Способ генотипирования полиморфного локуса rs196336 (T>C) гена BAG3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs196336 (T>C) гена BAG3 молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники. Ген BAG3 кодирует кошаперон для белков-шаперонов HSP70 и HSC70. Действует как фактор обмена нуклеотидов, способствуя высвобождению ADP из белков HSP70 и HSC70, тем самым запуская высвобождение клиентского/субстратного белка [Rauch, J. N. Non-canonical Interactions between heat shock cognate protein 70 (Hsc70) and Bcl2-associated anthanogene (BAG) Co-chaperones are important for client release / J. N. Rauch, E. R. P. Zuiderweg, J. E. Gestwicki // Journal of Biological Chemistry. – 2016. – Vol. 291, No. 38. – P. 19848-19857]. Обладает антиапоптотической активностью, играет роль в нуклеоцитоплазматическом транспорте HSF1 [Jin Y. H., Ahn S. G., Kim S. A. BAG3 affects the nucleocytoplasmic shuttling of HSF1 upon heat stress //Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2015. – Vol. 464. – №. 2. – P. 561-567]. Заболевания, связанные с BAG3, включают миопатию, и дилатационную кардиомиопатию [https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BAG3&keywords=BAG3].

Ген BAG3 (Gene ID: 9531) локализован на хромосоме 10q26.11. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs196336 (T>C) гена BAG3 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). SNP rs196336, позиция chr10:119654724 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs196336] локализован в интроне и характеризуется заменой T>C. SNP rs196336 отличается высокой функциональной значимостью. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, генетический вариант rs196336 (T>C) влияет на экспрессию генов BAG3, TXNP1, INPP5F в различных органах и тканях посредством eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs196336#eqtl-block]. Кроме того, обнаружена значительная связь rs196336 с модификациями гистонов, маркирующими промоторы и энхансеры в различных тканях [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs196336]; влияние данного генетического варианта на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs196336 гена BAG3.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006–2016 //Nature protocols. – 2017. – Vol. 12. – №. 2. – P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. – 2022. – Vol. 2. – №. 5. – P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран  коммерческий набор по генотипированию rs196336 BAG3 (Assay C____991605_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs196336 (T>C) гена BAG3, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs196336 (T>C), локализованного в позиции chr10:119654724 (GRCh38.p14) гена BAG3 (Gene ID: 9531) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs196336 (T>C) гена BAG3 осуществляют с использованием прямого праймера rs196336 5′-CACCTGCAGTCTTCCTGGAT-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs196336 5′-CATCCGGCCTCTGTTTATTC-3′ (SEQ ID NO 2), rs196336-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CAGGCCCTTTCCTGGC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),

rs196336-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CAGGCCCCTTCCTGGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фиг. 1: дискриминация аллелей по локусу rs196336 гена BAG3 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs196336-T/T показаны оранжевыми кругами, генотипы rs196336-T/C показаны зелеными треугольниками, генотипы rs196336-C/C показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [T/C] rs196336 BAG3, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs196336 5′-CACCTGCAGTCTTCCTGGAT-3′ (SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs196336 5′-CATCCGGCCTCTGTTTATTC-3′ (SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена BAG3 составляет 159 пар нуклеотидов (CACCTGCAGTCTTCCTGGATTTTGATTTTCTGCACACTTGGGCTTCCCA

CTAATTTGGCAAGTTCATACCAGTCCAGGCCC[T/C]TTCCTGGCAGAGG

ATGGCATTCAGTGCTGGTGCAGCCACTCCTCCAGGCTCCTCCCTGAATA

AACAGAGGCCGGATG).

2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. – New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs196336-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)CAGGCCCTTTCCTGGC(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),

rs196336-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)CAGGCCCCTTCCTGGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4)

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 60°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs196336 37 человек (18,5%) оказались гомозиготами по аллелю Т (генотип T/T); 97 человек (48,5%) являлись гетерозиготами (генотип T/C), 66 человек (33%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю C (генотип C/C).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs196336 (T>C) гена BAG3 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37˚C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs196336 (T>C) гена BAG3 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0.03 мM каждого dNTP, 3,0 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 60°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs196336 (T>C) гена BAG3 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю T, зонд с красителем ROX - аллелю C (фиг. 1). На фиг. 1 видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов – соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот T/T. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот C/C. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот T/C.

Резюме.

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs196336 (T>C) гена BAG3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена BAG3, а также в научных целях.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ генотипирования

полиморфного локуса rs196336 (T C) гена BAG3 у человека методом ПЦР в режиме

«реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных

зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-03-06">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate/>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1881</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный

медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской

Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования полиморфного локуса

rs196336 (T>C) гена BAG3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени»

с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacctgcagtcttcctggat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catccggcctctgtttattc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caggccctttcctggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caggccccttcctggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs196336 (T>C) гена BAG3. Предложен способ генотипирования полиморфного rs196336 (T>C) гена BAG3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранных праймеров (прямого 5'-CACCTGCAGTCTTCCTGGAT-3' и обратного 5'-CATCCGGCCTCTGTTTATTC-3') и зондов c флуорофорами (T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)CAGGCCCTTTCCTGGC(RTQ1)-3' и C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)CAGGCCCCTTCCTGGC(BHQ2)-3') в амплификаторе с детекцией флуоресценции. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования полиморфных вариантов гена BAG3, отличается простотой, точностью и низкой себестоимостью. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs196336 (T>C) гена BAG3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs196336 (T>C) гена BAG3 осуществляют с использованием прямого праймера rs196336 5′-CACCTGCAGTCTTCCTGGAT-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs196336 5′-CATCCGGCCTCTGTTTATTC-3′ (SEQ ID NO 2), rs196336-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CAGGCCCTTTCCTGGC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs196336-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CAGGCCCCTTCCTGGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).