СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОЯТНОСТИ НАЛИЧИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N33/68 G01N33/72 G01N33/92 G01N33/573 G01N1/28 

Изобретение относится к способу дифференциального определения вероятности наличия нозологических форм воспалительных заболеваний кишечника и может быть использовано в медицине, в частности в гастроэнтерологии, терапии для диагностики заболеваний кишечника.

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), включая болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), являются хроническими прогрессирующими иммуно-опосредованными заболеваниями неизвестной этиологии. Заболеваемость ВЗК неуклонно растет и стала важной проблемой общественного здравоохранения в западных странах и России, поскольку поражаются преимущественно люди трудоспособного возраста, тяжелое течение данной патологии с осложнениями обусловливает существенное снижение качества жизни, инвалидизацию пациентов, высокие расходы на терапию. Дифференциальное определение вероятности наличия нозологических форм ВЗК в настоящее время имеет решающее значение для индивидуального ведения пациента, поскольку каждый клинический случай предполагает конкретные терапевтические стратегии и прогнозы. Показана различная эффективность препаратов (аминосалицилаты, метотрексат, моноклональные антитела), разная хирургическая тактика, оценка результатов терапии для разных нозологических форм ВЗК. Неклассические формы как язвенного колита, так и болезни Крона все еще представляют собой диагностическую проблему, так как единого «золотого стандарта» диагностики ВЗК пока не существует, диагноз выставляется на основании комплекса данных - анамнеза, клинических проявлений, типичной эндоскопической картины и гистологических признаков, поэтому от 5 до 15% случаев ВЗК не отвечают строгим критериям ни для ЯК, ни для БК, а у 14% пациентов с установленным диагнозом «ЯК» или «БК» диагноз со временем меняется.

В настоящее время для дифференциального определения вероятности наличия ВЗК широко используются в сочетанном виде следующие основные методы: клинико-анамнестический, эндоскопический, гистологический в соответствии с Клиническими рекомедациями по язвенному колиту и болезни Крона у взрослых [Язвенный колит: Клинические рекомендации - 2020 (22.07.20; утв. Минздравом России, Российской гастроэнтерологической ассоциацией, Ассоциацией колопроктологов России), URL: https://legalacts.ru/doc/klinicheskie-rekomendatsii-iaz-vennyi-kolit-utv-minzdravom-rossii/; Ивашкин В.Т., Шелыгин Ю.А., Абдулганиева Д.И., Абдулхаков Р.А., Алексеева О.П., Алексеенко С.А. и др. Клинические рекомендации по диагностике и лечению болезни Крона у взрослых (Проект). Колопроктология. 2020; 19(2): 8-38. DOI: 10.33878/2073-7556-2020-19-2-8-38].

В публикации Федулова Э.Н. и соавт. представлен алгоритм дифференциальной диагностики язвенного колита и болезни Крона у детей на разных этапах медицинской помощи на основе математической оценки клинико-анамнестических и лабораторно-инструментальных данных [Федулова Э.Н., Жукова Е.А., Федорова О.В., Тутина О.А., Шумилова О.В. Алгоритм дифференциальной диагностики язвенного колита и болезни Крона у детей на разных этапах медицинской помощи (на основе математической оценки клинико-анамнестических и лабораторно-инструментальных данных) РМЖ №11, 2014, с. 848-853].

Недостатком представленного подхода является необходимость оценки широкого перечня показателей в виде суммы баллов, в том числе, данных эндоскопии, гистологии, ультразвуковых и клинических данных, что дорого, трудоемко и времязатратно. Кроме того, представленный алгоритм ассоциирован с детским возрастом и не проверен для взрослых пациентов с ВЗК.

Известны эндоскопические признаки для дифференциальной диагностики ЯК и БК [Воспалительные заболевания кишечника. Клинические, эндоскопические, морфологические аспекты диагностики. Принципы современной терапии. / Головенко О.В. [и др.]. - М.: Прима Принт, 2017. - 180 с.: ил. - ISBN 978-5-9907557-3-4]. Наиболее ценными дифференциально-диагностическими проявлениями ЯК при оценке данных илеоколоноскопии считаются: непрерывный и диффузный характер воспаления, которое начинается от прямой кишки, распространяясь проксимальнее заднего прохода; наличие четкой демаркационной линии - резкой границы между пораженной и неизмененной слизистой оболочкой; зернистость, ранимость, утеря нормального сосудистого рисунка слизистой оболочки; поверхностные изъязвления. Стриктуры не характерны для ЯК и встречаются редко, их обнаружение требует исключения БК либо злокачественной опухоли. Для БК, напротив, наиболее характерна прерывистость поражения, т.е. вовлечение кишки в воспалительный процесс отдельными сегментами, поражение терминального отдела подвздошной кишки, необязательное поражение прямой кишки, наличие стриктур и свищей, анальное и перианальное поражение. Для илеита при БК характерны выраженное, распространенное и очаговое воспаление с наличием отдельных язв и склонностью к стенозированию терминального отдела подвздошной кишки и/или Баугиниевой заслонки. Для илеита при БК нехарактерно наличие панколита, а выраженность воспалительного процесса подвздошной кишки существенно значительнее, чем слепой.

