СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА СЕМЯН Российский патент 2024 года по МПК A01H1/02 A01G22/20 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

[0001] Для настоящей заявки испрашивается приоритет по предварительной заявке Соединенных Штатов Америки сер. №62/184 596, поданной 25 июня 2015 года и озаглавленной «Производство семян» (SEED PRODUCTION), а также по предварительной заявке Соединенных Штатов Америки сер. №62/269 496, поданной 18 декабря 2015 года и озаглавленной «Производство семян» (SEED PRODUCTION), а также по предварительной заявке Соединенных Штатов Америки сер. №62/269 531, поданной 18 декабря 2015 года и озаглавленной «Производство зерновой продукции» (GRAIN PRODUCTION), а также по предварительной заявке Соединенных Штатов Америки сер.№62/269 514, поданной 18 декабря 2015 года и озаглавленной «Производство зерновой продукции» (GRAIN PRODUCTION). Содержание предварительных заявок Соединенных Штатов Америки сер. №62/184 596, сер. №62/269 496, сер. №62/269 531 и сер. №62/269 514 во всей полноте включено в настоящую заявку.

Область техники, к которой относится предлагаемое изобретение

[0002] Предлагаемое изобретение относится в целом к новой, применяемой по запросу технологии производства семян и (или) гибридных семян. В частности, предлагаемое изобретение относится к технологии производства гибридных семян, которая не зависит от активного сброса пыльцы, мужской стерильности и (или) физической изоляции.

Предпосылки создания предлагаемого изобретения

[0003] Предлагаемое изобретение предназначено для применения в области производства гибридных семян культурных растений и в области селекции растений, таких как кукуруза, соя, пшеница, рис, подсолнечник, канола, сорго, хлопчатник, ячмень, просо американское, люцерна и другие растения. Исходя из расположения репродуктивного органа и характеристик репродуктивной способности у растений, многие виды для производства фертильных семян полагаются на самоопыление. Без применения некоторых форм механического, физического или генетического вмешательства для достижения мужской стерильности многие растения просто воспроизводят генетику родительского растения. Гибридные растения являются результатом оплодотворения от источника мужской пыльцы одного фонового генотипа женских репродуктивных органов с другим фоновым генотипом. У сельскохозяйственных растений гибридность в целом дает преимущество в доходности при коммерческом производстве и поэтому представляется предпочтительной, при наличии возможности, по сравнению с открытыми или самоопылительными способами коммерческого производства сельскохозяйственных растений. Как можно видеть на фиг. 1, выход продукции с единицы площади начинает заметно расти с широким внедрением гибридов в 1940-х годах и урожаи продолжают неуклонно возрастать со временем вплоть до настоящего времени. В настоящее время кукуруза, рис, сорго, подсолнечник и канола являются главными культурами, пользующимися преимуществами, которые дает производство гибридных семян. Масштаб производства гибридных семян других сельскохозяйственных растений, таких как соя и пшеница, весьма ограничен по той причине, что требуется много ресурсов для преодоления препятствий, обусловленных биологией репродуктивных органов и отсутствием эффективных способов достижения мужской стерильности. Способы крупномасштабного производства гибридных семян от сортов растений, которые обычно являются самоопыляемыми, отсутствуют или неэффективны, но представляли бы большую ценность в случае внедрения в практику. Известно, что посев гибридных семян и выращивание из них растений обеспечивает намного урожаи семян по сравнению с посевом и выращиванием самоопыляемых сортов растений.

[0004] Вскоре после того, как были созданы новые сорта растений с гибридными семенами, фермеры загорелись желанием применять такие семена на своих полях. Следовательно, требуется производство таких семян. В настоящее время большинство гибридных семян являются простыми гибридами, а не двойными гибридами, которые широко использовались в начале XX века. Но можно использовать и те и другие. Смена предпочтения на простые гибриды произошла по причине возросшей урожайности этих семян. Для производства всех семян, нужных фермерам каждый сезон, требуются огромные площади. Чтобы обеспечить эффективное производство желаемого гибрида, опыление должно осуществляться назначенными родительскими растениями, что требует строго контроля над источниками пыльцы. Это часто требует предотвращения самоопыления назначенного женского растения. Обычно это осуществляют обеспечением его мужской стерильности. Для этого, например, у кукурузы удаляют метелки. Однако это удаление метелок имеет недостатки. Во-первых, это дорого. Во-вторых, при удалении метелок растение повреждается, результатом чего является понижение урожайности. Для преодоления этих недостатков предлагались другие формы обеспечения мужской стерильности. В качестве примеров могут быть названы цитоплазматическая мужская стерилизация, генная мужская стерилизация, и химически индуцированная мужская стерилизация. Но у всех этих технологий имеются недостатки.

[0005] Таким образом, для сельскохозяйственных культур, для которых производство гибридных семян является обычной практикой, используемые в настоящее время способы производства семян разнятся от одного биологического вида к другому, но в типичном случае они включают следующие операции: (1) высадку назначенных женского и мужского родительских растений (далее для краткости могут называться просто «женское растение» и «мужское растение», соответственно) в производственном блоке с расположением в непосредственной близости друг к другу, (2) расположение производственного блока в изолированной местности, чтобы сократить риск воздействия на родительские растения со стороны посторонних или нежелательных растений того же вида, и (3) придание женскому растению некоторой формы мужской стерильности, чтобы избежать, таким образом, самоопыления, которое сильно загрязнило бы генетику гибридных семян. Базовый способ производства гибридных семян кукурузы, в котором используют эти три операции, не изменился со времени первой коммерциализации гибридной кукурузы в конце 1920-х годов (Russell, W.A. (1974) Proceedings of the Annual Corn and Sorghum Industrial Research Conference 29:81-101). В отрасли производства гибридных семян под генетическим загрязнением понимается наличие семян, которые не являются результатом желательного и целенаправленного генетического скрещивания между назначенными женскими и мужскими родительскими растениями. Причиной генетического загрязнения может быть самоопыление женского растения, или же генетическое загрязнение может быть результатом опыления женского растения пыльцой от ненадлежащего мужского родителя. Это может случиться в результате переноса пыльцы по воздуху, или же ненадлежащая пыльца может быть занесена насекомыми, дикими животными, людьми, транспортными средствами или другими потенциальными носителями пыльцы, которые проникают на территорию производственного полигона, или же пребывают по отношению к женским растениям достаточно близко с точки зрения риска непреднамеренного переноса пыльцы.

[0006] Создание изолированных производственных блоков, которые обеспечивали бы недопущение нежелательных актов опыления и придания мужской стерильности, сталкивается с проблемами. Найти участок земли, который был бы изолирован и находился на достаточно большом расстоянии от других растений того же вида, трудно, а порой и невозможно. Поэтому нет ничего необычного в том, что поле не защищено от нежелательной пыльцы, и тем самым определенный процент производимых на этом поле семян оказывается загрязненным. К способам мужской стерилизации относятся генетическая стерилизация, физическое или механическое удаление мужской части репродуктивной области у растений, предназначенных к использованию в качестве женского источника, и применение химического гаметоцида, который убивает мужские гаметы. Физические и механические способы очень дороги, в то время как химические гаметоциды дороги и (или) недостаточно эффективны. Генетическая мужская стерилизация в форме цитоплазматической мужской стерилизации находит широкое применение для некоторых культурных растений, например, для канолы и подсолнечника, но только ограниченно применяется в отношении других культур, в частности, в отношении кукурузы и риса, для которых применимость этого способа ограничена в силу того, что не вся идиоплазма совместима (Beckett, J.В. (1971) Crop Sci. 11: 724-727; Duvick, D.N. (1965) Advances in Genetics 13: 1-56). Способы ядерно-геномной мужской стерилизации в отрасли производства семян по большей части находятся в стадии разработки, и только несколько из них введены в коммерческий оборот, но они нашли применение только на малой толике производственных площадей. Хотя генетическим способам мужской стерилизации отдается преимущество перед физическими / механическими и химическими, однако они требуют привлечения значительных ресурсов, повышают сложность создания пакетов признаков и получения продуктов, которые могли бы быть продвинуты на рынок в кратчайшие сроки, а иногда должны быть пропущены через сложные системы нормативно-правового регулирования разных стран мира (в случае генетически модифицированных организмов). По существу, общим знаменателем всех способов обеспечения мужской стерильности у растений является дороговизна и (или) недостаток ресурсов, а также ограниченность продуктов или недостаток времени для надлежащего завершения.

