ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР НА ОСНОВЕ ЛИПОСОМ С КУРКУМИНОМ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2024 года по МПК A61K36/9066 A61K6/00 A61P1/02 

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к биологически активным соединениям, содержащим в основе куркуминоид в липосомной форме, которое возможно использовать как фотосенсибилизатор (ФС) для проведения фотодинамической терапии (ФДТ) пациентов с воспалительными заболеваниями слизистой оболочки полости рта, тканей пародонта и заболеваниями, характеризующимися гиперкератозом (лейкоплакия и др.).

В основе метода фотодинамической терапии лежит использование специальных веществ - фотосенсибилизаторов, которые при попадании в организм накапливаются в патологических тканях, и при воздействии на них света с определенной длинной волны активизируются механизмы, оказывающие избирательное цитотоксическое действие. В настоящее время, известны фотосенсибилизаторы для проведения фотодинамической терапии при различных поражениях слизистой оболочки полости рта. В практической деятельности на современном этапе основную группу фотосенсибилизаторов, применяемых аппликационным способом, составляют ФС III поколения па основе хлоринов.

Известен ряд препаратов на основе хлоринов, разрешенных для клинического применения в качестве ФС для проведения ФДТ при различных воспалительных заболеваниях и новообразованиях в челюстно-лицевой области. К ним относятся средство для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний ФС фотофон [RU 2152790 С1 от 20.07.2000, Кл. Л61К 31/409]. Фотосенсибилизатор содержит производное хлорофилла Л (18-карбокси-20-(карбоксиметил)-8-этенил-13- этил-2, 3-дигидро-3,7, 12, 17-тетраметил-21Н,23Н порфин-2-пропионовую кислоту), в дальнейшем - хлорин е6 и его соли, и поливинилпирролидон (ПВП), в лиофилизированной форме. Данный препарат не применяется для лечения воспалительных заболеваний СОПР.

Также на рынке представлен ФС Фотодитазин [RU 2276976 С2, А61К 31/409 от 27.05.2006], который выпускается ООО BETA-ГРАНД. Согласно изобретению препарат содержит хлорин е6 в количестве не менее 98%, N-метил-D-глюкамин в мольном соотношении 1:2 и поливинилпирролидон с молекулярным весом от 9600 до 11500. Как и ранее описанные фотосенсибилизаторы, он направлен на медикаментозное воздействие на различные опухоли по средствам светового воздействия излучением с длиной волны 662±2 им.

Среди ФС для проведения ФДТ запатентован препарат Радахлорин (RU 2183956 C1, А61К 31/79, от 27.06.2002, US Pat 7550587 от 23.06.2009]. Данный фотосенсибилизатор включает щелочные соли хлорина е6, пурпурина 5 и хлорина Р6. Он выпускается фирмой ООО Рада-фарма и в патенте идет указание па его противоопухолевое действие. Однако, имеется запатентованный «способ лечения поверхностно расположенных воспалительных заболеваний парод опта» с использованием [RU 2712035С1, МПК A61N 5/067] геля Радахлорина.

Известен также гель фотосенсибилизатор для ФДТ под названием Ревиксан [RIJ 2568597 С1] и способ его применения в полости рта с помощью специальной каппы [RU 2728108 С1]

Ревиксан является биологически активным соединением хлоринового ряда может быть использован в качестве фотосенсибилизатора (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) рака и других новообразований различного генеза, а также для флюоресцентной диагностики раковых клеток. В настоящий момент указанный ФС также применяют при лечении воспалительных заболеваний полости рта, поскольку описаны его антибактериальные свойства.

Вышеперечисленные фотосенсибилизаторы на основе хлоринов имеют недостаточно выраженный антибактериальный эффект, отсутствует противовоспалительный эффект. Также данные ФС не обладают антигипоксантным (детоксицирующим) и ранозаживляющим эффектом.

Отдельно следует отметить высокую стоимость хлорина, который используется для приготовления ФС.

Куркумин активно применяют в стоматологии при красном плоском лишае, подслизистом фиброзе полости рта и заболеваниях пародонта, включая гингивит. Основными преимуществами данного препарата являются его противовоспалительные свойства, включая ингибирование NF-κВ и подавление провоспалительного фермента циклооксигеназы-2 посредством ингибирования экспрессии генов цитокинов. Препараты на основе куркумина активно исследовались как in vitro, так и в рамках клинических исследований. Опубликованное иностранными авторами исследование показало, что гель на основе куркумина, применяемый в качестве дополнения к нехирургическим методам терапии (SRP-терапии) при лечении пациентов с хроническим катаральный гингивитом, оказался более эффективным, чем гель с хлоргексидином, и может быть эффективно использован для инактивации многовидовых биопленок при проведении антибактериальной ФДТ [Dovigo, L. N., Pavarina, Л. С, Carmello, J. С, Machado, A. L., Burnetii, I. L., & Bagnato, V. S. (2011). Susceptibility of clinical isolates of Candida to photodynamic effects of cm-cumin. Lasers in Surgery and Medicine, 43(9), 927-934. doi:10.1002/lsm.21110].

