СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗЛОЖЕНИЯ И ДЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНИ, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ В БИОПРОТЕЗАХ Российский патент 2023 года по МПК A61L27/36 A61F2/24 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу предотвращения ферментативного разложения и дегенерации ткани бычьего перикарда, используемой в имплантируемом биопротезе, и к биопротезу, изготовленному таким образом. Способ, раскрытый в настоящем изобретении, полезен для изготовления интегрированного фиксированного биопротеза из бычьего перикарда.

Уровень техники

Целостность ткани жизненно важна для биопротезов, изготовленных из нее для применения в качестве имплантатов. Такие биопротезы могут представлять собой, в частности, сердечные клапаны, стентовые трансплантаты или любые иные биопротезы, например, хирургические заплаты и т.д. При нормальной температуре и влажности воздуха или использовании некоторых традиционных методов фиксации достижение целостности и стабильности ткани всегда является сложной задачей. В таких условиях нормальная ткань, обработанная ткань или любая другая обработанная ткань с течением времени растрескивается, меняет цвет, теряет механическую прочность, включая эластичность и характеристики, и т.д.

Практика замены или восстановления сердечного клапана с использованием материала биологического происхождения со временем потеряла свою привлекательность из-за различных проблем, связанных с биологическими материалами, в частности, кальцификации, долговечности, хранения устройства, а также низких эксплуатационных качеств по сравнению с механическими устройствами. Низкие эксплуатационные качества биопротеза обусловлены дегенерацией и кальцификацией ткани, причем патофизиология обеих причин остается неясной. Под кальцификацией понимают отложение соли фосфата кальция и сопутствующих минералов на поверхности ткани, причем в качестве ключевого материала для кальцификации известны фосфолипидные клеточные мембраны. Деградация тканей, приводящая к механическому разрушению сердечных клапанов, начинается с разрушения коллагеновых волокон в течение определенного периода времени, что приводит к концентрации напряжений в слабых местах биопротеза. Обнаружилось, что разрушение волокон, изменение ориентации, усталостные повреждения волокон и ухудшение видимых механических свойств коррелируют с потерей компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), в частности, выщелачиванием гликозаминогликанов и дегенерацией эластина. Также обнаружилось, что оксидативный стресс также может значительно влиять на дегенерацию структуры тканевого листка. Известно, что глутаровый альдегид (CHO(CH₂)₃CHO), используемый для сшивания тканей, также участвует кальцификации. В частности, свободные альдегидные группы и карбоновые кислоты, не образовавшие поперечных связей с коллагеном ткани, обладают цитотоксичностью и усиливают кальцификацию ткани.

В патентной заявке US 6878168 раскрыт способ уменьшения постимплантационной кальцификации материала биопротеза, содержащий следующие этапы:

(а) нагрев раствора глутарового альдегида с pH в пределах 7,2-7,8 до первой температуры выше 20°C в течение первого периода времени, составляющего по меньшей мере один час, до снижения pH раствора глутарового альдегида до уровня 5-7; и

(б) контакт некоторого количества биологической ткани, содержащей белок соединительной ткани, с раствором глутарового альдегида с пониженным pH в течение второго периода времени длительностью по меньшей мере один час.

В патентной заявке US 7559953 раскрыт способ приготовления фиксированной биологической ткани, содержащий следующие этапы:

(а) забор по меньшей мере одного слоя биологической ткани, выбранной из группы, содержащей перикардиальную, перитонеальную и плевральную ткань, причем слой биологической ткани содержит внутреннюю оболочку из серозной мембраны и внешнюю оболочку из связанной фасции;

(б) придание биологической ткани формы, причем придание формы включает обрезку и придание формы забранному слою биологической ткани до нужного размера и конфигурации;

(в) по меньшей мере частичное сшивание биологической ткани путем контакта биологической ткани с раствором, содержащим по меньшей мере один сшивающий агент;

(г) стерилизация биологической ткани путем контакта по меньшей мере частично сшитой биологической ткани с раствором, содержащим спирт; и

(д) инактивация прионов в стерилизованной биологической ткани, при этом прионы в биологической ткани инактивируются путем контакта стерилизованной биологической ткани с основным раствором, имеющим молярную концентрацию примерно от 0,5 М до 4,0 М;

причем этапы (а)-(д) выполняются последовательно.

В патентной заявке US 6322593 раскрыт способ обработки биологической ткани, в котором сшитую биологическую ткань, содержащую свободные альдегидные группы, подвергают реакции с подходящим нейтрализующим агентом для химической блокировки реакции альдегидных групп с клеточными белками. В результате получают сшитую биологическую ткань, по существу не содержащую реактивных альдегидных групп и вследствие этого отличающуюся пониженной токсичностью и улучшенной биосовместимостью.

Тем не менее, вышеуказанные решения не могут устранить проблему кальцификации и дегенерации тканей.

Протезы сердечных клапанов, используемые для замещения больных и нефункциональных клапанов сердца, применяются с середины 1960-х годов. По существу, они делятся на механические клапаны сердца (МКС) и биопротезные клапаны сердца (БПКС). МКС изготавливают из синтетических материалов (например, полимеров, металла и углерода), в то время как БПКС изготавливают из биологических тканей, которые крепятся на покрытый тканью металлический каркас. МКС более долговечны, но их способность к тромбообразованию и необходимость длительной антикоагулянтной терапии делают их непригодными для пациентов некоторых возрастных групп, особенно пожилых. В отличие от них, БПКС безопасны при имплантации, функционально схожи с естественным аортальным клапаном, не требуют длительной антикоагулянтной терапии и, следовательно, снижают риск кровотечений. Тем не менее, при обычных методах фиксации имеет место дегенерация внутренней структуры фиксированной ткани, в частности, коллагеновых волокон и других внеклеточных компонентов (ВКК). Дегенерация ткани происходит вследствие разрушения коллагеновых волокон. Нестабильность связей глутарового альдегида (CHO(CH₂)₃CHO) приводит к тому, что коллагеновые волокна медленно теряют структурную целостность. Таким образом, существует необходимость в совершенствовании способа обработки ткани и улучшении биопротеза, изготовленного из такой обработанной ткани.

В настоящем изобретении раскрыт способ изготовления интегрированной фиксированной ткани, отличающейся повышенной прочностью, стабильностью и сроком службы.