[0007] В настоящее время некоторые экономически важные сельскохозяйственные культуры, в том числе (но не только) соя и пшеница не могут выращиваться как гибриды, так как для них не существует эффективных способов получения мужской стерильности и (или) эти виды в настолько высокой степени склонны к самоопылению, и их пыльца способна переноситься только на столь короткие расстояния, что даже в случае мужской стерильности успех перекрестного опыления был бы невелик, результатом чего были бы низкие урожаи гибридных семян, полученных в результате перекрестного опыления, что делало бы производство гибридных семян экономически невыгодным. В настоящее время к ценным культурам, в отношении которых достигнут весьма ограниченный успех с точки зрения производства гибридных семян помимо сои относится пшеница. Вообще говоря, индустрия производства семян проявляет активный интерес к способам, обеспечивающим возможность производства большинства культурных видов растений или совершенствующим такое производство, и этот интерес обусловлен значительным повышением урожайности и оплодотворяемости, обеспечиваемыми гибридами сельскохозяйственных культур.

[0008] Что касается тех сельскохозяйственных культур, для которых производство гибридных семян используется (например, кукуруза и подсолнечник), то в их отношении предлагаемое изобретение полностью или частично устраняет необходимость во всех трех дорогих и ресурсозависимых операциях, которые были упомянуты выше, а именно: в высадке женского и мужского родительских растений в непосредственной близости друг к другу, в расположении производственного блока в изолированной местности и в придании женскому растению некоторой формы мужской стерильности, или сокращает зависимость от этих операций. Один из широко известных способов создания гибридных культурных растений состоит в посадке мужского и женского родительских растений в тесной близости друг к другу, при этом каждый из родителей имеет набор генов, подходящий для создания предпочтительных гибридных семян. Как будет более подробно описано далее, для производства семян каждое растение способно давать как мужские, так и женские гаметы. Таким образом, одна родительская линия назначается имеющей подходящий свойства, чтобы быть использованной как источник мужских гамет, в то время как другие растения назначаются источниками женских гамет. От мужских растений обычно требуется высокая способность к испусканию пыльцы, в то время как от женских растений требуется адекватная доступность женских репродуктивных тканей, а также способность давать высокий урожай семян и другие желаемые генетически обусловленные признаки. В широко практикуемых способах период испускания мужским растением пыльцы должен накладываться на период, в течение которого женское растение обладает наивысшей способностью к оплодотворению. Обычно мужские растения занимают приблизительно 30%, площади поля, а на долю женских растений остается 70% площади поля, при этом доля мужских растений возрастает в тех случаях, когда мужские растения испускают мало пыльцы. Наличие мужских растений нужно только для производства пыльцы для растений, которым назначено быть источником женских гамет. Поэтому территория, занятая мужскими растениями, не является продуктивной с точки зрения производства семян или пищевых продуктов. Кроме того, мужские растения потребляют ценные ресурсы, в частности, минеральные вещества и влагу. Кроме того растения, которым назначено быть женскими, должны быть стерилизованы в части их мужских свойств, чтобы предотвратить самоопыление или опыление другими такими же растениями, то есть, растениями, назначенными быть женскими растениями.

[0009] Как должно быть понятно специалистам соответствующего профиля, осуществление раскрываемого в настоящей заявке изобретения обеспечит различные положительные эффекты в зависимости от природы сельскохозяйственной культуры. Например, некоторые сельскохозяйственные культуры имеют высокую склонность к самоопылению по причине того, что пыльца испускается внутри цветка еще до того, как цветок раскроется. Такие сельскохозяйственные культуры естественным образом дают очень высокий процент семян, полученных в результате самоопыления. Осуществление предлагаемого изобретения может понизить процент таких семян, но по причине того, что самоопыление происходит до того, как цветок раскрывается, доля семян, полученных в результате опыления растений, назначенных быть женскими, растениями, назначенными быть мужскими, будет меньше, чем у тех сельскохозяйственных культур, у которых не происходит самоопыления в закрытом цветке. Некоторые сельскохозяйственные культуры по своей природе и благодаря свойствам их пыльцы не требуют больших дистанций изоляции для предотвращения случайных скрещиваний. В таких случаях осуществление предлагаемого изобретения не может повлиять на какие-либо требования в отношении изоляции, но все же повысит долю успешного перекрестного опыления надлежащими мужскими растениями, а также сократит самоопыление. Таким образом, в зависимости от выращиваемой сельскохозяйственной культуры, осуществление предлагаемого изобретения может полностью или частично устранить необходимость в любом одном, или в любых двух, или во всех трех дорогих и ресурсозависимых операциях, о которых говорилось выше а именно: в высадке женского и мужского родительских растений в непосредственной близости друг к другу, в расположении производственного блока в изолированной местности и в придании женскому растению некоторой формы мужской стерильности, или сокращает зависимость от них.

[0010] Кроме того, часто бывает трудно найти поле, достаточно изолированное от посторонних растений того же вида, которые могут стать фактором нежелательного перекрестного опыления вместо целенаправленного перекрестного опыления. Обеспечение такой изоляции вспомогательными средствами может быть дорогостоящим. Например, в производстве гибридных семян зерновых культур для достижения достаточной изоляции обычной практикой является высаживание зерновых культур в окружении других сельскохозяйственных культур, таких как соя. Как можно видеть на фиг. 2, для обеспечения изоляции типичное поле 100 для производства гибридных семян кукурузы обычно окружено со всех сторон полосой 102 шириной приблизительно 201 м (660 футов), на которой высажена соя. Территория, засаженная соей, на фиг. 2 изображена в виде слегка затушеванной широкой рамки, образующей наружное квадратное окаймление. Самое внутреннее поле 104, предназначенное непосредственно для производства гибридных семян кукурузы, со всех сторон окружено окаймлением 106, которое на фиг. 2 закрашено черным и на котором высажено от четырех до восьми рядов мужских растений. На самом внутреннем поле 104 рядами высажены мужские родительские растения, чередуясь с женскими родительскими растениями. В варианте, иллюстрируемом на фиг. 2, на этом поле растения располагаются по схеме два ряда мужских растений между четырьмя рядами женских растений. Эта схема не является ограничивающей, может использоваться много других схем, например, мужские ряды могут перемежаться женскими с общим интервалом. В зависимости от характеристик мужских и женских родительских растений и других факторов, которые могут действовать в данной местности, сельхозпроизводители используют различные схемы высадки родительских растений. В варианте, иллюстрируемом на фиг. 2, доля мужских родительских растений составляет приблизительно 35%, доля женских - приблизительно 65%. Если поле имеет приблизительно 610 м (2000 футов) в длину и 800 рядов по ширине, то в варианте, иллюстрируемом на фиг. 2, площадь поля, производящего семена, составит приблизительно 37 га (92 акра), и оно будет окружено 65 га (161 акром) соевого поля, служащего для обеспечения изоляции. Этот вариант требует значительных занятых площадей при относительно небольших площадях, обеспечивающих собственно производство семян. В других вариантах на полях для производства гибридных семян могут быть использованы другие комбинации мужских и женских родительских растений, и решение, какую схему применять, часто зависит от характеристик родительских растений.

[0011] Осуществление такой технологии в промышленном или коммерческом масштабе и дорого, и часто недостаточно для обеспечения требуемой генетической чистоты. Генетическая чистота является мерой чистоты семян. Когда речь идет о гибридных семенах, генетическая чистота является мерой семян, которые получены заданным генетическим скрещиванием между мужскими и женскими родительскими растениями, и выражается обычно в процентах. Семена, полученные в результате самоопыления или опыления ненадлежащей пыльцой (ауткроссинга), считаются семенами-загрязнителями и не являются гибридными семенами. Обычно для продажи в качестве сертифицированных гибридных семян генетическая чистота гибридных семян зерновых культур должны составлять 95% (то есть, 95% семян должны быть гибридными). Сертификация семян в Соединенных Штатах Америки производится по четырехстадийной схеме, за нее отвечает каждый отдельный штат, в котором существует орган по сертификации семян, руководствующийся соответствующим законом этого штата. Четыре стадии - это селекционные семена, суперэлитные семена, зарегистрированные семена и сертифицированные семена. Сертифицированные семена производятся из суперэлитных семян или из зарегистрированных семян и являются конечным продуктом четырехстадийной программы сертификации семян. Хотя в каждом штате свой закон о семенах, требование 95%-ной генетической чистоты является общим для всех. Даже при соблюдении рекомендуемых дистанций изоляции обычными источниками загрязнения нежелательной пыльцой с близлежащих полей являются ветер, насекомые и другие природные факторы.

