностировано заболевание, все еще живы.

Используемое в настоящем описании выражение «выживаемость без прогрессирования» относится к периоду времени во время и после лечения заболевания, такого как онкологическое заболевание, когда пациент живет с этим заболеванием, но оно не ухудшается.

Выражение «безрецидивная выживаемость» в том виде, как оно используется в настоящем описании, относится к периоду времени после окончания первичного лечения онкологического заболевания, когда пациент выживает без каких-либо признаков или симптомов этого онкологического заболевания.

Используемое в настоящем описании выражение «полный патологический ответ» относится к отсутствию остаточных инвазивных опухолевых клеток после введения пртивоопухолевой терапии.

Используемое в настоящем описании выражение «клиническая полная ремиссия» относится к исчезновению всех признаков онкологического заболевания в ответ на лечение.

Используемое в настоящем описании выражение «клиническая частичная ремиссия» относится к уменьшению размера опухоли или степени онкологического заболевания в организме в ответ на лечение.

Выражение «клинически стабильное заболевание» в контексте настоящего описания относится к онкологическому заболеванию, которое не уменьшается и не увеличивается по степени или тяжести.

Используемый в настоящем описании термин «рецидив» относится к появлению онкологического заболевания после лечения и после периода времени, в течение которого онкологическое заболевание не было обнаружено.

Используемое в настоящем описании выражение «выживание без метастазирования» относится к периоду времени после окончания лечения онкологического заболевания, когда пациент выживает без каких-либо признаков или симптомов метастазирования рака.

Используемое в настоящем описании выражение «уменьшение циркулирующих опухолевых клеток» относится к уменьшению концентрации циркулирующих опухолевых клеток в крови или лимфе у пациента с метастатическим раком. Уменьшение циркулирующих опухолевых клеток связано с эффективностью терапии против метастатического рака.

Используемое в настоящем описании выражение «ответ циркулирующих маркеров» относится к изменению концентрации в крови или в лимфе белков или нуклеиновых кислот, связанных с конкретным онкологическим заболеванием, после лечения против указанного специфического онкологического заболевания.

Используемый в настоящем описании термин «RECIST» относится к «Критериям оценки ответа в солидных опухолях». Это стандартный способ измерения того, насколько хорошо онкопациент отвечает на лечение. Это основано на том, уменьшаются ли опухоли, остаются такими же или становятся больше. Чтобы использовать RECIST, должна быть хотя бы одна опухоль, которую можно измерить с помощью рентгеновских снимков, компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ). Типы ответов, которые может иметь пациент, это полный ответ (CR), частичный ответ (PR), прогрессирующее заболевание (PD) и стабильное заболевание (SD). В доклинических исследованиях с мышиными моделями ксенотрансплантата мы применяем критерии RECIST к опухолям, измеренным штангенциркулем.

B. Способ выбора индивидуальной терапии для пациента с диагностированным онкологическим заболеванием

Во втором аспекте изобретение относится к способу выбора индивидуальной терапии для пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не был обработан способом, который вызывает повреждение ДНК перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением,

где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что выбранная терапия включает агенты, специфичные для лечения опухолей с дефицитом ответа на повреждение ДНК, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что выбранная терапия не содержит агентов, специфичных для лечения опухолей с дефицитом ответа на повреждение ДНК.

Используемый в настоящем описании термин «выбор индивидуальной терапии» или «выбор персонализированной терапии» относится к выбору подходящей и оптимальной терапии на основе конкретных медицинских характеристик пациента, обусловленных его личным генетическим фоном. В контексте настоящего изобретения указанная характеристика является специфической для опухолевых клеток пациента и состоит на уровне клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные от пациента, где пациент не получил за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не обрабатывали способом, который индуцирует повреждение ДНК, до определения уровня клеток с очагами RAD51. Указанный уровень клеток с очагами RAD51 и эталонное значение определяют, как указано в разделе 1-A.

В контексте настоящего изобретения терапия, которая должна быть выбрана или не выбрана, представляет собой терапию, включающую агенты, специфичные для лечения опухолей с дефицитом ответа на повреждение ДНК.

Используемое в настоящем описании выражение «опухоли с дефицитом ответа на повреждение ДНК» или «опухолевые клетки с дефицитом ответа на повреждение ДНК» или «опухолевые клетки, характеризующиеся потерей функции по меньшей мере одного белка, участвующего в ответе на повреждение ДНК клетки», как используется в настоящем документе, относится к злокачественным опухолям, образованным опухолевыми клетками, в которых изменяется ответ на повреждение ДНК. Указанное изменение может заключаться в наличии увеличения повреждений ДНК (по сравнению с неопухолевыми клетками, полученными из той же ткани органа и пациента, что и опухолевые клетки), опухолеспецифических дефектов репарации ДНК и неспособности остановить или застопорить клеточный цикл до того, как поврежденная ДНК передается дочерним клеткам, или в их комбинации. Любое из этих изменений может быть результатом аномальной экспрессии белка, участвующего в реакции повреждения ДНК. Неограничивающими примерами указанных белков являются ATM, ATR, BRCA 1, BRCA2, BP53, P53, CDC25, CHK1, CHK2, NBS, MRE1J, RAD51, PALB2, PARP или их комбинации. Указанные изменения приводят к нестабильности генома, характерной для раковых или злокачественных опухолевых клеток.

Используемый в настоящем описании термин «ATR» относится к серин/треонин-протеинкиназе ATR, также известной как атаксия-телеангиэктазия- и Rad3-связанный белок (ATR) или FRAP-связанный белок 1 (FRP1). ATR представляет собой серин-треонин-специфическую протеинкиназу, которая участвует в определении повреждения ДНК и активации контрольной точки повреждения ДНК, что приводит к остановке клеточного цикла. ATR активируется в ответ на постоянную одноцепочечную ДНК, которая является обычным интермедиатом, образующимся при детектировании и репарации повреждений ДНК. Одноцепочечная ДНК встречается в застопорившихся репликативных вилках и является интермедиатом в путях репарации ДНК, таких как репарация нуклеотидов и репарация гомологичной рекомбинации. ATR работает с белком-партнером под названием ATRIP для распознавания одноцепочечной ДНК, покрытой RPA. Как только ATR активируется, он фосфорилирует Chk1, инициируя каскад сигнальной трансдукции, который завершается остановкой клеточного цикла. В дополнение к своей роли в активации контрольной точки повреждения ДНК, ATR, как полагают, функционирует в невозмущенной репликации ДНК. ATR связан со второй киназой, активирующей контрольную точку, ATM.

Используемый в настоящем описании термин «ATM» относится к серин/треонинкиназе ATM. Ген ATM кодирует белок с молекулярной массой 350 кДа, состоящий из 3056 аминокислот. АТМ принадлежит к суперсемейству киназ, связанных с фосфатидилинозитол-3-киназой (PIKK). Белок АТМ представляет собой серин/треонин протеинкиназу, которая рекрутируется и активируется с помощью двухцепочечных разрывов ДНК. Она фосфорилирует несколько ключевых белков, которые инициируют активацию контрольной точки повреждения ДНК, что приводит к остановке клеточного цикла, репарации ДНК или апоптозу. Комплекс из трех белков MRE11, RAD50 и NBS1 (XRS2 в дрожжах), называемый комплексом MRN у человека, рекрутирует ATM для двухцепочечных разрывов цепи (DSB) и удерживает два конца вместе. ATM напрямую взаимодействует с субъединицей NBS1 и фосфорилирует вариант гистона H2AX на Ser139. Это фосфорилирование генерирует сайты связывания для адаптерных белков с доменом BRCT. Эти адаптерные белки затем рекрутируют различные факторы, включая эффекторную протеинкиназу CHK2 и опухолевый супрессор p53. Эффекторная киназа CHK2 фосфорилируется и тем самым активируется с помощью АТМ. Активированная CHK2 фосфорилирует фосфатазу CDC25A, которая после этого деградирует и больше не может дефосфорилировать CDK2-Циклин, что приводит к остановке клеточного цикла. Если DSB не может быть подвергнут репарации во время этого быстрого ответа, ATM дополнительно фосфорилирует MDM2 и p53 на Ser15. p53 также фосфорилируется эффекторной киназой CHK2. Эти события фосфорилирования приводят к стабилизации и активации р53 и последующей транскрипции многочисленных генов-мишеней р53, включая ингибитор CDK р21, которые приводят к длительной остановке клеточного цикла или даже апоптозу.

Термины «BRCA1» и «BRCA2», используемые в настоящем описании, относятся к белкам, называемым «белок рака молочной железы 1» и «белок рака молочной железы 2», соответственно. Их также называют «белками чувствительности к раку молочной железы». Они участвуют в репарации хромосомного повреждения и играют важную роль в безошибочной репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Если сам BRCA1 или BRCA2 поврежден мутацией BRCA в клетках молочной железы, поврежденная ДНК не восстанавливается должным образом, и это увеличивает риск рака молочной железы. Хотя структуры генов BRCA1 и BRCA2 очень разные, по меньшей мере некоторые их функции взаимосвязаны.

BRCA2 участвует в репарации двухцепочечных разрывов и/или гомологичной рекомбинации. Он действует путем нацеливания RAD51 на ssДНК по двухцепочечной ДНК, которая стимулирует встраивание в цепь во время гомологичной рекомбинации. Локализация RAD51 в двухцепочечном разрыве ДНК требует образования комплекса BRCA1-PALB2-BRCA2.

BRCA1, по-видимому, играет роль в двух разных путях репарации двухцепочечных разрывов, негомологичного соединения концов и гомологически направленной репарацией. Таким образом, BRCA1 взаимодействует с белками, вовлеченными как в негомологичный путь соединения концов (включая Mre11, Rad50, комплекс Nbs1), так и в гомологичную репарацию (RAD51 и BRCA2, среди прочих).

Используемый в настоящем описании термин «Cdc25» относится к фосфатазам Cdc25 (Cdc25A, B и C), которые отвечают за удаление ингибирующих фосфатов из Thr-14 и Tyr-15 в циклин-зависимых киназах, которые активируют киназы и управляют прогрессированием через клеточный цикл. Во время репарации ДНК митоз следует предотвращать, и, таким образом, ответ на повреждение ДНК активирует контрольную точку клеточного цикла для предотвращения митозов. Две протеинкиназы, Chk1 и Cds1, могут усиливать эту контрольную точку, фосфорилируя митотический индуктор Cdc25, таким образом предотвращая вход в митоз.

Используемый в настоящем описании термин «Chk1» относится к «киназе 1 контрольной точки», которая представляет собой серин/треонин-специфическую протеинкиназу. Активация Chk1 приводит к инициации контрольных точек клеточного цикла, остановке клеточного цикла, репарации ДНК и клеточной смерти для предотвращения прогрессии поврежденных клеток через клеточный цикл. Chk1 регулируется с помощью ATR посредством фосфорилирования, формируя путь ATR-Chk1. Этот путь распознает одноцепочечную ДНК (ssДНК). Часто ssДНК может быть результатом аномальной репликации во время S-фазы через разобщение ферментов репликации геликазы и ДНК-полимеразы. Эти структуры ssДНК привлекают ATR и в конечном итоге активируют путь контрольной точки.