Основной задачей настоящего изобретения является получение не подверженной автолизу и интегрированной фиксированной бычьей ткани, используемой для изготовления биопротезов.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа изготовления интегрированной фиксированной ткани в среде с низким содержанием кислорода и низкой концентрацией исходного раствора глутарового альдегида для сохранения базовых характеристик фиксированной ткани бычьего перикарда.

Следующей задачей настоящего изобретения является получение ткани бычьего перикарда, обработанной основными буферными растворами и многократно промытой во время химической обработки в среде с низким содержанием кислорода, что предотвращает ферментативное разложение фиксированной ткани.

Следующей задачей настоящего изобретения является получение фиксированной ткани с незначительным содержанием карбоновых кислот на поверхности и сокращением участков кальцификации, что снижает кальцификацию фиксированной ткани перикарда.

Следующей задачей настоящего изобретения является получение фиксированной ткани, не подверженной автолизу, механически и химически стабильной и долговечной, что в конечном итоге повышает целостность биопротеза и, соответственно, срок его службы.

Следующей задачей изобретения является разработка способа лазерного разрезания тканевого листка, который разрезают в поперечном направлении, чтобы избежать разрыва и износа створок сердечного клапана.

Сущность изобретения

Таким образом, настоящим изобретением предложен способ обработки для предотвращения ферментативного разложения и дегенерации ткани бычьего перикарда, используемой для изготовления биопротезов для имплантации, включающий следующие этапы: сбор и заготовка необработанной ткани бычьего перикарда; химическое сшивание промытой ткани для получения фиксированной ткани; лазерная резка указанной фиксированной ткани для получения тканевого листка; химическая обработка указанного тканевого листка с использованием AAS; химическая стерилизация и хранение фиксированной ткани бычьего перикарда для сохранения структурной целостности и характеристик; причем все вышеуказанные этапы выполняют в среде с низким содержанием кислорода и контролируемой температурой.

Предпочтительно, содержание кислорода в среде с низким содержанием кислорода составляет 5-15%. Более предпочтительно, содержание кислорода в среде с низким содержанием кислорода составляет 8-10%.

Указанная контролируемая температура составляет 18-20°C во время обработки и 8-10°C во время хранения.

Предпочтительно, указанное промывание охлажденным раствором хлорида натрия следует за каждым этапом химической и физической обработки до стерилизации и хранения. Промывание охлажденным раствором хлорида натрия осуществляют путем непрерывного распыления охлажденного раствора хлорида натрия в среде с низким содержанием кислорода и контролируемой температурой.

Предпочтительно, химическое сшивание выполняют с использованием 0,625% забуференного раствора глутарового альдегида.

Предпочтительно, химическое сшивание выполняют при непрерывной циркуляции глутарового альдегида со скоростью 0,8 л/мин.

Предпочтительно, этап сшивания выполняют в течение 35 минут.

Предпочтительно указанное хранение фиксированной ткани перикарда осуществляют с использованием 0,625% забуференного раствора глутарового альдегида.

Изобретением также предложен способ изготовления биопротеза для имплантации, содержащий этапы сбора и заготовки необработанной ткани бычьего перикарда; химического сшивания промытой ткани для получения фиксированной ткани; лазерной резки указанной фиксированной ткани для получения тканевого листка; химической обработки указанного тканевого листка с использованием AAS; химической стерилизации и хранением фиксированной ткани бычьего перикарда для сохранения структурной целостности и характеристик, и изготовления биопротеза из такой фиксированной ткани во влажной среде с распылением раствора хлорида натрия; причем все вышеуказанные этапы выполняют в среде с низким содержанием кислорода и контролируемой температурой.

Изобретением также предложен биопротез для имплантации, изготовленный из ткани бычьего перикарда, обработанной вышеуказанным способом. Предпочтительно, биопротез представляет собой сердечный клапан, стентовый трансплантат или хирургическую заплату.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: устройство для непрерывного распыления охлажденного раствора хлорида натрия на перикард сердечного клапана во время сбора и заготовки.

Фигура 2: вид в аксонометрии круглого фиксирующего лотка для удержания необработанной ткани во время процесса фиксации/сшивания, в соответствии с примерным вариантом осуществления изобретения.

Фигура 3: фиксирующий плоский фланец в сборе с непрерывной циркуляцией сшивающего раствора в соответствии с примерным вариантом осуществления изобретения.

Фигура 4: вид в аксонометрии лотка для лазерной резки из нержавеющей стали в соответствии с примерным вариантом осуществления изобретения.

Фигура 5: вид лазерного луча, облучающего круговую фиксированную ткань на лотке из нержавеющей стали для лазерной резки тканевого листка, в соответствии с примерным вариантом осуществления изобретения.

Фигура 6: гистограмма времени облучения фиксированной ткани во время обработки, в соответствии с примерным вариантом осуществления изобретения.

Осуществление изобретения

Для решения проблемы, присущей предшествующему уровню техники, настоящим изобретением предложен способ изготовления интегрированной фиксированной ткани бычьего перикарда, отличающейся повышенной стабильностью, прочностью и сроком службы. Кроме того, изобретением предложен способ изготовления интегрированного фиксированного биопротеза из бычьего перикарда в условиях среды с низким содержанием кислорода, относящийся к области восстановления и реконструкции сердечно-сосудистой системы, в частности, замены и восстановления сердечного клапана и т.д.

Обнаружилось, что среда с низким содержанием кислорода помогает повысить химическую реактивность ткани относительно обрабатывающих химикатов и избежать гнилостных изменений путем удаления мертвых колоний, токсичных веществ и т.д.; кроме того, она предотвращает оксидативный стресс на фиксированной ткани и разложение химического исходного раствора.

Способ, предложенный изобретением, включает этапы сбора и заготовки необработанной ткани перикарда в гигиенических условиях и среде с низким содержанием кислорода с непрерывным распылением раствора хлорида натрия, промывки основным соляным раствором, химической фиксации для получения стабильной сшитой ткани, предотвращающей ухудшение и разложение структуры, лазерной резки фиксированной ткани, альдегидной консервации для предотвращения ферментативного разложения, жидкостной химической стерилизации с использованием AAS и исходного раствора низкой концентрации.

Ниже раскрыты различные этапы процесса.

Сбор и заготовка необработанного перикарда:

Необработанный бычий перикард, как правило, может быть собран и заготовлен на скотобойне, проверенной и одобренной FDA, с использованием соответствующей процедуры, раскрытой в ISO 13485 и ISO 22442-1, -2, -3.