[0012] Среди способов мужской стерилизации женских родительских растений кукурузы для получения большинства производимых в мире гибридных семян используют удаление метелок, что является довольно дорогостоящей технологией по причине привлечения ручного труда и (или) применения дорогого оборудования для удаления метелок у женских растений. Начиная с широкого применения гибридов зерновых культур в 1930-х годах (Crow, J.F. (1998) Genetics 148:923-928), производство семян осуществляется по большей части весьма сходным способом, включающим высадку массива семяпроизводящих мужских и женских растений в изоляции и удаление метелок у женских растений. Экономическая ценность описываемого здесь изобретения состоит в том, что оно может уменьшить себестоимость реализованной продукции, полученной в процессе производства семян. Прежде всего, предлагаемое изобретение обеспечивает экономию денег на расходах по удалению метелок. Предлагаемое изобретение могло бы обеспечить удаление метелок с затратами, составляющим в среднем 50% от нынешнего. Приняв существующие расходы на удаление метелок равными 350 долларов США за акр (приблизительно 875 долларов США за гектар) (Draft Environmental Assessment [online], 2010. Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed Production Technology (SPT) Process DP-32138-1 Corn [retrieved on 2016-06-19]. Получено из Интернета: https.//www.aphis.usda.gov/brs/aphisdocs/08_33801p_fea.pdf) и учитывая, что производство гибридных семян только в Соединенных Штатах Америки осуществляют на площади приблизительно один миллион акров (приблизительно 400000 га) (Weber et al., 2009. Journal of Agronomy and Crop Science 193: 79-92), предлагаемое изобретение в семенной индустрии благодаря сокращению расходов на удаление метелок обеспечивало бы экономический эффект 175 миллионов долларов США в год (350 долларов США/акр × 50% × 1 млн акров). Кроме того, дополнительный экономический эффект мог бы быть получен за счет сокращения дистанций изоляции и сокращения количества мужских растений, высаживаемых на поле для производства семян. Генетические способы мужской стерилизации менее дороги, чем удаление метелок, но все же при производстве семян связаны с существенными расходами на разработку женских линий с правильными генами и (или) правильной цитоплазмой, чтобы получить разрешение государственных контрольно-надзорных органов на использование генов, если речь идет о генно-модифицированных организмах, и введение продуктов, которые немного запоздали по причине продолжительности процесса разработки. По этим причинам генетическая мужская стерилизация при производстве гибридных семян кукурузы находит в США весьма ограниченное применение. Сходным образом, химические способы мужской стерилизации используются только для небольшого числа зерновых культур и считаются дорогими, относительно неэффективными и не пригодными для широкого применения.

[0013] Таким образом, в данной области существует потребность в изобретении, которое бы сократило или полностью устранило вышеуказанные недостатки. Такое изобретение сократило бы или полностью устранило бы требование высаживать мужские родительские растения в непосредственной близости к женским родительским растениям, или же позволило бы сократить количество требуемых мужских родительских растений. Кроме того, изобретение смягчило бы или значительно сократило бы потребность в создании поля для производства семян в изоляции от других, не имеющих отношения к производству семян, растений того же вида благодаря более контролируемым средствам, используемым при процедурах опыления. Сходным образом, изобретение обеспечивало бы возможность использовать более короткие дистанции изоляции. Кроме того, изобретение смягчало или устраняло бы требование применения некоторых форм мужской стерильности у назначенных женских родительских растений с целью избежать самоопыления, тем самым уменьшив или полностью устранив необходимость трудоемкой процедуры удаления метелок или использования других способов мужской стерилизации.

[0014] Кроме того, для тех сельскохозяйственных культур, которые не могут выращиваться как гибриды или трудно поддаются гибридизации по причине их структурных особенностей или применяемых в настоящее время практик выращивания растений, это изобретение могло бы обеспечить производство гибридных семян в коммерчески оправданных количествах при уровне расходов, который делал бы производство гибридных семян экономически оправданным для семенной индустрии. Попытки гибридизировать пшеницу продолжались более 80 лет без особого успеха с точки зрения экономичного производства семян, несмотря на перспективу обусловленного гибридизацией повышения урожайности более чем на 20% (Pickett, А.А. (1993) Adv. Plant Breed., Suppl. J. Plant Breed. 15: 1-259). Система, которая обеспечивала бы экономичное производство гибридных семян, такая как описываемое здесь изобретение, имела бы огромную ценность. Скромно предположив, что у гибридной пшеницы повышение урожайности по сравнению с сортовой пшеницей вырастет на 10%, и предположив, что под гибридную пшеницу будет отведена треть занятой пшеницей площади, получим годовую добавленную ценность величиной 4,4 миллиарда долларов США по всей цепочке добавления ценности. Этот расчет базируется на мировом производстве пшеницы 729 миллионов метрических тонн (Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций (Статистическая база данных ФАО)) в 2014 году и мировой цене на пшеницу 180,32 доллара США за метрическую тонну (на дату 13 июня 2016 года, взято с сайта https://www.ams.usda.gov/market-news/livestock-grain-market-news-publications (Расчет: 180,32 $/мт × 729000000 мт × 10% прироста урожайности × 33% площади). Это общая выгода по консервативной оценке, в то время как семенная индустрия претендует на то, что в выгода от мировой продажи только семян при доле гибридной пшеницы приблизительно 33% составит приблизительно 3 миллиарда долларов США в год (Syngenta Investor Day 2015 Presentation [online], c. 20, [на 19 июня 2016 года]. Взято с сайта: http://www4.syngenta.com/~/media/Files/S/Svngenta/events-and-presentations/plenary-presentation-rndday2015-trish-malarkey.pdf). Во всемирном масштабе это еще намного больше.

Краткое описание прилагаемых графических материалов

[0015] На фиг. 1 изображен график роста средней урожайности (в бушелях на акр) хлебных культур в Соединенных Штатах Америки с 1866 года по 2011 год. Источник: веб-сайт Университета штата Миссури.

[0016] На фиг. 2 схематично изображен план типичного поля для производства гибридных семян кукурузы. Внешнее затушеванное квадратное окаймление изображает зону изоляции, обычно засаживаемую соей. Внутреннее черное квадратное окаймление изображает зону, засаженную мужскими родительскими растениями, а внутреннее квадратное поле засажено чередующимися рядами мужских и женских родительских растений.

Краткое описание предлагаемого изобретения

[0017] Предложен способ производства семян, обеспечивающий генетическую чистоту производимых семян, уровень которой повышен за счет уменьшения генетического загрязнения, содержащий выращивание назначенного женского родительского растения, которое имеет как женские, так и мужские репродуктивные компоненты, целенаправленное опыление, за один или большее число раз, упомянутого назначенного женского родительского растения пыльцой назначенного мужского родительского растения, когда упомянутые мужские репродуктивные компоненты упомянутого назначенного женского родительского растения не испускают жизнеспособной пыльцы, и когда другие биологически совместимые источники пыльцы тоже не испускают жизнеспособной пыльцы, выращивание назначенного женского родительского растения до зрелости и сбор урожая семян, произведенных этим назначенным женским родительским растением. Кроме того, способ включает сокращение или устранение необходимости в соблюдении одного или более из следующих условий: мужская стерильность упомянутого назначенного женского родительского растения, пространственная и (или) изоляция упомянутого назначенного женского родительского растения от каких-либо биологически совместимых источников пыльцы и выращивание мужских родительских растений-опылителей в непосредственной близости к упомянутому назначенному женскому родительскому растению.

[0018] Еще один вариант осуществления предлагаемого изобретения предусматривает использование свежей или консервированной пыльцы назначенного мужского родительского растения. Эта пыльца может быть собрана в одном или более из следующих мест: поле, ростовая камера, вегетационный домик, теплица, теневой домик, арочная теплица, установка для вертикального выращивания культур, гидропонная установка. Консервированная пыльца может быть получена с помощью любых средств консервирования, обеспечивающих возможность сохранения жизнеспособности пыльцы, это могу быть, например, средства, обеспечивающие охлаждение или замораживание, в том числе (но не только) заморозку, криоконсервацию, сушку, вымораживание, выдерживание в жидком азоте. Кроме того, пыльца, как свежая, так и консервированная, может быть собрана с источника с измененным циркадным ритмом, с источника с нормальным циркадным цветением, но при этом испускание пыльцы упомянутыми мужскими репродуктивными компонентами упомянутого назначенного женского родительского растения задержано, или же с источника с нормальным циркадным цветением, и при этом упомянутым мужским репродуктивным компонентам назначенного женского родительского растения позволено испускать пыльцу без задержки. Пыльца, как свежая, так и консервированная, может быть собрана с одного или более генетических источников и перед применением может быть скомбинирована с пыльцой от других генетических источников.

[0019] В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения пыльцу применяют к одному и тому же назначенному женскому родительскому растению более одного раза. Варианты осуществления предлагаемого изобретения предусматривают применение пыльцы назначенного мужского родительского растения к назначенному женскому родительскому растению в то время, когда последнее впервые становится восприимчивым к этой пыльце. Согласно еще одному варианту осуществления предлагаемого изобретения предусмотрена обработка с целью задержки созревания мужских репродуктивных компонентов назначенного женского родительского растения.