Недостатком данного подхода является потребность в инвазивной дорогостоящей процедуре - эндоскопии с риском осложнений (перфорация, кровотечение и др.), отсутствие абсолютной специфичности эндоскопических критериев для того или другого заболевания.

Известен способ дифференциальной диагностики НЯК и болезни Крона, основанный на морфологическом исследовании биоптатов кишки [Белоусова Е.А. «Язвенный колит и болезнь Крона». - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2002. - 128 с.]. Диагностическими признаками болезни Крона являются: более глубокое распространение инфильтрации в собственной пластинке, преобладание отека над полнокровием, редкие крипт-абсцессы, незначительное нарушение секреции слизи, редкая метаплазия клеток Панета. При болезни Крона в 70-80% случаев присутствуют саркоидные гранулемы, тогда как при НЯК они отсутствуют [Воспалительные заболевания кишечника. Клинические, эндоскопические, морфологические аспекты диагностики. Принципы современной терапии. / Головенко О.В. [и др.]. - М.: Прима Принт, 2017. - 180 с.: ил. - ISBN 978-5-9907557-3-4]. Считают, что формирование хронического воспаления при ВЗК опосредуется нарушением нормального иммунного ответа на кишечную микробиоту у генетически предрасположенных индивидуумов [Шумилов П.В. Нерешенные вопросы патогенеза воспалительных заболеваний кишечника у детей. Роль пристеночной микрофлоры кишечника // Педиатрическая фармакология. - 2010. - Т. 7. - №5. - С. 54-58].

Известны серологические маркеры, используемые для дифференциальной диагностики ВЗК. Так, одним из маркеров воспаления является С-реактивный белок (СРБ), который чаще повышен при активной болезни Крона, чем при язвенном колите (~ в 80% случаях против 50%). Но вместе с тем показано, что СРБ может коррелировать с клинической активностью и протяженностью поражения при ЯК [Rodgers, A.D. CRP correlates with clinical score in ulcerative colitis but not in Crohn's disease / A.D. Rodgers, A.G. Cummins // Dig. Dis. Sci. - 2007. - Vol. 52, N 9. - P. 2063-2068].

В клинической практике используются фекальные биомаркеры, в том числе, кальпротектин. Его уровень коррелирует с эндоскопической и симптоматической оценкой более выраженно для ЯК, менее для БК. Однако, данные исследований свидетельствуют о том, что ни один из доступных фекальных биомаркеров (лейкоциты, меченные индием-111; кальпротектин; лактоферрин; эластаза полиморфно-нуклеарных гранулоцитов; неоптерин и белки S100A12) не обладают достаточной диагностической точностью для дифференциальной диагностики у пациентов при локализации процесса в толстой кишке [Assessment of disease activity in ulcerative colitis by faecal calprotectin, a novel granulocyte marker protein / A.G. Røseth, E. Aadland, J. JahnsenA, N. Raknerud // Digestion. - 1997. - Vol. 58, N 2. - P. 176-180. Iskandar, H.N. Biomarkers in inflammatory bowel disease: current practices and recent advances / H.N. Iskandar, M.A. Ciorba. - DOI: 10.1016/j.trsl.2012.01.001. - Text: electronic // Transl. Res. - 2012 - Vol. 159, N 4. - P. 313-325].

Недостатками вышеописанных биомаркеров являются недостаточные чувствительность и специфичность, необходимость в дополнительной информации (протяженность поражения в кишке, активность процесса), потребность в дорогостоящем оборудовании, реактивах, трудоемкость процедуры определения.

Классическим способом диагностики ВЗК является проведение эндоскопии и последующее гистологическое исследование биоптата. Известен способ диагностика болезни Крона у детей [Патент RU 2125264; МПК G01N 33/48; Способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей. / Топтыгина А.П., Петричук С.В., Семикина Е.Л.; патентообладатели Федеральное государственное автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАУ "НМИЦ здоровья детей" Минздрава России) (RU), Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU), заявл. 10.02.1997, опубл. 20.01.1999]. Согласно данному способу, в биоптате слизистой оболочки кишки определяют содержание новообразованных лимфоидных узелков с перифокальным фиброзом, наличие дистрофически измененных эпителиальных клеток, адгезию лимфоцитов к апикальной мембране эпителия и образование невромоподобных структур и при наличии тетрады признаков диагностируют болезнь Крона. Способ дифференциальной диагностики, основан на морфологических показателях состояния слизистой оболочки кишечника, более объективный, чем визуальная оценка.

Однако данный способ трудоемкий, длительный, требует высокой квалификации морфолога, осуществим только с использованием эндоскопического исследования и биопсии. Точность способа 70-80%. Поскольку болезнь Крона может локализоваться во всех отделах желудочно-кишечного тракта, включая тонкую кишку, желудок и пищевод, морфологическое исследование требует взятия биоптатов в разных участках желудочно-кишечного тракта, что является травматической процедурой. Более щадящими и предпочтительными являются способы диагностики, основанные на анализе крови больного или фекальных маркеров.

