Способ определения упругости эритроцитов при гипергликемии в цельной крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N29/24 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть применяться для определения упругости эритроцитов в цельной крови при гипергликемии с целью оценки тяжести этих состояний, в частности при сахарном диабете и атеросклерозе.

Используемые в настоящее время методы определения упругости эритроцитов (методы определения модуля упругости Юнга) обладают рядом существенных недостатков, общими из которых являются:

- недостаточная точность и длительное время проведения анализа,

- зависимость результатов от качества используемых реактивов и сложности подготовительных операций к проведению анализа,

- подверженность эритроцитов к воздействию реактивов, которые могут изменять их упругость

- чувствительность существующих методов к температуре.

При исследовании реологических свойств эритроцитов рассматривается исследование деформируемости эритроцитов или ее обратной величины упругости (модуль упругости Юнга).

Понимание состояний реологических свойств крови является важнейшим компонентом оценки микроциркуляции пациента и представляет собой непростую задачу. Действительно, особенности реологического поведения крови человека обуславливает состояние его обмена на уровне микроциркуляции

Известен способ механической фильтрации для оценки деформируемости эритроцитов (т.е. величины обратной упругости) с использованием нуклеопористых мембран. Нормальные диапазоны рассчитываются у молодых субъектов. Среднее время фильтрации определяется при 5 фильтрациях для каждого субъекта. Скорость фильтрации выражают в сек/мл и соотносят с гематокритом. Этот метод сложно использовать при выполнении быстрых исследований для пациентов (время выполнения до 80 минут на образец).

Способ - прототип атомно-силовая микроскопия (АСМ). Этот способ используется для количественной оценки упругих свойств поверхности эритроцитов. Эритроциты имеют форму двояковогнутого диска с диаметром 7,2-7,5 мкм. Способность эритроцитов к деформации является важнейшим реологическим феноменом, позволяющим данным клеткам доставлять необходимые для жизнедеятельности организма вещества по сосудистой системе, включающей капилляры, диаметр которых достигает 2 мкм.

Способ оценки упругих свойств эритроцитов с помощью АСМ заключается в измерении их способности противостоять внедрению с заданной нагрузкой жесткого индикатора. Для проведения исследования используется цельная венозная кровь, предварительно стабилизированная КЗ ЭДТА, затем кровь фиксируется в пробирке, с 1.5% раствором глутарового альдегида, после чего эритроциты отделяют от плазмы путем центрифугирования в течение 3 мин, при 1500 об/мин. Полученный эритроцитарный осадок трехкратно отмывают от фиксатора в буферном растворе, а затем трижды промывают в дистиллированной воде. После чего эритроциты наносят на предметные стекла размером 10×10 мм² и высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Исследование упругих свойств эритроцитов осуществляют при помощи комплекса, соответствующего функции, сканирующей зондовой и оптической микроскопии.

Однако имеются существенные методологические сложности в определении упругости эритроцитов методом АСМ. Измеряемые значения модуля упругости зависят от скорости движения зонда при нагружении на эритроцит и времени нахождения зонда в контакте с эритроцитом.

Кроме того, необходимо учитывать толщину эритроцитов в точке идентирования. Поэтому при исследовании упругих свойств эритроцитов важен выбор области внедрения зонда, поскольку толщина эритроцита на периферии значительно превосходит толщину центральной части эритроцита (в центральной части 0.5 мкм, в периферии 2.0 мкм)

Для оценки упругих свойств эритроцитов используется метод статической силовой спектроскопии. Суть метода состоит в реализации контактного деформирования образца (эритроцита) острием зонда и в измерении зависимости силы взаимодействия зонда с поверхностью эритроцита (образца) от расстояния между ними.

При реализации процедуры статической силовой спектроскопии консоль зонда не совершает вынужденных колебаний, а занимает статическое положение в точке закрепления. Помимо этого, результат определения модуля упругости зависит от влияния жесткой подложки на величину оцениваемого модуля упругости.

Задачей изобретения является создание более точного и информативного способа определения в цельной крови упругости эритроцитов при гипергликемии.

Сущность изобретения состоит в том, что способ определения упругости эритроцитов в цельной крови пациентов характеризуется тем, что для проведения исследования используется цельная венозная кровь, предварительно стабилизированная КЗ ЭДТА и плазма крови, получаемая в результате центрифугирования цельной крови в течение 5 мин при 3000 об/мин.