[0020] Предлагаемый способ применим к широкому спектру растений, в частности (но не только), к кукурузе, сое, пшенице, рису, подсолнечнику, каноле, сорго, хлопчатнику, ячменю, просу американскому и люцерне.

[0021] Создан способ производства семян любых растительных видов, включающий целенаправленное применение пыльцы назначенного мужского родительского растения к назначенному женскому родительскому растению, когда это назначенное женское родительское растение находится в состоянии, в котором его женские репродуктивные компоненты готовы принять пыльцу, но его мужские репродуктивные компоненты не испускают пыльцу. Кроме того, нет необходимости в том, чтобы у назначенного женского родительского растения была обеспечена мужская стерильность, не требуется также изоляция этого растения от нежелательных источников биологически совместимой пыльцы.

[0022] Опыление пыльцой назначенного мужского родительского растения может осуществляться с помощью автоматизированных средств, механических средств, ручных средств, пневматических средств, повышенного давления, пониженного давления, полуавтоматических средств или комбинаций вышеперечисленных средств. Кроме того, пыльца может быть взята в предварительно законсервированном или свежем виде из мужского источникового материала.

Подробное описание предлагаемого изобретения

[0023] Далее следует подробное описание одного из вариантов осуществления технологии и способов, обеспечивающих возможность производства улучшенных гибридных семян. Такие технология и способы могут использоваться для создания гибридных семян от любых растений. Для облегчения обсуждения и понимания в дальнейшем подробном описании предлагаемого изобретения будут часто рассматриваться примеры, относящиеся к кукурузе, которая является зерновой культурой. Должно быть понятно, что предлагаемые технология и способы могут быть использованы для любых растений, размножающихся семенами, и что упоминание кукурузы или других конкретно поименованных растений сделано только в иллюстративных целях и не является ограничительным для объема изобретения. Сходным образом, предлагаемая технология может быть также использована для уменьшения генетического загрязнения и повышения генетической чистоты получаемых родительских организмов и (или) производимых семян в целом. Генетическое загрязнение может быть уменьшено до любого уровня, в том числе (но не только) на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или до любого другого уровня. Согласно предпочтительным вариантам осуществления предлагаемого изобретения, генетическое загрязнение может быть уменьшено по меньшей мере на 30%, в частности, на 30% или более, 40% или более, или 50% или более.

[0024] Есть несколько целей производства семян, в том числе гибридных семян. Прежде всего, семена производят для различных исследовательских целей, чтобы оценить ценность новых генетических комбинаций. Компании по производству семян вкладывают миллиарды долларов в исследования в стремлении разработать растения с лучшим набором генов. Еще одна причина производить гибридные семена состоит в коммерческих продажах таких семян производителям сельскохозяйственной продукции, в частности, фермерам. Кроме того, семена производят с целью получения родительских семян, то есть, чтобы использовать их для выращивания родительских растений в отрасли производства гибридных семян. Предлагаемое изобретение может быть использовано для производства любых гибридных или негибридных семян, производимых для любых целей. Независимо от конечного использования семян производство гибридных семян зависит от опыления надлежащих женских растений пыльцой надлежащих мужских растений. Усовершенствованный способ производства гибридных семян включает сбор, хранение и доставку пыльцы к женским родительским растениям. В отрасли известны некоторые способы сбора пыльцы. Например, в патенте США №4922651 раскрыто устройство для осуществления или усовершенствования опыления растений.

[0025] Кроме того, в отрасли известны также некоторые способы доставки пыльцы, такие как раскрываемый в патенте США №4922651. Кроме того, в отрасли известны различные способы хранения пыльцы. Например, в патенте США №5596838, в котором описаны способ и устройство для подготовки пыльцы к криогенному хранению, содержится информация о том, что пыльца может храниться в течение месяцев, оставаясь жизнеспособной. Хотя в отрасли известны некоторые способы доставки пыльцы, эти способы не мотивируют пользователя и ни прямо, ни косвенно не дают ему сведений о возможности целенаправленной доставки пыльцы таким образом, чтобы устранить необходимость в изоляции и (или) мужской стерилизации женских растений, что всегда требуется в настоящее время в отрасли для поддержания использования при широкомасштабных полевых исследованиях или при коммерческом производстве гибридных семян. Предлагаемым изобретением предусмотрено выполнение опыления вне активного периода, в который есть риск самоопыления растения и (или) в который растение может подвергаться риску нежелательного опыления от посторонних источников, в силу чего отпадает необходимость в мужской стерилизации или изоляции женского родительского растения, хотя и то и другое может быть применено без выхода за пределы предлагаемого изобретения. Кроме того, у некоторых растений, таких как пшеница, пыльца мужского растения не переносится достаточно далеко, чтобы можно было эффективно получать гибридные семена (Loureiro, I. et al. (2007) Euphytica 156: 25-37; Dong, S. et al. (2016) PLoS ONE 11(3): e0151373. doi:10.1371/journal. pone.0151373). Предлагаемое изобретение решает эту проблему благодаря целенаправленному опылению, при котором пыльца эффективно доставляется к женскому родительскому растению.

[0026] Как говорилось выше, предлагаемое изобретение применимо к установившейся практике выращивания женских родительских растений из семян, которые дают всходы и вырастают в семенные растения, несущие гибридные семена, которые впоследствии должны быть проданы фермерам или другим покупателям, или же могут быть использованы для производства семян, используемых в исследовательских программах. Однако вместо выращивания мужских родительских семенных растений в непосредственной близости к женским растениям, как это имеет место в существующей практике, предлагаемым изобретением в качестве предпочтительной альтернативы предусмотрено применение целенаправленного опыления женских растений пыльцой мужских растений в установленное время. В контексте настоящей заявки признаки «целенаправленное», «целенаправленно» в отношении опыления означает специальное нанесение пыльцы (на женские репродуктивные компоненты растения) способом, не включающим естественное опыление ветром, насекомыми или под действием других природных факторов. Целенаправленно нанесенная пыльца - это пыльца, нанесенная на растение в результате преднамеренной человеческой деятельности, человеческого решения или человеческого вмешательства. Пыльца может быть целенаправленно нанесена вручную или иными средствами. Одним из примеров целенаправленного опыления является «предписывающее» опыление, которое состоит в использовании пыльцы для реагирования на конкретные потребности или условия в отрасли. Хотя предпочтительным представляется конкретное время, как об этом будет говориться в дальнейшем, одним из аспектов предлагаемого изобретения является преимущество, состоящее в возможности опыления в поле в любое время дня. Во всех аспектах предлагаемого изобретения пыльцу можно получать от одного или большего количества генетических источников.

[0027] Приобретение пыльцы мужского растения, требуемой для производства гибридных семян, может быть осуществлено через банк пыльцы. Банк пыльцы - это источник хранимой пыльцы, которая собрана из одного или большего количества источников и хранится в таких условиях, что сохраняет жизнеспособность. Растения, которые были использованы в качестве источника пыльцы для такого банка пыльцы, могли быть выращены и доведены до созревания для сбора пыльцы в любых условиях, в частности (но не только), в поле, в ростовой камере, в вегетационном домике, в теплице, в теневом домике, в арочной теплице, в установке для вертикального выращивания культур, в гидропонной установке и т.д. Пыльца из банка пыльцы может иметь разное происхождение. Например, согласно одному из вариантов осуществления предлагаемого изобретения, свежая пыльца может быть взята у мужских растений, выращенных в контролируемой среде, у которых циркадный ритм на временной интервал от двух до восьми часов опережает женские растения, выращиваемые в естественных условиях в поле. Согласно другому варианту осуществления предлагаемого изобретения, пыльца, которая хранится в банке пыльцы, может быть консервированной пыльцой, собранной за дни, недели, месяцы или годы до ее выдачи из банка для целей опыления. Консервированная пыльца может быть получена любыми способами консервирования, обеспечивающими сохранение ее жизнеспособности, например (но не только), с помощью охлаждения или замораживания, в том числе (но не только) путем заморозки, криоконсервации, лиофильной сушки вымораживания, выдерживания в жидком азоте.

