СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ ДЛЯ ХИРУРГИЧЕСКОЙ ИМПЛАНТАЦИИ Российский патент 2024 года по МПК A61L27/36 A61L27/50 A61F2/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу обработки биологических тканей и биологической ткани, полученной этим способом обработки, и конкретно к способу обработки биологических тканей с тем, чтобы подавить кальцификацию, опасность прилипания биологической пленки к перикарду и снижение прочности ткани из-за обработки. Изобретение также относится к биопротезу и транскатетрным сердечным клапанам, содержащим биологическую ткань

Предпосылки создания изобретения

Биологические ткани широко используются для получения эндопротезов клапанов сердца и кровеносных сосудов, а также для транскатетрных клапанов сердца. Они являются соединительными тканями, включающими коллаген как основной компонент. Среди таких тканей бычий перикард является одним из наиболее широко используемых. Перикардиальная ткань представляет собой мешок, окружающий сердце, который обеспечивает естественный барьер для инфекции для сердца и предотвращает прилипание к окружающей ткани. Перикард также выполняет механические роли, например, предотвращая расширение сердца, поддерживая правильное анатомическое положение сердца и регулируя отношение давления к объему в левом желудочке во время расширения. Структура ткани определяет ее поведение при нагрузке как в состояниях, физиологических для перикарда, так и в протезе.

Однако биологические ткани, полученные со скотобойни, в частности, свиных и бычьих кадавров, сразу же начинают разлагаться. Поэтому, для возможности использования биологических тканей как клинического материала это повреждение должно быть остановлено. Целью является сохранение исходной структурной и механической целостности материала и удаление или по меньшей мере нейтрализация антигенных свойств, присущих этим материалам. Способы типично сосредоточены на создании новых дополнительных химических связей между молекулами коллагена. Эти дополнительные связи усиливают ткань для получения плотного и прочного, но неживого материала, который сохраняет исходную форму ткани. Для этой цели биологическую ткань, такую как, например, бычий или свиной перикард или сердечный клапан, обрабатывают химически для того, чтобы улучшить ее механические данные и иммуногенные свойства, уменьшить тромбообразование и разрушение, сохранить стерильность и продлить допустимый период хранения.

Соответственно, большое значение имеет выбор способа обработки биологической ткани, используемой для имплантации, который делает ткань легкодоступной для медицинского персонала с минимальной подготовкой перед операцией. Это снижает возможность ошибки и также время имплантации.

В этой связи известны уровне техники известны различные исследования, в которых биологические ткани обрабатывали различными способами. В этой связи даются следующие далее ссылки.

US 2008/0102439 A1 относится к получению или хранению биологических тканей, в частности, ткани млекопитающего, применимой для хирургической имплантации, причем указанный способ получения включает контактирование биологической ткани с неводным раствором для обработки, включающим многоатомный спирт, такой как глицерин, и C1-C3-спирт, и удаление части раствора для обработки из обработанной раствором биологической ткани. Ткань млекопитающего выбирают из группы, включающей перикард, корни аорты и легкого и клапаны, сухожилия, связки, кожу, твердую мозговую оболочку и брюшину.

US 2018/0133365 A1 представляет способ получения сухого материала из коллагеновых волокон животного происхождения, включающий стадии промывки материала из коллагеновых волокон животного происхождения, который обработан сшивающим агентом, погружения промытого тканевого материала в неводный спиртовый раствор для дегидратации, последующего погружения тканевого материала, который дегидратирован с помощью неводного спиртового раствора, в растворы сахаридов с различными градиентами концентрации для градиентной дегидратации, извлечения и сушки градиентно дегидратированного тканевого материала, герметичной упаковки высушенного тканевого материла и стерилизации.

В US 2011/0300625 A1 описывается способ получения ткани, в частности, ткани перикарда, который включает предоставление среза ткани, взятого из организма млекопитающего, и вызывание осмотического шока у среза ткани путем выполнения нескольких промывок среза ткани дистиллированной водой и затем промывки среза ткани изопропиловым спиртом и контактирования среза ткани с раствором формалина или раствором глутарового альдегида.

В US 5413798 раскрывается способ получения материалов бычьего перикарда и применение полученных таким образом материалов в качестве трансплантатов или имплантов в медицине и ветеринарии. В частности, в указанном документе описывается способ обработки ткани бычьего перикарда, включающий стадии жидкостной химической обработки ткани перикарда, сушки ткани перикарда и стерилизации ткани перикарда, причем жидкостная химическая обработка включает отделение от поверхности указанной ткани любого налипшего жира и базальной мембраны, контактирование указанной ткани с водным щелочным раствором, контактирование указанной ткани с раствором комплексообразователя, содержащего динатрий-ЭДТК, и контактирование указанной ткани с водным буферным раствором, имеющим рН 4,5-6,0, и промывку водой.

При другом подходе в WO 01/41828 описывается способ обработки биоматериала, включающий контактирование биоматериала с раствором для антикальцификационной обработки, причем указанный раствор для антикальцификационной обработки выбирают из группы, включающей растворы высших спиртов, растворы полиолов и растворы полярных апротонных органических растворителей.

Кроме того, в US 2001/0023372 A1 раскрывается способ получения компонента ткани для сухого хранения, включающий предоставление компонента ткани животного, обработку указанного компонента ткани водным раствором для обработки, включающим стабилизатор размеров, такой как глицерин или его производное, и хранение указанного тканевого компонента ткани в контейнере, который по существ свободен от жидкости.

Соответственно, каждая из упомянутых выше заявок на патент сделана для разработки биологической ткани, которую можно использовать в качестве биопротезов, которые можно хранить сухими до использования в клинических применениях. Однако имеются некоторые недостатки, связанные с вышеупомянутыми способами получения ткани. Например, после имплантации биологическая ткань, особенно ткань, фиксированная альдегидом, восприимчива к образованию дегенеративных кальцифицированных отложений. Кальцификация, в частности, патологическая кальцификация, мягких биологических тканей из-за отложения минеральных солей фосфата кальция в имплантированной ткани является нежелательной, и осаждение кальцифицированных отложений может иметь тяжелые последствия для работоспособности устройства. Кальцификация имплантов может привести к сдвигу, структурной нестабильности и в конечном счете к отказу устройства.