Упругость эритроцитов исследуют методом ультразвуковой (акустической) интерферометрии.

Скорость распространения V продольных волн в жидкой среде определяется упругими свойствами среды ее средней плотностью р и объемным модулем упругости Е

V=(Е/р)1/2

Акустические измерения проводятся на устройстве, содержащем две акустические ячейки №1 и №2, термостатируемые с помощью специального ультратермостата. Резонансные частоты акустических ячеек линейно связаны со скоростью ультразвука в исследуемой среде. Калибратором для проведения исследований является дистиллированная вода, которая помещается в акустические ячейки №1 и №2. В термостатируемых ячейках поддерживается строго заданная температура из диапазона (15-40)°С. С высокочастотного генератора, управляемого компьютером, на пьезоизлучатели акустических ячеек подается частота в диапазоне от 5 до 15 МГц. Электрический сигнал преобразуется на пьезоизлучателе в ультразвуковой, который распространяется в дистиллированной воде, находящейся в акустических ячейках. Пьезоприемник преобразует ультразвуковой сигнал на выходе в высокочастотный электрический. Продетектированный сигнал с выхода высокочастотного микровольметра поступает на вольтметр постоянного тока, управляемого компьютером. В результате обработки данных, получаемых с пъезоприемника акустических ячеек, в памяти компьютера фиксируется центральные частоты всех резонансных пиков в выбранном диапазоне частот для дистиллированной воды. Затем в акустические ячейки помещают исследуемые среды, а памяти компьютера фиксируется центральная частота всех резонансных пиков для исследуемых сред. Компьютер вычисляет среднюю разность частотного расстояния между резонансными пиками и номер j выбранного резонансного пика по формуле:

где j - порядковый номер выбранного резонансного пика;

N - число частотных расстояний между резонансными пиками в данном частотном диапазоне;

fj - резонансная частота j резонансного пика;

fj+1- резонансная частота j+1 резонансного пика.

На основании определения акустических параметров цельной крови (АкП цельной крови), плазмы (АкП плазмы) и количества эритроцитов RBC рассчитывается упругость эритроцитов по формуле:

где АкП - акустический параметр:

где (АкП) цельной крови - акустический параметр цельной крови;

(АкП) плазмы - акустический параметр плазмы крови;

RBC - количество эритроцитов в исследуемом образце цельной крови.

Технический результат достигается за счет того, что авторы впервые применили для определения упругости эритроцитов при гипергликемии измерение акустических параметров цельной крови и плазмы крови.

Способ обладает высокой быстротой выполнения, точностью и информативностью, поскольку позволяет определять упругость эритроцитов без какого-либо воздействия на эритроциты реагентами, а только благодаря высокоточному определению акустического параметра цельной крови и плазмы крови. Акустический способ позволяет проводить определение упругости эритроцитов значительно быстрее, акустический способ позволяет выполнить определение упругости эритроцитов за 60 сек, а пробоподготовку за 5 мин.

Ближайший аналог, в частности, проведение измерений на атомно-силовом микроскопе в расчете на одно измерение длится 30 минут, пробоподготовка суспензии эритроцитов по длительности занимает 1,5 часа. Кроме того, при использовании АСМ метода применяется ядовитый реактив, оказывающий вредное влияние на исследователя.

Предлагаемый в изобретении способ осуществляется следующим образом.

У пациента из локтевой вены забирают 5 мл крови в пробирку с антикоагулянтом, (например, с КЗ ЭДТА), 2.5 мл крови центрифугируются в течение 5 мин при 3000 об/мин для получения плазмы крови. Из 2,5 мл цельной крови забирают 0.5 мл цельной крови для подсчета количества эритроцитов камере Горяева.

В две акустические ячейки №1 и №2, термостатируемые с помощью специального ультратермостата для калибровки заливают дистиллированную воду, температура строго задана из диапазона (15-40)°С.

Затем в акустическую ячейку №2 заливают плазму крови, а в акустическую ячейку №1 после тщательного перемешивания цельную кровь. Среды термостатируются в течение 40 сек. На ячейки подается ультразвук в диапазоне 5-15 МГц, в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков в диапазоне частот 5-15 МГц. Компьютер вычисляет среднюю разность частотного расстояния между резонансными пиками и номер выбранного резонансного пика по формуле:

где j порядковый номер выбранного резонансного пика;

N число частотных расстояний между резонансными пиками в диапазоне частот 5-15 МГц;

fj -резонансная частота j -го резонансного пика;

fj+1 резонансная частота j+1 резонансного пика.