Существует патент на набор синтетических олигонуклеотидов, позволяющих выявлять маркерные участки генов бактерий, кодирующих бета-лактамазу, фимбриальный белок, 3 гипотетических белка и ген LrgA, ассоциированных с ВЗК. [Патент 2601132 Российской Федерации МПК C12Q 1/68. Набор синтетических олигонуклеотидов для диагностики болезни Крона и неспецифического язвенного колита путем выявления маркерных участков бактериальной ДНК методом полимеразной цепной реакции / Алексеев Д.Г., Павленко А.В., Каныгина А.В.; патентообладатель Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)» (МФТИ) (RU) №2015151029/10, заявл. 27.11.2015 опубл. 27.10.2016 Бюл. №30]. Данный набор включает специфичные олигонуклеотиды к фрагментам генов микроорганизма Escherichia coli, а именно ряд определенных праймеров.

Однако индивидуальный спектр кишечной микрофлоры сильно колеблется, а выявление той или иной микрофлоры не является основанием для верификации диагноза ВЗК.

Существует патент на диагностику ВЗК с помощью УЗИ-методов [Патент 2763705 Российской Федерации МПК А61В 8/08 (2006.01). Способ дифференциальной диагностики хронических воспалительных заболеваний и другой патологии кишечника в детском возрасте. / Неласов Н.Ю., Каркошка Т.А., Моргунов М.Н., Ерошенко О.Л., Паленый А.И.; патентообладатель Неласов Н.Ю., Каркошка Т.А. (RU) №2021101708, заявл. 26.01.2021, опубл. 30.12.2021 Бюл. №1]. В данном патенте проводят ультразвуковое исследование с определением двух ультразвуковых показателей: КЭ - значение показателя ультразвуковой компрессионной эластографии и показатель МА - межпетлевой асцит. Далее проводят расчет классификационных значений меток: «Нет ВЗК» и «Есть ВЗК» последовательно по двум оригинальным математическим формулам.

Однако, заявленные признаки являются признаками воспаления в стенке кишки, далеко не все признаки наблюдаются у каждого пациента с ВЗК и не обнаруживаются при других причинах воспаления кишечника.

Известен способ диагностики ВЗК с помощью инфракрасной спектроскопии слюны или сыворотки крови, причем диагноз устанавливают на основании вычисления соотношение определенных пиков [Патент 2366956 Российской Федерации МПК G01N 33/52 Способ дифференциальной диагностики неспецифического язвенного колита и болезни Крона у детей. / Федулова Э.Н., Гордецов А.С., Тутина О.А., Лебедев А.В.; патентообладатель Федеральное государственное учреждение «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Росмедтехнологий» (RU) №2007126007/15, заявл. 09.07.2007, опубл. 20.01.2009 Бюл. №2]. В ходе реализации предложенного способа сыворотку крови больного исследуют методом инфракрасной спектроскопии, при этом регистрируют высоту пиков полос поглощения с максимумами 1160 см^-1, 1150 см^-1, 1140 см^-1, 1130 см^-1 и на основании полученных данных рассчитывают показатели спектра поглощения, которые выражают в системе двумерных координат, и проводят дифференциальную диагностику неспецифического язвенного колита и болезни Крона.

Однако непонятно, какова природа этих пиков и что конкретно они характеризуют, поэтому специфичность данного метода для нозологических форм ВЗК недостаточна, особенно при наличии сопутствующей патологии, которая может повлиять на интенсивность данных пиков.

Кроме того, все вышеописанные методы были предложены для дифференциальной диагностики ВЗК у детей, но не адаптированы для взрослых.

Известен способ дифференциальной диагностики ВЗК по уровню жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови [Кручинина М.В., Светлова И.О., Осипенко М.Ф., Абалтусова Н.В., Громов А.А., Шашков М.В., Соколова А.С., Яковина И.Н., Борисова А.В. Жирные кислоты мембран эритроцитов и сыворотки крови для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2022; 32(4): 50-67. https://doi.org/10.22416/1382-4376-2022-32-4-50-67].

Однако, недостатком данного подхода является то, что он предполагает наличие информации о стадии заболевания изначально, рассчитан на определение обширного перечня жирных кислот из разных биологических образцов, что затратно по времени, требует высокоточного оборудования, библиотеки данных по определяемым соединениям. Кроме того, отсутствуют референтные значения уровней жирных кислот для разных нозологических форм ВЗК, что необходимо для дифференциальной диагностики.

Наиболее близким к предлагаемому способу является «Способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей по комплексу клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных критериев» [Патент 2 763 258 Российской Федерации МПК А61В 5/00, G01N 33/487. Способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей по комплексу клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных критериев. / Печкуров Д.В., Воронина Е.Н., Тяжева А.А., Кольцова Н.С., Порецкова Г.Ю., Захарова Л.И.; патентообладатель Воронина Е.Н.; (RU) №2020123826, заявл. 13.07.2020, опубл. 28.12.2021 Бюл. №1.]. Суть метода заключается в том, что у пациента оценивают в баллах перечень показателей: клинических (боль в животе, кровь, слизь в стуле, неоформленный стул, ночная диарея, повышение температуры тела, дефицит веса, внекишечные проявления, поражение глаз со стоматитом, снижение линейного роста, астеновегетативный синдром), анамнестических (отягощенная наследственность по аутоиммунной патологии), лабораторных (лейкоцитоз, анемия, скрытая кровь в кале, повышенный кальпротектин, диспротеинемия), инструментальных (эндоскопические для выявления эрозивного гастрита/дуоденита). Баллы по каждому параметру суммируются, затем сравнивают суммарные баллы с опорными показателями, ассоциированными с отдельными нозологическими формами ВЗК - язвенным колитом, болезнью Крона, неклассифицируемым колитом.