Однако активация Chk1 не зависит исключительно от ATR, часто необходимы промежуточные белки, участвующие в репликации ДНК. Регуляторные белки, такие как белок репликации A, Клапсин, Tim/Tipin, Rad 17, TopBP1, могут участвовать в активации Chk1. Дополнительные белковые взаимодействия вовлечены, чтобы вызвать максимальное фосфорилирование Chk1. Активация Chk1 также может быть независимой от ATR посредством взаимодействий с другими протеинкиназами, такими как PKB/AKT, MAPKAPK и p90/RSK.

Используемый в настоящем описании термин «Chk2» относится к «киназе 2 контрольной точки». Chk2 регулирует деление клеток. Когда ДНК подвергается двойному разрыву, белок Chk2 активируется. Более конкретно, АТМ фосфорилирует сайт Thr68 и активирует Chk2. После активации Chk2 фосфорилирует нижестоящие по сигнальному пути мишени, включая CDC25-фосфатазы, отвечающие за дефосфорилирование и активацию циклин-зависимых киназ (CDK). Таким образом, ингибирование Chk2 фосфатаз CDC25 предотвращает вход клетки в митоз, подобно Chk1. Кроме того, белок Chk2 взаимодействует с несколькими другими белками, включая р53 (р53). Стабилизация p53 с помощью Chk2 приводит к остановке клеточного цикла в фазе G1. Кроме того, известно, что Chk2 фосфорилирует фактор транскрипции клеточного цикла E2F1 и белок промиелоцитарного лейкоза (PML), участвующий в апоптозе (запрограммированная клеточная смерть).

Используемый в настоящем описании термин «NBS1» относится к белку, кодируемому геном, вызывающим «синдром хромосомных поломок Ниймегена». NBS1 обычно образует комплекс с нуклеазой hMRE11/hRAD50 и функционирует в репарации посредством гомологичной рекомбинации для двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). Взаимодействия NBS1 с ATM, MDC1, γH2AX и TopBP1 важны для формирования очага в сайтах DSB и активации ATM/ATR-зависимой контрольной точки клеточного цикла после повреждения ДНК.

Используемый в настоящем описании термин «PALB2» относится к «партнеру и локализатору BRCA2». Этот белок связывается и совместно локализуется с BRCA2 в ядерных очагах и, вероятно, обеспечивает стабильную внутриядерную локализацию и накопление BRCA2. PALB2 связывается с одноцепочечной ДНК и напрямую взаимодействует с рекомбиназой RAD51 для стимуляции встраивания в цепь, что является жизненно важным этапом гомологичной рекомбинации.

Используемый в настоящем описании термин «PARP» относится к «поли (АДФ-рибоза) полимеразе». Семейство PARP состоит из 17 членов, все они имеют очень разные структуры и функции в клетке. Основная роль PARP состоит в том, чтобы обнаруживать SSB и инициировать репарацию SSB путем передачи сигналов ферментативному аппарату, вовлеченному в указанную репарацию SSB, главным образом в пути BER. Как только PARP детектирует SSB, он связывается с ДНК, претерпевает структурные изменения и начинает синтез полимерной цепи аденозиндифосфат-рибозы (поли (ADP-рибозы) или PAR), которая действует как сигнал для других ферментов ДНК-репарации. Целевые ферменты включают ДНК-лигазу III (LigIII), ДНК-полимеразу бета (polβ) и каркасные белки, такие как ген XRCC1 (X-ray cross-complementing gene 1). После репарации цепи PAR деградируют с помощью поли (АДФ-рибозы) гликогидролазы (PARG).

Остальные термины в контексте настоящего способа изобретения имеют значение, определенное для предыдущего способа.

C. Способ классификации пациента с онкологическим заболеванием в когорту пациентов

В третьем аспекте изобретение относится к способу классификации пациента с онкологическим заболеванием в когорту пациентов, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не был обработан методом, который вызывает повреждение ДНК перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- пациента классифицируют в когорту, отличающуюся ответом на противоопухолевую терапию, если уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, или

- пациент классифицируется в когорту, для которой характерно отсутствие ответа на противоопухолевую терапию, если уровень клеток с очагами RAD51 выше, чем указанное эталонное значение.

Термин «когорта» или «группа пациентов», используемый в настоящем описании, относится к группе пациентов, подверженных общим заболеваниям, воздействиям окружающей среды или временным факторам, методам лечения или другими признаками, прогресс которых оценивается в научном или клиническом исследовании. В настоящем изобретении у пациентов всех групп диагностируется онкологическое заболевание, и общей характеристикой для пациентов в группе является положительный или отрицательный ответ (в зависимости от группы) на противоопухолевую терапию. Указанный ответ каждого пациента определяют путем сравнения уровня клеток с очагами RAD51 с контрольным значением в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не был обработан способом, который индуцирует повреждение ДНК перед определением уровня клеток с очагами RAD51. Указанный уровень клеток с очагами RAD51 и эталонное значение определяют, как указано в разделе 1-A.

Остальные термины в контексте настоящего способа изобретения также имеют значение, определенное для предыдущих способов.

D. Способ прогнозирования способности опухоли пациента к репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации

В четвертом аспекте изобретение относится к способу прогнозирования способности опухоли пациента к репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце опухоли, где опухоль была выделена у пациента, который не получал за 24 часа до выделения опухоли химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не был обработан методом, который индуцирует повреждение ДНК, до определения уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что опухоль способна к репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что опухоль не способна к репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации.

Выражение «прогноз того, способна ли опухоль от пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, к репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации», используемое в настоящем описании, относится к вероятностям, с помощью которых опухоль пациента может быть способна к репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации. Как поймут специалисты в данной области, и хотя это не является предпочтительным, прогноз не должен быть верным для 100% опухолей от проанализированных пациентов. Однако выражение требует, чтобы прогноз давал правильные результаты для статистически значимой части пациентов. Определение того, дает ли прогноз по изобретению статистически значимые результаты, может быть выполнено с использованием стандартных статистических методов, таких как определение доверительных интервалов, определение значения p, t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, как описано в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Подходящие доверительные интервалы составляют, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%. Значения p предпочтительно составляют 0,2, 0,1, 0,05.

Термин «вероятность», используемый в настоящем описании, понимается, как указано в разделе 1-А.

Используемое в настоящем описании выражение «репарация гомологичной рекомбинации» или «HRR» относится к процессу гомологичной рекомбинации, происходящему в клетке как DDR для репарации DSB по существу. В общих чертах, HRR требует наличия идентичной или почти идентичной последовательности, которая будет использоваться в качестве матрицы для репарации разрыва. Ферментативный аппарат, ответственный за этот процесс репарации, практически идентичен аппарату, ответственному за хромосомный кроссовер во время мейоза. Этот путь позволяет восстановить поврежденную хромосому с использованием сестринской хроматиды (доступной в G2 после репликации ДНК) или гомологичной хромосомы в качестве матрицы.

Таким образом, способ, раскрытый в этом разделе D, позволяет проводить различие между пациентами с онкологическим заболеванием, у которых HRR является качественной/функциональной или недостаточной/нефункциональной.

Остальные термины, используемые в определении настоящего способа изобретения, были объяснены в отношении предыдущих способов изобретения и в равной степени применимы к настоящему способу.

E. Предпочтительные варианты осуществления способов изобретения

В предпочтительном варианте осуществления в способе, определенном в любом из предыдущих аспектов изобретения, клетка определяется как имеющая очаги RAD51, если она содержит по меньшей мере один, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, в по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 очагов RAD51 в ядре. В более предпочтительном варианте осуществления указанная клетка должна содержать по меньшей мере 1 очаг RAD51 в ядре. В еще более предпочтительном варианте осуществления указанная клетка должна содержать по меньшей мере 5 очагов RAD51 в ядре.

В другом предпочтительном варианте осуществления очаги RAD51 идентифицируют с помощью иммуноанализа с использованием антитела, которое способно специфически распознавать белок RAD51. Используемый в настоящем описании термин «иммуноанализ» относится к биохимическому тесту, который измеряет присутствие или концентрацию молекулы в растворе путем использования его антигенсвязывающего фрагмента или антитела. Молекула, детектированная с помощью иммуноанализа, часто упоминается как «аналит» и во многих случаях является белком, хотя это могут быть и другие виды молекул, различного размера и типа, при условии, что разработаны соответствующие антитела, которые имеют адекватные свойства для анализ. Иммуноанализы используют множество различных меток для выявления антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Метки обычно химически связаны или конъюгированы с целевым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

Обычными метками для использования в иммуноанализах являются ферменты. Обычные иммуноанализы с использованием ферментов представляют собой твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) или иногда иммуноферментные анализы (EIA).

Ферменты, используемые в иммуноанализах в качестве меток, включают пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP) или глюкозооксидазу. Эти ферменты обеспечивают частое детектирование, потому что они вызывают заметное изменение цвета в присутствии определенных реагентов. В некоторых случаях эти ферменты подвергаются воздействию реагентов, которые вызывают генерацию ими света или хемилюминесценцию.

Радиоактивные изотопы могут быть включены в реагенты для иммуноанализа для получения радиоиммуноанализа (RIA). Радиоактивность, испускаемая связанными комплексами антитело-антиген, может быть легко детектирована с использованием традиционных методов.

Флюорогенные репортеры, такие как фикоэритрин, используются во многих современных иммуноанализах. Белковые микрочипы представляют собой тип иммуноанализа, в котором часто используются флуорогенные репортеры.

Хотя метки обычно используются в иммуноанализах, существуют определенные типы анализов, которые не полагаются на метки, но вместо этого используют методы детектирования, которые не требуют модификации или мечения компонентов анализа. Поверхностный плазмонный резонанс является примером метода, который может детектировать связывание между немеченым антителом и антигенами. Он состоит в резонансных колебаниях электронов проводимости на границе раздела материала с отрицательной и положительной диэлектрической проницаемостью, стимулируемых падающим светом. Другой продемонстрированный иммуноанализ без меток включает измерение изменения сопротивления на электроде, когда антиген связывается с ним.

Указанные принципы методов иммуноанализа используются специалистом в данной области для определения экспрессии и/или образования очагов представляющего интерес белка на уровне одной клетки. Способы, обеспечивающие указанное определение, известны специалисту в данной области. Неограничивающими примерами таких способов являются иммуногистохимия, иммунофлуоресценция, иммуноэлектронная микроскопия или проточная цитометрия.