Особенностью куркумина является то, что он нестабилен при физиологическом рН, имеет низкую растворимость в воде и быстро метаболизируется организмом. В настоящее время существуют разработки новых форм препаратов на основе куркуминоидов, повышающие биодоступность натурального куркумина.

В патенте [RU 2692473 С1, от 10.12.2014 года] описана композиция с модифицированным высвобождением куркумина. Она используется для лечения пациентов с кишечными расстройствами воспалительного, иммунологического и/или системного происхождения. Монолитные фармацевтические композиции включают ядро, содержащее гидроксипропилметилцеллюлозу, где диспергирован куркумин. Однако данный препарат неудобно применять для лечения патологий полости рта в виду плохой сорбции на слизистой и плохой пенитрации.

Технической задачей изобретения является создание эффективного геля-фотосенсибилизатора на основе куркумина для проведения фотодинамической терапии у пациентов с заболеваниями слизистых оболочек полости рта, активирующегося излучением света синего спектра.

Техническим результатом изобретения является повышенная биодоступность фотосенсибилизатора на основе куркумина, обладающего антимикробным действием и выраженным бактериостатическим эффектом.

Технический результат достигается созданием фотосенсибилизатора на основе куркуминоида в липосомной форме для проведения фотодинамической терапии пациентов с заболеваниями слизистых оболочек полости рта.

Для формирования липосом использовали куркуминоид - 1,7-Бис (4 гидрокси-3-метоксифенил)-гепта-1,6-диен-3-5-дион. Для гелевой основы применяли карбопол G-20.

Для получения липосом применили метод скоростного диспергирования гидрофильной и липофильной фаз с мелкодисперсным порошком (патент РФ №2311449С2. 2005). Метод обеспечивает формирование мелких однослойных везикул. Такие свойства и морфология липосом необходимы для быстрой трансдермальной доставки активного вещества в поверхностные и более глубокие слои слизистых оболочек. Мелкие липосомы (50-200 нм) легко распространяются по межклеточному пространству и обеспечивают направленную доставку включенных в них активных соединений. Однослойные липосомы нужны для облегчения процесса слияния с мембранами клеток слизистых оболочек. Предпочтение выбора и использования именно этого метода обусловлено многолетним успешным опытом его применения на практике: более 30 готовых средств производятся и выпускаются отечественными предприятиями и применяются в области гигиены, косметологии, дерматологии, ветеринарии. Именно благодаря липосомам и использованию биоразлагаемых полимеров в качестве гелеобразователей, достигнута высокая эффективность и биобезопасность средства и перевод в водорастворимую форму. Исследования на культурах клеток (макрофагах, фибробластах и др.) выявлены репаративные и пластифицирующие свойства липосом. Инкорпорация специальных активных соединений усиливает эффективность фосфолинидных везикул и обеспечивает применение более низких доз веществ.

Процесс приготовления геля состоит из нескольких этапов.

1. Первый этап - подготовка составляющих активных и вспомогательных компонентов (подготовка водной и жировой фазы).

1.1. Подготовка водной фазы: а) 0,5 г карбопола заливают 60 мл дистиллированной или деминерализованной водой и настаивают 20 мин при комнатной температуре в стеклянном стакане до полного набухания полимера

1.2. Готовят 10% раствор NaOH. В термостакане из стекла 10 г. NaOH заливают 90 гр. Н₂О, дают остыть.

1.3. Подготовка жировой фазы: 1-2 г куркумин смешивают с 10 г лецитина до однородной массы 3-5 минут на гомогенизаторе на малых оборотах (1000 об/мин);

2. Второй э тап - приготовление геля:

2.1. В стакан с набухшим до однородного состояния полимером при перемешивании вводят жировую фазу и гомогенизируют 5-10 минут с интервалами 30 секунд при скорости 6000 об/мин на лабораторном гомогенизаторе FSH-SA со скоростью вращения ротора от 3000 до 20000 оборотов в минуту.

2.2. В полученный желтый раствор вводят раствор щелочи 2 мл (10% раствор NaOH) и перемешивают при скорости 2000 об/мин 1-2 минуты при комнатной температуре.

2.3. Вводят 2 г глицерина, перемешивают 1 мин при скорости 20000 об/мин.

