Способ получения коллоидных квантовых точек для применения в медицинской диагностике Российский патент 2023 года по МПК C09K11/08 G03F7/105 B82Y15/00 

Разработка новых способов синтеза коллоидных квантовых точек (ККТ), флуоресцирующих в видимом (400-750 нм) ближнем инфракрасном (750-950 нм) диапазонах, является одним из перспективных направлений синтеза наноматериалов для биодиагностики.

В последнее время для получения ККТ широко используется два подхода к способам получения: металлоорганический коллоидный и метод коллоидного синтеза наночастиц в водных средах. ККТ с высоким квантовым выходом и оптической стабильностью, как правило, синтезируют в органических растворителях, однако их низкая растворимость и фотофлуоресценции в водных средах препятствуют прямому использованию ККТ в биологических средах. ККТ, полученные водным коллоидным синтезом, стабильны в водных средах, что является ключевым фактором для использования их в биоанализе.

В патенте [1] описывается высокотемпературный синтез ККТ. Способ получения ККТ в данном изобретении включает перемешивание амфифильного полимера, растворенного в некоординирующемся растворителе с прекурсором. Температура синтеза до 300°С, а значение рН зависит от растворителя (например, для полиэтиленгликоля оно ориентировочно является нейтральным; для гидрофобных растворителей значение рН является кислым (ниже 7) для сохранения карбокислотных групп протонированными). Затем карбоксилатный прекурсор перемешивают со вторым прекурсором для получения ядер ККТ. Добавление второго прекурсора осуществляется путем быстрого впрыскивания при высоких температурах (в диапазоне от 200°С до 350°С). Недостатком способа является необходимость применения токсичных, пирофорных и нестабильных реагентов, что вызывает необходимость использования специального оборудования и соблюдения строгих условий, и не подходит для крупномасштабного синтеза.

Известен метод низкотемпературного синтеза полупроводниковых ККТ золь-гель методом в полимерной матрице. В патенте [2] описан способ синтеза ККТ сульфида кадмия со средними размерами от 1,5 до 4,2 нм и разбросом по размеру не более 30%, обладающих размерно-зависимой флуоресценцией в области до 600 нм. Технический результат достигался тем, что в данном способе использовалось двуструйное сливание в раствор полимера растворов сульфида натрия и бромида кадмия, при нагревании и перемешивание с полимером. Главным недостатком представленного выше метода является длина излучения ККТ, которая существенно ниже 700 нм. Также недостатком данного способа является предполагаемая низкая фотостабильность получаемых ККТ, зависящая, в первую очередь, от устойчивости связи координирующих лигандов с поверхностью наночастиц.

В патенте [3] описан способ, позволяющий получать полупроводниковые ККТ, обладающие высокой фотостабильностью, и способные диспергироваться как в полярные, так и неполярные растворители без дополнительных стадий обработки, при сохранении, или увеличении высокого квантового выхода. Поставленная задача в изобретении решается тем, что в способе получения ККТ на основе халькогенидов металлов II или IV группы, включающем синтез ядер нанокристаллов из прекурсора, содержащего халькоген, и прекурсора, содержащего металл II или IV группы, в качестве модификатора поверхности используют (аминоалкил)триалкоксисиланы, однако синтез ядер осуществлялся в высокотемпературных пределах от 150°С до 250°С и поверхность наночастиц, полученных данным способом, имеет заряд, следствием чего является ее высокая реакционная способность и склонность к окислению.

В патенте [4] описывается способ синтеза гидрофильных ККТ ядро/оболочка. Однако в синтезе происходит нагревание смеси прекурсоров при температуре до 240°С. Также в вышеописанном методе синтеза используются поверхностно-активные вещества, которые не способны обеспечить устойчивую связь с поверхностью ККТ в течение длительного времени, что и приводит к фотоокислению последних и потере флуоресценции.