Термин «иммуногистохимия», используемый в настоящем описании, относится к методике, которая включает в себя процесс селективной визуализации антигенов (например, белков) в клетках среза ткани или образца клеток путем использования принципа иммунологического анализа, описанного выше. Визуализация антител, связанных с анализируемыми клетками, включает использование микроскопа, такого как электронный микроскоп (ЭМ). Иммуногистохимия может использоваться на срезах тканей, культивируемых клеточных линиях или отдельных клетках и может использоваться для анализа распределения белков, гликанов и небольших биологических и небиологических молекул в клетках или, в более общем случае, в образце клеток.

Подготовка образца имеет решающее значение для поддержания морфологии клеток, архитектуры ткани и антигенности целевых эпитопов. Это требует правильного сбора тканей, фиксации и секционирования. Раствор параформальдегида часто используется для фиксации ткани, но могут использоваться и другие методы. Затем ткань можно секционировать или использовать целиком, в зависимости от цели эксперимента или самой ткани. Перед секционированием образец ткани может быть погружен в среду, такую как парафиновый воск или криогенная среда. Срезы могут быть секционированы различными инструментами, чаще всего с использованием микротомного, криостатного или компресстомного слайсера для ткани. Образцы обычно секционируют в диапазоне от 3 до 50 мкм. Затем срезы устанавливают на предметные стекла, обезвоживают с использованием спиртовых моющих средств возрастающих концентраций (например, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%) и очищают с использованием детергента, такого как ксилол, перед тем, как визуализировать их под микроскопом. В зависимости от метода фиксации и консервации ткани, образец может потребовать дополнительных шагов, чтобы сделать эпитопы доступными для связывания антител, включая депарафинизацию и извлечение антигена. Для фиксированных формалином тканей, залитых парафином, часто необходим поиск антигена, который включает предварительную термообработку или протеазную обработку срезов. Эти стадии могут отличаться при окрашивании целевых антигенов или при отсутствии окрашивания.

Используемый в настоящем описании термин «иммунофлуоресценция» относится к конкретному примеру иммуногистохимии, который главным образом использует флуорофоры для визуализации локализации антител на анализируемых клетках.

Используемый в настоящем описании термин «проточная цитометрия» относится к лазерной или импедансной биофизической технологии, используемой для детектирования биомаркеров, подсчета клеток, сортировки клеток и белковой инженерии путем суспендирования клеток в потоке жидкости и пропускания их через электронный детектор. Проточный цитометр позволяет одновременно проводить многопараметрический анализ физических и химических характеристик до тысяч частиц в секунду. Клетки иммуноокрашивают в растворе, а затем анализируют проточной цитометрией.

Используемый в настоящем описании термин «антитело» включает в себя цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (то есть «антигенсвязывающий участок») или их отдельные цепи. «Антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (обозначенной в настоящем документе как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначенную здесь как VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. Области VH и VL могут быть далее подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая, VH и VL, состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, связывания который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Моноклональные антитела имеют моновалентную аффинность в том смысле, что они связываются с одним и тем же эпитопом антигена, где эпитоп является частью антигена, который распознается антителом. Моноклональные антитела получены из идентичных иммунных клеток, которые являются клонами уникальной родительской клетки. Напротив, поликлональные антитела связываются с несколькими эпитопами одного и того же антигена и обычно вырабатываются разными В-клеточными линиями.

Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, TNFα, IL-12). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена с помощью фрагментов полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из VH- или VL-домена; и (vi) выделенная область, определяющая комплементарность (CDR). Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены с помощью рекомбинантных способов посредством синтетического линкера, который позволяет им создать отдельную белковую цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv) см. Bird et al., (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Эти фрагменты антител получают с помощью традиционных методов известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на пригодность также как и интактные антитела. В одном варианте осуществления изобретения фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fab, Fd, Fd', одноцепочечного Fv (scFv), scFva и доменного антитела (dAb).

Термины «уровень клеток», а также «эталонное значение» были определены в разделе 1-А. Различные способы определения «уровня клеток с очагами RAD51» также были определены в разделе 1А.

Что касается определения уровня клеток с очагами RAD51 относительно количества клеток в образце, которые пролиферируют, в предпочтительном варианте осуществления количество клеток в образце, которые пролиферируют, определяется путем определения экспрессии белка, выбранного из списка, состоящего из Геминина, KI-67, ядерного антигена пролиферирующих клеток, Циклина A2. В другом предпочтительном варианте осуществления определение экспрессии выбранного белка проводят с помощью иммуноанализа с антителом, специфичным для выбранного белка. Предпочтительно, клетки, которые считаются пролиферирующими, демонстрируют ядерную экспрессию выбранного белка, где «ядерная экспрессия» относится к экспрессии белка, локализованного в ядре клетки. В предпочтительном варианте осуществления клетка определяется как обладающая ядерной экспрессией белка, когда экспрессия белка в ядре выше, чем в цитоплазме. В более предпочтительном варианте осуществления выбранный белок представляет собой геминин.

Что касается определения уровня клеток с очагами RAD51 относительно количества клеток в образце, которые показывают повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы, в предпочтительном варианте осуществления количество клеток в образце, которые демонстрируют наличие двухцепочечных разрывов, определяется путем определения ядерной экспрессии, предпочтительно наличия ядерных очагов, белка, выбранного из списка, состоящего из γH2AX, белка репликации A (pRPA), p53-связывающего белка 1 (53BP1), белка репарации двухцепочечного разрыва (MRE11). В другом предпочтительном варианте осуществления клетка определяется как обладающая ядерной экспрессией белка, когда экспрессия белка в ядре выше, чем в цитоплазме. В другом предпочтительном варианте осуществления клетки определяют как имеющие ядерные очаги выбранного белка, если они содержит, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15 по меньшей мере 20 очагов указанного белка в ядре. В более предпочтительном варианте осуществления клетка определяется как имеющая ядерные очаги выбранного белка, если она содержит по меньшей мере 1 очаг указанного белка в ядре. Проводится определение наличия ядерной экспрессии или ядерных очагов выбранного белка иммуноанализом с антителом, специфичным для выбранного белка, который предпочтительно представляет собой γH2AX. В предпочтительном варианте осуществления определение количества клеток в образце, которые демонстрируют наличие повреждения ДНК, предпочтительно двухцепочечных разрывов, определяют путем определения количества клеток с ядерными очагами γH2AX, где клетка определяется как имеющая ядерные очаги γH2AX, если она содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 очагов γH2AX в ядре.

Термины «иммуноанализ» и способы детектирования белка на одном уровне уже были определены выше, а также термин «антитело», используемый в настоящем описании.

В предпочтительном варианте осуществления образец любого из способов, описанных до настоящего времени, был выделен из крови, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, стула, костного мозга, аспирата соска или биопсии солидной опухоли. В еще более предпочтительном варианте осуществления образец способов, описанных до настоящего времени, был выделен из биопсии солидной опухоли.

В другом конкретном варианте осуществления образец любого из способов, описанных до настоящего времени, предоставляется в виде фиксированной ткани, ткани, залитой в парафин, ткани, фиксированной формалином, залитой в парафин (FFPE), гистологического препарата, клеточной суспензии, осадка клеток, клеточного препарата и/или замороженной биопсии солидной опухоли. В предпочтительном варианте осуществления образец представляет собой фиксированную ткань, где фиксация проводилась с помощью формалина, альдегидов, спиртов, окислителей, ртути, пикратов или с помощью HEPES-глутаминовой кислоты, опосредованного буферным эффектом защиты от органических растворителей (HOPE®).

В другом варианте осуществления ответ пациента, указанного в способе «для прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию», может быть определен по меньшей мере одним критерием, выбранным из группы, состоящей из общего показателя клинической пользы, общей выживаемости, выживаемости без прогрессирования заболевания, выживаемости без заболевания, патологического полного ответа, клинической полной ремиссии, клинической частичной ремиссии, клинически стабильного заболевания, рецидива, выживаемости без метастазирования, уменьшения циркулирующих опухолевых клеток, ответа циркулирующих маркеров и критериев RECIST для оценки ответа опухоли. Эти различные критерии были определены в разделе 1-A.

Противоопухолевая терапия, упомянутая в способе «для прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию» и/или в способе «для выбора индивидуальной терапии для пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание», предпочтительно содержит использование хирургического вмешательства. В другом варианте осуществления противоопухолевая терапия, упомянутая любым из указанных выше способов изобретения, включает, по меньшей мере один способ, который вызывает повреждение ДНК, и/или агент или комбинацию агентов, которые нацелены на ответ опухолевых клеток на повреждение ДНК. Выражение «метод, который индуцирует повреждение ДНК» было определено в разделе 1А. Неограничивающими примерами методов, которые индуцируют повреждение ДНК, являются ионизирующее излучение, ультрафиолетовое излучение или химиотерапия с агентами, непосредственно индуцирующими повреждение ДНК, такими как перечисленные в разделе 1А как «агенты, непосредственно индуцирующие повреждение ДНК». Используемое в настоящем описании выражение «агенты, которые нацелены на ответ на повреждение ДНК», относится к агентам, которые нацелены по меньшей мере на один белок, вовлеченный в указанный процесс в клетке. Неограничивающими примерами указанных белков являются ATM, ATR, BRCA 1/2, BP53, P53, CDC25, CHK1/2, NBS, MRE1J, RAD51, PALB2, PARP или их комбинации. Неограничивающие примеры агентов, которые нацелены на ответ повреждения ДНК, перечислены выше в разделе 1-A как «агенты, нацеленные на белок, участвующий в ответе клеток на повреждения ДНК». Предпочтительно, средство, которое нацелено на противоопухолевую терапию, выбирают из группы ингибиторов PARP (включая, но не ограничиваясь ими, олапариб, велипариб, талазопариб, рукапариб, нирапариб, CEP-8983, E7016 и BGB-290). Используемый в настоящем описании термин «PARPi» или «ингибиторы PARP» относится к группе фармакологических ингибиторов фермента поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP). Они разработаны по множественным показаниям, особенно для лечения онкологического заболевания. PARP1 является белком, который важен для репарации одноцепочечных разрывов в ДНК. Если такие SSB остаются не восстановленными до тех пор, пока ДНК не будет реплицирована (что должно предшествовать делению клетки), то сама репликация может вызвать формирование DSB. Таким образом, в общих чертах, механизм действия лекарственных средств, которые ингибируют PARP1, заключается в том, чтобы вызывать образование множественных DSB, так что в опухолях с мутациями белков, участвующих в репарации DSB, таких как BRCA1, BRCA2 или PALB2, эти двухцепочечные разрывы не могут быть эффективно восстановлены, что приводит к клеточной смерти. Неограничивающими примерами PARPi являются, как указано в разделе 1A, олапариб, велипариб, талазопариб, рукапариб, нирапариб, CEP-8983, E7016 и BGB-290.