В одном из вариантов осуществления необработанный бычий перикард получают с местной скотобойни, помещают в охлажденный фосфатно-солевой буфер (PBS, 0,1 М, pH 7,4) с температурой в диапазоне 2-8°C и немедленно транспортируют в лабораторию для дальнейшей обработки. Необработанные ткани промывают физиологическим раствором и освобождают от налипшего жира при температуре 18-20°C.

В другом варианте осуществления необработанные бычьи сердца с неповрежденным перикардом собирают на скотобойне, одобренной FDA, где история жизни и данные животного хранятся в соответствии со стандартами и регулятивными нормами. Необработанную ткань перикарда иссекают и извлекают из сердца путем выполнения разреза вдоль основания сердца, оставляя нетронутой остальную ткань. Необработанную ткань перикарда постоянной толщины транспортируют в лабораторию в забуференном физиологическом растворе для поддержания структурной целостности и электролитического баланса ткани. В лаборатории необработанную ткань промывают и очищают от внешнего жира и налипшего материала.

В предпочтительном варианте осуществления необработанный бычий перикард собирают со здорового крупного рогатого скота в возрасте не более 24 месяцев, не зараженного трансмиссивной губкообразной энцефалопатией / губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота. Данные и записи о состоянии здоровья отслеживаются и ведутся на скотобойне. Бычье сердеце немедленно переносят в камеру с низким содержанием кислорода, температуру в которой, предпочтительно, поддерживают на уровне 15-25°C, более предпочтительно, 18-20°C. Необработанную ткань обычно забирают хирургическим путем из сердца животного. Ее обрезают или разрезают по размеру и промывают деионизированной водой, основным соляным раствором, раствором натрия хлорида или другим подходящим промывочным раствором. Непрерывное распыление охлажденного раствора натрия хлорида поддерживают в процессе сбора и заготовки, чтобы избежать разложения и предотвратить гнилостные изменения живых клеток. Распыление охлажденного раствора хлорида натрия поддерживает электролитический баланс рН в течение этого периода и предотвращает гнилостные изменения в необработанный ткани.

На фигуре 1 изображено устройство (1), способное обеспечить непрерывное распыление охлажденного раствора хлорида натрия на ткани сердечного клапана или перикарда теплового клапана во время сбора и заготовки. Устройство содержит герметичный контейнер с резервуаром (3) для раствора хлорида натрия, непрерывно подающий раствор хлорида натрия на собранную ткань или перикард бычьего сердца (2), помещенную в подходящем положении на заданном расстоянии внутри устройства. В устройстве также предусмотрен вход (4) для подачи азота, анализатор (5) температуры, анализатор (6) кислорода и вентиляционная линия (7) для поддержания подходящей среды с низким содержанием кислорода.

Необработанный бычий перикард помещают в фосфатно-солевой буфер (PBS, 0,1 М, pH 7,4±0,2) и немедленно доставляют в лабораторию. Всю операцию, предпочтительно, проводят в течение 20-40 минут, более предпочтительно в течение 30 минут в среде с низким содержанием кислорода 5-15%, предпочтительно 8-10%. Содержание кислорода в окружающей среде измеряют обычным анализатором кислорода, который имеет диапазон измерения 0,1-25 об.% О₂. Низкое содержание кислорода предотвращает оксидативный стресс живых клеток и сохраняет структурную целостность коллагеновых волокон. Собранную необработанную ткань промывают физиологическим раствором и освобождают от налипшего жира. Во время удаления налипшего жира и жирового материала поддерживают непрерывное распыление фосфатно-солевого буфера, после чего ткань хранят в охлажденном 0,9% растворе натрия хлорида при температуре 8-10°C до выполнения фиксации. Использование охлажденного раствора натрия хлорида снижает рост микроорганизмов за счет создания антагонистической среды для бактерий и других микроорганизмов. Благодаря низкой температуре раствора натрия хлорида жизненные циклы микробов замедляются, что позволяет избежать гнилостных изменений в живой ткани.

Процесс промывания:

После удаления из ткани перикарда налипшего материала из жиров, кровеносных сосудов и сгустков крови ее многократно промывают основным соляным раствором для поддержания электролитического баланса и предотвращения повреждения живых клеток перед процессом сшивания. В одном варианте осуществления необработанную ткань трижды промывают основным соляным раствором, чтобы удалить следы налипшего материала.

В одном из вариантов осуществления необработанную ткань перикарда промывают охлажденным 0,9% раствором натрия хлорида путем помещения ткани в ванну из нержавеющей стали при комнатной температуре и относительной влажности 55%. Сначала в ванну из нержавеющей стали наливают охлажденный 0,9% раствор натрия хлорида и помещают туда бычий перикард, предварительно обрезанный и промытый при сборе материала. Затем необработанную ткань перикарда многократно промывают, пока не смоется весь мусор и оставшийся жировой материал. После процесса промывания в ванну из нержавеющей стали снова наливают свежий и охлажденный раствор натрия хлорида, после чего ткань промывают с обеих сторон.

В предпочтительном варианте осуществления необработанный бычий перикард помещают в фосфатно-солевой буфер (PBS, 0,1 М, рН 7,4±0,2) при температуре 18-20°С. Затем ткань трижды промывают охлажденным 0,9% раствором натрия хлорида и освобождают от налипшего жира с целью полного удаления жировых отложений, помещая в ванну из нержавеющей стали перед обрезанием и разрезанием необработанной ткани. После удаления лишнего материала и промывания охлажденным 0,9% раствором натрия хлорида промытую ткань перикарда осматривают на предмет отверстий, поврежденной поверхности и толщины ткани.

Толщину промытой ткани измеряют обычным толщиномером. Эту ткань снова промывают физиологическим раствором, после чего сшивают или фиксируют глутаровым альдегидом. Промывание охлажденным 0,9% раствором натрия хлорида удаляет неприятный запах из живых клеток и обогащает электролитический баланс живых клеток ткани. Весь процесс промывания раствором натрия хлорида длится 05-15 минут, предпочтительно 09-12 минут.

Сшивание промытой бычьей ткани перикарда:

Под фиксацией глутаровым альдегидом понимают процесс консервации тканей, используемый в производстве биопротезов сердечных клапанов. Сшивание выполняют с целью получения интегрированной, стабильной, прочной и биологически инертной фиксированной ткани, пригодной для медицинской имплантации. Коллаген, основной белок ткани, обеспечивает прочность и устойчивость к разрушающим нагрузкам в ткани и играет важнейшую роль в ее долговременной прочности.

