Способ создания аналитической метки на основе многослойных халькогенидных квантовых точек, покрытых полимером, с полноразмерными антителами Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 C09K11/08 C08F226/00 C08F220/06 C08F222/06 

Изобретение может быть использовано в медицине для создания аналитических меток полноразмерных антител на основе гидрофильных многослойных халькогенидных квантовых точек, полученных низкотемпературным водно-коллоидным синтезом для качественного и количественного определения биологических маркеров заболеваний в биологических жидкостях.

В настоящее время медицинские учреждения, клинические лаборатории и больницы для определения различных вирусных, бактериальных и аутоиммунных заболеваний широко используют иммунохроматографические тест-системы, характеризующиеся высокой селективностью. В качестве аналитических меток иммуннореагентов в тест-системах обычно используют наночастицы коллоидного золота, магнитные и латексные наночастицы, а также флуоресцентные красители [Vahedifard F., Chakravarthy K. Nanomedicine for COVID-19: The role of nanotechnology in the treatment and diagnosis of COVID-19 // Emergent materials. 2021. V. 4. №. 1. P. 75-99.]. Коммерчески доступных тест-систем, в которых в качестве аналитических меток белковых молекул используют квантовые точки на данный момент на рынке нет.

Для создания тест-систем на определение антигена в биологических жидкостях, к полноразмерным антителам, выработанным в качестве иммунного ответа организма, прикрепляют окрашенную или флуоресцирующую метку, причем использование флуоресцентной метки может повысить чувствительность анализа на порядок по сравнению с традиционно использующимися метками. Однако, ориентация антител на поверхности метки при иммобилизации карбодиимидным методом в обычных условиях несет случайный характер, что приводит к снижению чувствительности тест-систем на их основе. Существующие в настоящее время подходы к проведению ориентированной конъюгации включают в себя использование белков-адаптеров и химическую модификацию антител и являются весьма дорогостоящими и трудоемкими в реализации, поскольку требуют химической модификации белковых молекул [Tasso M. et al. Oriented bioconjugation of unmodified antibodies to quantum dots capped with copolymeric ligands as versatile cellular imaging tools // ACS Applied Materials & Interfaces. 2015. V. 7. №. 48. P. 26904-26913.].

Известен также способ получения ориентированных конъюгатов, основанный на реакции сульфгидрил-аминного связывания. Сульфгидрильные группы, входящие в состав аминокислоты, например, цистеина, попарно связаны между собой и образуют дисульфидную связь в шарнирной области антител. Ковалентное связывание квантовых точек с антителами осуществляют путем взаимодействия сульфгидрильных групп, образующихся при химической модификации антител, с аминогруппами на поверхности квантовых точек (Патент RU 2560699 C2 «Способ создания наноразмерной диагностической метки на основе конъюгатов наночастиц и однодоменных антител» Набиев И.Р., Суханова А.В., дата приоритета 02.08.2013). Недостатком данного метода является использование дорогостоящих кросс-линкеров и необходимость химической модификации нативных антител, которая может приводить к изменению их конформации и потере биологической активности.

Известен также способ, основанный на аффинном взаимодействии протеина A с Fc-фрагментом антитела, который не требует химической модификации антител. Недостатком данного способа является нековалентное связывание, которое приводит к низкой стабильности комплекса «квантовая точка – антитело». Так как сайты для связывания антител не всегда находятся на поверхности протеина A, его иммобилизация на носитель должна быть ориентированной. Кроме того, в виду наличия нескольких сайтов для связывания антител возможна агрегация конъюгатов посредством аффинных взаимодействий во время связывания (Патент KR 20180117405-A «Silica magnetic nanoparticle immobilized with protein A, manufacturing method of the same and isolating and purifying antibody using the silica magnetic nanoparticle immobilized with protein A» Kim Sung Hyun, Chang Jeong Ho, дата приоритета: 19.04.2017).

Известна методика ориентированной конъюгации наночастиц золота с антителами в зависимости от pH реакционной среды [Ruiz G. et al. pH impacts the orientation of antibody adsorbed onto gold nanoparticles // Bioconjugate Chemistry. 2019. V. 30. №. 4. P. 1182-1191.], включающая использование метода молекулярного моделирования для распределения поверхностного заряда антител при pH = 7.5, 8.0 и 8.5. Наибольшая антигенсвязывающая способность антител наблюдается при значении pH = 7.5, при котором на их поверхности образуется наибольшее количество участков с положительным зарядом. Аминокислоты, такие как лизин, содержащие аминогруппу в своем составе, а также аспарат и глутамат с боковыми карбоксильными группами, могут быть мишенями для ковалентного связывания. Основными недостатками данной методики является использование натрий-фосфатного буферного раствора с pH = 7.5, при котором снижается эффективность взаимодействия поверхностных групп квантовых точек с карбодиимидом в связи с гидролизом промежуточного соединения O-ацетилмочевины. Данный подход является наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков, таких как: карбодиимидный метод конъюгации и инкубирование антител в буферном растворе.