[0028] В одном или большем количестве вариантов осуществления предлагаемого изобретения пыльца может быть получена из пыльниковой студии. Пыльниковая студия обеспечивает оптимальные условия произрастания для репродуктивных тканей мужских растений любых видов или сортов. Эти ткани (например, метелки кукурузы) срезают с растений, выращиваемых в стандартных условиях на открытом воздухе, например, в поле, или же в контролируемых условиях, например, в теплице или в ростовой камере. Представляется предпочтительным такое решение, при котором эти ткани срезают с растения, когда оно начинает испускать пыльцу, и помещают в пыльниковую студию. Затем эта ткань может быть культивируема в питательной среде, обеспечивающей дальнейший рост. В этой пыльниковой студии может циклически повторяться по меньшей мере что-то одно из следующего: специальное освещение, температура и (или) влажность, обеспечивая возможность дальнейшего роста ткани. Этот рост может регулироваться, то есть, его можно ускорять или замедлять, регулируя тем самым продолжительность состояния наличия пыльцы. При таком решении обеспечена возможность по запросу иметь пыльцу для опыления, которое может быть осуществлено в любое время дня или ночи. Это имеет практическую ценность для внедрения в части опыления нескольких выгодных и ценных технологий, относящихся к производству семян и зерновой продукции. Этим решением также обеспечена возможность сконцентрировать источники пыльцы, предназначаемой для консервирования. Любая пыльца, собранная в пыльниковой студии и консервированная, могла бы быть использована таким же образом, как и свежесобранная пыльца, но в течение долгого времени после того, как свежая пыльца, которая не была консервирована, умерла (R.I. Greyson (1994) Maize inflorescence culture, p. 712-714. In: M. Freeling, V. Walbot (eds), The Maize Handbook; Springer-Verlag, New York; J.B. Schoper, R.J. Lamber, B.L. Vasilas, and M.E. Westgate (1987) Plant factors controlling seed set in maize. The influence of silk, pollen, and ear-learf water status and tassel heat treatment at pollination, Plant Phyiol. 83: 121-125).

[0029] Доставку пыльцы мужского растения к женским репродуктивным тканям, которая может быть реализована механическими средствами, с помощью повышенного давления, с помощью пониженного давления, пневматическими средствами или иным образом, осуществляют, как только женские растения становятся восприимчивыми к пыльце, но всегда до того, как в каждый отдельный день станет пригодной для опыления пыльца самого назначенного женского родительского растения, благодаря чему обеспечено окно, на протяжении которого обеспечена возможность успешного перекрестного опыления всех готовых к оплодотворению женских растений. Иначе говоря, женские репродуктивные компоненты растения доступны для приема пыльцы от мужского растения до того, как мужские репродуктивные компоненты самого этого растения достигнут готовности к производству пыльцы. У кукурузы женские растения восприимчивы к пыльце до появления пестичных столбиков и в течение многих дней после проявления початка из обвертки. Кроме того, для кукурузы есть две возможности: пыльца может испускаться до появления пестичных столбиков (протандрия), или же пестичные столбики могут появиться раньше, чем будет испускаться пыльца (протогиния). И в том и в другом случае, когда пестичные столбики восприимчивы к пыльце, они будут восприимчивы к пыльце до того, как пыльца испускается на данный день. Предлагаемое изобретение применимо в обоих случаях. Кроме того, в некоторых случаях пестичные столбики восприимчивы к пыльце круглосуточно в течение приблизительно семи дней. Таким образом, пыльца может целенаправленно наноситься сколько угодно раз, например (но не только), один раз в день, дважды в день, или же в непрерывном режиме. Без мужской стерилизации пыльца самого назначенного женского родительского растения обычно начинает испускаться в середине утра, и это испускание продолжается до конца утра или до ранних полуденных часов, после чего эта пыльца либо находит жизнеспособные женские репродуктивные компоненты и происходит успешное самоопыление с оплодотворением, либо, не найдя женских репродуктивных компонентов, в течение 60 минут или ранее умирает (Luna V. et al. (2001) Crop Sci. 41(5): 1551-1557). Таким образом, женское растение кукурузы каждый день имеет временное окно, на протяжении которого не происходит испускания своей пыльцы и к нему может быть доставлена пыльца мужского растения. Это окно «открывается» в течение нескольких дней. Согласно предлагаемому изобретению, на протяжении окна, когда отсутствует испускание у женских растений своей пыльцы, или эта пыльца не жизнеспособна, происходит перекрестное опыление почти всех женских растений, поэтому отпадает необходимость выполнять мужскую стерилизацию для предотвращения самоопыления.

[0030] Таким образом, один аспект предлагаемого изобретения - это выбор времени доставки пыльцы к женским растениям. У всех зерновых культур на продолжении временного окна опыления (промежуток времени, в течение которого женское растение восприимчиво к пыльце, и в течение которого опыление может быть успешным), есть дневной цикл, в котором женские растения созревают и растут относительно непрерывно, в то время как мужские растения имеют отчетливый цикл, в котором пыльца становится жизнеспособной и испускается, или же происходит раскрытие пыльников, и это начинается в середине утреннего периода и заканчивается в конце утреннего периода или в начале полуденного периода. В некоторых случаях своя пыльца женского растения может стать жизнеспособной до того, как это женское растение станет способным к оплодотворению, но это всегда будет в первое утро, после чего жизнеспособные женские репродуктивные компоненты становятся способными к оплодотворению до того, как своя пыльца женского растения начнет испускаться в этот день. Поэтому пыльца женского растения, которая была испущена днем раньше, уже не жива и стала нежизнеспособной раньше, чем женские репродуктивные компоненты растения становятся на следующее утро способными к оплодотворению. Поэтому период от раннего утра до его середины является идеальным для перекрестного опыления всех жизнеспособных женских репродуктивных компонентов растения мужской пыльцой как раз до того, как своя пыльца женского растения начнет испускаться, или несколько раз в день, или в непрерывном режиме, чтобы повысить вероятность успешного получения генетически чистых гибридных семян. Например, доставка мужской пыльцы к женским репродуктивным компонентам может осуществляться в шесть часов утра (6.00). Но это опыление может осуществляться в любое время дня, что представляет большое преимущество по сравнению с известными способами. Таким образом, когда начнет испускаться пыльца женского растения, все женские репродуктивные компоненты растения будут уже опылены пыльцой из назначенного источника, и пыльца женского растения через короткое время умрет, благодаря чему удастся избежать самоопыления женских растений, для которых при применении традиционных способов получения гибридных семян требовались те или иные формы мужской стерилизации. Разные виды имеют разный период сохранения жизнеспособности пыльцы, на который могут повлиять условия окружающей среды (Dafni, А. & D. Firmage (2000) Plant Systemics and Evolution 222(1): 113-132). Повышенная влажность и пониженные температуры могут продлевать период сохранения жизнеспособности пыльцы. Например, было установлено, что у риса (Oryza sativa) период сохранения жизнеспособности пыльцы составляет всего четыре минуты (Кода et al. (1971) Cytologia 36: 104-110), или на протяжении до 20 минут умирает 50% пыльцы (Khatum, S. and T.J. Flowers (1995) J. Exp. Bot. 46: 151-154). В противоположность этому было установлено, что пыльца выращиваемого в поле редиса (Raphanus sativas) сохраняет жизнеспособность на протяжении пяти дней (Siddiqui, В.А. (1983) Acta Bot. Ind. 11: 150-154).

[0031] Поэтому предлагаемое изобретение обеспечивает преимущество, которое состоит в том, что как только установлена восприимчивость женских репродуктивных компонентов женского растения к пыльце, то это значит, что эти компоненты в общем готовы к опылению прежде, чем своя пыльца будет испускаться в этот день, даже в тех случаях, когда эта пыльца была в первый раз испущена до того, как женское растение стало восприимчивым к пыльце. У большинства, если не у всех растений это происходит с суточным ритмом, как это имеет место у кукурузы, у которой женские репродуктивные компоненты восприимчивы к пыльце, а мужские репродуктивные компоненты не готовы до тех пор, пока хотя бы не высохнет роса, что в некоторых примерах случается около десяти часов (10.00) утра или, когда облачно или день дождливый, около часу дня (13.00). Кроме того, в плохую или дождливую погоду мужские репродуктивные компоненты могут существенно запоздать с испусканием пыльцы, а то и совсем ее не испустить. У многих зерновых культур, таких как соя, женские репродуктивные компоненты могут быть готовы принять пыльцу за день до готовности мужских репродуктивных компонентов ее испустить. Часто готовность женских репродуктивных компонентов к опылению в целом опережает готовность мужских репродуктивных компонентов на дни. Таким образом, опыление, выполненное утром, это часто опыление желаемой пыльцой. Кроме того, возможность проводить опыление в то самое время, когда женские репродуктивные компоненты с опережением своих мужских репродуктивных компонентов становятся восприимчивы, независимо от времени дня, представляет огромное преимущество по сравнению с существующей практикой.

