Способ получения йодированного мицеллярного казеина, подходящего для применения в составах фармакологических и ветеринарных препаратов, биологически активных добавок и радиопротекторных препаратов, композиция для профилактики йодной недостаточности и оптимизации йодного обмена, композиция для профилактики и защиты от радиационного поражения Российский патент 2024 года по МПК A61K38/16 A61K33/18 A61P39/00 A23J3/10 

Изобретение относится к медицинской и пищевой промышленности, а именно к способу получения йодированного мицеллярного казеина, который может быть использован для получения средств для профилактики и коррекции йододефицитных состояний человека и животных.

Известен способ получения биологически активной добавки к пище путем йодирования исходного белкового сырья смешиванием с водным раствором молекулярного йода при соотношении раствора неорганического йода к общему содержанию белка в диапазоне (2-40):1, при этом йодирование смеси сывороточных белков осуществляется смесью ферментов, иммобилизованных на полупроницаемых мембранах или на инертных носителях, при этом процесс ферментации проводят при непрерывном контроле содержания йода в растворе. Раствор йодированных белков очищают от примесей применением макрофильтрации, микрофильтрации и ультрафильтрации с последующей диафильтрацией водного раствора йодированных белков на ультрафильтрационной установке, очищенный раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации, затем сублимационной сушке с получением готового порошкового продукта. (RU 2212155 C1).

Известен способ изготовления йодированных молочных сывороточных белков для получения биологически активного вещества путем йодирования исходного белкового сырья, в качестве которого используют α-лактальбумин, β-лактоглобулин или смесь перечисленных белков, или гидролизаты перечисленных белков. Инициируют ферментацию смеси белков с водным раствором неорганического йода введением в нее буферной смеси реагентов –и смеси ферментов на основе лактопероксидазы, содержащей от 16 до 24 мас. %, пероксидазы хрена и от 14 до 21 мас. % каталазы. Процесс ферментации проводят при непрерывном контроле содержания йода в растворе. Водный раствор йодированных белков очищают от примесей сочетанием макрофильтрации, микрофильтрации и последующей диафильтрацией водного раствора йодированных белков на ультрафильтрационной установке. Полученный раствор йодированных белков сушат распылительной сушкой с получением готового порошкового продукта с содержанием детерминированного ковалентно связанного йода в количестве 0,5-4 % в форме содержащейся в йодированных белках смеси йодированных аминокислот – монойодтирозинов в количестве 55-75 мас. %, 24,0-43,5 мас. % дийодтирозинов и с 1,0-1,5 мас. % трийодтирозинов (RU 2700444 C1).

Однако, известные способы имеют недостатки в виде конструктивно сложного процесса ферментативного синтеза иммобилизованными ферментами, что приводит к высокой себестоимости конечного продукта при использовании сравнительно недорогого исходного сырья.

Известен жесткий способ йодирования казеина однохлористым йодом (ООО «НПК МЕДБИОФАРМ», ТУ 9229-001-48363077-99) в результате которого производят препарат под названием «Йодказеин».

Известные способы производят йодированные белки «Йодказеин» и «Биойод», существенным недостатком которых является следующее: более 4/5 от общего количества йода, присутствующего в препарате «Йодказеин», представлено не йодпроизводными аминокислотами, а неорганическими соединениями йода и сложными эфирами кислородсодержащих кислот - производных положительно заряженного йода. Молочный белок, сильно окисленный в ходе жесткого йодирования, расщепляется панкреатическими протеазами кишечника ощутимо хуже исходного казеина, и всего около 1/15 от исходного количества йода в этом препарате освобождается в ходе протеолиза в виде йодированных ди- и трипептидов (с м.в. 0-500 Да), пригодных для усвоения энтероцитами – эпителиальными клетками кишечника («Проведение качественных и количественных анализов образцов йодированных белков «Биойод» производства ООО «Техновита» и «Йодказеин» производства ООО «Медбиофарм»». ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ. НЕГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР Центр Высоких Технологий "ХимРар", М., 2011. https://refdb.ru/look/2793682-pall.html).