Недостатками данного способа являются обширный перечень показателей, существенная доля которых оценивается субъективно (клинические параметры), необходимость выполнения большого количества лабораторных и инструментальных исследований, что дорого, требует времени, специального оборудования. Кроме того, предложенный метод рассматривается у детей с ВЗК, он не адаптирован для взрослых с данной патологией.

Задачей предлагаемого изобретения является учет показателей красной крови, уровней сывороточных и фекальных маркеров воспаления, уровней жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови для различения пациентов с ВЗК от здоровых лиц, а также для дифференцировании нозологических форм ВЗК.

Технический результат предлагаемого способа состоит в существенном повышении диагностической точности при доступности исследуемых параметров получения результатов исследования и позволяет использовать предлагаемый метод для скринингового и углубленного обследования населения.

Технический результат достигается тем, что для диагностики воспалительных заболеваний кишечника у обследуемых путем исследования уровня фекального кальпротектина, показателей красной крови, биохимических параметров, уровней жирных кислот сыворотки крови и мембран эритроцитов, состоящий в том, что у пациента забирают образец фекалий и определяют уровень фекального кальпротектина методом иммуноферментного анализа, параллельно забирают венозную тощаковую кровь в три пробирки: первая пробирка с антикоагулянтом - калиевой солью ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) K2/K3/Na2 в соотношении 1,95 мг ЭДТА/1 мл крови, из крови которой с использованием автоматического гематологического анализатора определяют уровень гемоглобина, гематокрит, средний корпускулярный объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС), скорость оседания эритроцитов; вторая пробирка с активатором свертывания и гелем, выдерживают кровь 15 минут при комнатной температуре, отделяют стеклянной палочкой сгусток от стенок пробирки, центрифугируют на центрифуге при 2000 оборотов/мин в течение 10 минут с целью получения сыворотки крови, которую тут же отделяют от сгустка, помещают в две сухие чистые пробирки, далее в сыворотке крови первой пробирки методом иммуноферментного анализа определяют С-реактивный белок, ферритин, из сыворотки крови второй пробирки с помощью процедур экстракции и переэтерификации получают образцы для определения уровней жирных кислот - арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот, отношения омега 6 к омега 3 полиненасыщенным жирным кислотам методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии; третья пробирка с цитратом натрия: 0,109 моль/л, 3,2%, соотношение с кровью 1:9, выдерживают кровь 15 минут при комнатной температуре, затем центрифугируют на центрифуге при 1200 оборотов/мин в течение 10 минут с целью получения плазмы крови, которую тут же отделяют от взвеси эритроцитов, помещают в сухую чистую пробирку, далее в плазме крови Клоттинговым методом определяют концентрацию фибриногена, взвесь эритроцитов подвергают трехкратному отмыванию фосфатным буфером, содержащим 0,103 М Na2HPO4 и 0,155 М KH2PO4, (рН=7,36) при 2000 оборотов/мин в течение 20 минут для получения отмытых эритроцитов, из которых с помощью процедур экстракции и переэтерификации получают образцы мембран эритроцитов для определения уровней олеиновой, арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии,

после чего вычисляют два диагностических индекса Y_D1 и Y_D2 по формулам

Y_D1=1/[1+exp(-S_D1)],

Где S_D1=-0,0068*Hb+0,2219*СОЭ-0,0101*Фер+0,1138*ФКП-0,4724*эрОлК+0,0409*эрАраК+0,4365*сАраК+0,0136*эрПНЖК-0,0215*сПНЖК-0,0083*сО6/O3

и

Y_D2=1/[1+exp(-S_D2)],

Где S_D2=-0,014*Hb+0,1751*Ht-0,0212*MCV-0,2974*MCH+0,0334*МСНС+0,0516*СОЭ+0,005*Фер-0,0342*СРБ-1,1244*ФГ+0,0014*ФКП-0,0328*эрОлК,

где

Hb - уровень гемоглобина, г/л

Ht - гематокрит, %

МСН - среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, пг

МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, г/л

MCV - средний корпускулярный объем эритроцита, фл

сО6/O3 - отношения омега 6 к омега 3 полиненасыщенным жирным кислотам в сыворотке крови

сАраК - содержание арахидоновой кислоты в сыворотке крови С20:4n-6 (эйкозатетраеновая), %

СОЭ - скорость оседания эритроцитов, мм/ч

сПНЖК - суммарное содержание полиненасыщенных жирных кислот в сыворотке крови, %

СРБ - С-реактивный белок, мг/л

ФГ - фибриноген, г/л

Фер - ферритин, мкг/л

ФКП - фекальный кальпротектин, мкг/г

эрАраК - содержание арахидоновой кислоты в эритроцитах С20:4n-6 (эйкозатетраеновая), %

эрОлК - содержание олеиновой кислоты в эритроцитах С18:1; с9 (цис-9-октадекановая), %

эрПНЖК - суммарное содержание полиненасыщенных ЖК в эритроцитах, %

и при значении диагностического индекса Y_D1 превышающем 0,66 принимают решение о вероятности наличия воспалительного заболевания кишечника и при значении диагностического индекса Y_D2 превышающем 0.5 принимают решение о вероятности наличия язвенного колита, менее 0.5 - о вероятности наличия болезни Крона.