[0032] При доставке пыльцы к женским репродуктивным компонентам в надлежащее время и для надлежащей продолжительности временного окна репродуктивной способности растения адекватная генетическая чистота может быть достигнута без придания назначенным женским родительским растениям мужской стерильности в какой-либо форме. Впервые для любой зерновой культуры обеспечивается возможность коммерческого производства гибридных семян без применения мужской стерилизации. Это представляет аспект новизны предлагаемого изобретения. Кроме того, в отношении некоторых зерновых культур, таких как соя, которые не имеют экономически оправданных форм мужской стерилизации, предлагаемое изобретение обеспечивает возможность производства гибридных семян у видов, для которых это невозможно (например, соя) или представляет трудности (например, пшеница). Таким же образом предлагаемое изобретение впервые обеспечивает возможность эффективного производства гибридных семян, не прибегая к изоляции, пространственной или , от источников нежелательной биологически совместимой пыльцы (далее для краткости может называться просто «нежелательной пыльцой»). Таким образом, когда начинает испускаться нежелательная пыльца, все жизнеспособные женские репродуктивные компоненты назначенных женских родительских растений оказываются уже опыленными от надлежащего источника пыльцы, а нежелательная пыльца, не найдя подходящих жизнеспособных женских репродуктивных компонентов, умирает через короткое время (от одного до четырех часов), зависящее от вида растения и условий окружающей среды (Luna V. et al. (2001) Crop Sci. 41(5): 1551-1557; Stanley, R.G. & Linskens, H.F. (1974) Pollen: Biology, Biochemistry, Management. Springer-Verlag, Heidelberg.; Shivanna, K.R. (2003) Pollen Biology and Biotechnology. Science Publishers, Inc.), в результате чего удается избежать загрязняющего перекрестного опыления женских растений, которые при осуществлении известных технологий производства гибридных семян приходилось подвергать той или иной форме изоляции.

[0033] Возможность по запросу доставить жизнеспособную пыльцу для эффективного своевременного опыления восприимчивых пестиков снимает ряд ограничений, характерных для производства гибридных семян и зерна в масштабе отрасли. В частности, правильное осуществление предлагаемого изобретения снимает проблему низких уровней производства пыльцы, устраняет плохую репродуктивную синхронию между мужскими и женскими цветками и сокращает расходы на пространственную изоляцию родительских растений при производстве гибридных семян.

[0034] Варианты осуществления предлагаемого изобретения обеспечивают спектр возможностей для решения проблем традиционных технологий изоляции родительских растений. Как говорилось выше, традиционные технологии изоляции родительских растений могут предполагать пространственную изоляцию. Спектр возможностей для решения проблем пространственной изоляции может включать полное исключение пространственной изоляции женских родительских растений от нежелательной пыльцы, или же сокращение дистанций изоляции, требуемых для уменьшения генетического загрязнения нежелательной пыльцой. Стандартное расстояние, используемое в США при производстве гибридных семян для изоляции поля, на котором выращиваются линии мужских и женских родительских растений, до другого кукурузного поля составляет 201 м (660 футов) или больше (Iowa Seed Certification Requirements Handbook, Iowa Crop Improvement Association, 2009). Это расстояние может быть разным от штата к штату, но обычно этого расстояния достаточно, чтобы предотвратить занесение нежелательной пыльцы ветром или насекомыми. При использовании раскрываемой здесь технологии, обеспечиваемой предлагаемым изобретением, в комбинации с сокращением или полным устранением дистанции изоляции родительских растений для производства гибридных семян может быть обеспечена последовательность повышающихся уровней генетической чистоты гибридных семян. Например, комбинируя способы опыления согласно предлагаемому изобретению с сокращением дистанций изоляции, можно получать в результате повышенный уровень генетической чистоты получаемых гибридных семян. Дистанция изоляции с 210 м может быть сокращена до 180 м, 170 м, 160 м, 150 м, 140 м, 130 м, 120 м, 110 м, 100 м, 90 м, 80 м, 70 м, 60 м, 50 м, 40 м, 30 м, 20 м, 10 м, 5 м или 1 м, или же дистанция изоляции может быть полностью устранена, так что родительские растения для получения гибридных семян выращиваются в непосредственной близости к другим растениям кукурузы, не назначенным быть родительскими растениями для перекрестного опыления. По мере сокращения дистанции изоляции возрастает вероятность понижения уровня генетической чистоты, но благодаря эффективности раскрываемой здесь технологии опыления достигаемые уровни генетической чистоты получаемых гибридных семян все же могут удовлетворять стандартам генетической чистоты производимых и поставляемых на рынок гибридных семян. Традиционное требование к пространственной изоляции от заносной пыльцы удорожает производство гибридных семян. Непосредственное нанесение пыльцы на восприимчивые к ней пестики, как это предусмотрено предлагаемым изобретением, в дозах, достаточных для обеспечения высокого уровня оплодотворения прежде, чем будет испущена собственная пыльца назначенного женского родительского растения, устраняет необходимость в изоляции поля для производства гибридных семян.

[0035] В дополнение к пространственной изоляции существует изоляция, которая может быть использована для изоляции назначенных женских родительских растений от генетического загрязнения нежелательной пыльцой. изоляция имеет место, когда вегетация назначенных женских родительских растений и мужских растений - источников нежелательной пыльцы не синхронизирована, то есть, происходит в разное время, так что готовность пестиков назначенных женских родительских растений к оплодотворению и испускание нежелательной пыльцы имеют место в разное время. Согласно одному варианту осуществления предлагаемого изобретения, не ограничивающему его объем, женские и мужские растения могут высаживаться с разрывом в один месяц. Такая технология чаще всего используется в местностях с тропическим и субтропическим климатом. Варианты осуществления предлагаемого изобретения предполагают также ряд возможностей для решения проблем изоляции. Это ряд возможностей для решения проблем изоляции может включать полное устранение изоляции от нежелательной пыльцы, а также сокращение периода времени или количества, требуемых для сокращения генетического загрязнения нежелательной пыльцой. Благодаря эффективности раскрываемой здесь технологии опыления достигаемые уровни генетической чистоты получаемых гибридных семян все же могут удовлетворять требуемым стандартам генетической чистоты производимых и поставляемых на рынок гибридных семян.

[0036] Хорошо согласованная синхронизация цветения мужских и женских цветков и минимальная плотность пыльцы на раскрытый пестик являются фундаментальными требованиями для достижения высоких уровней производства семян и генетической чистоты. Ранее собранная и консервированная пыльца или свежая пыльца может наноситься на восприимчивые пестики в течение периода от семи до десяти дней, благодаря чему гарантировано получение семян в условиях сниженной жизнеспособности пыльцы, запаздывания фазы выметывания пестичных столбиков относительно испускания пыльцы или высокого риска близкородственного скрещивания мужских и женских растений. Высокий риск близкородственного скрещивания имеет место при идеально синхронном развитии мужских и женских цветков (то есть, когда пик испускания пыльцы мужскими цветками совпадает с пиком выметывания пестичных столбиков у женских цветков), так что пыльцевые зерна произведут успешное опыление, результатом которого станет оплодотворение. Для производителей семян такое совпадение пиков имеет место, когда 50% мужской популяции начинают испускать пыльцу в тот же день, когда у 50% женской популяции начинается выметывание пестичных столбиков.

[0037] Подобная последовательность повышающихся уровней генетической чистоты применима, если технология опыления согласно предлагаемому изобретению использована в тандеме с сокращением количества удаленных метелок в поле. Стандарт удаления метелок требует, чтобы у назначенных женских родительских растений в поле оставалось не более, чем 1% способных испускать пыльцу метелок (Iowa Seed Certification Requirements Handbook, Iowa Crop Improvement Association, 2009). Чтобы проделать это удаление метелок, может понадобиться бригада работников, которая должна проходить по полю в течение четырех-пяти дней подряд с разным уровнем интенсивности (имеется в виду скорость передвижения удаляющих метелки работников по полю во время каждого прохождения). При использовании раскрываемых здесь технологий согласно предлагаемому изобретению количество прохождений поля с целью удаления метелок и (или) их интенсивность могут быть уменьшены, при этом способных испускать пыльцу метелок назначенных женских родительских растений может остаться более 1%, но требование генетической чистоты будет соблюдено. Допустимая доля оставленных у назначенных женских родительских растений метелок, способных испускать пыльцу, может составлять 1%, 2%, 3%, 4%, 5% to 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. В последнем случае (100%) удаления метелок не потребовалось бы.

[0038] Подобная последовательность повышающихся уровней генетической чистоты применима, если технология опыления согласно предлагаемому изобретению использована в тандеме с сокращением количества мужских растений, которые необходимо выращивать для обеспечения успешного опыления поля с женскими растениями для достижения необходимого уровня генетической чистоты. На типичном поле для производства гибридных семян кукурузы доля назначенных мужских родительских растений составляет от 20% до 40% от всех растений на поле (Basra, A.S. (1999) Heterosis and Hybrid Seed Production in Agronomic Crops, p. 48). Необходимая доля назначенных мужских родительских растений зависит от ряда факторов, включая ожидаемые жизнеспособность и сохранность пыльцы, которую проявят назначенные мужские родительские растения, а также факторы, зависящие от конкретного участка земли и климата. Осуществление предлагаемого изобретения обеспечит значительное сокращение необходимой доли назначенных мужских родительских растений в поле или даже сведет ее к нулю. Например, вместо требуемых 40% назначенных мужских родительских растений в производственной среде можно использовать их в меньшем относительном количестве, в частности, это может быть 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или даже 0% назначенных мужских растений в поле. Нормативное нанесение пыльцы согласно предлагаемому изобретению позволяет полностью отказаться от использования мужских родительских растений-опылителей в поле для производства семян.