Серьезный недостаток данных йодированных белков состоит в их полной нерастворимости (или крайне низкой растворимости) в воде: эта особенность сильно затрудняет технологическое использование йодированных белков с целью обогащения продуктов пищевых производств данным микроэлементом.

Известен способ получения йодированного пищевого продукта, который использует дийодтирозин в свободном или связанном в составе белковой молекулы состоянии для профилактики йодного дефицита в питании обогащенными им пищевыми продуктами (RU 2134520 C1). Изобретение рассматривает дийодтирозин или его связанную форму в составе натуральных белков в качестве химически устойчивого соединения, заменяющего нестабильные неорганические соединения йодида.

Известна «Биологически активная добавка к пище для профилактики йодной недостаточности и оптимизации йодного обмена, и пищевой продукт, ее содержащий» (RU 2192150 C1). Достоинство изобретения заключается в предложении использовать в качестве йодсодержащих нутриентов химические соединения разных классов, содержащих йод в ковалентно связанной форме, в том числе и соединений, йодированных по 3- или 5- положениях фенольного цикла, таких как монойодтирозин, дийотирозин в свободном состоянии, или в составе белковых, пептидных молекул. Основная особенность этих соединений состоит в их доступности ферментативному дейодированию с высвобождением йодида, предназначенного для обеспечения потребности щитовидной железы в тиреоидном гормональном синтезе. Как йодсодержащие нутриенты эти соединения имеют безусловное преимущество перед химически нестабильными неорганическими йодидными солями.

Известен «Способ профилактики поражения радионуклидами йода и оптимизации йодного обмена в постпрофилактический период» (RU 2323733 C2), а также «Способ и препарат для профилактики поражения радионуклидами йода организма человека или животного» (RU 2796757 C1), в которых предлагается использование в качестве профилактических препаратов белков растительного или животного происхождения, содержащих 4-гидрокси, 3-, 5-дийодфенильное соединение двукратно в сутки с 10-14-часовым интервалом.

Однако в известных способах не предполагается конкретного продукта и представлен лишь перечень возможного сырья для его создания. Также существенным недостатком является предложение использовать белки, содержащие ковалентно связанный йод в 5-ом и 3-м или в 3-м положении фенольного цикла. Известно, что широкий спектр высокомолекулярных соединений, особенно в составе «смесей» (как указано в вышеупомянутых патентах), является разнородным материалом, который чрезвычайно трудно стандартизировать для последующего получения стандартизированного продукта, способного выступать эффективным средством профилактики радиационного поражения.

Казеины, кислотный и сычужный, являются сухими концентратами пищевой либо технической категории качества, выпускающиеся в виде гранулированных или мелкодисперсных порошков.

Принцип их выделения основан на нарушении коллоидной стабильности мицелл казеина, обусловленной наличием на поверхности мицелл «волоскового» слоя гидрофильных макропептидных остатков κ-казеина, препятствующих их сферическому сближению. В процессе преципитации помимо мономерных денатурированных молекул образуются комплексы белковых молекул, включающие димерные, тримерные и более сложные формы, что в конечном итоге обуславливает присутствие в конечном продукте частиц разного размера. Технологии получения таких традиционных белковых ингредиентов (казеины, казеинаты, копреципитаты) не обеспечивают сохранение их нативных свойств, главным из которых является растворимость, обуславливающая высокую биодоступность и усваиваемость в желудочно-кишечном тракте человека.

При получении мицеллярных казеинов используются ультрафильтрационные мембраны, размер пор которых обеспечивает удержание практически всех белков молока, при максимальном удалении небелковых компонентов. Используя мембраны разного размера, можно получать мицеллярные казеины с заданными физико-химическими свойствами, такими как растворимость, жиро- и влагоудерживание, эмульгирование, а также выполнять ряд технологических функций в пищевых системах (Kumar P, Sharma N, Ranjan R, Kumar S, Bhat ZF, Jeong DK. Perspective of membrane technology in dairy industry: A review. Asian-Australasian Journal of Animal Science. 2013;26(9):1347–1358. https://doi.org/10.5713/ajas.2013.13082).