Следовательно, очень важно предоставить биологические ткани, имеющие устойчивость к кальцификации, особенно потому, что заболевания клапанов сердца требуют операции по замене клапанов у более, чем нескольких сотен тысяч человек в мире каждый год.

Большинство клинически доступных биопротезов клапанов сердца состоят из ткани бычьего перикарда, фиксированной в глутаровом альдегиде, установленной в стенте. Фиксация в глутаровом альдегиде эффективно сшивает коллаген в ткани и в высшей степени элиминирует иммуногенность и тромбогенность биопротеза. Однако большое количество биопротезов клапанов сердца выходят из строя из-за патологической кальцификации клапана, вызывающей сдвиг и разрыв.

Соответственно желательно предоставление нового антикальцификационного подхода с повышенной эффективностью и простотой применения. Таким образом, существует потребность в эффективном способе придания антикальцификационных свойств биологическим тканям, используемым для хирургической имплантации, которая не сопровождается разрушительным действием, а также обеспечивает улучшенные механические характеристики биологической ткани во время хранения.

Сущность изобретения

По этой причине целью настоящего изобретения является новый способ получения биологической ткани, подходящей для стерильного сухого хранения, т.е., без погружения в жидкий консервирующий раствор. Другой целью настоящего изобретения является новый способ, который приводит доступные биологические ткани для хирургической имплантации в настолько близкую к готовой к применению форму, насколько возможно. Другой целью настоящего изобретения является способ обработки биологической ткани, который уменьшает кальцификацию биологической ткани, опасность прилипания биопленки к перикарду и предоставляет улучшенные механические свойства биопротезу, включающему биологическую ткань.

Эта цель достигается способом, включающим особенности по п.1 формулы изобретения. Конкретные варианты осуществления изобретения описаны в зависимых пунктов формулы изобретения.

В связи с этим в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу обработки биологической ткани, включающему стадии

(1) замачивания биологической ткани, обработанной сшивающим агентом, в солевом растворе;

(2) контактирования замоченной биологической ткани с водным раствором, включающим пероксид водорода;

(3) контактирования биологической ткани с водным раствором, включающим ФСБ и ЭДТК;

(4) контактирования биологической ткани с раствором, включающим глицерин, этанол и ЭДТК; и

(5) контактирования биологической ткани с глицериновым раствором.

В одном воплощении способ дополнительно включает стадии (3а) и/или (5а) контактирования биологической ткани с этанолом в концентрации по меньшей мере 70 об.%.

Предпочтительно сшивающий агент, используемый согласно заявляемому способу, представляет собой глутаровый альдегид, например, в концентрации, выбранной в интервале 0,1 об.% - 5,0 об.%.

Предпочтительно, когда биологическая ткань согласно заявляемому способу представляет собой бычий или свиной перикард или сердечный клапан.

Преимущественно солевой раствор согласно заявляемому способу представляет собой водный раствор, включающий 0,9 об.% хлорида натрия.

Предпочтительно, когда концентрация пероксида водорода на стадии (2) согласно заявляемому способу составляет от 0,05 до 5,0 об.%.

Предпочтительно, когда объемное отношение глицерина к этанолу на стадии (4) согласно заявляемому способу составляет от 1:5 до 5:1.

Преимущественно концентрация ЭДТК на стадиях (3) и (4) согласно заявляемому способу составляет 0,01 мас.% - 10,0 мас.%.

Также предпочтительно, когда способ дополнительно включает стадии (6) сушки биологической ткани, (7) помещения биологической ткани в упаковку, (8) герметизации упаковки и (9) стерилизации упаковки.

Также предпочтительно, когда стадии (1)-(9) осуществляют непрерывно, т.е., одну за другой или последовательно.

Предпочтительно стерилизацию упаковки, включающей биологическую ткань согласно заявляемому способу, выполняют путем воздействия на упаковку газа этиленоксида.

Также предпочтительно, когда стадии (1)-(7) заявляемого способа выполняют при температуре 10°С – 25°С, предпочтительно при температуре 15°С – 25°С, предпочтительнее при температуре 18°С – 22°С

Предпочтительно стадии (4) и (5) заявляемого способа выполняют при перемешивании в течение по меньшей мере 60 минут.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к биологической ткани, включающей биологическую ткань, полученную согласно заявляемому способу.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению биологической ткани, полученной согласно заявляемому способу, для хирургической имплантации, а также к применению биологической ткани в качестве биопротеза и транскатетерных сердечных клапанов.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Кальцификация испытываемых образцов перекарда из примеров 1-1 – 1-3.

Фиг.2. Изображения бычьего перикарда, полученные на сканирующем электронном микроскопе (SEM): (а) и (с) без SBF, (b) и (d) погруженные в растворы SBF на 24 часа.

Фиг.3. Предел прочности при растяжении испытываемых образцов бычьего перикарда на различных стадиях получения.

Фиг.4. Изображение для гистологической оценки с использованием окрашивания образца сухого бычьего перикарда, полученное с помощью оптического микроскопа (Eclipse E-200 Nikon с видеоцифровым full HD Lite 1080p, Tucsen).

Фиг.5. Изображение для гистологической оценки с использованием окрашивания стандартного образца бычьего перикарда, полученное с помощью оптического микроскопа (Eclipse E-200 Nikon с видеоцифровым full HD Lite 1080p Tucsen).

Фиг.6. Изображение образца сухого бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (200×).

Фиг.7. Изображение образца сухого бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (3000×).

Фиг.8. Изображение образца сухого бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (50000×).

Фиг.9. Изображение образца сухого бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (100000×).