[0039] Кроме того, подобная последовательность повышающихся уровней генетической чистоты применима также к зерновым культурам, среди которых одна или большее количество могут осуществлять самоопыление до цветения этого растения и способны принять пыльцу из других источников. В качестве одного из не ограничивающих объем предлагаемого изобретения примеров такой зерновой культуры может быть названа пшеница. Предлагаемое изобретение может быть с обеспечением преимущества применено к таким зерновым культурам. Кроме того, женские растения могут быть выращиваемы с обеспечением раннего цветения, или же они могут подвергаться механическому или физическому вмешательству с целью заставить цветки раскрыться. В некоторых обстоятельствах пыльца может быть введена в цветок принудительно. Даже в тех случаях, когда самоопыление в таких обстоятельствах неизбежно, у растений, у которых цветки открываются до самоопыления, надлежащее гибридное опыление возможно. В таком случае степень генетической чистоты является более высокой.

[0040] Пыльцевые зерна имеют малые размеры и могут требовать очень осторожного обращения. Их способность успешно опылять женские репродуктивные компоненты может быть подорвана рядом экологических стрессов, и им могут быть также присущи свойства, переданные растениями, производящими пыльцу. Характеристика пыльцы (то есть, скорость роста, сила роста трубки) может далее называться силой пыльцы, а способность пыльцы успешно порождать жизнеспособные семена может быть названа жизнеспособностью пыльцы (Shivanna, KR et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81(1):38-42). Сила и жизнеспособность пыльцы могут в значительной степени варьировать от вида к виду, от культивара к культивару, от варитета к варитету. В некоторых случаях представляется желательным осуществлять предлагаемое изобретение с использованием пыльцы, которая обычно имеет слабую силу и (или) жизнеспособность. В таких обстоятельствах, хотя ожидается, что осуществление предлагаемого изобретения повысит полезный выход и генетическую чистоту, относительное улучшение каждой из этих характеристик может быть невелико по сравнению с тем случаем, когда использована пыльца с высокой силой или жизнеспособностью. Таким образом, имеет место последовательность повышения уровней как генетической чистоты, так и полезного выхода, которые могут быть достигнуты при осуществлении предлагаемого изобретения, что может зависеть от широкого диапазона факторов, в том числе от силы и жизнеспособности пыльцы. В случае, когда повышение генетической чистоты невелико, для повышения этого уровня могут быть предприняты дополнительные шаги, которые будут описаны позже.

[0041] Как должно быть понятно специалистам соответствующего профиля, выбор мужской пыльцы, предназначенной для использования при осуществлении предлагаемого изобретения, имеет большое значение с точки зрения потенциальной выгоды от применения предлагаемого изобретения. Сила и жизнеспособность пыльцы - это факторы, которые необходимо учитывать, наряду с различными генетическими признаками и характеристиками, которыми наделена пыльца. Возможны обстоятельства, когда использование пыльцы с более низкой силой или жизнеспособностью все же является правильным выбором благодаря генетическим признакам, которые будут переданы производимым семенам. В таких обстоятельствах, когда известно, что пыльца имеет более низкую силу или жизнеспособность, следует ожидать более скромного результирующего снижения генетического загрязнения вместе с более низким ростом полезного выхода. Такие решения могут быть сделаны сельхозпроизводителем на основе конкретных характеристик зерновой культуры, желаемых семян и превалирующих условий в ожидаемое время опыления в виду воздействий окружающей среды и других биологических и небиологических воздействий. Таким образом, возможность выбирать пыльцу во время опыления представляет собой дополнительный значительный фактор выгоды от использования предлагаемого изобретения. В Таблице 1, приводимой ниже, отражены потенциальные выгоды от использования предлагаемого изобретения.

[0042] Следующий не ограничивающий объем предлагаемого изобретения пример представляет потенциальный сценарий, в котором может быть реализовано предлагаемое изобретение, и в общих чертах обрисовывает преимущества последнего. Предлагаемое изобретение может быть осуществлено в случае получения гибридных семян от слабо испускающих пыльцу мужских родительских растений, которые при традиционных методиках требуют своего присутствия на поле для производства гибридных семян в относительном количестве 35% или более, и это с обеспечением генетической чистоты на границе приемлемости (степень генетического загрязнения приблизительно 5%). Применение предлагаемого изобретения позволило бы снизить долю мужских родительских растений на поле наполовину - до 17% с одновременным понижением генетического загрязнения до приемлемого уровня (от 2% до 3%), а также с сокращением расходов на получение товарной продукции. В альтернативном варианте, если у мужского родительского растения испускание пыльцы превышает средний уровень, и его пыльца была собрана и законсервирована в предыдущих циклах размножения родительских растений, то предлагаемое изобретение позволило бы не использовать мужские родительские растения и сократить интенсивность удаления метелок (и связанные с этим расходы) на 50%, результатом чего стало бы сокращение расходов на производство товарной продукции при поддержании обычного для предшествующего уровня техники уровня генетического загрязнения (от 2% до 3%), который, однако, намного ниже того, который был бы при тех же условиях (50%-ная интенсивность удаления метелок и полное отсутствие мужских родительских растений) без применения предлагаемого изобретения.

[0043] Пыльца назначенного мужского родительского растения может быть доставлена к женским репродуктивным компонентам назначенного женского родительского растения различными способами, в том числе (но не только) полностью вручную, вручную с использованием малогабаритного ручного устройства для полуавтоматического рассеивания пыльцы, с помощью полевых приводимых в движение технических средств, оснащенных механизмами для рассеивания пыльцы или с применением полностью автоматического рассеивания пыльцы с помощью самоходных и (или) руководимых человеком аппаратов, таких как беспилотные летательные аппараты (дроны), оснащенные установленным на них устройством для рассеивания пыльцы, при этом рассеивание пыльцы осуществляется автоматическими средствами, в том числе (но не только) механическими средствами, повышенным давлением, пониженным давлением, или же пневматическими средствами. Использование дронов было бы особым новшеством и представляется практичным с точки зрения осуществления способа согласно предлагаемому изобретению. Небольшие дроны, использование которых не требует регулирования, при осуществлении предлагаемого способа можно было бы направлять для распыления пыльцы прямо над назначенными женскими родительскими растениями с помощью системы GPS. Авторами предлагаемого изобретения было подсчитано, что при любом из таких способов доставки пыльцы для успешного перекрестного опыления одного гектара (2,47 акра), засаженного женскими родительскими растениями кукурузы, с обеспечением адекватной генетической чистоты, удовлетворяющей действующим на данный момент законам США в отношении семян, которые требуют, чтобы для сертифицируемых и поступающих на рынок семян уровень генетического загрязнения (от самоопыления и постороннего опыления) не превышал 5%, достаточно приблизительно 140 г (5 унций) пыльцы назначенных мужских родительских растений, доставляемой и рассеиваемой в течение трех-четырех дней подряд. Эта оценка основывается на литературе, указывающей, сколько пыльцевых зерен кукурузы приходится на 1 мг, и оценивающей что для успешного опыления на один пестик должно быть от трех до пяти пыльцевых зерен (от трех до четырех пыльцевых зерен на пестик - это общепринятое в среде специалистов количество, необходимое для обеспечения успешного опыления (М.Е. Westgate, J. Lizaso, W., Batchelor (2003) Quantitative relationships between pollen shed density and grain yield in maize, Crop Science 43: 934-942; M. Uribelarrea, J. Carcova, M.E. Otegui, M. Westgate (2002) Pollen production, pollination dynamics, and kernel set in maize, Crop Science 42: 1910-1918).). См, например, Porter (1981) Environ. Health Perspectives 37: 53-59; Miller (1982) In Maize for Biological Research. W.F. Sheridan (ed.), pp. 279-293). Время доставки пыльцы, требуемое количество пыльцы и количество дней, в течение которых следует доставлять пыльцу, могут регулироваться необходимым образом в зависимости от обстоятельств, которые могут быть разными. В частности, могут разниться количество пыльцы, производимой различными женскими родительскими растениями, погодные условия (то есть, частотность дождей и их обилие, скорость и направление ветра и т.д.). Предлагаемый способ может быть приспособлен, например, для любого данного набора родительских растений в зависимости от способности производить пыльцу, присущей мужским и женским родительским растениям. Кроме того, ожидается, что количество пыльцы, требующейся для опыления с целью получения гибридных семян, может быть сокращено за счет эффективности упоминавшихся выше способов доставки пыльцы. По оценке авторов предлагаемого изобретения при применении этих более эффективных способов использование пыльцы может быть сведено к тысячной (1/1000) или еще меньшей доле от того количества пыльцы, которое производится сейчас в отрасли производства гибридных семян. Проведенные авторами предлагаемого изобретения исследования указывают, что для обеспечения полного набора зерен кукурузы на один пестик требуется приблизительно 3000 пыльцевых зерен, испускаемых на поле кукурузными метелками. Исследования по опылению вручную и тесты «открытое поле» показали, что для обеспечения полного набора зерен кукурузы достаточно от трех до четырех пыльцевых зерен на один пестик. (М.Е. Westgate, J. Lizaso, W., Batchelor (2003) Quantitative relationships between pollen shed density and grain yield in maize, Crop Science 43: 934-942; M. Uribelarrea, J. Carcova, M.E. Otegui, M. Westgate (2002) Pollen production, pollination dynamics, and kernel set in maize, Crop Science 42: 1910-1918). Результатом этого является вывод о достаточности тысячной (1/1000) доли от того количества пыльцы, которое производится сейчас в отрасли производства гибридных семян.