Задачей изобретения является разработка способа получения йодированного мицеллярного казеина с высоким выходом и качеством целевого продукта, пригодного для производства биологически активных добавок и фармакологических препаратов.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении йодированного мицеллярного казеина и создании продуктов на его основе для профилактики йодной недостаточности и оптимизации йодного обмена и для профилактики и защиты от радиационного поражения, обладающих терапевтическим и профилактическим эффектом и неизменностью состава при длительном хранении.

 Поставленная задача была решена путем создания способа получения йодированного мицеллярного казеина, подходящего для применения в составах фармакологических и ветеринарных препаратов, биологически активных добавок и радиопротекторных препаратов, включающий прибавление к водному раствору мицеллярного казеина кристаллического калия йодида при соотношении 1:7 – 1:9, выдерживание смеси в течение 5-10 минут, добавление к смеси кристаллического калия надсернокислого при его соотношении к массе мицеллярного казеина 1:8 – 1:12, последующее выдерживание смеси в течение 4-8 часов при температуре 18-25 ℃ и рН 6,5–8,9 при непрерывном контроле содержания молекулярного йода в растворе и периодическом прибавлении порций кристаллического калия надсернокислого при его соотношении к массе мицеллярного казеина 1:12 – 1:24 для продолжения реакции йодирования, очищение полученного водного раствора йодированного мицеллярного казеина от оставшихся неорганических солей микрофильтрацией и диафильтрацией, с последующей стерилизующей микрофильтрацией, сублимационной или распылительной сушкой.

Используемый в предложенном способе мицеллярный казеин по своим физико-химическим свойствам превосходит сычужный казеин и все виды смесей белков животного и растительного происхождения – яичный альбумин, молочные или сывороточные белки, гемоглобины, соевый белок, дрожжевые белки и гидролизат дрожжей. Это связано с тем, что молекулы мицеллярного казеина однородны по размеру и обладают растворимостью, близкой к 100 %.

Таблица. Некоторые физико-химические свойства белков, включая фракцию мицеллярного казеина (по данным собственных исследований).

Белки Растворимость в воде сухого гранулята, в мг на 1000 мл Размер частиц в сухом веществе, мкм Яичные белки 380±50 80-800 Молочные белки 1000±180 5-90 Дрожжевые белки 550±120 5-150 Соевые белки 150±80 10-300 Мицеллярный казеин 20000±1000 80-90

Этим обусловлена и высокая эффективность йодированного мицеллярного казеина, полученного предложенным способом, поскольку мицеллярный казеин обладает растворимостью, близкой к 100 % и сохраненными нативными свойствами белка, что обеспечивает возможность проведения «мягкого йодирования», при значениях рН раствора, сохраняющих нативную структура белка. Сохранность нативной структуры белка обеспечивают и выбранные диапазоны концентраций реагентов, дробность и порядок их внесения, что позволяет избежать воздействия экстремальных концентраций высокоактивных веществ на белок.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

К водному 5-10 % раствору мицеллярного казеина прибавляют необходимое количество кристаллического калия йодида, перемешивают и выдерживают смесь в течение 5-10 минут. Далее добавляют кристаллический калий надсернокислый в соотношении к мицеллярного казеина 1:8 – 1:12 и выдерживают смесь еще 4-8 часов. Непрерывно осуществляют контроль содержания молекулярного йода в растворе и для продолжения реакции йодирования периодически прибавляют порции кристаллического калия надсернокислого. Йодирование осуществляют при температуре 18-25 ℃, в диапазоне значений рН 6,5–8,9 при постоянном контроле рН и поддержания необходимого значение титрованием.

Водный раствор мицеллярного казеина с ковалентно связанным йодом очищают от оставшихся неорганических солей, используя микрофильтрацию с последующей диафильтрацией водного раствора. Полученный раствор йодированного мицеллярного казеина подвергают стерилизующей микрофильтрации, затем сублимационной или распылительной сушке с получением готового порошкового продукта с содержанием ковалентно связанного йода в количестве 4-10 %.