Фиг.10. Изображение образца стандартного бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (200×).

Фиг.11. Изображение образца стандартного бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (3000×).

Фиг.12. Изображение образца стандартного бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (50000×).

Фиг.13. Изображение образца стандартного бычьего перикарда, полученное на сканирующем электронном микроскопе (100000×).

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу обработки биологической ткани. Предпочтительно способ относится к биологической ткани, содержащей такую обработанную ткань в готовой к применению форме для хирургической имплантации.

Термин «биологическая ткань», используемый в настоящем описании, относится вообще к обработанным или необработанным содержащим коллаген материалам, происходящим от человека, или животного происхождения.

В настоящем изобретении предпочтительно использовать в качестве материала биологической ткани животного происхождения перикард или сердечный клапан, в частности, полученные из свиного или бычьего сердца, который обрабатывают сшивающим агентом. Естественные сердечные клапаны человека определяются как аортальный, митральный, трехстворчатый клапаны и клапан легочного ствола. Ткань перикарда или ткани сердечных клапанов используют для замены поврежденных или больных сердечных клапанов и для замены любого из упомянутых выше естественных клапанов.

В этой связи биологические ткани, полученные согласно способу по настоящему изобретению, применяют для конструирования «биопротеза», имеющего функцию, очень схожую с естественным сердечным клапаном человека, причем биопротез имитирует естественное действие гибких створок сердечного клапана. Тканевые сердечные клапаны являются также весьма сложными и трудоемкими в изготовлении, поскольку они должны быть изготовлены в соответствии с точными стандартами и допусками, чтобы функционировать в течение многих лет в динамической среде сердца живого пациента.

Основным компонентом биологических тканей является коллаген. Молекулы коллагена состоят из трех цепочек полиаминокислот, расположенных в трехспиральной конфигурации, заканчивающейся в неспиральных карбоксильных и аминоконцах. Такие молекулы коллагена собираются с образованием микрофибрилл, которые в свою очередь собираются в волокна и в результате в коллагеновые волокна. Поскольку коллагеновые ткани быстро распадаются после имплантации хозяину-реципиенту, необходимо стабилизировать ткань, если ее используют для клинических применений. Химической стабилизации ткани путем сшивания, также известной как фиксация ткани, достигают с использованием ряда соединений.

Наиболее обычно в химической фиксации используют полифункциональные молекулы, имеющие две или больше реактивных групп, способных образовывать необратимые и устойчивые межмолекулярные и внутримолекулярные химические связи с реакционноспособными боковыми группами аминокислот, присутствующих в молекулах коллагена.

Наиболее широко из таких полифункциональных молекул используется глутаровый альдегид, который имеет альдегидную группу на каждом конце линейной алифатической цепи. Альдегидные группы глутарового альдегида и других подобных молекул взаимодействуют в физиологических условиях с первичными аминогруппами молекул коллагена с образованием в материале поперечных связей. Полученная таким путем сшитая глутаровым альдегидом ткань показывает возросшую резистентность к ферментативному расщеплению, пониженную иммуногенность и увеличенную стабильность.

Несмотря на широкое использование, существуют некоторые недостатки, связанные со сшиванием ткани глутаровым альдегидом. Например, после имплантации ткань, фиксированная альдегидом, восприимчива к образованию дегенеративных кальциевых отложений, т.е. кальцификации. Кальцификация представляет собой нежелательное осаждение минеральных солей фосфатов кальция в имплантированной ткани и является наиболее существенным фактором повреждения фиксированных глутаровым альдегидом биологических тканей, используемых в биопротезах.

В одном воплощении настоящего изобретения используется замачивание биологической ткани, обработанной сшивающим агентом, в солевом растворе.

При использовании в настоящем описании сшивающий агент представляет собой глутаровый альдегид, который предпочтительно используют в применениях в биохимии и медицине как реагирующий с аминогруппой гомофункциональный сшиватель. Как уже упоминалось выше, обработка глутаровым альдегидом дает устойчивые поперечные связи в клеточных белках и белках внеклеточного матрикса, что в значительной степени снижает иммуногенность трансплантата. Однако такая ткань имеет измененные механические свойства, раннее механическое повреждение, цитотоксичность и неполное подавление иммунологического распознавания. Кроме этого, в обработанном глутаровым альдегидом бычьем перикарде отмечается сильная кальцификация. Перспективной альтернативой обработке глутаровым альдегидом является дополнительная обработка согласно способу по настоящему изобретению, т.е., способу, позволяющему уменьшить кальцификацию биологической ткани.

В настоящем изобретении предпочтительно использовать сшивающий агент в количестве от 0,1 об.% до 5,0 об.%, предпочтительнее от 0,2 об.% до 3,0 об.%, также предпочтительно от 0,3 об.% до 2,0 об.% и особенно предпочтительно от 0,5 об.% до 1,0 об.%.

В этой связи как первую стадию выполняют замачивание биологической ткани в водном солевом растворе, включающем 0,9% хлорида натрия (9,0 г на литр). Такой раствор обычно называют также нормальным солевым раствором, физиологическим раствором или изотоническим солевым раствором.

На второй стадии способа по настоящему изобретению замоченную биологическую ткань вводят в контакт с водным раствором, включающим пероксид водорода. Предпочтительно, когда концентрация пероксида водорода составляет от 0,05 об.% до 5,0 об.%, предпочтительно от 0,1 об.% до 3,0 об.%, предпочтительнее от 0,2 об.% до 2,0 об.%.

На третьей стадии способа по настоящему изобретению биологическую ткань вводят в контакт с водным раствором, включающим ФСБ и ЭДТК.

При использовании в настоящем описании термин «контактирование» означает обработку, погружение, воздействие на, промывку биологической ткани, используемой в способе по изобретению.