Промытую бычью ткань обычно фиксируют водным раствором глутарового альдегида, поскольку глутаровый альдегид содержит двойные альдегидные группы и обладает наивысшей стабильностью сшивания с композитами коллагеновых волокон. Обработка глутаровым альдегидом изменяет свойства коллагена и делает ткань пригодной для организма человека. Обнаружилось, что процесс сшивания повышает стабильность и прочность фиксированной ткани перикарда, что делает ее пригодной для изготовления или производства биопротезов.

Тем не менее, для фиксации промытого бычьего перикарда или любой другой биологической ткани можно использовать множество других сшивающих агентов/химических веществ (см. таблицу ниже), служащих фиксатором для получения нереактивной ткани;

Таблица 1: Перечень сшивающих агентов

Обрабатываемая ткань Сшивающий агент Промытый бычий перикард Глутаровый альдегид
Формальдегид
Ацетали глутарового альдегида
Соединения на эпоксидной основе
Ацилазид
Пигментно-опосредованное фотоокисление
Цианамид
Карбодиимиды

В одном из вариантов осуществления изобретения приготавливают свежий водный 0,625% раствор глутарового альдегида (CHO(CH₂)₃CHO), который затем фильтруют под вакуумом в среде с нормальным содержанием кислорода для удаления любых нежелательных частиц.

На фигуре 2 изображен кусочек промытой ткани (2) перикарда, помещенный в лотке из нержавеющей стали (8) в фиксирующую рамку (9) с системой (10) фиксации.

Как показано на фигуре 3, фиксацию осуществляют в плоском фланце (11), содержащем вход (4) для подачи азота, анализатор (5) температуры, анализатор (6) кислорода, вентиляционную линию (7) и циркуляционный насос (12).

Циркуляционный насос соединен с входом на одном фланце резервуара плоского фланца и с выходом раствора на другом конце. К другому фланцу присоединен газопровод медицинского азота (N₂) для вытеснения воздуха и кислорода из резервуара плоского фланца, а анализатор кислорода (O₂) и датчик температуры прикреплены к другим зондам. Благодаря вдуванию медицинского газообразного N₂ в резервуар плоского фланца уровень кислорода поддерживается в пределах 5-15%, предпочтительно 8-10%, в течение всего процесса внутри камеры. Температура и процент содержания кислорода оказывают функциональное воздействие на промытую ткань и сшивающий раствор.

Примерно 5 литров раствора заливают в резервуар плоского фланца в среде с нормальным содержанием кислорода. Циркуляционный насос подключают к резервуару плоского фланца для надлежащей циркуляции сшивающего раствора, так как это повышает способность сшивания с промытой тканью и обеспечивает стабильное связывание белка ткани с фиксаторами. Циркуляция раствора также улучшает сцепление/контакт промытой ткани с верхней и нижней поверхностью. Кроме того, механизм циркуляции улучшает плавучесть промытого бычьего перикарда, который помещают в фиксатор и выдерживают при температуре 18-20°C в течение 30-50 минут. После этого его промывают 0,9% раствором натрия хлорида для удаления непрореагировавшего глутарового альдегида и далее выдерживают в 0,625% растворе глутарового альдегида в течение 06-10 дней при комнатной температуре. После сшивания полученная ткань приобретает золотисто-желтоватый цвет и толщину 0,32-0,48 мм. По желанию можно получить ткань другой толщины, например, 0,40-0,55 мм или 0,30-0,50 мм и т.д., используя тот же процесс.

В предпочтительном варианте осуществления процесс сшивания использует нейтральное давление и непрерывную циркуляцию фиксаторов, т.е. глутарового альдегида в камере с низким содержанием кислорода, что помогает сохранить естественную эластичность коллагеновой матрицы и повышает стабильность сшивания молекул коллагена, присутствующих в промытой бычьей ткани. Глутаровый альдегид, используемый в процессе, является «чистым для анализа» реагентом с содержанием не менее 25%. Процесс сшивания позволяет глутаровому альдегиду образовывать стабильные сшивки с молекулой коллагена лизиновых цепей, что приводит к образованию прочных волокнистых тканевых структур с долгосрочными эксплуатационными свойствами, подходящими для применения в качестве биопротезов сердечных клапанов и перикардиальных заплат.

Сначала промытый бычий перикард помещают в ванну из нержавеющей стали, содержащую 0,9% физиологический раствор. Промытую ткань многократно, предпочтительно три раза по 03 минуты промывают раствором натрия хлорида при температуре 18-20°C и помещают в фиксирующую рамку. Промытый кусочек ткани помещают гладкой стороной вверх на дно приспособления, т.е. фиксирующей рамки. Преимущество размещения гладкой стороной вверх заключается в том, что это повышает способность к сшиванию, эффективность и прочность ткани. При фиксации в рамке промытая ткань должна быть плотной, чтобы вся поверхность была доступна для контакта с фиксирующими агентами / раствором. При необходимости излишки ткани можно обрезать. Все рамки с промытыми тканями помещают в резервуар плоского фланца для выполнения процесса сшивания.

0,625% раствор глутарового альдегида в водной среде с водой для инъекций в качестве растворителя приготавливают, как показано в таблице 2, в чистом шкафу с низким содержанием кислорода, чтобы избежать загрязнения и разложения глутарового альдегида и сохранить его физико-химические характеристики. Шкаф с низким содержанием кислорода используют при приготовлении сшивающего раствора для того, чтобы сохранить химические свойства раствора глутарового альдегида путем поддержания температуры рабочей зоны на уровне 18-20°C и предотвратить загрязнение токсинами, способными повлиять на результат сшивания промытых тканей. Вода для инъекций повышает стабильность глутарового альдегида, снижает уровень его разложения и предотвращает нежелательный рост микроорганизмов. Для сшивания примерно 5 литров фильтрованного фиксирующего раствора заливают в резервуар плоского фланца и помещают в него 8-10 круглых рамок с промытыми тканями. Рамки можно оставить плавать в резервуаре плоского фланца. Сшивающий раствор продолжает циркулировать для более эффективного сшивания с промытой тканью бычьего перикарда. Расход поддерживают на уровне 0,5-2 л/мин, предпочтительно 1,3-2,2 л/мин, более предпочтительно 0,8-1 л/мин. Длительность погружения тканей составляет приблизительно 20-50 минут, предпочтительно 30-40 минут, более предпочтительно 35 минут. Температуру резервуара плоского фланца и окружающей среды поддерживают на уровне 15-25°C, предпочтительно 18-23°C, более предпочтительно 18-20°C. После этого сшитую ткань хранят в 0,625% водном забуференном растворе глутарового альдегида в от 5-6 до 10 дней, предпочтительно 7-9 дней, более предпочтительно 8 дней с целью повышения прочности и стабильности фиксированной ткани. Поддержание температуры фиксации увеличивает скорость диффузии фиксатора в ткань и ускоряет химическую реакцию между фиксатором и компонентами ткани, такими как белковые группы -NH₂, обеспечивая, тем самым, «комплексную» и «долговечную» фиксацию ткани бычьего перикарда. Глутаровый альдегид реагирует с боковыми цепями белков с образованием реактивных гидрокси-метильных групп. Глутаровый альдегид также реагирует с некоторыми группами в ненасыщенных липидах.