В результате осуществления способа получают продукт с содержанием детерминированного ковалентно связанного йода в количестве 4-10 % в форме мономеров йодированных аминокислот. Йод ковалентно связан в 5- и 3- или только в 3-м положении фенольного группы тирозинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина, а также во 2-, 2- и 5-, а также 1-, 2- и 5-положениях гистидинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина.

Экспериментальные исследования предложенного способа изготовления йодированного мицеллярного казеина для применения в составах фармакологических и ветеринарных препаратов, а также биологически активных добавок показали его высокую эффективность. Это подтвердили эксперименты, проведенные на животных.

Реализация предложенного способа иллюстрируется следующими практическими примерами:

Пример 1.

Выполняли процесс йодирования предварительно подготовленного раствора мицеллярного казеина прибавлением к нему кристаллического калия йодида при соотношении его к общему белку 1:7, затем выдерживали смесь 5 минут. Далее внесли кристаллический калий надсернокислый в соотношении к массе белка 1:8 и выдерживали смесь 6 часов при непрерывном контроле содержания молекулярного йода в растворе, прибавляя порции кристаллического калия надсернокислого через 1,5 часа после начала йодирования в количестве ½ от начального, через 3 часа после начала йодирования в количестве ½ от начального, через 5 часов после начала йодирования в количестве ¼ от начального. Процесс осуществляли при температуре 18 ℃, в диапазоне значений рН 6,5–7,2 при постоянном контроле рН и поддержании необходимого значение титрованием.

Водный раствор йодированного мицеллярного казеина очистили от макропримесей и микропримесей, в том числе и от неорганического йода, с использованием макрофильтрации с последующей диафильтрацией водного раствора на ультрафильтрационной установке на микрофильтрационных мембранах с размером пор 0,1 мкм. Полученный раствор йодированного мицеллярного казеина подвергли сублимационной сушке с получением готового порошкового продукта с содержанием детерминированного количества ковалентно связанного йода в количестве 8 % в форме содержащихся в йодированных белках смеси йодированных аминокислот. Йод ковалентно связан в 5- и 3- или только в 3-м положении фенольного группы тирозинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина, а также во 2-, 2- и 5-, а также 1-, 2- и 5-положениях гистидинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина.

Пример 2.

Выполняли процесс йодирования предварительно подготовленного раствора мицеллярного казеина прибавлением к нему кристаллического калия йодида при соотношении его к общему белку 1:9, затем выдерживали смесь 5 минут. Далее внесли кристаллический калий надсернокислый в соотношении к массе белка 1:12 и выдерживали смесь 8 часов при непрерывном контроле содержания молекулярного йода в растворе, прибавляя порции кристаллического калия надсернокислого через 1,5 часа после начала йодирования в количестве ½ от начального, через 3 часа после начала йодирования в количестве ½ от начального, через 4,5 часа после начала йодирования в количестве ¼ от начального и через 6,5 часов после начала йодирования в количестве ¼. Процесс осуществляли при температуре 25 ℃, в диапазоне значений рН 7,2–7,9 при постоянном контроле рН и поддержании необходимого значение титрованием.

Водный раствор йодированного мицеллярного казеина очистили от макропримесей и микропримесей, в том числе и от неорганического йода, с использованием макрофильтрации с последующей диафильтрацией водного раствора на ультрафильтрационной установке на микрофильтрационных мембранах с размером пор 0,1 мкм. Полученный раствор йодированного мицеллярного казеина подвергли сублимационной сушке с получением готового порошкового продукта с содержанием детерминированного количества ковалентно связанного йода в количестве 7 % в форме содержащихся в йодированных белках смеси йодированных аминокислот. Йод ковалентно связан в 5- и 3- или только в 3-м положении фенольного группы тирозинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина, а также во 2-, 2- и 5-, а также 1-, 2- и 5-положениях гистидинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина.