При использовании в настоящем описании термин «ФСБ» относится к забуференному фосфатом физиологическому раствору, имеющему рН 7,4, и содержащему водный солевой раствор дигидрофосфата натрия, хлорид натрия и, в некоторых препаратах, хлорид калия и дигидрофосфат калия. ФСБ используют в применениях в биологии и медицине, таких как промывка клеток, перевозка тканей и разбавление, поскольку ФСБ точно имитирует рН, осмолярность и концентрацию ионов в организме человека.

Термин «водный раствор» относится к раствору, включающему вещество или соединение и воду, которая очищена от загрязнений, которые способны влиять на конечный продукт. Предпочтительно в способе по настоящему изобретению используют дистиллированную воду, дважды дистиллированную воду или деонизированную воду.

Термин «ЭДТК» используется в настоящем описании для обозначения этилендиаминтетрауксусной кислоты, которая является комплексообразующим и хелатирующим агентом, способным связывать ионы металлов, особенно подобные Fe²⁺/Fe³⁺, Al³⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, и другие и удалять их из раствора, образуя так называемые ЭДТК-комплексы.

Согласно настоящему изобретению, особенно важно удалять ионы кальция из раствора с помощью хелатообразователя для кальция, что, как показано, ингибирует минерализацию биологических тканей, в частности, ткани бычьего или свиного перикарда. Полагают, что ЭДТК связывает ионы кальция на наружной оболочке кристаллов гидроксиапатита, которые образуются из кристаллов фосфата кальция, посредством этого образуя комплекс и удаляя ионы кальция из кристаллов, вызывая сжатие материала ткани и, таким образом, деминерализацию материала.

Таким образом, обработка биологических тканей ЭДТК замедляет развитие кальцификации за счет связывания кальция до того, как он может реагировать с образованием гидроксиаппатита. Так как кальцификация биологических тканей, используемых, например, в качестве биопротезов сердечных клапанов, является существенной проблемой, которая вносит вклад в разрушение импланта, большое значение имеет снижение уровня кальция в биологических тканях, используемых в качестве импланта. Следовательно, в настоящем изобретении обработка ЭДТК может снизить уровень кальция в биологических тканях, в частности, в бычьем или свином перикарде или сердечном клапане, на 20%, предпочтительнее на 30%, еще предпочтительнее на 40% и особенно предпочтительно на 50%. Кроме того, предпочтительно использовать ЭДТК в комбинации с ФСБ для того, чтобы повысить деминерализацию и совместимость с человеческим организмом.

Также в настоящем изобретении предпочтительно использовать ЭДТК, в частности, на стадиях (3) и (4), в концентрации больше 0,01 мас.%, предпочтительно больше 0,05 мас.%, предпочтительнее больше 0,10 мас.%, еще предпочтительнее больше 0,15 мас.%, и меньше 10,0 мас.%, предпочтительно меньше 8,0 мас.%, предпочтительнее меньше 6,0 мас.%, еще предпочтительнее меньше 5,0 мас.% и еще предпочтительнее меньше 3,0 мас.%. Также в настоящем изобретении предпочтительно использовать динатриевую соль ЭДТК.

На четвертой стадии способа по настоящему изобретению биологическую ткань вводят в контакт с раствором, включающим глицерин, этанол и ЭДТК, и на пятой стадии биологическую ткань вводят в контакт с глицериновым раствором для того, чтобы дополнительно уменьшить кальцификацию биологической ткани и дегиратировать биологическую ткань. Следующие стадии описывают осуществление этих процессов в способе по настоящему изобретению.

После обработки биологических тканей на стадиях (1)-(3) способа по настоящему изобретению их подвергают обработке в растворе, включающем глицерин, этанол и ЭДТК.

В большинстве заметных центров кристаллизации в клетках биологической ткани и вокруг них обнаруживают фосфолипиды. Поэтому предполагается, что удаление этих компонентов ткани уменьшит минерализацию, в частности, кальцификацию. Различные исследования показывают эффективность этих стратегий предупреждения кальцификации. Подобным образом, для этой цели могут использоваться органические растворители, подобные этанолу или глицерину или смеси этанола и глицерина. Например, обработка по меньшей мере 70% этанолом, предпочтительно по меньшей мере 80% этанолом, предпочтительнее по меньшей мере 90% этанолом, экстрагирует фосфолипиды из ткани, вызывая в то же время также изменение конформации коллагена, что повышает резистентность биопротеза к коллагеназе. Таким образом, обработка этанолом позволяет экстрагировать почти все фосфолипиды и холестерины из биопротеза, устраняя таким образом кальцификацию клеток биологической ткани. Кроме того, обработка этанолом также предотвращает адсорбцию фосфолипидов и холестеринов из раствора. Система, по которой глицерин фиксирует биологическую ткань, пока не до конца понятна, но 98% концентрация, предпочтительно 99% концентрация, является достаточной для обработки биологической ткани, чтобы сделать ткань более биосовместимой и резистентной к кальцификации.

В этой связи в настоящем изобретении предпочтительно обрабатывать биологическую ткань в растворе, включающем глицерин, этанол и ЭДТК, в течение по меньшей мере 60 минут, предпочтительно в течение по меньшей мере 70 минут, предпочтительнее в течение по меньшей мере 90 минут, при комнатной температуре, в частности, при температуре 10°С – 25°С, предпочтительно при температуре 15°С – 25°С, предпочтительнее при температуре 18°С – 22°С, при перемешивании со скоростью не более 500 об/мин, предпочтительно не более 300 об/мин, предпочтительнее не более 50 об/мин. На протяжении этого времени большая часть молекул воды, присутствующей в биологической ткани, в частности ткани перикарда, заменяется глицерином.

Также в настоящем изобретении предпочтительно использовать смесь глицерина и этанола, причем объемное отношение глицерина к этанолу предпочтительно составляет от 1:5 до 5:1, предпочтительнее от 1:4 до 4:1, еще предпочтительнее от 1:3 до 3:1, и еще предпочтительнее от 1:2 до 2:1.