На Фиг. 1 представлена структурная схема предлагаемого способа диагностического процесса.

На Фиг. 2 представлена иллюстрация выбора порогового значения 0.66 для диагностического индекса Y_D1 на основе графиков чувствительности и специфичности.

На Фиг. 3 представлена иллюстрация выбора порогового значения 0.5 для диагностического индекса Y_D2 на основе графиков чувствительности и специфичности.

Способ осуществляется следующим образом.

У обследуемого пациента забирают образец фекалий и определяют уровень фекального кальпротектина методом иммуноферментного анализа.

Параллельно для гематологического и биохимических исследований у обследуемых кровь забирают утром натощак (не менее 12 часов голодания) из локтевой вены в три пробирки.

Первая пробирка объемом 8-10 мл с антикоагулянтом - калиевой солью ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) K2/K3/Na2 в соотношении 1,95 мг ЭДТА/1 мл крови, из крови которой с использованием автоматического гематологического анализатора определяют гематологические показатели: уровень гемоглобина, гематокрит, средний корпускулярный объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС), скорость оседания эритроцитов.

Вторая пробирка объемом 8-10 мл с активатором свертывания и гелем, кровь выдерживают 15 минут при комнатной температуре, отделяют стеклянной палочкой сгусток от стенок пробирки, центрифугируют на центрифуге при 2000 оборотов/мин в течение 10 минут с целью получения сыворотки крови, которую тут же отделяют от сгустка, помещают в две сухие чистые пробирки. Далее в сыворотке крови первой пробирки методом иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов ELISA (Cloud-Clone Corp., USA) на ИФА анализаторе определяют концентрации С-реактивного белка, ферритина (Biomerica). Из сыворотки крови второй пробирки с помощью процедур экстракции и переэтерификации [процедуры описаны в источнике: Кручинина М.В., Кручинин В.Н., Прудникова Я.И., Громов А.А., Шашков М.В., Соколова А.С. Исследование уровня жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови у пациентов с колоректальным раком г. Новосибирска. Успехи молекулярной онкологии. 2018; 5(2): 50-61. DOI: 10.17650/2313-805Х-2018-5-2-50-61] получают образцы для определения уровней жирных кислот - арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот, отношения омега 6 к омега 3 полиненасыщенным жирным кислотам методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии с помощью ГХ/МС системы на основе трех квадруполей Agilent 7000 В (США) - из соотношений площадей пиков каждой кислоты на хроматограмме вычисляют массовые соотношения жирных кислот.

Третья пробирка объемом 8-10 мл с цитратом натрия: 0,109 моль/л, 3,2%, соотношение с кровью 1:9, кровь выдерживают кровь 15 минут при комнатной температуре, затем центрифугируют на центрифуге при 1200 оборотов/мин в течение 10 минут с целью получения плазмы крови, которую тут же отделяют от взвеси эритроцитов, помещают в сухую чистую пробирку. Далее в плазме крови Клоттинговым методом определяют концентрацию фибриногена. Взвесь эритроцитов подвергают трехкратному отмыванию фосфатным буфером, содержащим 0,103 М Na2HPO4 и 0,155 М KH2PO4, (рН=7,36) при 2000 оборотов/мин в течение 20 минут для получения отмытых эритроцитов, из которых с помощью процедур экстракции и переэтерификации получают образцы мембран эритроцитов для определения в них уровней олеиновой, арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии с помощью ГХ/МС системы на основе трех квадруполей Agilent 7000 В (США), после чего вычисляют два диагностических индекса Y_D1 и Y_D2 по формулам

Y_D1=1/[1+exp(-S_D1)]

Где S_D1=-0,0068*Hb+0,2219*СОЭ-0,0101*Фер+0,1138*ФКП-0,4724*эрОлК+0,0409*эрАраК+0,4365*сАраК+0,0136*эрПНЖК-0,0215*сПНЖК-0,0083*сО6/O3

Y_D2=1/[1+exp(-S_D2)]

Где S_D2=-0,014*Hb+0,1751*Ht-0,0212*MCV-0,2974*MCH+0,0334*МСНС+0,0516*СОЭ+0,005*Фер-0,0342*СРБ-1,1244*ФГ+0,0014*ФКП-0,0328*эрОлК

и при значении диагностического индекса Y_D1 превышающем 0,66 принимают решение о вероятности наличия воспалительного заболевания кишечника и при значении диагностического индекса Y_D2 превышающем 0.5 принимают решение о вероятности наличия язвенного колита, менее 0.5 - о вероятности наличия болезни Крона.

Для доказательства результативности заявленного технического результата проведены экспериментальные исследования.

Обследовано 91 пациент (49 женщин, 42 мужчин, средний возраст 37,7±12,1 года) с ВЗК и 53 пациента группы сравнения (28 женщин, 25 мужчин, средний возраст - 43,3±11,7 года).