Затем из акустических ячеек удаляют дистиллированную воду и в акустическую ячейку №2 заливают плазму крови, а в акустическую ячейку №1 после тщательного перемешивания заливают цельную кровь. На ячейки подается ультразвук в диапазоне 5-15 МГц, в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков в диапазоне частот 5-15 МГц для цельной крови и плазмы крови.

Затем выбирают значение центральных частот резонансных пиков одного и того же номера для дистиллированной воды, плазмы крови и цельной крови и вычисляют соответствующие скорости ультразвука по формулам (3, 4):

где V(^H2O)^1,2 - скорость ультразвука в дистиллированной воде в устройствах №1 и №2;

f_j^(H2O)¹². центральные частоты резонансных пиков номера j для дистиллированной воды в устройствах №1 и №2;

2j^(H2O)1,2 - продольные волновые числа в устройствах №1 и №2 с дистиллированной водой;

R - радиус устройства для контроля биосред.

где V(S)1,2 - скорость ультразвука в цельной крови в устройстве №1 и в плазме крови в устройстве №2

f_j^(S)1,2 - центральные частоты резонансных пиков номера j для цельной крови крови в устройстве №1 и в плазме крови в устройстве №2;

Z^j(S)1,2 - продольные волновые числа в цельной крови устройстве №1 и в плазме крови в устройстве №2;

R - радиус устройства для контроля биосред.

На основании вычисленных (АкП) цельной крови, (АкП) плазмы и полученных при подсчете в камере Горяева количества эритроцитов, рассчитывают упругость эритроцитов по формуле:

G=(АкП цельной крови-АкП плазмы) / RBC,

где АкП - акустический параметр:

АкП=(Vобразца - VH2O) * 1000 /VH2O

где (АкП) цельной крови акустический параметр цельной крови;

(АкП) плазмы акустический параметр плазмы крови;

RBC количество эритроцитов в исследуемом образце цельной крови.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к способу определения упругости эритроцитов при гипергликемии в цельной крови. В способе у пациента забирают цельную кровь в пробирку с антикоагулянтом, первую часть цельной крови центрифугируют для получения плазмы крови, из второй части цельной крови забирают часть цельной крови для подсчета количества эритроцитов в камере Горяева, в две акустические ячейки заливают дистиллированную воду для калибровки, температуру задают 15-40°С. На две акустические ячейки подают ультразвук в диапазоне 5-15 МГц. В памяти компьютера фиксируют центральные частоты всех резонансных пиков в диапазоне частот 5-15 МГц, компьютер вычисляет среднюю разность частотного расстояния между резонансными пиками и номер выбранного резонансного пика по формуле

где j - порядковый номер выбранного резонансного пика; N - число частотных расстояний между резонансными пиками в диапазоне частот 5-15 МГц; f_j - резонансная частота j-го резонансного пика; f_j+1 - резонансная частота j+1 резонансного пика, затем из акустических ячеек удаляют дистиллированную воду и в первую акустическую ячейку после перемешивания заливают цельную кровь, а во вторую акустическую ячейку заливают плазму крови. На акустические ячейки подают ультразвук в диапазоне 5-15 МГц, в памяти компьютера фиксируют центральные частоты всех резонансных пиков в диапазоне частот 5-15 МГц для цельной крови и плазмы крови. Затем выбирают значение центральных частот резонансных пиков одного и того же номера для дистиллированной воды, плазмы крови и цельной крови и вычисляют скорости ультразвука дистиллированной воды, плазмы крови и цельной крови по формулам

где V^(H2O)1,2 - скорость ультразвука в дистиллированной воде в акустических ячейках; f_j^(H2O)1,2 - центральные частоты резонансных пиков номера j для дистиллированной воды в акустических ячейках; Z_j(H2O)1,2 - продольные волновые числа в акустических ячейках с дистиллированной водой; R - радиус акустических ячеек,

где V^(S)1,2 - скорость ультразвука в цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке; f_j^(S)1,2 - центральные частоты резонансных пиков номера j для цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке; Z_j(S)1,2 - продольные волновые числа в цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке; R - радиус акустических ячеек, на основании полученных скоростей ультразвука в цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке вычисляют акустический параметр цельной крови (АкП цельной крови) по формуле