В патенте [5] описан метод получения гидрофильных модифицированных ККТ, включающий использование источника ионов кадмия и неорганических соединений, содержащих меркаптогруппы. Соединение смешивают с фосфоновой кислотой и водой, и подвергают реакции зародышеобразования при температуре ниже 100°С. После очистки получают гидрофильные модифицированные ККТ. Предполагается, что при облучении полученных вышеописанными способами нанокристаллов УФ светом на воздухе произойдет значительное падение флуоресценции. Также недостатком способа является то, что описанные выше методики не способны обеспечить монодисперсность ККТ.

В патенте [6] описано получение многофункциональных зондов на основе наночастиц, а именно инкапсулированных в полимер и конъюгированных зондов с ККТ, в которых ККТ были инкапсулированы в амфифильную сополимерную структуру и применялись для бионализа. Так, ядра ККТ CdSe-ZnS инкапсулировали в амфифильное полимерное покрытие (в том числе сополимером N-винилпирролидона, малеинового ангидрида и этиленгликоль диметакрилата), обеспечивающее гидрофобное взаимодействие между полимером и углеводородной боковой цепью, образуя, таким образом, самособирающийся зонд наночастиц. Гидрофобная структура защищала ККТ от гидролиза. Данный патент является прототипом. Недостатком способа является то, что, несмотря на значительные успехи в совершенствовании оптических свойств ККТ (квантовый выход, ширина пика флуоресценции), не удавалось добиться достаточной фотостабильности синтезируемых нанокристаллов.

Несмотря на имеющиеся разработки в области синтеза ККТ в водных средах, обеспечение их фото- и химической стабильности остается актуальной задачей. Для решения данной задачи наночастицы предлагается внедрять в полимерные структуры, как синтетические, так и природные.

Целью данного изобретения является разработка способа, позволяющего получать ККТ, покрытые полимером, обладающие высокой фотостабильностью и биосовметимостью, методом низкотемпературного синтеза в водной среде.

Технический результат - способ водного низкотемпературного синтеза многослойных стабилизированных ККТ с модифицированной поверхностью, обладающих фотостабильностью и применимых в медицинской диагностике.

Поставленная задача решается, способом получения коллоидных полупроводниковых ККТ на основе халькогенидов металлов II или IV группы, включающий синтез ядер нанокристаллов из прекурсора, содержащего халькоген, и прекурсора, содержащего металл II или IV группы. Для фотостабильности используют модификаторы поверхности, в качестве последнего используют тиогликолевую кислоту (ТГК), L-Цистеин (L-cys), синтез ядер и оболочек осуществляют при постоянной температуре в пределах от 50 до 100°С. Для придания биосовместимости, полученные ККТ покрывают сополимером N-винилпирролидона, малеинового ангидрида и этиленгликоль диметакрилата (ВП-МА-ЭГДМА).

На фиг. 1 представлена схема синтеза многослойных коллоидных CdTe/CdSe/CdS/ZnS ККТ, стабилизированных ТГК. Для увеличения квантового выхода флуоресценции и улучшения стабильности синтезированных ядер CdTe ККТ, они были покрыты дополнительными слоями различных полупроводников.

На фиг. 2 представлена схема синтеза сополимера ВП-МА-ЭГДМА. Для дальнейшей модификации ККТ использовался сополимер ВП-МА-ЭГДМА. Данный полимер был выбран ввиду его биосовместимости, гидрофильности, а также по той причине, что после гидролиза данного полимера можно получить большое количество карбоксильных групп на поверхности ККТ, по которым можно проводить как модификацию ККТ, так и конъюгацию с биомолекулами. Структура сополимера подтверждалась ИК-спектрометрией с Фурье преобразованием на приборе Nicolet 6700 (Thermo Scientific, США).

Фиг. 3 представляет схему модификации CdTe/CdSe/CdS/ZnS-(ТГК; L-cys) ККТ сополимером ВП-МА-ЭГДМА. Пришивку полимера к поверхности ККТ осуществляли за счет образования амидной связи между ангидридной группой МА, входящей в сополимер и аминогруппой L-cys.