Группа пациентов с ВЗК включала в себя больных с язвенным колитом (ЯК) - 50 человек, с болезнью Крона (БК) - 41 человек. Диагноз был верифицирован на основании сочетания данных анамнеза, клинической картины и типичных эндоскопических и гистологических изменений в соответствии с Клиническими рекомендациями по диагностике и лечению болезни Крона у взрослых, 2020; Клиническими рекомендациями по язвенному колиту, утвержденными Минздравом России, 2020. Стадия (ремиссия - обострение) заболевания определялась по совокупности оценки клинических, морфологических и лабораторных показателей.

В качестве группы контроля были отобраны лица, проходившие профилактическое обследование, - 53 человека, ведущие здоровый образ жизни, употребляющие алкоголь не чаще 1-2 раз в месяц в дозах, не превышающих 20 г в сутки в пересчете на чистый этанол, без манифестирующей патологии внутренних органов.

В исследование включены пациенты с воспалительными заболеваниями кишечника, находившиеся на обследовании и лечении в гастроэнтерологическом отделении ЧУЗ «Клиническая больница «РЖД-Медицина» г. Новосибирск», кабинете воспалительных заболеваний кишечника в составе Городского бюджетного учреждения здравоохранения НСО «Городской инфекционной клинической больницы №1», в медицинском центре «Гастроцентр».

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы библиотек анализа данных для Python (scikit-learn). Формулы расчета диагностических индексов Y_D1 и YD2 были получены с использованием библиотек анализа данных для Python (scikit-learn).

В ходе исследования были выявлены изменения показателей красной крови, концентрации сывороточных, фекальных маркеров воспаления, уровней жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови у пациентов с ВЗК, в том числе при разных нозологических формах в стадии обострения. Основные результаты анализа показателей значимые для построения диагностических панелей у пациентов с ВЗК и лиц группы контроля для параметров общего анализа крови, показатели обмена железа, биохимии приведены в Табл. 1, и уровни жирных кислот мембран эритроцитов, сыворотки крови приведены в Табл. 2. Для Табл. 1. и Табл. 2 результаты представлены в виде: (М±SD), Me [25%; 75%].

Выявлено достоверное снижение уровня гемоглобина, гематокрита, среднего корпускулярного объема эритроцитов, среднего содержания и концентрации гемоглобина в эритроците, уровня ферритина (р<0,00001) у пациентов с ВЗК по сравнению с группой контроля и, напротив, значимое повышение уровня маркеров воспаления - СОЭ, СРБ, фибриногена, фекального кальпротектина (р=0,00001-0,00002). Пациенты с язвенным колитом в стадии обострения имели меньший СКОЭ (р=0,007), МСН (р=0,082), МСНС (р=0,056), СОЭ (р=0,055), уровень ферритина (р=0,014), СРБ (р=0,002), фибриногена (р<0,0001), фекального кальпротектина (р=0,005), чем пациенты с болезнью Крона в активной стадии.

Уровни олеиновой кислоты в мембранах эритроцитов (р=0,0031), суммарное содержание ПНЖК в сыворотке (р=0,0018) оказалось ниже, а отношение омега3/омега 6 ПНЖК (р=0,0005) - выше у пациентов с ВЗК по сравнению с контрольной группой. По уровню арахидоновой кислоты как в мембранах эритроцитов, так и в сыворотке крови, как и по суммарному содержанию ПНЖК в эритроцитах пациенты с ВЗК не отличались от группы сравнения. Уровни всех исследованных ЖК в группах с разными нозологическими формами ВЗК достоверно не различались.

Для различения групп пациентов с ВЗК и обследуемых группы сравнения, а также нозологических форм ВЗК - язвенного колита и болезни Крона в стадии обострения - с учетом показателей красной крови, серологических, фекальных маркеров воспаления, уровней жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови в ходе экспериментальных исследований была получена формулы M1 и М2 расчета диагностических индексов Y_D1 и Y_D2

с высокими оценками диагностической точности - 0.968, чувствительности - 0.974 и специфичности - 0.941 при пороговом значении диагностического индекса Y_D=0.66 для первой модели (M1) для дифференцирования пациентов с ВЗК от здоровых лиц

и диагностической точностью - 0.891, чувствительностью - 0.993 и специфичности -0.887 при пороговом значении диагностического индекса Y_D=0.5 для второй модели (М2) для различения пациентов с язвенным колитом в стадии обострения от пациентов с активной болезнью Крона. Характеристики точности для моделей M1 и М2 приведены в таблице 3.

Заявляемый способ обеспечивает выявление наличия воспалительного заболевание кишечника у пациента, при подтверждении диагноза ВЗК - установление наиболее вероятной нозологической формы заболевания для дальнейшей разработки тактики профилактических и лечебных мероприятий.

Предлагаемый способ позволяет определить с высокой диагностической точностью позволяет исключить наличие воспалительного заболевания кишечника при проведении диагностического поиска, установить вероятность наличия определенной нозологической формы ВЗК - язвенного колита или болезни Крона при проведении дифференциальной диагностики, что значимо для тактики ведения пациента, прогноза. Данный способ является малоинвазивным, безопасным, не требующим больших финансовых затрат, может быть выполнен в условиях медицинских и научных учреждений, в том числе для скрининг-обследования больших групп населения.

Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами. Пример 1.