Пример 3.

Выполняли процесс йодирования предварительно подготовленного раствора мицеллярного казеина прибавлением к нему кристаллического калия йодида при соотношении его к общему белку 1:6, затем выдерживали смесь 5 минут. Далее внесли кристаллический калий надсернокислый в соотношении к массе белка 1:7 и выдерживали смесь 4 часа при непрерывном контроле содержания молекулярного йода в растворе, прибавляя порции кристаллического калия надсернокислого через 1 час после начала йодирования в количестве ½ от начального, через 2 часа после начала йодирования в количестве ½ от начального, через 3 часа после начала йодирования в количестве ½. Процесс осуществляли при температуре 25 ℃, в диапазоне значений рН 8,0–8,9 при постоянном контроле рН и поддержании необходимого значение титрованием.

Водный раствор йодированного мицеллярного казеина очистили от макропримесей и микропримесей, в том числе и от неорганического йода, с использованием макрофильтрации с последующей диафильтрацией водного раствора на ультрафильтрационной установке на микрофильтрационных мембранах с размером пор 0,1 мкм. Полученный раствор йодированного мицеллярного казеина подвергли сублимационной сушке с получением готового порошкового продукта с содержанием детерминированного количества ковалентно связанного йода в количестве 8 % в форме содержащихся в йодированных белках смеси йодированных аминокислот. Йод ковалентно связан в 5- и 3- или только в 3-м положении фенольного группы тирозинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина, а также во 2-, 2- и 5-, а также 1-, 2- и 5-положениях гистидинильных мономеров, входящий в состав мицеллярного казеина.

Очищенный йодированный мицеллярный казеин применяют для получения фармацевтических и ветеринарных композиций, используемых в случаях профилактики йодной недостаточности и профилактики и защиты от радиационного поражения.

Для производства композиций, в частности биологически активных добавок (БАД), для профилактики йодной недостаточности и профилактики радиоактивного заражения предлагаются как моноформы йодированного мицеллярного казеина, так и его комбинации с другими физиологически активными веществами, обеспечивающие индивидуальный подход к профилактике заболеваний, связанных с нарушениями йодного обмена, выполненные в виде или капсул, или таблеток, или порошков, или растворов или входить в состав витаминно-минеральных комплексов.

Полученные на основе йодированного мицеллярного казеина препараты обладают хорошей водорастворимостью и неизменностью содержания ковалентно связанного йода в ходе хранения.

Таблица 1. Показатели содержания йода в йодированном мицеллярном казеине (ЙМК) во время хранения.

Препарат Содержание йода, в процентах от начального Через 2 месяца Через 3 месяца Через 4 месяца Через 5 месяцев Через 6 месяцев ЙМК с начальным содержанием йода 8 % 100 100 100 100 100 ЙМК с начальным содержанием йода 6 % 100 100 100 100 100 ЙМК с начальным содержанием йода 5 % 100 100 100 100 100

Для доказательства эффективности препаратов с йодированным мицеллярным казеином были проведены биологические эксперименты в соответствии с рекомендациями МУК 2.3,2.721 "Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище". Эксперимент проводили на самцах крыс линии Вистар массой 200 г, n=8-10 в каждой группе.

Учитывая патогенетические механизмы развития гипотиреоза, для экспериментального моделирования его основных симптомов была создана модель гипотиреоза. Для этого использовали препарат мерказолил, который ускоряет выведение йодидов из щитовидной железы, ингибирует пероксидазу и угнетает процессы йодирования тирозина с образованием тиреоидных гормонов, в дозировке 25 мг/кг массы животного.

В эксперименте определяли концентрацию тиреоидных гормонов в сыворотке крови опытных животных на фоне гипотериоза и при последующей коррекции препаратом йодированного мицеллярного казеина и препарата сравнения – йодида калия. Концентрация йода рассчитывалась на массу животного, и она соответствовала рекомендованной ВОЗ дозировке для человека – 200 мкг йода. Уровень гормонов определяли методом иммуноферментного анализа.