На фиг. 4 представлены спектры поглощения и нормированные спектры флуоресценции CdTe/CdSe/CdS/ZnS-(ТГК-L-cys) - ВП-МА-ЭГДМА, измерения проводились на спектрофлуориметре FluoroLog 3 модель FL3-21 (Horiba Jobin Yvon SAS, Франция) и спектрофотометре UNICO-2100 (UNITED PRODUCTS & INSTRUMENTS, США).

Пример 1. Получения ядер ККТ на основе CdTe.

Синтез ККТ CdTe осуществляли в три этапа.

Первым этапом синтеза являлось получение NaHTe. В колбу объемом 25 мл помещали навеску теллура Те (0,387 ммоль), навеску боргидрида натрия NaBH₄ (1,692 ммоль) и перемешивали. Затем добавляли 5,0 мл дегазированной деионизированной воды и перемешивали реакционную массу при комнатной температуре в течение 1 ч до полного растворения порошка и появления светло-розовой окраски. Синтез ведется в атмосфере аргона.

Вторым этапом синтеза получали прекурсор кадмия Cd. В круглодонную колбу объемом 100 мл помещали навеску хлорида кадмия CdCl₂ и растворяли ее в дегазированной дистиллированной воде. К полученному раствору добавляли стабилизатор. В качестве стабилизатора использовали ТГК. Для получения соли ТГК рН полученных растворов доводили до значения 9,2 раствором гидроксида натрия с концентрацией 0,5 М.

Третий этап включал в себя синтез CdTe ККТ. К раствору прекурсора кадмия со стабилизатором нагретому до 98°С быстро добавляли свежеприготовленный раствор NaHTe (прекурсор теллура) при постоянном перемешивании, соотношение Cd : Те составляет 1:0,3. Соблюдение данных условий способствует ускорению роста ККТ. Синтез CdTe ККТ проводят в атмосфере аргона.

Пример 2. Получение ККТ CdTe/CdSe.

Очищенные CdTe ККТ, стабилизированные ТГК, с соотношением Cd : ТГК равным 1:3, полученные в примере 1, со временем синтеза 180 мин, помещали в трехгорлую колбу, затем к раствору CdTe ККТ медленно добавляли прекурсор Cd и 0,8 мл заранее приготовленного прекурсора Se. В качестве прекурсора селена выступал NaHSe, который предварительно готовили за счет смешивания в 3,0 мл деионизированной воды порошка селена Se (0,01 г) и порошка боргидрида натрия NaBH₄ (0,0254 г). Реакционную смесь кипятили при перемешивании с обратным холодильником при 50°С в течение 1 ч (в качестве реакционной среды использовали боратный буфер с рН=9,2).

Прекурсор Cd готовился за счет смешения 0,3 ммоль CdCl₂ и 0,9 ммоль ТГК в 5,0 мл деионизированной воды. рН смеси доводили до 9,2 при помощи 0,5 М NaOH.

Очищенные CdTe/CdSe ККТ, стабилизированные ТГК с соотношением Cd : ТГК равным 1:3, полученные в примере 2, помещали в трехгорлую колбу, затем к раствору ККТ медленно добавляли прекурсор Cd и прекурсор S, в качестве которого выступала тиомочевина, реакционную смесь кипятили при перемешивании с обратным холодильником при 100°С в течение 1 часа (в качестве реакционной среды служил боратный буфер с рН=10).

Пример 3. Получение ККТ CdTe/CdSe/CdS.

Прекурсор Cd готовили за счет смешения 0,03 ммоль CdCl₂ и 0,09 ммоль ТГК в 5 мл деионизированной воды. рН смеси доводили до 10 при помощи 0,5 М раствора NaOH.

Прекурсор S готовили в результате растворения 0,2 ммоль тиомочевины в 5 мл деионизированной воды.

Полученные ККТ осаждали с помощью изопропанола в центрифуге при 8000 об/мин в течении 15 мин, декантировали жидкость, осадок промывали изопропанолом. После чего осажденные ККТ сушили при 50°С на воздухе.