АкП цельной крови = (V цельной крови - V_H2O) * 1000/V_H2O,

где V цельной крови - скорость ультразвука в цельной крови в первой акустической ячейке, V_H2O - скорость ультразвука в дистиллированной воде в первой акустической ячейке; и вычисляют акустический параметр плазмы крови (АкП плазмы крови) по формуле

АкП плазмы крови=(V плазмы крови - V_H2O) *1000 /V_H2O,

где V плазмы крови - скорость ультразвука в плазме крови во второй акустической ячейке; V_H2O - скорость ультразвука в дистиллированной воде во второй акустической ячейке, на основании вычисленных АкП цельной крови, АкП плазмы крови и полученных при подсчете в камере Горяева количеств эритроцитов в цельной крови рассчитывают упругость эритроцитов по формуле

G=(АкП цельной крови - АкП плазмы крови)/RBC, где RBC - количество эритроцитов в цельной крови. Техническим результатом является создание более точного и информативного способа определения в цельной крови упругости эритроцитов при гипергликемии.

Способ определения упругости эритроцитов при гипергликемии в цельной крови, характеризующийся тем, что у пациента забирают цельную кровь в пробирку с антикоагулянтом, первую часть цельной крови центрифугируют для получения плазмы крови, из второй части цельной крови забирают часть цельной крови для подсчета количества эритроцитов в камере Горяева, в две акустические ячейки заливают дистиллированную воду для калибровки, температуру задают 15-40°С, на две акустические ячейки подают ультразвук в диапазоне 5-15 МГц, в памяти компьютера фиксируют центральные частоты всех резонансных пиков в диапазоне частот 5-15 МГц, компьютер вычисляет среднюю разность частотного расстояния между резонансными пиками и номер выбранного резонансного пика по формуле

где j - порядковый номер выбранного резонансного пика;

N - число частотных расстояний между резонансными пиками в диапазоне частот 5-15 МГц;

f_j - резонансная частота j-го резонансного пика;

f_j+1 - резонансная частота j+1 резонансного пика,

затем из акустических ячеек удаляют дистиллированную воду и в первую акустическую ячейку после перемешивания заливают цельную кровь, а во вторую акустическую ячейку заливают плазму крови, на акустические ячейки подают ультразвук в диапазоне 5-15 МГц, в памяти компьютера фиксируют центральные частоты всех резонансных пиков в диапазоне частот 5-15 МГц для цельной крови и плазмы крови, затем выбирают значение центральных частот резонансных пиков одного и того же номера для дистиллированной воды, плазмы крови и цельной крови и вычисляют скорости ультразвука дистиллированной воды, плазмы крови и цельной крови по формулам

где V^(H2O)1,2 - скорость ультразвука в дистиллированной воде в акустических ячейках;

f_j(H2O)1,2 - центральные частоты резонансных пиков номера j для дистиллированной воды в акустических ячейках;

Z_j(H2O)1,2 - продольные волновые числа в акустических ячейках с дистиллированной водой;

R - радиус акустических ячеек,

где V_(S)1,2 - скорость ультразвука в цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке;

f_j(S)1,2 - центральные частоты резонансных пиков номера j для цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке;

Z_j(S)1,2 - продольные волновые числа в цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке;

R - радиус акустических ячеек,

на основании полученных скоростей ультразвука в цельной крови в первой акустической ячейке и в плазме крови во второй акустической ячейке вычисляют акустический параметр цельной крови (АкП цельной крови), по формуле:

АкП цельной крови = (V цельной крови - V_H2O)*1000/V_H2O, где

V цельной крови - скорость ультразвука в цельной крови в первой акустической ячейке, V_H2O - скорость ультразвука в дистиллированной воде в первой акустической ячейке;

и вычисляют акустический параметр плазмы крови (АкП плазмы крови) по формуле

АкП плазмы крови=(V плазмы крови - V_H2O) *1000/V_H2O,

где V плазмы крови - скорость ультразвука в плазме крови во второй акустической ячейке;

V_H2O - скорость ультразвука в дистиллированной воде во второй акустической ячейке,

на основании вычисленных АкП цельной крови, АкП плазмы крови и полученных при подсчете в камере Горяева количеств эритроцитов в цельной крови рассчитывают упругость эритроцитов по формуле:

G=(АкП цельной крови - АкП плазмы крови)/RBC, где RBC - количество эритроцитов в цельной крови.