Затем биологические ткани извлекают из раствора и помещают в глицерин для дальнейшей дегидратации в течение по меньшей мере 60 минут, предпочтительно в течение по меньшей мере 75 минут, предпочтительнее в течение по меньшей мере 90 минут, при комнатной температуре, в частности, при температуре 10°С – 25°С, предпочтительно при температуре 15°С – 25°С, предпочтительнее при температуре 18°С – 22°С, при перемешивании со скоростью не более 500 об/мин, предпочтительно не более 300 об/мин, предпочтительнее не более 50 об/мин.

Кроме того, в настоящем изобретении предпочтительно использовать дополнительную стадию контактирования или промывки биологической ткани этанолом, имеющем концентрацию по меньшей мере 70 об.%, предпочтительно по меньшей мере 80 об.%, предпочтительнее по меньшей мере 90 об.%. Дополнительную стадию, в частности стадию (3а), предпочтительно выполняют до контактирования биологической ткани с раствором, включающим глицерин, этанол и ЭДТК. Также предпочтительно выполнять другую дополнительную стадию (5а) контактирования биологической ткани с этанолом после стадии контактирования биологической ткани с глицерином и перед стадией сушки биологической ткани. Еще предпочтительнее выполнять дополнительные стадии (3а) и/или (5а) с использованием смеси этанола и ЭДТК в концентрации как на стадии (3) или (4).

Биологические ткани извлекают из раствора и подвергают воздействию воздуха или инертной окружающей среды, например, азота, при комнатной температуре и влажности, чтобы не нанести вреда свойствам ткани. Предпочтительно сушку выполняют в чистой комнате в условиях окружающей среды в течение по меньшей мере 12 часов, предпочтительно в течение по меньшей мере 16 часов, предпочтительнее в течение по меньшей мере 20 часов. Также предпочтительно сушку выполняют под высокоэффективным воздушным фильтром (НЕРА), в частности, под НЕРА, в условиях чистой комнаты. Используемый в настоящем описании термин «условия окружающей среды» относится к температуре окружающей среды выше 10°С, предпочтительно выше 18°С, и предпочтительно ниже 25°С, предпочтительнее ниже 23°С, даже предпочтительнее ниже 22°С. Также в настоящем изобретении предпочтительно выполнять каждую из стадий (1)-(7) в условиях окружающей среды, описанных выше.

Затем обработанные и высушенные биологические ткани упаковывают в контейнер или упаковку, по существу свободную от жидкости, для последующей хирургической имплантации. При использовании в настоящем описании термин «по существу свободная от жидкости» обозначает нетекучую среду, в которой присутствие воды или других веществ ограничено приблизительно до содержания таких веществ в окружающем воздухе.

Другим предпочтительным способом является применение вакуума для упаковки для минимизации уровня кислорода, и дополнительно можно использовать вытеснение инертным газом, таким как азот. Такие методы стерильной упаковки известны специалистам в данной области техники.

Затем упакованную обработанную ткань можно стерилизовать способом стерилизации газом или путем воздействия ионизирующего излучения. Для уверенности в том, что камера остается стерильной после стерилизации, формируют элементы упаковки из материала, который непроницаем для микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Затем ткань или биопротез, содержащий такую ткань, помещают в камеру и/или стерилизуют, камеру закрывают герметично.

Стерилизация под воздействием ионизирующего излучения или стерилизующего газа, особенно под воздействием газа этиленоксида, находится в компетенции специалиста в данной области техника. В предпочтительном воплощении биологические ткани стерилизуют под воздействием стерилизующего газа, в частности этиленоксида (ЕТО). Стерилизацию способом с ЕТО обычно выполняют при температуре от 37°С до 55°С, причем газовая смесь включает по меньшей мере 10% этиленоксида, и по меньшей мере в течение 60 минут.

Полученный продукт представляет собой по существу стерильную и герметизированную имплантируемую ткань, находящуюся по существу в сухой форме. Она особенно хорошо подходит для хирургической имплантации больным людям для лечения разного рода заболеваний или состояний. Перед хирургической имплантацией биологическую ткань извлекают из упаковки, и тканевый компонент необязательно регидратируют путем воздействия водного раствора, предпочтительно стерильного водного раствора. Ткань можно регидратировать путем многократного замачивания в стерильном растворе, таком как физиологический раствор. Глицерин и этанол можно легко вымыть из ткани физиологическим раствором.

Описанный способ предоставляет биологическую ткань, имеющую стабильность размеров, и которая по существу готова для хирургической имплантации пациенту, т.е., находится в так называемой готовой к применению форме.

Биологические ткани, обработанные согласно способу по настоящему изобретению, типично будут возвращаться к размеру, который составляет по меньшей мере 95%, предпочтительнее по меньшей мере 97%, еще предпочтительнее по меньшей мере 99% исходных размеров их гидратированных форм. В результате биологические ткани, полученные согласно способу по изобретению, готовы к применению для хирургической имплантации как пригодные к имплантации биопротезы, в частности, транскатетерные сердечные клапаны.

Также в настоящем изобретении предпочтительно использовать в качестве биологической ткани перикард или сердечный клапан. Соответственно, ткань перикарда или сердечного клапана перед их применением для хирургической имплантации можно обработать согласно способу по настоящему изобретению. И еще в настоящем изобретении также предпочтительно использовать перикард или сердечный клапан, полученные из животной ткани, в частности, из свиного или бычьего сердца. Предпочтительно бычий перикард, полученный со сертифицированной скотобойни, перед применением в способе по настоящему изобретению претерпевает процедуры очистки, обрезки и сшивания глутаровым альдегидом.

Изобретение также относится к биопротезу и транскатетерным сердечным клапанам, содержащим биологическую ткань.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к биологической ткани, включающей биологическую ткань, обработанную согласно заявляемому способу.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к применению биологической ткани, полученной согласно заявляемому способу, для хирургической имплантации, а также к применению биологической ткани в качестве биопротеза и транскатетерных сердечных клапанов.