Хроническое введение мерказолила крысам в течение 2 недель вызывало снижение концентрации тироксина и трийодтиронина в 2 раза, при этом уровень тиреотропного гормона повышался в 2 раза (таблице 2).

Таблица 2.

группа Концентрация гормонов в сыворотке крови Т-4, нмоль/л Т-3, нмоль/л ТТГ, мкМЕ/мл интактная 110,2±10,1 1,5±0,05 0,69±0,02 мерказолил, 25 мг/кг, 14 дней 54,77±3,8 0,75±0,02 1,41±0,03 йодированный мицеллярный казеин, 4 мкг/кг 14 дней перорально после модели гипотиреоза 109,98±10,1 1,43±0,4 0,66±0,02 KI-200 4 мкг/кг 14 дней перорально после модели гипотиреоза 79,4±5,8 1,16±0,03 0,92±0,03

Примечание: р <0,01 (ошибка определения среднего).

При действии препарата йодированного мицеллярного казеина уровень гормонов уровень тироксина составил 99,8 %, трийодтиронина – 95,5 %, тиреотропного гормона – 95,2 % от уровня концентрации гормонов в интактной группе животных.

Применение для коррекции экспериментального гипотиреоза препаратом KI-200 снизило концентрацию тиреотропного гормона на 35 % и увеличило концентрации тироксина на 55 % и трийодтиронина на 45 % по сравнению с группой экспериментального гипотиреоза.

Таким образом, экспериментальные данные показывают, что йодированный мицеллярный казеин полностью устраняет последствия гипотиреоза и гораздо более эффективен по сравнению с KI.

Изобретение относится к области медицины и пищевой промышленности, а именно к способу получения йодированного мицеллярного казеина, подходящего для применения в составах фармакологических и ветеринарных препаратов, биологически активных добавок и радиопротекторных препаратов. Способ получения йодированного мицеллярного казеина включает прибавление к водному раствору мицеллярного казеина кристаллического калия йодида при соотношении 1:7-1:9, выдерживание смеси в течение 5-10 минут, добавление к смеси кристаллического калия надсернокислого при его соотношении к массе мицеллярного казеина 1:8-1:12, последующее выдерживание смеси в течение 4-8 часов при температуре 18-25°С и рН 6,5-8,9 при непрерывном контроле содержания молекулярного йода в растворе и периодическом прибавлении порций кристаллического калия надсернокислого при его соотношении к массе мицеллярного казеина 1:12 - 1:24 для продолжения реакции йодирования, очищение полученного водного раствора йодированного мицеллярного казеина от оставшихся неорганических солей микрофильтрацией и диафильтрацией с последующей стерилизующей микрофильтрацией, сублимационной или распылительной сушкой. Указанное изобретение позволяет получить йодированный мицеллярный казеин и создать продукты на его основе для профилактики йодной недостаточности, оптимизации йодного обмена и для профилактики и защиты от радиационного поражения, обладающие терапевтическим и профилактическим эффектом и неизменностью состава при длительном хранении. 3 табл., 3 пр.

Способ получения йодированного мицеллярного казеина, подходящего для применения в составах фармакологических и ветеринарных препаратов, биологически активных добавок и радиопротекторных препаратов, включающий прибавление к водному раствору мицеллярного казеина кристаллического калия йодида при соотношении 1:7-1:9, выдерживание смеси в течение 5-10 минут, добавление к смеси кристаллического калия надсернокислого при его соотношении к массе мицеллярного казеина 1:8-1:12, последующее выдерживание смеси в течение 4-8 часов при температуре 18-25°С и рН 6,5-8,9 при непрерывном контроле содержания молекулярного йода в растворе и периодическом прибавлении порций кристаллического калия надсернокислого при его соотношении к массе мицеллярного казеина 1:12-1:24 для продолжения реакции йодирования, очищение полученного водного раствора йодированного мицеллярного казеина от оставшихся неорганических солей микрофильтрацией и диафильтрацией с последующей стерилизующей микрофильтрацией, сублимационной или распылительной сушкой.