Реакция фиксации представлена на следующей схеме 1.

Схема 1

После процесса химического сшивания фиксированную ткань помещают в свежеприготовленный 0,625% раствор глутарового альдегида в среде с низким содержанием кислорода до дальнейшего использования.

Таблица 2: Объем для приготовления 1 литра 0,625% водного раствора глутарового альдегида.

Материал Состав на 1 л Na₂HPO₄·7H₂O 4,16 г KH₂PO₄ 0,61 г NaCl 7,89 г Глутаровый альдегид, прибл. 25% (м/об) 26,50 г Вода для инъекций 987,5 мл

Лазерная резка фиксированной ткани:

Систему лазерной резки используют для резки листка фиксированной ткани, используемой для изготовления сердечного клапана.

На фигуре 4 показан лоток для лазерной резки, в котором лоток (9') из нержавеющей стали предусмотрен для лазерной резки фиксированной ткани (2').

В способе резки материала используют систему лазерной резки в среде с низким содержанием кислорода. Система лазерной резки управляется компьютером и содержит лазер с системой перемещения. Лазер точно разрезает ткань по заданному шаблону, определенному компьютером, который соответствует критериям, указанным в проекте створок сердечного клапана. Во время лазерной резки энергия лазера преобразуется в тепловую энергию, что позволяет получить створку определенной формы и разместить ее на рамке сердечного клапана для создания устройства.

Как показано на фигуре 4, фиксированную ткань перикарда помещают над пластиной для лазерной резки из нержавеющей стали, а источник лазерного луча (13), как показано на фигуре 5, применяют в среде с низким содержанием кислорода.

В процессе лазерной резки ткань располагают гладкой поверхностью вверх таким образом, чтобы она находилась в прямом контакте с лазерным лучом. Это предотвращает ожог фиксированной ткани и улучшает резку ткани от кромки до кромки, что обеспечивает точную резку листка фиксированной ткани и снижает риск тромбоза. После лазерной резки листки фиксированной ткани промывают основным соляным раствором / 0,9% охлажденным раствором натрия хлорида для удаления следов в среде с низким содержанием кислорода, т.е. при содержании кислорода 8-10% и температуре рабочей зоны 18-20°C. Повторный этап промывки вырезанной лазером ткани выполняют во избежание ненужного загрязнения. После промывки раствором натрия хлорида вырезанную лазером ткань трижды промывают 0,625% водным раствором глутарового альдегида, чтобы удалить следы ожога, присутствующие на краю вырезанной лазером ткани. Кроме того, промывание фиксирующим раствором уменьшает количество токсичных элементов, образующихся на этапе лазерной резки, и удаляет мертвые колонии или другие токсины и т.д. После промывки вырезанной лазером ткани листки снова погружают в 0,625% забуференный раствор глутарового альдегида в среде с низким содержанием кислорода до его дальнейшего использования, т.е. изготовления сердечного клапана. Хранение вырезанного лазером тканевого листка в том же растворе приведет к изменению основных характеристик и свойств ткани. Толщина вырезанных лазером листков бычьего перикарда составляет от 0,32 до 0,48 мм, и эти листки используются для изготовления сердечных клапанов и хирургической реконструкции и восстановления сосудов.

Таблица 3: Параметры лазерной резки

Параметры лазерной резки Режим : Векторный режим Мощность : 50,3% Скорость : 18%

Хранение вырезанной лазером ткани:

Вырезанный лазером бычий перикард хранят в 0,625% глутаровом альдегиде для поддержания влажности и в среде с низким содержанием кислорода при содержании кислорода 5-15%, предпочтительно 8-10%, и температуре 8-10°C. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вырезанный лазером бычий перикард помещают при температуре 8-10°C в вакуумированную герметичную банку с 80 мл 0,625% раствора глутарового альдегида для хранения в среде с низким содержанием кислорода до дальнейшего использования.

Обработка вырезанных лазером листков ткани с использованием AAS:

Фосфолипиды биологической ткани могут служить субстратом для кальцификации, сокращающей срок службы ткани, поэтому для удаления этих кальцифицируемых материалов применяют различные спиртовые растворы в сочетании с альдегидом и поверхностно-активным веществом. В предпочтительном варианте осуществления для извлечения фосфолипидов используют этанол в сочетании с альдегидом, т.е. формальдегидом, и поверхностно-активным веществом, например, Tween-80.

В некоторых вариантах осуществления другие низкомолекулярные спирты, такие как метанол и изопропанол, также добавляют для эффективного уменьшения кальцификации вырезанных лазером листков ткани, в результате чего повышается стабильность, целостность и эффективность биопротеза. Фосфор, присутствующий внутри фосфолипидов, является потенциальным местом связывания кальция для извлечения фосфолипидов, что уменьшает кальцификацию in-vivo после имплантации. Это связано с тем, что AAS содержит спирты, структура которых схожа с фосфолипидами, и, таким образом, выполняет извлечение из вырезанных лазером тканевых листков. Спирты с более длинными цепочками имеют структуру, более схожую со структурой фосфолипидов, и, как известно, замещают молекулы фосфолипидов, тем самым более эффективно удаляя молекулы фосфолипидов. Удаление фосфолипидов и липидов также снижает поглощение холестерина из организма, что позволяет избежать кальцификации, являющейся основным недостатком биологических тканей. Использование AAS противодействует кальцификации и снижает бионагрузку, увеличивая срок службы биопротеза.

i. Роль формальдегида:

Формальдегид - материал из категории сшивающих агентов с одной альдегидной группой. Он также обладает стерилизующими свойствами, поэтому действует как стерилизатор.