В другом предпочтительном варианте осуществления образец, указанный в любом из предыдущих способов, содержит опухолевые клетки, характеризующиеся потерей функции по меньшей мере одного белка, участвующего в ответе клетки на повреждения ДНК, где клетка имеет дефицит ответа на повреждение ДНК. Выражение «опухолевые клетки, характеризующиеся потерей функции, по меньшей мере одного белка, участвующего в ответе клетки на повреждения ДНК», было определено в разделе 1-А. Предпочтительно, по меньшей мере один белок, участвующий в ответе на повреждение ДНК, выбран из группы, состоящей из BRCA1, BRCA2 и/или PALB2. Еще более предпочтительно, указанный по меньшей мере один белок представляет собой BRCA1 и/или BRCA2.

В конкретном варианте осуществления онкологическое заболевание, диагностированное у пациента, выбирают из списка, состоящего из рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака простаты, рака легкого, колоректального рака, рака желудка/желудочно-кишечного тракта, рака эндометрия/матки/шейки матки, рака мочевого пузыря, рак головы и шеи, лейкоза, саркомы, холангиокарциномы, глиобластомы, множественной миеломы, лимфомы. Более предпочтительно, онкологическое заболевание, диагностированное у пациента, выбирается из списка, состоящего из рака молочной железы, рака яичника и рака предстательной железы, даже предпочтительно это рак молочной железы или рак яичника, еще более предпочтительно это рак молочной железы.

Что касается лечения, полученного пациентом до выделения образца в любом из аспектов изобретения, предпочтительно пациент не получал в любое время, предпочтительно в течение последних 168 часов, более предпочтительно в течение последних 72 часов, более предпочтительно в течение последние 48 часов, еще более предпочтительно в течение последних 36 часов, еще более предпочтительно в течение последних 24 часов, даже еще более предпочтительно за 24 часа до выделения образца, химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина. В другом предпочтительном варианте пациент не получал химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, за 24 часа до выделения образца, но в течение последних 23 часов, предпочтительно в течение последних 22 часов, более предпочтительно в течение последних 21 часа, еще более предпочтительно в течение последних 20 часов, еще более предпочтительно в течение последних 15 часов, еще более предпочтительно в течение последних 10 часов, еще более предпочтительно, в течение последних 5 часов, и даже еще более предпочтительно, в течение последних 2 часов, еще более предпочтительно, в течение последнего часа, предшествующего выделению образца.

В предпочтительном варианте осуществления пациент, у которого был выделен образец, не получал никакой химиотерапии в любое время, предпочтительно в течение последних 168 часов, предпочтительно в течение последних 72 часов, более предпочтительно в течение последних 48 часов, еще более предпочтительно в течение последние 36 часов, еще более предпочтительно в течение последних 24 часов, еще более предпочтительно за 24 часа до выделения образца. В другом предпочтительном варианте осуществления пациент не получал никакой химиотерапии за 24 часа до выделения образца, но в течение последних 23 часов, предпочтительно в течение последних 22 часов, более предпочтительно в течение последних 21 часа, еще более предпочтительно в течение последних 20 часов, еще более предпочтительно в течение последних 15 часов, даже еще более предпочтительно в течение последних 10 часов, еще более предпочтительно в течение последних 5 часов и даже еще более предпочтительно в течение последних 2 часов, еще более предпочтительно в течение последнего часа, предшествующего выделению образца.

В более предпочтительном варианте осуществления пациент не получал никакой противоопухолевой терапии в любое время, предпочтительно в течение последних 168 часов, более предпочтительно в течение последних 72 часов, еще более предпочтительно в течение последних 48 часов, еще более предпочтительно в течение последнего 36 часов, еще более предпочтительно в течение 24 часов, еще более предпочтительно за 24 часа до выделения образца. В еще более предпочтительном варианте осуществления пациент не получал никакой пртивоопухолевой терапии в любое время до выделения образца.

В другом конкретном варианте осуществления пациент, у которого выделен образец, получал противоопухолевую терапию в любое время в течение периода, предшествующего выделению образца, предпочтительно в течение последних 168 часов, более предпочтительно в течение последних 72 часов, еще более предпочтительно в течение последних 48 часов, еще более предпочтительно в течение последних 36 часов, еще более предпочтительно в течение последних 24 часов до выделения образца. При назначении за 24 часа до выделения образца, предпочтительно в течение последних 24 часов до выделения образца, указанная противоопухолевая терапия отличается от химиотерапии, выбранной из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина. В другом варианте осуществления, при введении в течение последних 36 часов, более предпочтительно в течение последних 48 часов, еще более предпочтительно в течение последних 72 часов, еще более предпочтительно в течение последних 168 часов, еще более предпочтительно в любое время до выделения образца, указанная противоопухолевая терапия отличается от химиотерапии, выбранной из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина. Предпочтительно, лечение любого из состояний, описанных в настоящем параграфе, представляет собой противоопухолевую терапию, ответ на которую определяется в способе «для прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию».

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу определения поддержания или прекращения противоопухолевой терапии у пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, подвергаемого лечению с использованием противоопухолевой терапии, включающему:

i) определение уровня клеток с очагами RAD51 в образце, содержащем опухолевые клетки, выделенные у указанного пациента, где пациент не получал за 24 часа до выделения образца химиотерапию, выбранную из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, и где образец не обрабатывали способом, который индуцирует повреждение ДНК перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже указанного эталонного значения, следовательно, следует сохранить противоопухолевую терапию, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что противоопухолевую терапию следует прекратить.

Термины, используемые в настоящем способе изобретения, были объяснены в отношении предыдущих способов изобретения и в равной степени применимы к настоящему способу.

2. Терапевтические применения изобретения

В пятом аспекте изобретение относится к лекарственному средству для применения при лечении онкологического заболевания у пациента, где пациент был идентифицирован как отвечающий на указанное лекарственное средство с помощью способа прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию согласно настоящему изобретению.

В шестом аспекте изобретение относится к лекарственному средству для применения при лечении онкологического заболевания у пациента, где лечение было разработано способом выбора индивидуальной терапии для пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, в соответствии с настоящим изобретением.

Используемый в настоящем описании термин «лекарственное средство» относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, предпочтительно пртивоопухолевого агента, более предпочтительно агента, повреждающего ДНК. Лекарственное средство также содержит по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или носитель.

В предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство содержит более одного агента, где каждый агент находится в своем соответствующем терапевтически эффективном количестве, предпочтительно, по меньшей мере один из этих агентов представляет собой противоопухолевый агент, и более предпочтительно, по меньшей мере один из этих агентов представляет собой агент, повреждающий ДНК. В другом предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство состоит из агента в его соответствующем терапевтически эффективном количестве, предпочтительно пртивоопухолевого агента в его соответствующем терапевтически эффективном количестве, более предпочтительно агента, повреждающего ДНК, в его соответствующем терапевтически эффективном количестве. В этом случае агент уже содержит по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или носитель.

Используемый в настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству агента, достаточному для обеспечения желаемого эффекта, и, как правило, определяется, помимо других причин, характеристиками самого соединения и терапевтическим эффектом, который должен быть достигнут. Это также будет зависеть от подлежащего лечению пациента, тяжести онкологического заболевания, которым страдает указанный пациент, выбранной лекарственной формы, пути введения и т. д.

Даже при том, что индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов для терапевтически эффективных количеств соединений для применения согласно изобретению зависит от общего опыта этих специалистов в данной области. В целом, дозировка, необходимая для обеспечения эффективного лечения, которая может регулироваться одним специалистом в данной области, будет варьироваться в зависимости от возраста, состояния здоровья, физической формы, пола, диеты, веса, степени изменения молекулярного пути, подвергающегося направленному воздействию, частоты лечение, природы и состояния онкологического заболевания, природы и степени онкологического заболевания, медицинское состояние пациента, пути введения, фармакологических факторов, таких как активность, эффективность, фармакокинетический и токсикологический профиль конкретного используемого агента, если используется системная доставка лекарственного средства, и если агент вводится как часть комбинации лекарств.

Используемое в настоящем описании выражение «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» или «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому соединению или комбинации соединений, которые по существу нетоксичны для пациента в используемых дозировке и концентрации и совместимы с другими компонентами лекарственного средства. Таким образом, вспомогательное вещество представляет собой неактивное вещество, составленное вместе с активным ингредиентом (то есть агентом, предпочтительно противоопухолевым агентом, еще более предпочтительно агентом, повреждающим ДНК, таким как PARPi) лекарственного средства с целью увеличения объема композиций, которые содержат указанные активные ингредиенты. Увеличение объема материала позволяет удобно и точно дозировать активный ингредиент при изготовлении лекарственной формы. Вспомогательные вещества также могут служить различным терапевтическим целям, таким как облегчение абсорбции или растворимости активного ингредиента, или другим фармакокинетическим соображениям. Вспомогательные вещества также могут быть полезны в процессе производства, чтобы помочь в обращении с соответствующим активным веществом, например, путем улучшения текучести порошка или неадгезивных свойств, в дополнение к содействию стабильности in vitro, такой как предотвращение денатурации в течение ожидаемого срока годности. Выбор подходящих вспомогательных веществ зависит от пути введения и дозированной формы, а также от активного ингредиента и других факторов. Вспомогательное вещество может быть нетоксичным твердым, полутвердым или жидким наполнителем, разбавителем, инкапсулирующим материалом или вспомогательным препаратом любого традиционного типа. Иллюстративные неограничивающие примеры вспомогательных веществ или носителей включают воду, солевые (физиологические) растворы, спирт, декстрозу, растительные масла, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, поверхностно-активные вещества, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, сложные эфиры жирных кислот, петроэфиры, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобное.

Предпочтительные варианты осуществления терапевтического применения изобретения

В предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство содержит противоопухолевый агент, более предпочтительно агент, повреждающий ДНК. В более предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство содержит агент-ингибитор PARP, предпочтительно выбранный из списка, состоящего из олапариба, велипариба, талазопариба, рукапариба, нирапариба, CEP-8983, E7016 и BGB-290. В еще более предпочтительном варианте осуществления PARPi представляет собой олапариб, велипариб или нирапариб, предпочтительно олапариб.

В другом конкретном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для применения при лечении, состоящем из иммунотерапии.

В конкретном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для использования в лечении, где лечение, в дополнение к введению лекарственного средства, включает иммунотерапию, химиотерапию, лучевую терапию или их комбинацию, и где пациент был идентифицирован в ответ на указанное лекарственное средство способом «Для прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию».

В другом конкретном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для использования в лечении, где лечение, в дополнение к введению лекарственного средства, включает иммунотерапию, химиотерапию, лучевую терапию или их комбинацию, и где лечение было разработано способом «выбора индивидуальной терапии для пациента с диагностированным онкологическим заболеванием».

Термины, используемые в контексте лекарственных средств по изобретению, имеют то же значение, которое определено для способов по изобретению.

3. Использование набора

В седьмом аспекте изобретение относится к применению набора в способе «для прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию», где набор содержит антитело, которое способно специфически распознавать белок RAD51.