2.4. Вводят эуксил (консервант), перемешивают 30 сек на минимальной скорости.

2.5. Доводят объем деминерализованной водой до 100 мл.

2.6. Измеряют рН готового геля. При необходимости, добавляют р-р щелочи каплями до рН в диапазоне 5.0- 7.4

Перечень фигур:

Фиг. 1 Спектр поглощения препарата в трех относительных концентрациях при разбавлении водой.

Фиг. 2 Автоматическое программируемое культивирование референтного штамма S. aureus при использовании фотосенсибилизирующего воздействия.

Фиг. 3. Ключевые показатели оптической плотности при культивировании референтного штамма S. aureus в комплексе с фотосенсибилизирующим воздействием.

Пример 1. Гель-фотосенсибилизатор следующего состава в мас. %:

Куркумин 1,0 -2,0, Лецитин соевый 10,0, Глицерин 2,0, Эуксил (консервант) 1,0, Карбопол 0,4, Гидрооксид натрия 10% - 0,2, Вода деминерализованная 85,4 -84,4.

Для апробации геля фотосенсибилизатора на основе липосом с куркумином использовались различные физико-химические и биологические методы контроля и стандартизации, которые отражают возможность применения данного геля у пациентов.

Стабильность препарата установили при центрифугировании аликвот образцов. Определение коллоидной стабильности осуществлялась по ГОСТ 29188.3-91 «Изделия косметические. Методы определения стабильности эмульсии» на центрифуге лабораторной медицинской TG16WS при 6 тыс. об/мин в течение 5 минут. Стабильность геля оценивали по количеству выпавшего осадка. Гель фотосенсибилизатор с концентрацией куркумина 1,0% показал стабильность при центрифугировании, выпадение осадка нe определялось. При центрифугировании геля фотосенсибилизатора с концентрацией куркумина 2,0% выпадения осадка также не определялось, препарат стабилен.

Па возможность проникновения липосом в клетку влияет их размер. Оптимальный размер по литературным данным является от 100 до 220 им. Размер полученных липосом определяли с помощью анализатора Malvern Instruments Ltd. (Великобритания), Модель: Zetasizer Nano ZS. В рамках исследования, гель фотосенсибилизатор на основе куркумина как 1,0%, так и 2,0% в липосомах разбавляли в 10 раз бидистиллированной водой. Вне зависимости от концентрации, средний размер частиц составил 157 им. Более высокая степень разбавления (в 50 раз) приводит к тому, что распределение липосом по размерам становится шире и составляет 208,8 им. По полученным результатам можно сделать вывод, что средний размер липосом в геле-фотосенсибилизаторе на основе куркумина как 1,0%, так и 2,0% остается в нанометровом диапазоне.

Определение термостабильности осуществлялась по ГОСТ 29188.3-91 «Изделия косметические. Методы определения стабильности эмульсии». Образцы выдерживали 24 часа и 14 суток при температуре 40°С в инкубаторе BD-53 (BINDER). По результатам исследования стабильности при хранении 40°С образец геля фотосенсибилизатора на основе куркумина 1,0% в липосомах па протяжении 24 часов и 14 суток показал стабильность, выделения водной и масляной фазы не наблюдалось. Образец геля фотосенсибилизатора на основе 2,0% куркумина в липосомах также показал стабильность и отсутствие выделения водной и масляной фазы. Оба образца показали высокую стабильность.

Для определения биологической активности образцов фотосенсибилизатора на основе куркуминоида в липосомах оценивали их детоксицирующее (антигипоксантное) действие. Для этого использовали методику НЛО «ДИОД»: «Определение антигипоксической активности на модели гемической гипоксии методом ультразвуковой допплерографии сосудов хориоалантоисной оболочки куриного эмбриона ex vivo» (Методические рекомендации MP 1.2.0025-11). По результатам исследования образец геля фотосенсибилизатора на основе 1,0% куркумина в липосомах обладает ярко выраженным антигипоксантным (детоксицирующим) эффектом и эквивалентен образцу диметилсульфоксид, который используется в качестве стандартного растворителя водонерастворимых веществ. Образец геля фотосеисибилизатора па основе 2,0% куркумина в липосомах обладает слабым антигипоксантным (детоксицирующим) действием.