В некоторых вариантах осуществления сшивающий агент не ограничивается формальдегидом или глутаровым альдегидом и может быть выбран из различных категорий, таких как карбодиимиды, эпоксиды и другие комбинации с альдегидами, например, глицеральдегид и т.д.

ii. Роль этанола:

Обработку тканей органическими растворителями (этанолом, октанолом и октандиолом) применяют для удаления остаточных фосфолипидов, служащих связывающим субстратом для кальция.

iii. Роль полисорбата-80:

Полисорбат 80 / Tween-80 представляет собой неионное поверхностно-активное вещество и эмульгатор, полученный из полиэтоксилированного сорбитана и олеиновой кислоты. Поверхностно-активное вещество характеризуется склонностью к адсорбции на поверхностях и границах раздела. Tween-80 также удаляет кислотный тип фосфолипидов из ткани, который непосредственно связан со сроком службы ткани.

В другом варианте осуществления поверхностно-активное вещество может быть выбрано из категории анионных или неионных поверхностно-активных веществ или их смесей. Примерами анионных поверхностно-активных веществ являются додецилсульфат натрия и додецилсульфоацетат натрия, а примерами неионных поверхностно-активных веществ являются октилфенокси-полиэтоксиэтанол, полиоксиэтилен, tween-80 или tween-60.

Таблица 4: Объемы для раствора AAS

Химическое вещество (определяемое вещество) Общий объем (1 л) Na₂HPO₄ 2,40 г KH₂PO₄ 0,416 г Полисорбат-80 12,00 мл Этанол (99,97%) 243 мл 37% формальдегид 108,19 мл Вода для инъекций 637,0 мл

Вырезанные лазером тканевые листки погружают в раствор AAS на 1-20 часов в среде с низким содержанием кислорода, причем содержание кислорода поддерживают на уровне 5-15%, предпочтительно 8-10%, внутри полипропиленовой банки. В течение этого времени погружения температуру раствора AAS поддерживают на уровне 25-45°C. Повышение температуры усиливает химическую реакцию, способствуя удалению фосфолипидов, склонных к кальцификации.

В предпочтительных вариантах осуществления раствор AAS приготавливают в среде с низким содержанием кислорода; после этого вырезанные лазером тканевые листки обрабатывают для уменьшения бионагрузки, то есть подвергают обработке AAS. Вырезанную лазером ткань помещают в вакуумированную герметичную банку, содержащую приблизительно 50-90 мл раствора AAS, более предпочтительно 75-85 мл, и устанавливают в перемешивающее устройство для обеспечения плавного движения жидкости. Эту банку ставят в перемешивающее устройство при температуре 25-45°C, более предпочтительно 37-40°C, и плавно перемешивают жидкость в течение 3-6 часов. Благодаря плавному встряхиванию процесс снижения бионагрузки обычно завершается за короткий промежуток времени. Обработанную AAS (фиксированную) ткань промывают деионизированной водой, раствором натрия хлорида или фосфатно-солевым буфером, после чего хранят в 0,625% растворе глутарового альдегида в среде с низким содержанием кислорода для сохранения структурной целостности и свойств фиксированной ткани бычьего перикарда.

Фиксированную ткань в дальнейшем используют для изготовления сердечного клапана в условиях контролируемой окружающей среды, т.е. в условиях ламинарного потока воздуха. Во время изготовления сердечного клапана фиксированную ткань необходимо постоянно поддерживать во влажном состоянии, для чего ее регулярно опрыскивают раствором натрия хлорида, который поддерживает ткань во влажном состоянии в процессе изготовления. Затем сердечный клапан или биопротез стерилизуют методом жидкостной химической стерилизации. Время выдержки от забора ткани до процесса фиксации при температуре 18-20°C показано на рисунке 6. Выдержка в среде с низким содержанием кислорода предотвращает ухудшение морфологических и химических свойств ткани, тем самым повышая целостность фиксированной ткани бычьего перикарда / биопротеза. Затем стерилизованный биопротез упаковывают и хранят в среде с низким содержанием кислорода для повышения стабильности биопротеза.

Рабочий пример 1

Свежие бычьи сердца с неповрежденным перикардом собрали на одобренной FDA скотобойне, которая хранит историю жизни и данные о животном в соответствии со стандартами и регулятивными нормами, т.е. ISO 13485 и ISO 22442. Свежую ткань перикарда иссекли и извлекли из сердца путем разреза вдоль основания сердца, оставив прочую ткань неповрежденной. Необработанную ткань перикарда постоянной толщины доставили в лабораторию в забуференном растворе натрия хлорида. В лаборатории свежую ткань промыли и очистили от внешнего жира и налипшего материала.

Собранную ткань перикарда промыли охлажденным 0,9% раствором натрия хлорида, поместив ткань в ванну из нержавеющей стали при комнатной температуре и в среде с нормальным содержанием кислорода с влажностью 55%. Сначала в ванну из нержавеющей стали налили 100 мл охлажденного 0,9% раствора натрия хлорида и поместили в него бычий перикард, предварительно обрезанный и промытый при сборе материала. Затем ткань перикарда несколько раз промыли до смывания всего мусора и остатков жировой ткани. После многократного промывания свежий охлажденный раствор натрия хлорида объемом 500 мл снова залили в ванну из нержавеющей стали, после чего ткань промыли с обеих сторон и передали на сшивание.

5 литров водного 0,625% раствора глутарового альдегида (CHO(CH₂)₃CHO) согласно таблице 5 приготовили и отфильтровали под вакуумом в среде с нормальным содержанием кислорода для удаления любого нежелательного мусора. 10 кусочков промытой ткани перикарда поместили в фиксирующую рамку. Фиксирующий раствор налили в фиксирующую ванну и поместили в нее 10 кусочков перикарда. Циркуляционный насос подключили к резервуару плоского фланца для надлежащей циркуляции сшивающего раствора. Расход поддерживали на уровне 1,3-2,2 л/мин. Время погружения ткани установили равным 35 минутам при температуре 18-20°C в среде с нормальным содержанием кислорода. После этого сшитую ткань выдерживали в 0,625% водном забуференном растворе глутарового альдегида в течение 8 дней. Далее ее разрезали лазером на листки и подвергли обработке AAS для снижения бионагрузки.