В восьмом аспекте изобретение относится к применению набора в способе «для выбора терапии для пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание», где набор содержит антитело, которое способно специфически распознавать белок RAD51.

В девятом аспекте изобретение относится к применению набора в способе «для классификации пациента, имеющего онкологическое заболевание, в когорту пациентов», где набор содержит антитело, которое способно специфически распознавать белок RAD51.

В десятом аспекте изобретение относится к применению набора в способе «для прогнозирования, способна ли опухоль от пациента к репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации», где набор содержит антитело, которое способно специфически распознавать RAD51. белка.

В одиннадцатом аспекте изобретение относится к применению набора в любом из способов по изобретению, где набор включает антитело, которое способно специфически распознавать белок RAD51.

В контексте настоящего изобретения «набор» понимается как продукт, содержащий различные реагенты, необходимые для осуществления различных применений изобретения, упакованные таким образом, чтобы обеспечить их транспортировку и хранение. Кроме того, наборы, используемые в изобретении, могут содержать инструкции по одновременному, последовательному или раздельному использованию различных компонентов, входящих в набор. Указанные инструкции могут быть в форме печатного материала или в форме электронной поддержки, способной хранить инструкции, которые могут быть прочитаны или поняты, такие как, например, электронные носители данных (например, магнитные диски, ленты) или оптические носители (например, CD-ROM, DVD) или аудиоматериалы. Дополнительно или альтернативно, средства массовой информации могут содержать интернет-адреса, которые предоставляют указанную инструкцию.

В предпочтительном варианте осуществления набор, упомянутый в любом из указанных выше применений, дополнительно содержит антитело, способное специфически распознавать белок, экспрессия которого определяет, пролиферирует ли клетка в образце. Предпочтительно, указанное антитело способно специфически распознавать белок, выбранный из списка, состоящего из геминина, KI-67, ядерного антигена пролиферирующих клеток, циклина А2. Более предпочтительно белок представляет собой Геминин.

В другом предпочтительном варианте осуществления набор, упомянутый в любом из указанных выше применений, дополнительно содержит антитело, способное специфически распознавать присутствие специфического белка в ядре, предпочтительно присутствие ядерных очагов указанного белка, где указанное присутствие в клетке указывает, что клетка содержит повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК. Предпочтительно, указанное антитело способно специфически распознавать белок, выбранный из списка, состоящего из γH2AX, белка репликации A (pRPA), p53-связывающего белка 1 (53BP1), белка репарации двухцепочечного разрыва (MRE11). Более предпочтительно, антитело способно специфически распознавать белок γH2AX.

В предпочтительном варианте осуществления набор, упомянутый в любом из применений, указанных в первом, втором, третьем и четвертом абзацах этого раздела 3, дополнительно содержит антитело, выбранное из группы, состоящей из антитела, способного специфически распознавать белок Геминин, и антитело, способное специфически распознавать белок γH2AX или их комбинацию.

В другом предпочтительном варианте осуществления любое из антител, указанных в этом разделе 3, включает каждое из них, что составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или, по меньшей мере 100% от общего количества реагентов, образующих наборы, используемые в изобретении.

Термины, используемые в контексте применений изобретения, имеют то же значение, которое определено для способов и лекарственных средств изобретения.

Следующие примеры и чертежи предоставляются в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

План исследования

Чтобы выявить новые биомаркеры эффективности PARPi, проспективно собрали образцы опухолей у пациентов с диагнозом карцинома молочной железы (BC) или с серозным раком яичников высокой степени злокачественности (HGSOC) и создали коллекцию моделей PDX. Оценивали их чувствительность к PARPi и анализировали функциональность пути HRR и сравнивали между PARPi-чувствительными и PARPi-устойчивыми образцами PDX, чтобы найти функциональный тест, коррелирующий с ответом. Функциональный тест был также исследован в независимой коллекции PDX. Исследовательский анализ в клинических образцах, включая пациентов с мутациями зародышевой линии в BRCA1, BRCA2 или PALB2, был использован для изучения потенциального клинического интереса функционального теста.

Модели ксенотрансплантата, полученные от пациента (PDX)

Свежие образцы опухолей от пациентов с раком молочной железы или серозным раком яичников высокой степени злокачественности были отобраны для имплантации голым мышам в соответствии с протоколами, утвержденными экспертным наблюдательным советом (IRB) Vall Hebron, Institut Curie или Institut Paoli-Calmettes. Эксперименты проводили в соответствии с директивой Европейского союза по уходу за животными (2010/63/EU) и были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных при Научно-исследовательском институте Valld'Hebron (Барселона, Испания) или Этическим комитетом по экспериментам на животных CEEA-51 (Эври, Франция). Свежие первичные или метастатические опухоли человека были получены от пациентов во время операции или биопсии и немедленно имплантированы в жировую прокладку молочной железы (образцы для хирургического вмешательства) или в нижнюю часть бока (образцы для метастазирования) бестимусных самок 6-недельного возраста HsdCpb: NMRI-Foxn1nu. (Harlan Laboratories). Животным постоянно добавляли 1 мкМ 17b-эстрадиола (Sigma-Aldrich) в их питьевую воду. После роста приживленных опухолей модель была сохранена путем последовательной трансплантации в нижнюю боковую часть. В каждом пассаже для генотипирования и гистологических исследований брали залитые в парафин быстрозамороженные и фиксированные формалином образцы (FFPE).

Анализ генов BRCA1/2 и PALB2

ДНК выделяли из образцов опухолей PDX или периферической крови пациента и проводили секвенирование следующего поколения генов BRCA1, BRCA2 и PALB2.

Эксперименты in vivo по чувствительности PDX к PARPi

Чтобы оценить чувствительность к ингибированию PARP, мышей с опухолями поровну распределяли по группам обработки от 5 до 10 мышей с опухолями размером от 70 до 300 мм³. Олапариб 50 мг/кг или 100 мг/кг, нирапариб 75 мг/кг или 50 мг/кг или Велипариб 100 мг/кг вводили на каждый зонд (перорально) ежедневно (в 10% об./об. ДМСО/10% масс/об Клептоз [HP-β-CD]). Рост опухоли измеряли штангенциркулем раз в две недели с первого дня обработки до 21 дня и каждые 7-10 дней в условиях приобретенной устойчивости. Для создания моделей PDX с приобретенной устойчивостью к PARPi обработка олапарибом поддерживалась до 150 дней в опухолях, чувствительных к олапарибу, до восстановления отдельных опухолей. Во всех экспериментах массу мыши регистрировали два раза в неделю. Объем опухоли рассчитывали как V=4π/3/L×l2, где «L» - самый большой диаметр, а «l» - самый маленький. Мышей умерщвляли, когда опухоли достигали 1500 мм³ или в случае сильной потери массы, в соответствии с установленными правилами. Противоопухолевую активность определяли путем сравнения объема опухоли через 21 день с ее исходным уровнем:% изменения объема опухоли = (V21день -Vисходный)/Vисходный x100. Для чувствительной к олапарибу PDX наилучший ответ определяли как минимальное значение % изменения объема опухоли, сохраняющееся в течение по меньшей мере 10 дней. Для классификации противоопухолевого ответа использовали критерии оценки ответа в солидных опухолях (RECIST) по% изменения объема опухоли: CR (полный ответ), лучший ответ <-95%; PR (частичный ответ), -95 <лучший ответ <-30%; SD (стабильное заболевание), - 30% <лучший ответ <+ 20%, PD (прогрессирующее заболевание), лучший ответ> + 20%.

Иммунофлюоресценция

Для иммунофлюоресценции были использованы следующие первичные антитела: кроличьи антитела против RAD51 (Santa Cruz Biotechnology H-92, разведение 1: 250), кроличьи антитела против RAD51 от Cell Signaling Technologies (CST # 8875, разведение 1:25 от 83 мкг/мл материала), кроличьи антитела против RAD51 от Abcam (ab-133534, разведение 1:1000), мышиное антитело против Геминина (NovoCastra NCL-L, 1:100 в образцах PDX, 1:60 в образцах пациентов), кроличьи антитела против Геминина (ProteinTech 10802-1-AP, 1:400), мышиные антитела против BRCA1 (Santa Cruz Biotechnology D-9, 1:50 для C-term; или Abcam MS110, 1: 200 для N-term) и мышиные антитела против γH2AX (Millipore JBW301, 1:200). В качестве вторичных антител использовали козлиное анти-кроличье антитело, конъюгированное с Alexa fluor 568 (Invitrogen; 1: 500), козье анти-мышиное антитело, конъюгированное с Alexa fluor 488 (Invitrogen; 1:500), козье анти-мышиное антитело, конъюгированное с Alexa fluor (Invitrogen; 1:500) и козье анти-кроличье антитело, конъюгированное с Alexa fluor 488 (Invitrogen; 1:500).

Тонкие срезы ткани депарафинизировали ксилолом и гидратировали при уменьшении концентрации этанола. Для извлечения целевого антигена срезы подвергали микроволновой обработке в течение 4 минут при 110°C в буфере для извлечения антигена DAKO, pH 9. Срезы охлаждали в дистиллированной воде в течение 5 минут, затем пермеабилизовали с использованием промывочного буфера DAKO (содержит Tween 20) в течение 5 минут с последующей инкубацией в блокирующем буфере (промывочный буфер DAKO с 1% бычьего сывороточного альбумина) в течение 5 минут. Первичные антитела разводили в разбавителе антител DAKO и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Срезы промывали в течение 5 минут в промывочном буфере DAKO, затем 5 минут в блокирующем буфере. Вторичные антитела разводили в блокирующем буфере и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Двухстадийную промывку повторяли с последующей 5-минутной инкубацией в дистиллированной воде. Дегидратацию проводили с повышением концентрации этанола. Срезы были закреплены с помощью антиадгезивного реагента DAPI ProLong Gold и хранились при -20°C. Иммунофлуоресцентные изображения получали при 600-кратном увеличении с помощью микроскопа Olympus DP72 и генерировали изображения с использованием программного обеспечения CellSens Entry.

RAD51 определяли количественно путем подсчета: а) процента опухолевых клеток с ядерными очагами RAD51, b) процента γH2AX-положительных клеток с очагами RAD51, или c) процентного содержания геминин-положительных клеток с очагами RAD51, как показано на фигурах. Оценку проводили вслепую на живых изображениях. Оптимально, сто геминин- или γH2AX-очаги-положительных клеток из по меньшей мере 3 различных и репрезентативных областей каждого образца были проанализированы. Когда это было возможно, были изучены 3 биологических реплики каждой модели PDX (как с обработкой носителем, так и олапарибом).