Для определения спектральных свойств (спектра поглощения) геля-фотосенсибилизатора на основе куркуминоида в липосомах использовался спектрофотометр Hitachi. Этот метод позволил определить пик поглощения свеч а, при котором происходит активация фотосенсибилизатора. В исследовании использовался препарат в концентрации 1 г/50 г геля. Поглощение препарата было исследовано при его разведении в Н₂О в концентрациях: 0,5, 1, 2 / концентрация 0.5: 0.05 г препарата / 1 мл растворителя; концентрация 1: 0.1 г препарата / 1 мл растворителя; концентрация 2: 0.2 г препарата / 1 мл растворителя). Основной пик поглощения препаратов лежит в синем диапазоне спектра с максимумом в 410-450 им (фиг.1), что позволит проводить как флуоресцентную диагностику, так и последующую фотодинамическую терапию.

Для определения антимикробного действия геля фотосенсибилизатора с куркумином 1,0% и куркумином 2,0% проводили эксперимент при культивировании S. Aureus (Фиг. 1). Культивирование проводилось на питательные среды, время культивирования составило 36 часов. При этом проводилась оценка оптической плотности (OD) на разных этапах эксперимента. Для сравнения антимикробного действия дополнительно взяли образец фотосенсибилизатора на основе Хлорина Е6, для контроля роста бактерий был использован образец с Chlorhexidini bigluconas 0,05%. При культивировании бактериальной популяции с добавлением исследуемого образца Chlorhexidini bigluconas 0,05%, признаков развития бактериальных клеток не выявлено. При анализе значения OD при культивировании S. Aureus с образцами Хлорина Е6, Куркумина 1,0% и Куркумина 2,0% было отмечено, что скорость увеличения показателя оптической плотности пролонгация фазы адаптивного нахождения клеток (до 4 часа культивирования) (Фиг. 2). При этом период ускоренного развития популяции обладал меньшей интенсивностью увеличения значения OD, и переход в экспоненциальное развитие культуры было отсрочен на 4 часа относительно всех ранее описанных образцов. Однако, оценивая скорость увеличения показателя оптической плотности, было отмечено, что по своей тенденции она была сопоставима с образцом куркумин 1,0%, и статистически значимо выше, чем при использовании куркумина 2,0%. Это показывает, что образец с куркумином 2,0% обладает выраженным бактериостатическим эффектом относительно образцов с Хлорином Е6 и образцом в Куркумином 1,0% (Фиг. 3).

В итоге, активными компонентами геля фотосенсибилизатора являются куркумин и лецитин, входящие в жировую фазу. Лецитин амфифильное соединение, поэтому позволяет получить коллоидный раствор куркумина без применения спирта или агрессивных для клеточных мембран поверхностно активных веществ. Мембраны клетки легко взаимодействуют с мембранами липосом и осуществляется трансмембранный перенос активного вещества.

По результатам апробация геля фотосенсибилизатора на основе как 1,0%, так и 2,0% с помощью физико-химических и биологических методов контроля и стандартизации были сделаны выводы о его свойствах. Проведена оценка стабильности препарата при центрифугировании с определением количества выпадения осадка и при длительном термическом воздействии. По их результатам, препарат показал стабильность. Наряду с этим, определен размер полученных липосом, который соответствует оптимальным параметрам. Дополнительно исследовано, что гель-фотосенсибилизатор обладает антигомотоксическим действием. Определен ник поглощения свеча, при котором происходит активация фотосенсибилизатора. Он соответствовал синему диапазону спектра и составил 410-450 нм. Таким образом, можно сделать вывод о том, что гель фотосенсибилизатор на основе куркумина как 1,0%, так и 2,0% не обладает токсичностью и возможен к применению у пациентов. Также был проведен эксперимент по определению антимикробного действия и выявлено, что гель фотосенсибилизатор на основе куркумина в липосомах, особенно в концентрации 2,0%, обладает выраженным бактериостатическим эффектом.

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к фотосенсибилизатору на основе куркуминоида в липосомной форме для проведения фотодинамической терапии пациентов с воспалительными заболеваниями слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта. Фотосенсибилизатор на основе куркуминоида в липосомной форме для проведения фотодинамической терапии пациентов с воспалительными заболеваниями слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта следующего состава в мас.%: куркумин - 2,0-1,0; лецитин соевый - 10; глицерин - 2; эуксил (консервант) - 1; карбопол - 0,4; гидроксид натрия 10% - 0,2; вода деминерализованная - 84,4-85,4. Вышеописанный фотосенсибилизатор обладает повышенной биодоступностью, антимикробным действием и выраженным бактериостатическим эффектом. 3 ил., 1 пр.

Фотосенсибилизатор на основе куркуминоида в липосомной форме для проведения фотодинамической терапии пациентов с воспалительными заболеваниями слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта следующего состава в мас.%:

Куркумин 2,0-1,0 Лецитин соевый 10 Глицерин 2 Эуксил (консервант) 1 Карбопол 0,4 Гидроксид натрия 10% 0,2 Вода деминерализованная 84,4-85,4