Таблица 5: Объем для приготовления 5 литров 0,625% водного раствора глутарового альдегида

Материал Состав на 5 л Na₂HPO₄·7H₂O 20,80 г KH₂PO₄ 3,05 г NaCl 39,45 г Глутаровый альдегид, прибл. 25% (м/об) 132,50 г Дистиллированная вода 4937,5 мл

Сшитую ткань дополнительно обработали для этапа уменьшения бионагрузки с целью удаления нежелательного мусора, мертвых колоний, токсинов и поглощающих холестерин экстрактов, что уменьшает кальцификацию и повышает целостность и срок службы фиксированной ткани перикарда. Раствор AAS приготавливают в сухом шкафу в среде с нормальным содержанием кислорода. Сшитую ткань помещают в вакуумированную герметичную банку, содержащую приблизительно 50-90 мл раствора AAS, предпочтительно 80 мл, и устанавливают в перемешивающее устройство для плавного перемешивания жидкости. Эту банку ставят в перемешивающее устройство и плавно перемешивают жидкость в течение 3 часов при температуре 37-40°C. По завершении обработки AAS (фиксированную) ткань промывают деионизированной водой или раствором натрия хлорида или фосфатно-солевым буфером и хранят в 0,625% растворе глутарового альдегида.

После этого полученную ткань хранили в свежеприготовленном 0,625% растворе глутарового альдегида при различных температурных условиях следующим образом:

1. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 25-30°C в среде с низким содержанием кислорода.

2. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 25-30°C в среде с нормальным содержанием кислорода.

3. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 8-10°C в среде с низким содержанием кислорода.

4. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 8-10°C в среде с нормальным содержанием кислорода.

Фиксированные ткани периодически проверяли на механическую прочность (прочность ткани на разрыв) с периодичностью: начальная, 03 месяца, 06 месяцев, 09 месяцев и 12 месяцев. Результаты представлены в таблице 6 ниже.

Периодичность, месяцев Любая обработка ткани выполняется в среде воздуха с нормальным содержанием кислорода Прочность фиксированной ткани на разрыв (Н) Хранение при температуре 25-30°C Хранение при температуре 8-10°C Среда с низким содержанием кислорода Среда с нормальным содержанием кислорода Среда с низким содержанием кислорода Среда с нормальным содержанием кислорода Начальная 12,52 12,52 12,52 12,52 03 месяца 12,41 11,79 12,49 12,21 06 месяцев 12,03 11,29 12,46 11,41 09 месяцев 11,48 10,21 12,24 10,39 12 месяцев 09,83 08,01 11,03 09,13

Таблица 6

Согласно приведенным выше данным, был сделан вывод, что фиксированные ткани, хранящиеся при температуре 8-10°C в среде с низким содержанием кислорода, обладают лучшей стабильностью, целостностью и долговечностью.

Рабочий пример 2

Свежий бычий перикард собрали от животного в возрасте менее 24 месяцев, не зараженного трансмиссивной губкообразной энцефалопатией / губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота, на одобренной FDA скотобойне. Перикард иссекли в соответствии со стандартами ISO, т.е. ISO 22442, и отделили от сердца при непрерывном распылении 0,9% охлажденного раствора натрия хлорида. Свежую ткань перикарда постоянной толщины доставили в лабораторию в охлажденном растворе натрия хлорида для поддержания электролитического баланса в живых клетках и предотвращения гнилостных изменений в ткани. Затем необработанную ткань промыли, удалили наружный жир, кровеносные сосуды и другие налипшие материалы в лаборатории в шкафу в среде с низким содержанием кислорода при непрерывном распылении охлажденного раствора натрия хлорида на ткань. Полученную поверхность ткани проверили на предмет отверстий, трещин и других загрязнений. После этого одобренную качественную необработанную ткань перикарда поместили в среду с низким содержанием кислорода для предотвращения окислительного повреждения ткани и передали в лабораторию для сшивания.

Резервуар плоского фланца в сборе со средой с низким содержанием кислорода и датчиком температуры использовали для улучшения процесса сшивания с целью повышения способности к фиксации и компетентности ткани. Внутри резервуара плоского фланца поддерживали низкое содержание кислорода, т.е. содержание кислорода в окружающей среде 8-10%, а рабочую температуру поддерживали на уровне 18-20°C. Камера с низким содержанием кислорода способствует сохранению естественной эластичности коллагеновой матрицы и повышает стабильность сшивок молекул коллагена. 5 литров водного 0,625% раствора глутарового альдегида (CHO(CH₂)₃CHO) приготовили в шкафу с низким содержанием кислорода для предотвращения разложения и окисления раствора глутарового альдегида, после чего отфильтровали под вакуумом для удаления любых нежелательных частиц. 10 кусочков ткани перикарда поместили в фиксирующую рамку для удержания ткани в растягивающейся рамке. Фиксирующий раствор налили в резервуар плоского фланца и поместили в него 10 кусочков перикарда. После этого резервуар плоского фланца подключили к насосу для циркуляции сшивающего раствора, а также к анализатору O₂ и датчику температуры. Расход поддерживали на уровне 1,3-2,2 л/мин. Время погружения ткани установили равным 35 минутам при температуре 18-20°C. После этого сшитую ткань выдерживали в 0,625% водном забуференном растворе глутарового альдегида в течение 08 дней в среде с низким содержанием кислорода. Сшитую ткань дополнительно обработали на этапе снижения бионагрузки для удаления нежелательного мусора, мертвых колоний, токсинов и экстрактов фосфолипидов, а также снижения поглощения холестерина, что позволяет снизить кальцификацию и повысить целостность фиксированной ткани перикарда. Ткань поместили в вакуумированную герметичную банку, содержащую приблизительно 50-90 мл раствора AAS, предпочтительно 80 мл, которую поставили в перемешивающее устройство для плавного перемешивания жидкости. Эту банку поставили в перемешивающее устройство для плавного перемешивания жидкости в течение 03 часов при температуре 37-40°C. После обработки AAS (фиксированную) ткань промыли деионизированной водой или раствором натрия хлорида или фосфатно-солевым буфером и хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при различных условиях (см. ниже).

1. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 25-30°C в среде с низким содержанием кислорода.

2. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 25-30°C в среде с нормальным содержанием кислорода.

3. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 8-10°C в среде с низким содержанием кислорода.

4. Фиксированные ткани хранили в 0,625% растворе глутарового альдегида при температуре 8-10°C в среде с нормальным содержанием кислорода.

Фиксированные ткани периодически проверяли на механическую прочность (прочность ткани на разрыв) с периодичностью: начальная, 03 месяца, 06 месяцев, 09 месяцев и 12 месяцев. Результаты представлены в таблице 7 ниже.