Иммуногистохимия

Окрашивание IHC RAD51 и Геминина на ткани ксенотрансплантата опухоли, полученной от пациента, также было разработано на платформе Ventana Ultra Discovery. Тонкие срезы тканей FFPE депарафинизировали с использованием EZ Prep (Ventana), а затем извлекали антиген с использованием раствора для кондиционирования клеток 1 (CC1) (Ventana) при 98°C в течение 32 минут. Препараты блокировали в течение 32 минут при 36°C с использованием блокирующего реагента блокирующего реагента Mouse on Mouse (M.O.M) (Vector Laboratories), разведенного в разбавителе антител SignalStain (Cell Signaling Technology), и затем блокировали в течение 4 минут с помощью ингибитора обнаружения (Roche). Препараты инкубировали в течение 32 минут при 36°C с коктейлем антител против RAD51 (CST # 8875 при 6,6 мкг/мл) и антител против геминина (Leica Geminin-NCL-L, разведение 1:10) в разбавителе антител Ventana с казеином (Roche). Детектирование проводили с использованием UltraMap anti-Rb HRP в течение 16 минут (Roche), UltraMap anti-Ms AP (Roche) в течение 12 минут и затем с использованием наборов Purple и Yellow (Roche), каждый в течение 32 минут. Ядра окрашивали гематоксилином в течение 4 минут. Затем предметные стекла промывали в мыльной воде, промывали и сушили в течение 30 минут при 60°С, затем погружали в ксилол и покрывали покровным стеклом. Этапы промывки были автоматизированы и выполнены с использованием 1x реакционного буфера (Roche). Все предметные стекла были отсканированы с использованием сканера Zeiss Axio Z1 с объективом 40x и минимум 4 Z-стеками.

Анализ экспрессии мРНК RAD51

РНК выделяли из образцов PDX (15-30 мг) с использованием набора PerfectPure RNA Tissue (5 Prime). Чистоту и целостность оценивали с помощью системы Agilent 2100 Bioanalyzer, а кДНК получали с использованием набора реагентов PrimeScript RT (Takara).

Количественную ОТ-ПЦР проводили в системе быстрой ПЦР в реальном времени 7900HT (Applied Biosystems) с использованием TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems) и ранее разработанных человеческих специфических праймеров и зондов TaqMan (Hs99999908_m1 для GUSB, Hs99999903_m1 для ACTB и Hs00153451_m1 для Hs00153451_m1). Сравнительный метод CT был использован для анализа данных, в котором были применены алгоритмы geNorm для выбора наиболее стабильно экспрессируемых генов домашнего хозяйства (GUSB и ACTB), а средние геометрические значения были рассчитаны для получения нормализованных значений CT.

Когорта пациентов

Когорта состояла из пациентов с раком молочной железы и яичников из университетской клиники Valld'Hebron, с материалом FFPE, представляющим заболевание, и подписанной одобренной IRB формой информированного согласия. Иммунофлуоресцентный анализ и количественное определение RAD51 проводили, как описано для образцов опухоли FFPE PDX.

Статистический анализ

Все статистические тесты были выполнены с использованием GraphPad Prism версии 7.0. Парный или непарный критерий Стьюдента (двухвыборочный) был рассчитан и приведены значения p. Планки погрешностей характеризуют SEM по меньшей мере из трех биологических повторов, если не указано иное.

Пример 1. Противоопухолевая активность олапариба в PDX идентифицирует подмножество PARPi-чувствительных опухолей, которые представляют изменения, связанные с HRR.

Противоопухолевую активность PARPi олапариба оценивали на 39 PDX-моделях рака молочной железы (BrC), 3 PDX-моделях рака яичников (HGSOC/OvC) и 2 PDX рака поджелудочной железы (PaC) (Фиг. 1). Для этой цели свежие образцы опухолей отбирали у пациентов с BrC, HGSOC или PaC и имплантировали голым мышам для создания экспериментальных моделей PDX. Обработка олапарибом показала противоопухолевую активность в десяти моделях PDX, как оценивали с помощью RECIST: полный ответ (CR, n=6), частичный ответ (PR, n=2) и стабильное заболевание (SD, n=2). Все эти чувствительные к PARPi PDX несут мутации гена gBRCA1/2 или функциональные изменения в пути репарации гомологичной рекомбинации (HRR), включая мутации в PALB2 или гиперметилирование промотора BRCA1. Остальные 34 PDX-модели, полученные от пациентов с мутированным BRCA и с BRCA дикого типа, были устойчивы к олапарибу (PD, прогрессирующее заболевание). Эту PDX-когорту использовали для изучения клинически значимых механизмов чувствительности PARPi и приобретенной устойчивости in vivo.

Пример 2. Необработанные опухоли имеют детектируемые уровни пролиферации клеток, повреждения ДНК и образования очагов RAD51.

Функциональное состояние HRR было дополнительно исследовано в опухолях, залитых в парафин, фиксированных формалином (FFPE), из вышеупомянутой когорты PDX. Опухоли классифицировали в соответствии с их ответом олапариба, то есть устойчивые (PD) против чувствительных (CR/PR/SD), как конечная точка, аналогичная уровню клинической пользы, используемой в клинической практике. В частности, в подмножестве образцов FFPE из необработанных (носитель) и обработанных (олапариб) опухолей PDX оценивали процент опухолевых клеток с ядерными очагами γH2AX или RAD51, обнаруженными с помощью иммунофлуоресценции (Фиг. 2A). Очаги γH2AX использовали в качестве маркера повреждения двухцепочечной ДНК, а очаги RAD51 - в качестве маркера HRR. Как и ожидалось, обработка олапарибом увеличивала образование очагов γH2AX во всех опухолях. Необработанные образцы уже имели детектируемый исходный уровень повреждения ДНК. Очаги RAD51 были четко детектированы на устойчивых моделях и увеличены при обработке олапарибом. В опухолях, чувствительных к олапарибу, очаги RAD51 были очень слабыми или не детектировались, несмотря на образование очагов γH2AX.

Затем оценивали процент клеток, положительных по геминину и γH2AX, (Фиг. 2B). Геминин использовали в качестве маркера S/G2-фазы клеточного цикла и, следовательно, пролиферации клеток. Во всех группах наблюдали сопоставимые уровни пролиферации клеток. Обработка олапарибом увеличивала образование очагов γH2AX как в чувствительных, так и в устойчивых опухолях.

Процент RAD51-положительных клеток в геминин-положительных клетках, отныне также называемый показателем RAD51, затем определяли как в необработанных (носитель) клетках, так и в обработанных (олапариб) образцах PDX (Фиг. 2C). Тенденции между необработанными и обработанными образцами были сопоставимы, поэтому последующие исследования и анализы были проведены в первой группе, то есть образцы от необработанных индивидуумов.

Уменьшение образования очагов RAD51 в чувствительных опухолях не было результатом снижения экспрессии RAD51 (Фиг. 2D), а скорее предполагало уменьшенную локализацию белков RAD51 (то есть загрузку RAD51 на ДНК для репарации) и, таким образом, дисфункциональный путь HRR.

В целом, эти данные показывают, что низкий процент опухолевых клеток с ядерными очагами RAD51, идентифицированных с помощью анализа RAD51, связан с чувствительностью PARPi, и что высокий процент опухолевых клеток с ядерными очагами RAD51 связан с устойчивостью к PARPi в когорте PDX.

Пример 3. Формирование ядерных очагов с низким уровнем RAD51 идентифицирует PARPi-чувствительные опухоли PDX в многоцентровой панели 71 PDX-модели.

Многоцентровая панель с PDX из VHIO (n=44, рис. 1) и PDX из XenTech (n=27) была использована для разработки и доклинической проверки анализа RAD51. Оценивали процентное содержание γH2AX-положительных клеток в геминин-положительных клетках (Фиг. 3А). Результаты показали, что повреждение ДНК происходит во всех опухолях независимо от ответа PARPi. Однако процент RAD51-положительных клеток в γH2AX-положительных клетках или в геминин-положительных клетках коррелировал с ответом PARPi (Фиг. 3B-D). Действительно, все опухоли из чувствительных к PARPi PDX показали более низкий процент RAD51-очаги-положительных клеток в геминин-положительных клетках по сравнению с PARPi-устойчивыми PDX. Большинство образцов, демонстрирующих чувствительность к PARPi, несут мутации в генах BRCA1/2 или PALB2 (n=12 мутированных из 17 чувствительных моделей) и семь не показали формирования очагов BRCA1 (Фиг. 3D). Эти результаты подтверждают потенциал анализа RAD51 в качестве прогностического биомаркера функционального ответа HRR и PARPi, особенно, но не исключительно, в опухолях с некоторым типом дефицита хотя бы одного белка, участвующего в ответе на повреждение ДНК.

Пример 4. Оценка формирования очагов RAD51 точно связана с ответом PARPi.

Чтобы дополнительно подтвердить, что оценка RAD51 ассоциируется с ответом PARPi, результаты на Фиг. 3C были проанализированы с помощью кривой зависимости количества верно классифицированных положительных объектов от количества неверно классифицированных отрицательных объектов (ROC) (Фиг. 4A и B). В этой когорте PDX результаты показывают, что оценка RAD51 различается при 100% чувствительности и 100% специфичности опухолей, которые чувствительны к PARPi по сравнению с устойчивостью к PARPi-обработке.

Пример 5: Показатель RAD51 прогнозирует ответ PARPi в необработанных клинических образцах.

Кроме того, была проведена клиническая проверка точности оценки RAD51 для различения пациентов с PARPi-чувствительными против PARPi-устойчивых опухолей. Данные получены из образцов, включая метастазы в коже, печени, брюшной полости и лимфатических узлах, у пациентов с gBRCA1 или gBRCA2 BrC или HGSOC. Представлены данные двух пациентов с первичной PARPi-устойчивостью, четырех PARPi-чувствительных пациентов и трех пациентов с прогрессированием PARPi (Фиг. 5А). Эти результаты показывают, что определение процента клеток с ядерными очагами RAD51 точно ассоциируется с ответом PARPi и поддерживает его потенциальное использование в клинических условиях.

Затем мы расширили клиническую валидацию в 24 образцах от 21 пациента без мутаций gBRCA (Фиг. 5B). Поскольку хорошо известно, что PALB2 необходим для HRR, мы обогатили нашу группу пациентов 12 опухолями от пациентов, имеющих мутации зародышевой линии в PALB2 (gPALB2). Пятнадцать из 24 образцов опухолей показали низкую положительность RAD51 (6%), включая все двенадцать образцов gPALB2 опухолей. Интересно, что три опухоли с низким уровнем RAD51, в которых отсутствовали мутации gPALB2, продемонстрировали отсутствие ядерных очагов BRCA1 с помощью иммунофлюоресценции, что позволяет предположить, что гиперметилирование промотора BRCA1 может быть причиной дефицита HRR. Таким образом, эти результаты подтверждают, что анализ RAD51 идентифицирует HRR-дефицитные опухоли, которым может быть полезна терапия PARPi, помимо пациентов с онкологическими заболеваниями, связанными с BRCA.≤

Наконец, мы измерили образование очагов RAD51 (Фиг. 5C) и очагов γH2AX (Фиг. 5D) в 20 образцах опухолей gBRCA (n=10 BRCA1 и n=10 BRCA2, мутированных), включая 10 первичных опухолей молочной железы, не подлежащих лечению (то есть от пациентов, которые никогда не получали противоопухолевую терапию) и 10 опухолей от пациентов, которые ранее получали лечение при ранних/метастатических состояниях. Следует отметить, что эндогенное повреждение ДНК было обнаружено во всех опухолях, включая первичный не леченный рак молочной железы. Кроме того, положительность RAD51/геминина составляет 0-58% в образцах, не получавших лечения, диапазон, подобный опухолям у пациентов, которые получали химиотерапию. Таким образом, этот тест является высокочувствительным и подтверждает возможность обнаружения очагов RAD51 в образцах, не получающих лечения, что позволяет предположить, что восстановление HRR может присутствовать при диагностике.