Пример 4. Получение ККТ CdTe/CdSe/CdS/ZnS.

CdTe/CdSe/CdS ККТ, стабилизированные ТГК с соотношением Cd : ТГК равным 1:3 (полученные в примере 3), помещали в трехгорлую колбу, затем к раствору медленно добавляли прекурсор Zn и прекурсор S, в качестве которого выступала тиомочевина, реакционную смесь кипятили при перемешивании с обратным холодильником при 100°С в течение 1 часа (в качестве реакционной среды выступал боратный буфер с рН - 10).

Прекурсор Zn готовили следующим способом, 0,3 ммоль L-cys растворяли в 5,0 мл деионизированной воды, после чего раствор оттитровали до рН=9 при помощи 0,1 М раствора NaOH, затем медленно при перемешивании добавляли 1 мл раствора, содержащего 0,2 ммоль ZnCl2. И полученную смесь снова оттитровывали 1 М раствором NaOH до рН=10. Прекурсор S готовили растворением 0,2 ммоль тиомочевины в 5,0 мл деионизированной воды.

Пример 5. Получение сополимера ВП-МА-ЭГДМА.

Сополимер ВП-МА-ЭГДМА был синтезирован по данной методике: в трехгорлую колбу объемом 50 мл загрузили ВП (28 ммоль) и раствор, содержащий МА (10 ммоль), 2,0 мл уксусной кислоты, 11,0 мл тетрагидрофурана (ТГФ) и ТГК (0,5 ммоль). Смесь дегазировали в течение 20 мин, затем нагревали до 65°С в течение 10 мин при перемешивании в атмосфере аргона. К полученному раствору шприцом добавляли (2,3 ммоль) ЭГДМА и 0,3 г (0,25 ммоль) ТГК, растворенных в 4,0 мл ТГФ. После 10 мин дополнительного нагревания до 65°С реакцию гасили добавлением ТГФ (7,5 ммоль) в 1,0 мл ТГФ и держали при 65°С еще 10 мин. Полученный сополимер очищали за счет осаждения деионизированной водой (3 объема) и последующего центрифугирования при 10000 об/мин. Полученный осадок промывали деионизированной водой и сушили в вакууме при 40°С. Выход реакции составил 20%.

Очищенные CdTe/CdSe/CdS/ZnS ККТ, покрытые ТГК и L-cys (полученные в примере 4) помещали в трехгорлую колбу на 100 мл, после чего добавляли 0,06 г сополимера ВП-МА-ЭГДМА и титровали с помощью 0,5 М NaOH до рН=10, смесь дегазировали в течение 30 мин при помощи аргона. Далее смесь нагревали до 75°С при перемешивании в течение 40 мин в токе аргона.

Полученные ККТ, покрытые сополимером ВП-МА-ЭГДМА, очищали путем центрифугирования с трехкратным избытком по объему изопропанола при 10000 об/мин в течении 15 мин, декантировали жидкость, осадок промывали изопропанолом. Далее осажденные ККТ сушили при 50°С на воздухе. Данные ККТ имеют гидродинамический радиус 9,7 нм с разбросом менее 10%. Люминесценцию на длинах волн более 650 нм. Растворимость и устойчивость в биологических средах. Квантовый выход более 25%. Исследование характеристик ККТ проводилось на следующем оборудовании: спектрофотометр UNICO-2100 (UNITED PRODUCTS & INSTRUMENTS, США, диапазон длин волн: 190-1100 нм), спектрофлуориметр FluoroLog 3 модель FL3-21 (Horiba Jobin Yvon SAS, Франция, спектральный диапазон возбуждения флуоресценции - 200 - 850 нм), анализатор дзета-потенциала серии Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments Ltd, Великобритания, диапазон измерения: 5 нм - 10 микрон), анализатор размера частиц серии Zetasizer Nano S (Malvern Instruments Ltd, Великобритания, диапазон измерения: 0,6 нм - 6 микрон), ИК-спектрометр с Фурье преобразованием Nicolet 6700 (Thermo Scientific, США, спектральный диапазон 25000 - 20 см^-1)

В результате, применение заявляемого способа можно получить металлические ККТ, обладающие увеличенной стабильностью и квантовым выходом, пригодные для применения в медицинской диагностике.