Периодичность, месяцев Любая обработка ткани выполняется в среде воздуха с нормальным содержанием кислорода Прочность фиксированной ткани на разрыв (Н) Хранение при температуре 25-30°C Хранение при температуре 8-10°C Среда с низким содержанием кислорода Среда с нормальным содержанием кислорода Среда с низким содержанием кислорода Среда с нормальным содержанием кислорода Начальная 16,98 16,98 16,98 16,98 03 месяца 16,71 15,91 16,94 16,13 06 месяцев 15,99 14,36 16,89 15,55 09 месяцев 15,61 12,24 16,85 14,25 12 месяцев 14,87 11,34 16,83 13,82

Таблица 7

Согласно приведенным выше данным, был сделан вывод, что фиксированная ткань, которую хранили при температуре 8-10°C в среде с низким содержанием кислорода, обладает лучшей стабильностью, целостностью и долговечностью по сравнению с фиксированной тканью, которую обрабатывали и хранили в среде с нормальным содержанием кислорода. На основании вышеприведенных данных можно сделать вывод, что при хранении в течение одного года не наблюдалось значительных изменений в растяжимости фиксированной ткани, хранившейся в среде с низким содержанием кислорода при температуре 8-10°C. Предполагается, что в течение длительного периода хранения свойства растяжения сохраняются, поэтому фиксированная ткань сохраняет свою целостность, стабильность и эффективность в течение длительного периода времени.

Следовательно, обработка ткани бычьего перикарда в среде с низким содержанием кислорода, как указано выше, позволяет получить ткань, отличающуюся повышенной целостностью и прочностью на растяжение, минимальным количеством трещин и разрывов, чистой и гладкой поверхностью, светлым цветом, то есть имеющую более высокую стабильность по сравнению с бычьей тканью, обработанной в среде с нормальным содержанием кислорода, описанной в примере 1. После этого, фиксированную ткань, обработанную в среде с низким содержанием кислорода, подвергают дальнейшим гемодинамическим испытаниям in-vitro в соответствии с ISO 5840 путем изготовления сердечного клапана.

Изобретение раскрыто на основе некоторых предпочтительных вариантов осуществления и примеров, не носящих ограничительного характера. Возможны различные изменения, не выходящие за рамки объема изобретения, раскрытого ранее и определенного в прилагаемой формуле изобретения.

Изобретением предложен способ обработки для предотвращения ферментативного разложения и дегенерации ткани бычьего перикарда, используемой для изготовления биопротезов для имплантации, включающий следующие этапы: сбор и заготовка необработанной ткани бычьего перикарда; химическое сшивание промытой ткани для получения фиксированной ткани; лазерная резка указанной фиксированной ткани для получения тканевого листка; химическая обработка указанного тканевого листка с использованием AAS; химическая стерилизация и хранение фиксированной ткани бычьего перикарда для сохранения структурной целостности и характеристик; причем все вышеуказанные этапы выполняют в среде с низким содержанием кислорода и контролируемой температурой. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл., 2 пр.

1. Способ обработки для предотвращения ферментативного разложения и дегенерации ткани бычьего перикарда, используемой для изготовления биопротезов для имплантации, включающий следующие этапы:

- сбор и заготовка необработанной ткани бычьего перикарда;

- промывание необработанной ткани бычьего перикарда физиологическим раствором хлорида натрия;

- химическое сшивание промытой ткани сшивающим агентом, представляющим собой глутаровый альдегид, для получения фиксированной ткани;

- лазерная резка указанной фиксированной ткани для получения тканевого листка;

- химическая обработка указанного тканевого листка с использованием раствора AAS, содержащего в 1 л раствора: 2,40 г Na₂HPO₄, 0,416 г KH₂PO₄, 12,00 мл полисорбата-80, 243 мл 99,97% этанола, 108,19 мл 37% формальдегида и 637,0 мл воды для инъекций;

- хранение фиксированной ткани бычьего перикарда в 0,625% растворе глутарового альдегида на основе фосфатно-солевого буфера;

причем все вышеуказанные этапы выполняют в среде с низким содержанием кислорода и контролируемой температурой, где содержание кислорода в среде с низким содержанием кислорода составляет 8-10%, а контролируемая температура составляет 18-20°С во время обработки и 8-10°С во время хранения.

2. Способ по п. 1, в котором за каждым из этапов химического сшивания, лазерной резки и химической обработки следует промывание охлажденным раствором хлорида натрия.

3. Способ по п. 2, в котором промывание охлажденным раствором хлорида натрия осуществляют путем непрерывного распыления охлажденного раствора хлорида натрия в среде с низким содержанием кислорода и контролируемой температурой.

4. Способ по п. 1, в котором химическое сшивание выполняют с использованием 0,625% раствора глутарового альдегида на основе фосфатно-солевого буфера.

5. Способ по п. 1, в котором химическое сшивание выполняют при непрерывной циркуляции глутарового альдегида со скоростью 0,8 л/мин.

6. Способ по п. 4 или 5, в котором этап сшивания выполняют в течение 35 минут.

7. Способ изготовления биопротеза для имплантации, включающий следующие этапы:

- сбор и заготовка необработанной ткани бычьего перикарда;

- промывание необработанной ткани бычьего перикарда физиологическим раствором хлорида натрия;

- химическое сшивание промытой ткани сшивающим агентом, представляющим собой глутаровый альдегид, для получения фиксированной ткани;

- лазерная резка указанной фиксированной ткани для получения тканевого листка;

- химическая обработка указанного тканевого листка с использованием раствора AAS, содержащего в 1 л раствора: 2,40 г Na₂HPO₄, 0,416 г KH₂PO₄, 12,00 мл полисорбата-80, 243 мл 99,97% этанола, 108,19 мл 37% формальдегида и 637,0 мл воды для инъекций;

- хранение фиксированной ткани бычьего перикарда в 0,625% растворе глутарового альдегида на основе фосфатно-солевого буфера;

- изготовление биопротеза из такой фиксированной ткани во влажной среде с распылением раствора хлорида натрия; и

- химическая стерилизация биопротеза с использованием раствора AAS; причем все вышеуказанные этапы выполняют в среде с низким содержанием кислорода и контролируемой температурой, где содержание кислорода в среде с низким содержанием кислорода составляет 8-10%, а контролируемая температура составляет 18-20°С во время обработки и 8-10°С во время хранения.