Нами предлагается способ создания аналитической метки полноразмерных антител на основе многослойных гидрофильных халькогенидных квантовых точек, полученных низкотемпературным водно-коллоидным синтезом и модифицированных биосовместимым сополимером винилпирролидона-малеинового ангидрида-этиленгликольдиметакрилата, схема представлена на Фиг. 1. Для достижения оптимальной ориентации антител относительно поверхности квантовых точек проводят выдержку квантовых точек в органическом буферном растворе с pH = 5.0 при постоянном перемешивании и комнатной температуре в течение 30 минут. Раствор квантовых точек смешивают с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом в мольном соотношении 1:2000:1000 для активации карбоксильных групп, входящих в состав их полимерного покрытия. После завершения процесса активации, в реакционную смесь добавляют антитела. Непрореагировавшие сложноэфирные группы на поверхности квантовых точек блокируют раствором бычьего сывороточного альбумина и трис(гидроксиметил)аминометана.

Технический результат предложенного способа заключается в использовании квантовых точек, флуоресцирующих в ближней инфракрасной области спектра, в котором флуоресценция нитроцеллюлозы, которую используют как основу тест-полосок, и биологических жидкостей минимальна. Сополимер винилпирролидона-малеинового ангидрида-этиленгликольдиметакрилата, используемый для покрытия квантовых точек, выполняет роль спейсера и якорных групп для проведения конъюгации карбодиимидным методом. Поскольку антитела представляют собой аминокислотную последовательность, изменение pH приводит к образованию области с высокой плотностью положительных зарядов, которая удалена от антиген-связывающих фрагментов. Данный подход позволяет по максимуму сохранить пространственную доступность Fab-фрагментов антител. Таким образом, выбранные условия конъюгации и использование квантовых точек в качестве меток белковых молекул позволяет снизить пределы обнаружения биологических маркеров заболеваний и увеличить чувствительность иммунохроматографической тест-системы.

Настоящее изобретение относится к способу создания аналитической метки полноразмерных антител на основе многослойных гидрофильных халькогенидных квантовых точек, полученных низкотемпературным водно-коллоидным синтезом и модифицированных биосовместимым сополимером винилпирролидона-малеинового ангидрида-этиленгликольдиметакрилата, в котором для достижения оптимальной ориентации антител относительно поверхности квантовых точек проводят выдержку квантовых точек в органическом буферном растворе с pH = 5.0 при постоянном перемешивании и комнатной температуре в течение 30 минут с целью активации карбоксильных групп, входящих в состав полимерного покрытия, очищенные квантовые точки смешивают с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом в мольном соотношении 1:2000:1000, далее в реакционную смесь добавляют антитела, после завершения конъюгации, непрореагировавшие сложноэфирные группы на поверхности квантовых точек блокируют раствором бычьего сывороточного альбумина и трис(гидроксиметил)аминометана. Настоящее изобретение обеспечивает использование квантовых точек, флуоресцирующих в ближней инфракрасной области спектра, в котором флуоресценция нитроцеллюлозы, которую используют как основу тест-полосок, и биологических жидкостей минимальна. 1 ил.

Способ создания аналитической метки полноразмерных антител на основе многослойных гидрофильных халькогенидных квантовых точек, полученных низкотемпературным водно-коллоидным синтезом и модифицированных биосовместимым сополимером винилпирролидона-малеинового ангидрида-этиленгликольдиметакрилата, в котором для достижения оптимальной ориентации антител относительно поверхности квантовых точек проводят выдержку квантовых точек в органическом буферном растворе с pH = 5.0 при постоянном перемешивании и комнатной температуре в течение 30 минут с целью активации карбоксильных групп, входящих в состав полимерного покрытия, очищенные квантовые точки смешивают с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом в мольном соотношении 1:2000:1000, далее в реакционную смесь добавляют антитела, после завершения конъюгации, непрореагировавшие сложноэфирные группы на поверхности квантовых точек блокируют раствором бычьего сывороточного альбумина и трис(гидроксиметил)аминометана.