Используемый в настоящем описании термин «биопротез» обозначает устройство, полученное из обработанной биологической ткани, которое используют для имплантации людям. Разработка таких устройств возникла как попытка обойти некоторые критичные осложнения, связанные с ранней разработкой механического сердечного клапана, и затем привела к быстрому распространению биопротезов для различных применений. Примеры некоторых биопротезов, используемых или разрабатываемых в настоящее время, включают сердечные клапаны, сосудистые трансплантаты, биогибридные сосудистые трансплантаты, заменители связок, перикардиальные заплаты и другие.

Следующие далее примеры имеют целью только пояснение и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения, которая прилагается к описанию.

ПРИМЕР 1-1

Сначала 40 мембран 1×1 см из биологической ткани, выбранной из бычьего перикарда «образец 180702-1» (P+F Brasil, EDQM сертифицированная), извлекают из 0,625% раствора глутарового альдегида (P+F GmbH/Biocollagen) и после этого замачивают в холодном 0,9% солевом растворе (JP Pharma) в течение 3 минут. Затем замоченную ткань погружают в 0,5 об.% пероксид водорода, (Sigma-Aldrich), при 18°C на 60 минут. На следующей стадии ткань вводят в контакт с холодным (10°C) ФСБ, pH 7,4, и 0,5 мас.% ЭДТК в течение 3 минут (Sigma-Aldrich). После этого ткань погружают в 99 об.% этанол (Sigma-Aldrich) при температуре 22°C на 60 секунд при интенсивном перемешивании и затем погружают в смесь глицерин/этанол (50/50) и 0,5 мас.% ЭДТК (Sigma-Aldrich) при температуре 22°C на 60 минут при слабом перемешивании. Далее, ткань погружают в 99% глицерин (Sigma-Aldrich) при температуре 22°C на 120 минут при слабом перемешивании. Затем ткань замачивают в абсолютном, 99 об.%, этаноле (Sigma-Aldrich) и 0,5 мас.% ЭДТК при температуре 22°C в течение 60 секунд при интенсивном перемешивании. Наконец, ткань подвергают процедуре выпаривания растворителя при вдувании фильтрованного через высокоэффективный воздушный фильтр (HEPA) воздуха в течение 18 часов при температуре 18°C. Затем ткань упаковывают в двойной мешочек и стерилизуют этиленоксидом (ETO) (55°C, воздействие ETO 4 часа) в Sterium Company.

ПРИМЕР 1-2

Получают 40 мембран 1×1 см из биологической ткани, выбранной из бычьего перикарда «образец 180702-2» согласно процедуре, описанной в примере 1-1.

ПРИМЕР ДЛЯ СРАВНЕНИЯ 1-3

Извлекают 40 мембран 1×1 см из биологической ткани, выбранной из бычьего перикарда «образец 180803-1» (P+F Brasil, EDQM сертифицированная), из 0,625% раствора глутарового альдегида (P+F GmbH/Biocollagen) и используют как образец для сравнения без дополнительной обработки.

ПРИМЕР 1-4

Мембраны из бычьего перикарда из примеров 1-1 – 1-3 (несколько образцов: 180702-2 и 180702-1 соответствуют настоящему изобретению, и 180803-1 представляет пример для сравнения) замачивают в солевом растворе в течение 2 минут и затем погружают в имитированную жидкость организма (SBF), которая представляет собой раствор с концентрацией ионов, близкой в плазме крови человека, показанной в таблице 3, поддерживаемый в таких же физилогических условиях рН и температуры (рН 7,4 и температура 36,5°С). Погружение варьируют в течение от 1 до 30 дней.

Образцы гидролизуют в системе из закрытой колбы с нагреванием (closed flask conductive heating system), называемой CHDS. Калибровочную кривую получают со стандартным раствором Specsol^®, 1000 мг. л^-1, содержащим 0,0 - 20 мг. л^-1 Ca.

Определение Са, представленное в таблице 1 и на фиг.1, выполняют на атомно-абсорбционном спектрометре высокого разрешения с непрерывным источником ContrAA 300 (HR-CS FAAS) (Analytic Jena, Jena, Германия), снабженном короткодуговой ксеноновой лампой как непрерывным источником излучения (на фиг.1 обозначение "," на оси Y следует читать как точку согласно таблице 1, т.е., величину 1000,00 следует понимать как 1000 или 1000.00).

Сканирующую электронную микроскопию (SEM) образцов бычьего перикарда (180803-1 сохранен в глутаровом альдегиде) выполняют с использованием растрового электронного микроскопа с автоэлектронным проектором (FESEM) (JEOL, модель 7500F): (a) и (c) без SBF, (b) и (d) погруженные в растворы SBF на 24 часа (см. фиг.2).

ТАБЛИЦА 1

Дни 180803-1
Ca, мг/кг 180702-2
Ca, мг/кг 180702-1
Ca, мг/кг 0 342,44 170,95 114,17 1 951,35 1009,33 1095,72 2 1032,68 871,74 958,13 3 1080,46 719,87 806,27 4 1046,86 879,55 965,94 5 1088,43 974,26 1060,65 10 973,81 846,86 933,25 15 2703,91 2151,70 2165,84 20 5887,85 3607,95 3623,10 25 9100,73 4145,59 4186,11 30 7812,76 4123,35 4193,58

ПРИМЕР 2-1

Выбранные из бычьего перикарда (P+F Brasil) и фиксированные в присутствии глутарового альдегида (Sigma-Aldrich, 0,625 об.%) 75 единиц помещают в холодный 0,9% солевой раствор (JP Farma) и затем в водный раствор, включающий ФСБ (Sigma-Aldrich), pH 7,4, и ЭДТК (Sigma-Aldrich, 0,2 мас.%), на 3 минуты с последующей промывкой этанолом (Sigma-Aldrich, 70 об.%). Затем замоченную ткань погружают в этанол при температуре окружающей среды примерно на 1 минуту. Как следующая стадия, ткань вводят в контакт со смесью глицерина (Sigma-Aldrich, 99%), этанола и раствора ЭДТК (70% глицерина, 29,8% этанола и 0,2% раствор ЭДТК) при температуре окружающей среды по меньшей мере на 90 минут. После этого ткань погружают в глицерин по меньшей мере на 90 минут при перемешивании и с последующей промывкой этанолом. Затем ткань осторожно извлекают из раствора и сушат на воздухе. После сушки в течение 16 часов ткань проверяют в отношении регидратации и механической стабильности.