Пациент №21, мужчина, возраст 33 года, обратился в клинико-диагностическое отделение НИИ ТПМ-филиал ИЦиГ СО РАН с жалобами на эпизоды диарреи, периодически - боли в животе. При проведении дифференциальной диагностики было необходимо исключить наличие ВЗК. Выполнено исследование общего анализа крови, проведен биохимический анализ сыворотки, плазмы крови, определен фекальный кальпротектин, уровни жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови, произведен расчет результатов по формуле для Модели 1. Результаты расчетов приведены в таблице 4.

Y_D1=0.02, что МЕНЬШЕ 0.66. Согласно данным Модели 1.

Проведенное эндоскопическое, гистологическое исследование, данные иммунологических маркеров (отрицательные результаты на ASCA и pANCA) подтвердили отсутствие у пациента воспалительного заболевания кишечника.

Пример 2. Пациентка №160, женщина, возраст 34 года. В течение 6 лет наблюдается у гастроэнтеролога с диагнозом «Неклассифицируемый колит». В течение данного срока наблюдения за пациенткой после изучения истории болезни, анализа эндоскопических проявлений, гистологического исследования множественных биопсий слизистой оболочки и адекватного рентгенологического исследования не удалось установить нозологическую форму ВЗК - ЯК или БК, при этом были исключены колиты, обусловленные другой причиной.

Пациентке выполнено исследование общего анализа крови, проведен биохимический анализ сыворотки, плазмы крови, определен фекальный кальпротектин, уровень олеиновой кислоты мембран эритроцитов, произведен расчет результатов по формуле для Модели 1 и по результатам оценки вероятности дополнительно для Модели 2. Результаты расчетов приведены в таблице 5.

Y_D1=1.00, что БОЛЬШЕ 0.66. Согласно данным Модели 1, у пациентки ВЫСОКАЯ вероятность наличия ВЗК.

Y_D2=0.101, что МЕНЬШЕ 0.5. Согласно данным Модели 2, у пациентки с большей вероятностью можно сделать заключение о наличии болезни Крона.

В течение последующих 2ух лет наблюдения у пациентки выявлено поражение двенадцатиперстной кишки, что подтверждает диагноз - болезнь Крона.

Пример 3. Пациент №92, мужчина, возраст 38 лет, наблюдается у гастроэнтеролога с язвенным колитом, левосторонним, с рецидивирующим течением с системными проявлениями - серонегативным спондилоартритом, сакроилеитом, коксартрозом с эпизодами высокой активности. Стаж болезни составил 17 лет. Отмечен низкий комплайенс по приему лекарственных препаратов, выявлена плохая переносимость сульфасалазина. В связи с необходимостью назначения терапии рекомендовано комплексное обследование.

Пациенту выполнено исследование общего анализа крови, проведен биохимический анализ сыворотки, плазмы крови, определен фекальный кальпротектин, уровень олеиновой кислоты мембран эритроцитов, произведен расчет результатов по формуле для Модели 1 и по результатам оценки вероятности дополнительно для Модели 2. Результаты расчетов приведены в таблице 6.

Y_D1=0.988, что БОЛЬШЕ 0.66. Согласно данным Модели 1, у пациента ВЫСОКАЯ вероятность наличия ВЗК.

Y_D2=0.847, что БОЛЬШЕ 0.5. Согласно данным Модели 2, у пациента с большей вероятностью можно сделать заключение о наличии болезни язвенный колит.

Данные эндоскопического, гистологического исследования также соответствовали данному диагнозу, что позволило назначить пациенту моноклональные антитела (Инфликсимаб), наиболее эффективные при язвенном колите.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для дифференциального определения вероятности наличия воспалительных заболеваний кишечника путем исследования уровня фекального кальпротектина, показателей красной крови, биохимических параметров, уровней жирных кислот сыворотки крови и мембран эритроцитов. У пациента забирают образец фекалий и определяют уровень фекального кальпротектина методом иммуноферментного анализа, параллельно забирают венозную тощаковую кровь в три пробирки: первая пробирка с антикоагулянтом - калиевой солью этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), из крови которой с использованием автоматического гематологического анализатора определяют уровень гемоглобина, гематокрита, средний корпускулярный объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (МСН), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (МСНС), скорость оседания эритроцитов. Вторая пробирка с активатором свертывания и гелем, из которой получают сыворотку крови, которую тут же отделяют от сгустка, помещают в две сухие чистые пробирки. Далее в сыворотке крови первой пробирки методом иммуноферментного анализа определяют С-реактивный белок, ферритин, из сыворотки крови второй пробирки получают образцы для определения уровней жирных кислот - арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот, отношения омега 6 к омега 3 полиненасыщенным жирным кислотам методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Третья пробирка с цитратом натрия, из которой получают плазму крови, которую тут же отделяют от взвеси эритроцитов, далее в плазме крови Клоттинговым методом определяют концентрацию фибриногена, взвесь эритроцитов подвергают трехкратному отмыванию фосфатным буфером для получения отмытых эритроцитов, из которых получают образцы мембран эритроцитов для определения уровней олеиновой, арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии, после чего вычисляют два диагностических индекса Y_D1 и Y_D2 по оригинальным формулам. При значении диагностического индекса Y_D1, превышающем 0,66, определяют вероятность наличия воспалительного заболевания кишечника. Если Y_D1 превышает 0,66, то вычисляют Y_D2. При значении диагностического индекса Y_D2, превышающем 0,5, определяют вероятность наличия язвенного колита. При значении диагностического индекса Y_D2 менее 0,5 - вероятность наличия болезни Крона. Способ обеспечивает возможность повышения специфичности и точности верификации диагноза воспалительных заболеваний кишечника на более ранних стадиях с определением его вариантов за счет учета показателей красной крови, уровней сывороточных и фекальных маркеров воспаления, уровней жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови. 3 ил., 6 табл., 3 пр.