Пример 6. Показатель RAD51 выше у пациентов с рецидивом заболевания, чем у пациентов с нерецидивным раком молочной железы с мутированным gBRCA.

Мы исследовали потенциальную прогностическую ценность показателя RAD51 для прогнозирования исхода заболевания в долгосрочной перспективе. С этой целью анализ RAD51 был проведен в необработанных первичных опухолях ретроспективной когорты из 19 BrC-пациентов с мутированным gBRCA. Клиническая информация о пациентах представлена в Таблице 1.

Пациент зародышевый BRCA 1/2 Подтип опухоли TNM стадия Рецидивы заболеванияe Противоопухолевая терапия NeoAdjCTx Хирургическое вмешательство AdjCTx BrC-001 1 TNBC T3N1M0 ДА PTX+CB->AC ДА BrC-002 1 TNBC T4N2M0 ДА ДА TC BrC-003 2 lum T2N1M0 ДА ДА AC->PTX BrC-004 1 TNBC T2N0M0 ДА ERI ДА AC BrC-005 2 lumB T2N0M0 ДА AC->PTX ДА BrC-006 1 TNBC T2N1M0 ДА AC->DTX ДА BrC-007 2 TNBC T2N1M0 ДА ДА TAC BrC-008 1 TNBC T2N0M0 ДА ДА EC->PTX BrC-009 1 TNBC T2N0M0 ДА ДА DTX BrC-010 2 lum T2N1M0 ДА ДА ET->CPC BrC-011 2 lumB T2N1M0 НЕТ ДА TAC BrC-012 2 lumB T1N2M0 НЕТ ДА неизвестно (стандарт) BrC-013 1 lumB T3N1M0 НЕТ L-DOX+CP->PTX ДА BrC-014 1 TNBC T2N1M0 НЕТ ДА AC->PTX BrC-015 1 TNBC T2N1M0 НЕТ ДА Неизвестно
(стандарт) BrC-016 2 lumA T3N2M0 НЕТ ДА AC->DTX BrC-017 2 lumB T1N1M0 НЕТ ДА AC->PTX BrC-018 1 TNBC T3N1M0 НЕТ AC->PTX ДА BrC-019 1 lumB T3N0M0 НЕТ ДА AC->PTX

Таблица 1: Клиническая информация о пациентах, проанализированных в настоящем примере, с обобщением статуса BRCA, подтипа опухоли, стадии TNM, рецидива заболевания и противоопухолевой терапии для этой группы пациентов. Подтип опухоли: lumA, люминальный A; lumB, люминальный B; lum, люминальный (не указано). Тип лечения: PTX, паклитаксел; СР, циклофосфамид; AC, доксорубицин+CP; L-DOX, липосомальный доксорубицин; CB, карбоплатин; DTX, доцетаксел; ERI, эрибулин; ET, эпирубицин+DTX; CPC, капецитабин; TC, DTX+CP; TAC, DTX+доксорубицин+CP; неизвестно, неизвестная стандартная химиотерапия из-за информации, не доступной в клинических записях.

Все пациенты получали радикальные операции при опухолях молочной железы и стандартную химиотерапию в неоадъювантных или адъювантных условиях. Все пациенты, которые не рецидивировали (после ≥ 5 лет наблюдения), показали низкие показатели RAD51. Напротив, уровень образования очагов RAD51 был выше в опухолях от пациентов с плохим исходом заболевания, т.е. с рецидивом (Фиг. 6А). Группы с рецидивами и без рецидивов были сбалансированы по классическим прогностическим факторам и отличались по показателю RAD51 с чувствительностью 100% и специфичностью 80% (Фиг. 6B). Таким образом, анализ RAD51 прогнозирует клинический ответ после стандартной противоопухолевой терапии.

Пример 7. Показатель RAD51 идентифицирует подмножество рака предстательной железы с изменениями HRR.

Анализ RAD51 был успешно проведен при раке предстательной железы (Pr) и полученных метастазах (Фиг. 7). Низкие уровни очагов RAD51 были обнаружены в трех образцах, несущих геномное или соматическое изменение в BRCA2. Следует отметить, что образец PrC-021, полученный от пациента с мутацией gBRCA2, был получен после развития устойчивости к стандартной химиотерапии карбоплатином. Высокие уровни очагов RAD51 в этом образце свидетельствуют о реверсии дефицита HRR, который, вероятно, является результатом длительного воздействия (в частности, семи месяцев) этого препарата, повреждающего ДНК. Четыре других образца BRCA дикого типа показали высокий показатель RAD51. Таким образом, показатель RAD51 стратифицирует опухоли предстательной железы в зависимости от уровня и дефицита HRR. Эти данные подтверждают использование PARPi у пациентов с раком простаты с низким показателем RAD51.

Пример 8. Оптимальное отсечение положительности RAD51 основано на количестве ядерных очагов в геминин-положительных клетках.

Все вышеперечисленные результаты были получены с учетом отсечения по положительности RAD51, по меньшей мере 5 очагов RAD51 на геминин-положительную клетку. Этот параметр был получен в результате глубокого анализа абсолютного количественного определения очагов RAD51 в девяти репрезентативных PDX (шесть PARPi-устойчивых и три PARPi-чувствительных модели), как показано на Фиг. 8A-B. Количественный анализ показал, что в опухолях с дефицитом HRR большинство геминин-положительных клеток имеют нулевые очаги RAD51, в то время как клетки с высоким уровнем HRR демонстрируют бимодальное распределение числа очагов RAD51 с самым высоким пиком при 5 очагах на клетку (Фиг. 8C). Что касается прогноза ответа PARPi, мы проанализировали влияние использования различных порогов в необработанных образцах и продемонстрировали, что отсечки от 1 до 5 очагов на клетку обеспечивают наиболее точные и конкретные прогнозы (Фиг. 8D-E). В целом, мы решили использовать отсечку в 5 очагов /на клетку, чтобы быть самым высоким (то есть самым строгим) и все еще очень точным порогом для анализируемых образцов.

Пример 9: Анализ RAD51 воспроизводим с использованием других коммерческих антител против RAD51 и других иммунных анализов.

Мы подтвердили предыдущие результаты путем количественной оценки RAD51 с другим коммерческим антителом против RAD51 как в опухоли PDX, обработанной носителем, так и в PARPi-обработанной опухоли (фиг. 9A). Подобные результаты также наблюдали с третьим антителом против RAD51, протестированным в профицитных/дефицитных по RAD51 клеточных линиях (Фиг. 9B) и в репрезентативной PDX (Фиг. 9C). Кроме того, мы разработали иммуногистохимический анализ для количественного определения показателя RAD51, и были получены сопоставимые результаты по сравнению с ранее использованным иммунофлуоресцентным анализом (Фиг. 9B-C).

Пример 10. Анализ RAD51 осуществим для множества типов опухолей.

К настоящему моменту мы предоставили доказательства того, что анализ RAD51 работает во множестве подтипов рака молочной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и метастатических участков, включая кожу, лимфатический узел и костный мозг (Фиг. 1-7). Наконец, мы также проверили эффективность анализа RAD51 при других типах опухолей, включая педиатрическую нейробластому, метастазирование головного мозга и печени. На самом деле, мы обнаружили положительные образцы RAD51 и отрицательные образцы RAD51 из различных типов опухолей, что предполагает потенциальное расширенное использование анализа RAD51 для опухолей.

В целом, эти результаты демонстрируют, что показатель RAD51 является надежным и высокоточным биомаркером функциональности HRR и ответа на противоопухолевую терапию при различных типах опухолей.

Предложенная группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии. Предложен способ прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию ингибитором PARP путем определения относительного уровня опухолевых клеток с очагами RAD51. Предложены способ выбора индивидуальной терапии и способ классификации пациента. Предложен способ прогнозирования способности опухоли пациента к репарации ДНК с помощью гомологичной рекомбинации. Предложен набор для осуществления указанных способов, содержащий антитело, способное специфически распознавать белок RAD51 и антитело, способное специфически распознавать белок Геминин и/или γH2AX. Предложенная группа изобретений обеспечивает определение опухолей, которые устойчивы и чувствительны к ингибиторам PARP, за счет определения уровня опухолевых клеток с очагами RAD51. 5 н. и 60 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 10 пр.

1. Способ прогнозирования ответа пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, на противоопухолевую терапию, основанную на ингибиторе PARP, включающий:

i) определение относительного уровня опухолевых клеток с очагами RAD51 относительно количества клеток, которые пролиферируют, в образце, выделенном из указанного пациента, где пациент не проходил лечение с использованием любого противоопухолевого средства или проходил лечение, и образец выделяли через по меньшей мере 24 часа после принятия любого противоопухолевого средства, и где образец не обрабатывали способом, который индуцирует повреждение ДНК, перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что пациент, по прогнозам, ответит на противоопухолевую терапию, основанную на ингибиторе PARP, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что пациент, по прогнозам, не ответит на противоопухолевую терапию, основанную на ингибиторе PARP.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки, которые пролиферируют, также демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые пролиферируют, определяют путем определения экспрессии белка, выбранного из списка, состоящего из Геминина, KI-67, ядерного антигена пролиферирующих клеток, Циклина А2.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой Геминин.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют по экспрессии в ядре белка, выбранного из списка, состоящего из γH2AX, белка репликации A (pRPA), p53-связывающего белка 1 (53BP1), белка репарации двухцепочечного разрыва (MRE11).

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой γH2AX.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец выделяют из крови, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, стула, костного мозга, аспирата соска или биопсии солидной опухоли.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец представлен в виде фиксированной ткани, ткани, залитой в парафин, гистологического препарата, клеточной суспензии, клеточного осадка, клеточного препарата и/или замороженной биопсии солидной опухоли.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение очагов RAD51, определение маркеров пролиферирующих клеток и/или определение маркеров клеток, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют с помощью иммунофлюоресценции или иммуногистохимии.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает применение хирургического вмешательства.

11. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает иммунотерапию.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что опухолевые клетки характеризуются потерей функции по меньшей мере одного белка, вовлеченного в ответ клетки на повреждение ДНК.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок, вовлеченный в ответ на повреждение ДНК, выбран из группы, состоящей из BRCA1, BRCA2 и/или PALB2.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что онкологическое заболевание, диагностированное у пациента, выбирают из списка, включающего рак молочной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак легких, колоректальный рак, рак желудка/желудочно-кишечного тракта, рак эндометрия/матки/шейки матки, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, саркому, холангиокарциному, глиобластому, лейкоз, множественную миелому, лимфому.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, не получал никакой противоопухолевой терапии до того, как образец был выделен.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, получал противоопухолевую терапию перед выделением образца, причем противоопухолевая терапия отличается от химиотерапии, выбранной из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, если пациент получал противоопухолевую терапию за 24 часа до выделения образца.

17. Способ выбора индивидуальной терапии для пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, включающий:

i) определение относительного уровня опухолевых клеток с очагами RAD51 относительно количества клеток, которые пролиферируют, в образце, выделенном из указанного пациента, где пациент не проходил лечение с использованием любого противоопухолевого средства или проходил лечение, и образец выделяли через по меньшей мере 24 часа после принятия любого противоопухолевого средства, и где образец не обрабатывали способом, который вызывает повреждение ДНК, перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что выбранная терапия включает ингибиторы PARP, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что выбранная терапия не содержит ингибиторы PARP.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что клетки, которые пролиферируют, также демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые пролиферируют, определяют путем определения экспрессии белка, выбранного из списка, состоящего из Геминина, KI-67, ядерного антигена пролиферирующих клеток, Циклина А2.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой Геминин.

21. Способ по п.18, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют по экспрессии в ядре белка, выбранного из списка, состоящего из γH2AX, белка репликации A (pRPA), p53-связывающего белка 1 (53BP1), белка репарации двухцепочечного разрыва (MRE11).

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой γH2AX.

23. Способ по п.17, отличающийся тем, что образец выделяют из крови, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, стула, костного мозга, аспирата соска или биопсии солидной опухоли.

24. Способ по п.17, отличающийся тем, что образец представлен в виде фиксированной ткани, ткани, залитой в парафин, гистологического препарата, клеточной суспензии, клеточного осадка, клеточного препарата и/или замороженной биопсии солидной опухоли.

25. Способ по п.17, отличающийся тем, что определение очагов RAD51, определение маркеров пролиферирующих клеток и/или определение маркеров клеток, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют с помощью иммунофлюоресценции или иммуногистохимии.

26. Способ по любому из пп.17-25, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает применение хирургического вмешательства.

27. Способ по любому из пп.17-25, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает иммунотерапию.

28. Способ по п.17, отличающийся тем, что опухолевые клетки характеризуются потерей функции по меньшей мере одного белка, вовлеченного в ответ клетки на повреждение ДНК.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок, вовлеченный в ответ на повреждение ДНК, выбран из группы, состоящей из BRCA1, BRCA2 и/или PALB2.

30. Способ по п.17, отличающийся тем, что онкологическое заболевание, диагностированное у пациента, выбирают из списка, включающего рак молочной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак легких, колоректальный рак, рак желудка/желудочно-кишечного тракта, рак эндометрия/матки/шейки матки, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, саркому, холангиокарциному, глиобластому, лейкоз, множественную миелому, лимфому.

31. Способ по п.17, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, не получал никакой противоопухолевой терапии до того, как образец был выделен.

32. Способ по п.17, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, получал противоопухолевую терапию перед выделением образца, причем противоопухолевая терапия отличается от химиотерапии, выбранной из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, если пациент получал противоопухолевую терапию за 24 часа до выделения образца.

33. Способ классификации пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, в когорту пациентов, включающий:

i) определение относительного уровня опухолевых клеток с очагами RAD51 относительно количества клеток, которые пролиферируют, в образце, выделенном из указанного пациента, где пациент не проходил лечение с использованием любого противоопухолевого средства или проходил лечение, и образец выделяли через по меньшей мере 24 часа после принятия любого противоопухолевого средства, и где образец не обрабатывали способом, который индуцирует повреждение ДНК, перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- пациента классифицируют в когорту, отличающуюся ответом на противоопухолевую терапию, основанную на ингибиторах PARP, если уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, или

- пациента классифицируют в когорту, отличающуюся отсутствием ответа на противоопухолевую терапию, основанную на ингибиторах PARP, если уровень клеток с очагами RAD51 выше, чем указанное эталонное значение.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что клетки, которые пролиферируют, также демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые пролиферируют, определяют путем определения экспрессии белка, выбранного из списка, состоящего из Геминина, KI-67, ядерного антигена пролиферирующих клеток, Циклина А2.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой Геминин.

37. Способ по п.34, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют по экспрессии в ядре белка, выбранного из списка, состоящего из γH2AX, белка репликации A (pRPA), p53-связывающего белка 1 (53BP1), белка репарации двухцепочечного разрыва (MRE11).

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой γH2AX.

39. Способ по п.33, отличающийся тем, что образец выделяют из крови, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, стула, костного мозга, аспирата соска или биопсии солидной опухоли.

40. Способ по п.33, отличающийся тем, что образец представлен в виде фиксированной ткани, ткани, залитой в парафин, гистологического препарата, клеточной суспензии, клеточного осадка, клеточного препарата и/или замороженной биопсии солидной опухоли.

41. Способ по п.33, отличающийся тем, что определение очагов RAD51, определение маркеров пролиферирующих клеток и/или определение маркеров клеток, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют с помощью иммунофлюоресценции или иммуногистохимии.

42. Способ по любому из пп.33-41, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает применение хирургического вмешательства.

43. Способ по любому из пп.33-41, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает иммунотерапию.

44. Способ по п.33, отличающийся тем, что опухолевые клетки характеризуются потерей функции по меньшей мере одного белка, вовлеченного в ответ клетки на повреждение ДНК.

45. Способ по п.44, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок, вовлеченный в ответ на повреждение ДНК, выбран из группы, состоящей из BRCA1, BRCA2 и/или PALB2.

46. Способ по п.33, отличающийся тем, что онкологическое заболевание, диагностированное у пациента, выбирают из списка, включающего рак молочной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак легких, колоректальный рак, рак желудка/желудочно-кишечного тракта, рак эндометрия/матки/шейки матки, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, саркому, холангиокарциному, глиобластому, лейкоз, множественную миелому, лимфому.

47. Способ по п.33, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, не получал никакой противоопухолевой терапии до того, как образец был выделен.

48. Способ по п.33, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, получал противоопухолевую терапию перед выделением образца, причем противоопухолевая терапия отличается от химиотерапии, выбранной из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, если пациент получал противоопухолевую терапию за 24 часа до выделения образца.

49. Способ прогнозирования способности опухоли пациента, у которого диагностировано онкологическое заболевание, к репарации ДНК с помощью гомологичной рекомбинации и к ответу на противоопухолевую терапию на основе ингибитора PARP:

i) определение относительного уровня опухолевых клеток с очагами RAD51 относительно количества клеток, которые пролиферируют, в образце, выделенном из указанного пациента, где пациент не проходил лечение с использованием любого противоопухолевого средства или проходил лечение, и образец выделяли через по меньшей мере 24 часа после принятия любого противоопухолевого средства, и где образец не обрабатывали способом, который индуцирует повреждение ДНК, перед определением уровня клеток с очагами RAD51, и

ii) сравнение уровня, полученного на стадии i), с эталонным значением, где:

- уровень клеток с очагами RAD51 ниже, чем указанное эталонное значение, указывает на то, что опухоль способна к репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации и к ответу на противоопухолевую терапию на основе ингибитора PARP, или

- уровень клеток с очагами RAD51, равный или превышающий указанное эталонное значение, указывает на то, что опухоль не способна к репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации и к ответу на противоопухолевую терапию на основе ингибитора PARP.

50. Способ по п.49, отличающийся тем, что клетки, которые пролиферируют, также демонстрируют повреждение ДНК, предпочтительно двухцепочечные разрывы ДНК.

51. Способ по п.50, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые пролиферируют, определяют путем определения экспрессии белка, выбранного из списка, состоящего из Геминина, KI-67, ядерного антигена пролиферирующих клеток, Циклина А2.

52. Способ по п.51, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой Геминин.

53. Способ по п.50, отличающийся тем, что количество клеток в образце, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют по экспрессии в ядре белка, выбранного из списка, состоящего из γH2AX, белка репликации A (pRPA), p53-связывающего белка 1 (53BP1), белка репарации двухцепочечного разрыва (MRE11).

54. Способ по п.53, отличающийся тем, что выбранный белок представляет собой γH2AX.

55. Способ по п.49, отличающийся тем, что образец выделяют из крови, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, стула, костного мозга, аспирата соска или биопсии солидной опухоли.

56. Способ по п.49, отличающийся тем, что образец представлен в виде фиксированной ткани, ткани, залитой в парафин, гистологического препарата, клеточной суспензии, клеточного осадка, клеточного препарата и/или замороженной биопсии солидной опухоли.

57. Способ по п.49, отличающийся тем, что определение очагов RAD51, определение маркеров пролиферирующих клеток и/или определение маркеров клеток, которые демонстрируют двухцепочечные разрывы ДНК, определяют с помощью иммунофлюоресценции или иммуногистохимии.

58. Способ по любому из пп.49-57, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает применение хирургического вмешательства.

59. Способ по любому из пп. 49-57, отличающийся тем, что противоопухолевая терапия дополнительно включает иммунотерапию.

60. Способ по п.49, отличающийся тем, что опухолевые клетки характеризуются потерей функции по меньшей мере одного белка, вовлеченного в ответ клетки на повреждение ДНК.

61. Способ по п.60, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок, вовлеченный в ответ на повреждение ДНК, выбран из группы, состоящей из BRCA1, BRCA2 и/или PALB2.

62. Способ по п.49, отличающийся тем, что онкологическое заболевание, диагностированное у пациента, выбирают из списка, включающего рак молочной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак легких, колоректальный рак, рак желудка/желудочно-кишечного тракта, рак эндометрия/матки/шейки матки, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, саркому, холангиокарциному, глиобластому, лейкоз, множественную миелому, лимфому.

63. Способ по п.49, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, не получал никакой противоопухолевой терапии до того, как образец был выделен.

64. Способ по любому из пп.49-63, отличающийся тем, что пациент, у которого был выделен образец, получал противоопухолевую терапию перед выделением образца, причем противоопухолевая терапия отличается от химиотерапии, выбранной из группы, состоящей из AC, FEC, ECF и навельбина/эпирубицина, если пациент получал противоопухолевую терапию за 24 часа до выделения образца.

65. Набор для осуществления способа по любому из пп.1-64, отличающийся тем, что набор содержит антитело, способное специфически распознавать белок RAD51, где набор дополнительно содержит антитело, выбранное из группы, состоящей из антитела, способного специфически распознавать белок Геминин, и антитела, способного специфически распознавать белок γH2AX, или их комбинацию.