Механические свойства материала, в частности, предел прочности при растяжении, проверяют при оценке напряжения-деформации с использованием универсальной машины для испытаний (Oswaldo Filizzola, модель AME-2kN). Прочность при растяжении испытываемых образцов бычьего перикарда на различных стадиях обработки приводится на фиг.3, причем группа 1 соответствует стандартному перикарду, группа 2 соответствует высушенному перикарду и группа 3 соответствует высушенному и регидратированному перикарду.

ПРИМЕР 2-2

Выбранные из бычьего перикарда (P+F Brasil) и фиксированные в присутствии глутарового альдегида (Sigma-Aldrich, 0,625 об.%) 04 единицы (4 круглых лоскута диаметром 130 мм) помещают в холодный 0,9% солевой раствор (JP Farma) и затем в водный раствор, включающий ФСБ (Sigma-Aldrich), pH 7,4, и ЭДТК (Sigma-Aldrich, 0,2 мас.%) на 3 минуты с последующей промывкой этанолом (Sigma-Aldrich, 70 об.%). Затем замоченную ткань погружают в этанол при температуре окружающей среды примерно на 1 минуту. В качестве следующей стадии, ткань приводят в контакт со смесью глицерина (Sigma-Aldrich, 99%), этанола и раствора ЭДТК (70% глицерина, 29,8% этанола и 0,2% раствор ЭДТК) при температуре окружающей среды по меньшей мере на 90 минут. После этого ткань погружают в глицерин по меньшей мере на 90 минут при перемешивании и с последующей промывкой этанолом. Эти образцы проверяют на атомно-абсорционном спектрометре ContrAA 300 (Analytik Jena, Jena, Germany). Таблица 2 показывает содержание кальция в этих образцах к содержанию в стандартном сохраненном с глутаровым альдегидом бычьем перикарде.

ТАБЛИЦА 2

Образец Конц. Ca (г/кг) Конц. Ca (ч./млн) Сухой 0,0652 65,2 Глутаровый альдегид 0,1452 145,2

Для того, чтобы сравнить абсорбцию кальция образцов бычьего перикарда, высушенные и стандартные образцы бычьего перикарда инкубируют в имитированной жидкости организма (SBF) с концентрацией ионов согласно таблице 3, которое схоже с плазмой крови человека.

ТАБЛИЦА 3

Na⁺ K⁺ Ca²⁺ Mg²⁺ HCO₃^2- Cl^- HPO₄^2- SO₄^2- SBF (мг/л) 213,0 7,5 3,8 2,3 6,3 223,0 1,5 0,75

Образцы инкубируют с SBF в течение 24 часов и после этого подвергают анализу с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии. Результаты приводятся в таблице 4.

ТАБЛИЦА 4

Образец Конц. Ca (г/кг) Конц. Ca (ч/млн) Сухой/SBF 0,5446 544,6 Глутаровый альдегид/ SBF 0,8251 825,1

ПРИМЕР 2-3

Исследуют целостность коллагеновых волокон с помощью гистологической оценки с использованием окрашивания для проверки сохранения коллагеновых волокон в бычьем перикарде после процесса сушки. Изображения получают с использованием Eclipse E-200 (Nikon) с видеоцифровым full HD Lite 1080p (Tucsen). Результаты сравнивают со стандартным образцом материала, сохраненного в глутаровом альдегиде. Проверку осуществляют с использованием различных красителей, как показано на фиг.4 (высушенный бычий перикард) и фиг.5 (стандартный бычий перикард), причем HE обозначает гематоксилин, RE обозначает резорцин-орцеин, TM обозначает трихром по Массону и TG обозначает трихром по Гомори (все красители предоставлены Merck).

Фиг.4 показывает микроскопическое изображение (без светопольной микроскопии) поперечных гистологических срезов мембраны PF180611-Std 05, окрашенной гематоксилином и эозином (HE, A-A''), резорцином-орцеином (RE, B-B''), трихромом по Маллори (TM, C-C") и трихромом по Гомори (TG, D-D"). Можно наблюдать следующие части образца высушенного бычьего перикарда: толстые коллагеновые волокна (более мелкие черные стрелки), эластичные волокна в трансверсии или продольных срезах (большие черные стрелки), остатки клеточных ядер (размерные стрелки). На этом изображении не имеется остатков сосудистых элементов. Масштаб показывает фактическое увеличение на микрофотографиях.

Фиг.5 показывает микроскопическое изображение (без светопольной микроскопии) поперечных гистологических срезов мембраны PF 180801-3-DRY05, окрашенной гематоксилином и эозином (HE, A-A''), резорцином-орцеином (RE, B-B''), трихромом по Маллори (TM, C-C") и трихромом по Гомори (TG, D-D"). Можно наблюдать следующие части образца стандартного бычьего перикарда: толстые коллагеновые волокна (более мелкие черные стрелки), эластичные волокна в трансверсии или продольных срезах (большие черные стрелки), остатки клеточных ядер (размерные стрелки) и остатки сосудистых элементов (стрелки с большим острием и из точек). Масштаб показывает фактическое увеличение на микрофотографиях.