Литература

1. Пат. №2497746 С2 Российская федерация, МКП⁷ В82В 3/00, B82Y 30/00. Квантовые точки, способы получения квантовых точек и способы использования квантовых точек / Смит Э., Най Ш., Кайрдольф Б. - №2011112683/28, заявл. 03.09.2009 г., опубликовано 10.11.2013 г., бюл. №31.

2. Пат. №2540385 С2 Российская федерация, МКП⁷ C09K 11/54, C09K 11/56, В82В 3/00, B82Y 40/00. Способ получения полупроводниковых точек сульфида кадмия / Овчинников О.В., Смирнов М.С. Шапиро Б.И., Шатских Т.С., Перепелица А.С., Дедикова А.О. - №2013127477/05, заявл. 17.06.2013 г., опубликовано 10.02.2015 г., Бюл. №4.

3. Пат. №2381304 С1 Российская федерация, МКП⁷ С30В 7/00, С30В 29/46, C09K 11/02, C09K 11/88, В82В 3/00. Способ синтеза полупроводниковых кватовых точек. / Новичков Р.В., Вакштейн М.С., Нодова Е.Л., Маняшин А.О., Тараскина И.И. - №2008134160/15, заявл. 21.08.2008 г., опубликовано 10.02.2010 г., бюл. №4.

4. Pat. №9790425 В2 United States, С09К11/88, H01L31/0352. Synthesis of quantum dots / Hunter M. - №14/690,152 filed 17.04.2015, publ. 22.10.2015.

5. Pat. №1453161 В Taiwan, B82B 1/00, B82B 3/00, C01G 11/00. Hydrophilic modified II-VI quantum dots and preparation method thereof / Kuan J. - №098138224 filed 11.11.2009, publ. 16.05.2011.

6. Pat. №7846412 B2 United States, C09B 31/00, H01L 21/00, H01L 21/326, H01L 21/469, G01N 33/48. Synthesis of quantum dots / Shuminh N., Xiaouhu G. - №10/988,923 filed 15.11.2004, publ. 23.06.2005.

Изобретение относится к области коллоидной химии, а именно к способам получения полупроводниковых наночастиц, в частности коллоидных квантовых точек (ККТ), методом водного коллоидного синтеза. Описанный в изобретении подход позволяет получать квантовые точки CdTe/CdSe/CdS/ZnS, покрытые сополимером N-винилпирролидона, малеинового ангидрида и этиленгликольдиметакрилата, с использованием системы стабилизаторов, состоящей из тиогликолевой кислоты и L-Цистеина в водной среде. Полученные описанным методом квантовые точки остаются стабильными в биологических средах и обладают квантовым выходом более 25%. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 пр.

1. Способ получения многослойных коллоидных квантовых точек состава CdTe/CdSe/CdS/ZnS, покрытых сополимером N-винилпирролидона, малеинового ангидрида и этиленгликольдиметакрилата, с использованием системы стабилизаторов, в качестве которых используют тиогликолевую кислоту и L-Цистеин в водной среде.

2. Способ получения многослойных коллоидных квантовых точек состава CdTe/CdSe/CdS/ZnS по п. 1, отличающийся тем, что для получения сополимера N-винилпирролидона, малеинового ангидрида и этиленгликольдиметакрилата в качестве ингибитора используется тиогликолевая кислота, а в качестве осадителя используется вода.

3. Способ получения многослойных коллоидных квантовых точек состава CdTe/CdSe/CdS/ZnS по п. 1, отличающийся тем, что для покрытия слоя ZnS в качестве стабилизатора используется раствор L-Цистеина.