Способ генотипирования полиморфного локуса rs1042665 (T>C) гена HSPA9 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs1042665 (T>C) гена HSPA9 молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники

Этот ген кодирует член семейства генов белка теплового шока 70. Кодируемый белок преимущественно локализуется в митохондриях, но также обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме, плазматической мембране и цитоплазматических везикулах; играет роль в пролиферации клеток, реакции на стресс и поддержании митохондрий [Shan Y., Cortopassi G. Mitochondrial Hspa9/Mortalin regulates erythroid differentiation via iron-sulfur cluster assembly //Mitochondrion. – 2016. – Vol. 26. – P. 94-103]. Ген HSPA9 (Gene ID: 3313) локализован на хромосоме 5q31.2. Полиморфный вариант rs1042665 гена HSPA9, позиция chr5:138566650 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1042665] представляет собой миссенс-вариант и характеризуется заменой T>A,C,G. Однако, аллели A и G встречаются популяциях мира с чаcтотой <0.000001, в связи с чем именно замена T>C является актуальной для исследований многофакторных болезней человека.

Генетический вариант rs1042665 отличается высоким регуляторным потенциалом. Согласно биоинформатическим ресурсам, данный SNP влияет на уровень экспрессии генов REEP2 и KDM3B посредством cis-eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs1042665]; ассоциирован с модификациями гистонов, маркирующими промоторы и энхансеры [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs1042665]. Также установлено влияние rs1042665 на связывание с транскрипционными факторами в зависимости от носительства референсного/альтернативного аллелей [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это доказывает высокую функциональную значимость данного генетического варианта и создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs1042665 (T>C) гена HSPA9.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006–2016 //Nature protocols. – 2017. – Vol. 12. – №. 2. – P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. – 2022. – Vol. 2. – №. 5. – P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs1042665 (C/T) гена HSPA9 (Assay ID C___2082322_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs1042665 (T>C) гена HSPA9, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs1042665 (T>C), локализованного в позиции chr5:138566650 (GRCh38.p14) гена HSPA9 (Gene ID: 3313) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs1042665 (T>C) гена HSPA9 осуществляют с использованием прямого праймера rs1042665 5'-AAATAAGCTCCGGCTGAAAA-3' (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs1042665 5'-GACAGGGGTTGATTTGACTAAA-3' (SEQ ID NO 2), rs1042665-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)AGTTCACATTTAGCCT(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),

rs1042665-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)AGTTCACACTTAGCCT(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs1042665 (T>C) гена HSPA9 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs1042665-T/T показаны оранжевыми кругами, генотипы rs1042665-T/C показаны зелеными треугольниками, генотипы rs1042665-C/C показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран сиквенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [T/C] rs1042665 HSPA9, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs1042665 5'-AAATAAGCTCCGGCTGAAAA-3' (SEQ ID NO 1), обратный общий праймер rs1042665 5'-GACAGGGGTTGATTTGACTAAA-3' (SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена HSPA9 составляет 150 пар нуклеотидов:

AAATAAGCTCCGGCTGAAAATATCCATCAAGACTGCTCGAATTTTCCGTGTCTCACCTGCACAGATGAGGAGAGTTCACA[T/C]TTAGCCTTTTCAGCAGCTTCCCGTACCCTCTGAAGTGCCATGTTGTCTTTAGTCAAATCAACCCCTGTC.

2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. – New York: Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs1042665-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(FAM)AGTTCACATTTAGCCT(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),

rs1042665-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(ROX)AGTTCACACTTAGCCT(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 51°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs1042665 120 человек (60%) оказались гомозиготами по аллелю T (генотип T/T); 70 человек (35%) - гетерозиготами (генотип T/C), 10 человек (5%) индивидуумов были гомозиготами по аллелю C (генотип C/C).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs1042665 (T>C) гена HSPA9 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs1042665 (T>C) гена HSPA9 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0,03 мM каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 51°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs1042665 (T>C) гена HSPA9 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю T, зонд с красителем ROX - аллелю C (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов – соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот T/T. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот C/C. Кластер зеленых треугольников позволяет идентифицировать гетерозигот T/C.

Резюме

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs1042665 (T>C) гена HSPA9 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена HSPA9, а также в научных целях.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

генотипирования полиморфного локуса rs1042665 (T C) гена HSPA9 у

человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-26">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate/>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1878</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский

государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения

Российской Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования полиморфного

локуса rs1042665 (T>C) гена HSPA9 у человека методом ПЦР в режиме

«реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных

зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaataagctccggctgaaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacaggggttgatttgactaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agttcacatttagcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agttcacacttagcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs1042665 (T>C) гена HSPA9. Предложен способ генотипирования полиморфного локуса rs1042665 (T>C) гена HSPA9 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранных праймеров (прямого 5'-AAATAAGCTCCGGCTGAAAA-3' и обратного 5'-GACAGGGGTTGATTTGACTAAA-3') и зондов c флуорофорами (T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)AGTTCACATTTAGCCT(RT'-(ROX)AGTTCACACTTAGCCT(BHQ2)-3') в амплификаторе с детекцией флуоресценции. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования полиморфных вариантов гена HSPA9, отличается простотой, точностью и низкой себестоимостью. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs1042665 (T>C) гена HSPA9 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs1042665 (T>C) гена HSPA9 осуществляют с использованием прямого праймера rs1042665 5'-AAATAAGCTCCGGCTGAAAA-3' (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs1042665 5'-GACAGGGGTTGATTTGACTAAA-3' (SEQ ID NO 2), rs1042665-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)AGTTCACATTTAGCCT(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3), rs1042665-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)AGTTCACACTTAGCCT(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).