Способ дифференциального определения вероятности наличия воспалительных заболеваний кишечника путем исследования уровня фекального кальпротектина, показателей красной крови, биохимических параметров, уровней жирных кислот сыворотки крови и мембран эритроцитов, состоящий в том, что у пациента забирают образец фекалий и определяют уровень фекального кальпротектина методом иммуноферментного анализа, параллельно забирают венозную тощаковую кровь в три пробирки: первая пробирка с антикоагулянтом - калиевой солью этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) K₂/K₃/Na₂ в соотношении 1,95 мг ЭДТА/1 мл крови, из крови которой с использованием автоматического гематологического анализатора определяют уровень гемоглобина, гематокрита, средний корпускулярный объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (МСН), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (МСНС), скорость оседания эритроцитов; вторая пробирка с активатором свертывания и гелем, выдерживают кровь 15 мин при комнатной температуре, отделяют стеклянной палочкой сгусток от стенок пробирки, центрифугируют на центрифуге при 2000 об/мин в течение 10 мин с целью получения сыворотки крови, которую тут же отделяют от сгустка, помещают в две сухие чистые пробирки, далее в сыворотке крови первой пробирки методом иммуноферментного анализа определяют С-реактивный белок, ферритин, из сыворотки крови второй пробирки с помощью процедур экстракции и переэтерификации получают образцы для определения уровней жирных кислот - арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот, отношения омега 6 к омега 3 полиненасыщенным жирным кислотам методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии; третья пробирка с цитратом натрия: 0,109 моль/л, 3,2%, соотношение с кровью 1:9, выдерживают кровь 15 минт при комнатной температуре, затем центрифугируют на центрифуге при 1200 об/мин в течение 10 мин с целью получения плазмы крови, которую тут же отделяют от взвеси эритроцитов, помещают в сухую чистую пробирку, далее в плазме крови Клоттинговым методом определяют концентрацию фибриногена, взвесь эритроцитов подвергают трехкратному отмыванию фосфатным буфером, содержащим 0,103 М Na₂HPO₄ и 0,155 М KH₂PO₄ (рН=7,36), при 2000 об/мин в течение 20 мин для получения отмытых эритроцитов, из которых с помощью процедур экстракции и переэтерификации получают образцы мембран эритроцитов для определения уровней олеиновой, арахидоновой, суммы полиненасыщенных жирных кислот методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии, после чего вычисляют два диагностических индекса Y_D1 и Y_D2 по формулам

Y_D1=1/[1+exp(-S_D1)],

где S_D1=-0,0068⋅Hb+0,2219⋅СОЭ-0,0101⋅Фер+0,1138⋅ФКП-0,4724⋅эрОлК+0,0409⋅эрАраК+0,4365⋅сАраК+0,0136⋅эрПНЖК-0,0215⋅сПНЖК-0,0083⋅сО6/O3,

и

Y_D2=1/[1+exp(-S_D2)],

где S_D2=-0,014⋅Hb+0,1751⋅Ht-0,0212⋅MCV-0,2974⋅MCH+0,0334⋅МСНС+0,0516⋅СОЭ+0,005⋅Фер-0,0342⋅СРБ-1,1244⋅ФГ+0,0014⋅ФКП-0,0328⋅эрОлК,

где

Hb - уровень гемоглобина, г/л;

Ht - гематокрит, %;

МСН - среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, пг;

МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, г/л;

MCV - средний корпускулярный объем эритроцита, фл;

сО6/O3 - отношение омега 6 к омега 3 полиненасыщенным жирным кислотам в сыворотке крови;

сАраК - содержание арахидоновой кислоты в сыворотке крови С20:4n-6 (эйкозатетраеновая), %;

СОЭ - скорость оседания эритроцитов, мм/ч;

сПНЖК - суммарное содержание полиненасыщенных жирных кислот в сыворотке крови, %;

СРБ - С-реактивный белок, мг/л;

ФГ - фибриноген, г/л;

Фер - ферритин, мкг/л;

ФКП - фекальный кальпротектин, мкг/г;

эрАраК - содержание арахидоновой кислоты в эритроцитах С20:4n-6 (эйкозатетраеновая), %;

эрОлК - содержание олеиновой кислоты в эритроцитах С18:1; с9 (цис-9-октадекановая), %;

эрПНЖК - суммарное содержание полиненасыщенных ЖК в эритроцитах, %;

и при значении диагностического индекса Y_D1, превышающем 0,66, определяют вероятность наличия воспалительного заболевания кишечника, при значении диагностического индекса Y_D2, превышающем 0,5, определяют вероятность наличия язвенного колита и при значении диагностического индекса Y_D2 менее 0,5 - вероятность наличия болезни Крона.