ПРИМЕР 2-4

Структуру коллагена и антикальцификационное действие процесса сушки стандартного и высушенного (обоих) бычьего перикарда оценивают с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM, микроскоп FESEM, JEOL, модель 7500F) с использованием различного разрешения:

(a) высушенный бычий перикард: фиг.6: увеличение 200×; фиг.7: 3000× увеличение; фиг.8: увеличение 50000×; фиг.9: увеличение 100000×;

(b) стандартный бычий перикард: фиг.10: увеличение 200×; фиг.11: увеличение 3000×; фиг.12: увеличение 50000×; фиг.13: увеличение 100000×.

Группа изобретений относится к способу обработки биологической ткани, состоящему из стадий: (1) замачивания биологической ткани, обработанной сшивающим агентом, в солевом растворе; (2) контактирования замоченной биологической ткани с водным раствором пероксида водорода; (3) контактирования биологической ткани с водным раствором, включающим ФСБ и ЭДТК, где ФСБ означает забуференный фосфатом физиологический раствор, имеющий рН 7,4 и содержащий водный солевой раствор дигидрофосфата натрия, хлорид натрия и, при необходимости, хлорид калия и дигидрофосфат калия, а ЭДТК означает этилендиаминтетрауксусную кислоту, которая является комплексообразующим и хелатирующим агентом, способным связывать ионы металлов, особенно Fe²⁺/Fe³⁺, Al³⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ и подобные, и удалять их из раствора, образуя ЭДТК-комплексы, (3а) контактирования биологической ткани с этанолом в концентрации 70% по объему; (4) контактирования биологической ткани с раствором, включающим глицерин, этанол и ЭДТК, где объемное соотношение глицерин:этанол на стадии (4) составляет от 1:5 до 5:1, (5) контактирования биологической ткани с глицериновым раствором, (5а) контактирования биологической ткани с этанолом в концентрации 70% по объему; (6) сушки биологической ткани; (7) помещения биологической ткани в упаковку; (8) герметизации упаковки; (9) стерилизации упаковки; при этом сшивающий агент представляет собой глутаровый альдегид, а биологическая ткань представляет собой бычий или свиной перикард, или сердечный клапан, причем ЭДТК на стадиях (3) и (4) имеет концентрацию от 0,01 до 10,0% по массе, а пероксид водорода на стадии (2) имеет концентрацию от 0,05 до 5,0% по объему, также относится к биологической ткани с антикальцификационными свойствами в готовой к использованию форме для хирургической имплантации, обработанной водным раствором, включающим ФСБ и ЭДТК, а также раствором, включающим глицерин, этанол и ЭДТК, согласно способу по любому из пп.1-6, возвращенной к размеру, составляющему по меньшей мере 95% от ее исходной гидратированной формы, которая представляет собой бычий или свиной перикард, или сердечный клапан, а также относится к применениям биологической ткани в качестве биопротеза и в транскатетерных сердечных клапанах. Группа изобретений обеспечивает эффективный способ придания антикальцификационных свойств биологическим тканям, используемым для хирургической имплантации, которая не сопровождается разрушительным действием, а также обеспечивает улучшенные механические характеристики биологической ткани во время хранения. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл., 8 пр.

1. Способ обработки биологической ткани, состоящий из стадий:

(1) замачивания биологической ткани, обработанной сшивающим агентом, в солевом растворе;

(2) контактирования замоченной биологической ткани с водным раствором пероксида водорода;

(3) контактирования биологической ткани с водным раствором, включающим ФСБ и ЭДТК,

где ФСБ означает забуференный фосфатом физиологический раствор, имеющий рН 7,4 и содержащий водный солевой раствор дигидрофосфата натрия, хлорид натрия и, при необходимости, хлорид калия и дигидрофосфат калия,

а ЭДТК означает этилендиаминтетрауксусную кислоту, которая является комплексообразующим и хелатирующим агентом, способным связывать ионы металлов, особенно Fe²⁺/Fe³⁺, Al³⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ и подобные, и удалять их из раствора, образуя ЭДТК-комплексы,

(3а) контактирования биологической ткани с этанолом в концентрации 70% по объему;

(4) контактирования биологической ткани с раствором, включающим глицерин, этанол и ЭДТК; где объемное соотношение глицерин:этанол на стадии (4) составляет от 1:5 до 5:1,

(5) контактирования биологической ткани с глицериновым раствором,

(5а) контактирования биологической ткани с этанолом в концентрации 70% по объему;

(6) сушки биологической ткани;

(7) помещения биологической ткани в упаковку;

(8) герметизации упаковки;

(9) стерилизации упаковки;

при этом сшивающий агент представляет собой глутаровый альдегид, а биологическая ткань представляет собой бычий или свиной перикард или сердечный клапан,

причем ЭДТК на стадиях (3) и (4) имеет концентрацию от 0,01 до 10,0% по массе, а пероксид водорода на стадии (2) имеет концентрацию от 0,05 до 5,0% по объему.

2. Способ по п.1, в котором солевой раствор представляет собой водный раствор, включающий 0,9% хлорида натрия.

3. Способ по п.1, в котором стерилизацию упаковки, включающей биологическую ткань, выполняют путем воздействия на упаковку газа этиленоксида.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором стадии (1)-(5) выполняют при температуре 10-25°С.

5. Способ по п.1, в котором стадии (6) и (7) выполняют при температуре 10-25°С.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором стадии (4) и (5) выполняют при перемешивании в течение по меньшей мере 60 минут.

7. Биологическая ткань с антикальцификационными свойствами в готовой к использованию форме для хирургической имплантации, обработанная водным раствором, включающим ФСБ и ЭДТК, а также раствором, включающим глицерин, этанол и ЭДТК, согласно способу по любому из пп.1-6, возвращенная к размеру, составляющему по меньшей мере 95% от ее исходной гидратированной формы, которая представляет собой бычий или свиной перикард, или сердечный клапан.

8. Применение биологической ткани по п.7 в качестве биопротеза.

9. Применение биологической ткани по п.7 в транскатетерных сердечных клапанах.