[0044] Поэтому осуществление предлагаемого изобретения одновременно устраняет необходимость присутствия мужских родительских растений вблизи женских родительских растений, а также необходимость какой-либо формы стерилизации мужских репродуктивных компонентов последних. Кроме того, специалист в данной области при необходимости может без опаски отклоняться от тех примеров, которые были рассмотрены выше. Например, в некоторых случаях может быть целесообразно осуществлять опыление в ночное время. В других случаях может оказаться выгодно осуществлять опыление на протяжении всего дня. Ожидается, что эффективным будет опыление в любое время до того, как начнут испускать пыльцу мужские репродуктивные компоненты женских родительских растений.

[0045] Предлагаемое изобретение применимо к любой сельскохозяйственной культуре с целью повышения эффективности или обеспечения возможности производства гибридных семян. Предлагаемое изобретение применимо в любых природных условиях, в частности (но не только), в природных условиях, идеальных или требуемых для выращивания, в условиях межсезонного периода, в условиях контролируемой среды (например, в теневом домике, в теплице, в вегетационном домике, в арочной теплице, в ростовой камере, в установке для вертикального выращивания культур, в гидропонной установке, в аэропонной установке и т.д.). Нанесение пыльцы назначенных мужских родительских растений на женские репродуктивные компоненты назначенных женских родительских растений может быть выполнено, как только последние станут восприимчивы к опылению и независимо от жизнеспособности собственной пыльцы женских родительских растений или другой нежелательной пыльцы, пока все на данный момент восприимчивые к пыльце женские репродуктивные компоненты назначенных женских родительских растений не будут подвергнуты перекрестному опылению в течение периода, когда не происходит активного испускания собственной пыльцы женских родительских растений или другой пыльцы из нежелательных источников. Предлагаемое изобретение может быть использовано также для повышения эффективности приемов, применяемых в настоящее время при производстве семян, даже когда присутствуют все обычные операции, с повышением при этом степени генетической чистоты гибридных семян в ситуациях, являющихся проблемными, даже при применении мужской стерилизации и (или) изоляции, и (или) при использовании мужских родительских растений. Предлагаемое изобретение могло бы найти применение на полях по размножению родительских растений, где выращиваются инбредные семена со специфическим генотипом, которым позволено самоопыление. Посадка семян, получаемых в результате этого самоопыления, приводит к получению значительно большего количества инбредных семян, которые будут использованы для выращивания родительских растений, из которых позже будут произведены гибридные семена. Использование предлагаемого изобретения в полях для выращивания стерильных женских родительских растений позволяет избежать необходимости изоляции или необходимости присутствия линий закрепителей мужской стерильности (подобны линиям цитоплазматической мужской стерильности, но имеют жизнеспособную пыльцу и способность производить нормальные семена). Подобным же образом предлагаемое изобретение может применяться на нормальных полях для производства родительских растений с целью повышения генетической чистоты семян. Кроме того, предлагаемое изобретение может найти применение в научных исследованиях, направленных на то, чтобы избавиться от необходимости ежедневного заключения метелочных побегов в мешочки во избежание перекрестного опыления или чтобы не удалять метелки в блоках для скрещивания (для получения экспериментальных гибридных семян в малых количествах).

[0046] В случаях, когда требуются очень высокие уровни генетической чистоты, или в случаях, когда ожидаемый уровень генетической чистоты ниже желаемого, могут быть предприняты дальнейшие меры по повышению генетической чистоты партий гибридных семян до желаемого уровня из генетически загрязненных самоопылением и перекрестным опылением семян, которые находятся в смеси семян, собранных из любого технологического блока производства гибридов, включая известные системы производства гибридов любой сельскохозяйственной культуры. Подобным же образом, учитывая, что описываемое здесь предлагаемое изобретение может быть осуществлено с разным профессиональным уровнем, для повышения генетической чистоты партий гибридных семян до желаемого уровня могут быть предприняты дополнительные меры. Например, с помощью генетического маркера в мужской родительской линии, который передается пыльце мужского родительского растения, и детерминирует у полученных семян отчетливо выраженный фенотипический признак, была бы обеспечена возможность дальнейшего повышения генетической чистоты партии семян путем сортировки. Примеры такого способа раскрыты в международной патентной публикации WO 2014/147005. Кроме того, такие технологии обычно используются в отрасли производства белосемянной кукурузы, при котором белые и желтые кукурузные зерна легко рассортировываются с помощью автоматических сортирующих устройств. Упомянутый генетический маркер может детерминировать фенотип, обеспечивающий различимость по цвету семян, по интенсивности окраски семян или по узору, по форме семян, по размеру семян, по плотности семян или по другим признакам семян. Предприятие по производству семян может использовать свои собственные маркеры, отличающие их продукцию от семян, произведенных другими предприятиями, это могут быть как отличительные унаследованные признаки семян, так и цветовые маркеры, полученные генетической модификацией, которые потенциально могли бы быть невидимы невооруженным глазом. Затем семена могут быть визуально или механически рассортированы на основе этого маркерного фенотипического признака. (См., например, Raboy et al. (2000) Plant Physiol. 124: 355-368; Evans, M.M.S. & Kermicle, J.L (2001) Genetics 159: 303-315; Jenkins, M.T. (1925) J. Heredity 16: 307-310; and Chase, S. (1949) Genetics 34: 328-332). Для некоторых сельскохозяйственных культур в развивающихся странах, где рабочая сила очень дешева, это может проделываться вручную, в то время как в других обстоятельствах более экономичным является применение автоматических или полуавтоматических сортирующих устройств, таких как, например, «Сатакэ сид сортер» (Satake Seed Sorter), или систем оптического сканирования, приспособленных для сканирования и сортировки семян.

[0047] Например, у кукурузы унаследованный признак «пурпурная зародышевая почка» (РР; см. Chase (1949) Genetics 34: 328-332) может быть использован в качестве мужского фенотипического маркера, который вводится во все мужские инбредные растения и передается семенам через пыльцу мужских родительских растений, благодаря чему обеспечена возможность применения для сортировки семян автоматических сортирующих устройств. Предлагаемое изобретение может работать как описано выше, но с мужскими родительскими растениями, содержащими генетический маркер, который может быть использован для измерения итогового уровня генетической чистоты. После сбора урожая путем быстрой проверки сокращенной выборки семян можно было бы определить, является ли генетическая чистота семян с признаком «пурпурная зародышевая почка» достаточно высокой, чтобы можно было не выполнять сортировку для повышения генетической чистоты семян. Если же этот уровень не достаточен, то семена можно было бы пропустить через автоматическое сортирующее устройство, например, чтобы отделить семена с признаком «пурпурная зародышевая почка», которые являются гибридными, от семян, несущих ген бесцветной зародышевой почки, которые генетически загрязнены самоопылением или перекрестным опылением от постороннего источника. Это может делаться наряду с нормальными процессами кондиционирования, осуществляемыми на заводе по производству семян. Что касается отбракованных семян, несущих ген бесцветной зародышевой почки, то их можно продать как пищевой продукт или утилизировать.

[0048] В качестве некоторых (но не всех возможных) маркеров для кукурузы могут быть использованы белый / желтый эндосперм, желтый / оранжевый эндосперм, нормальная / пурпурная зародышевая почка, бесцветный / пурпурный алейрон, крахмал-эндоспермные мутанты, а также любые комбинации этих маркеров и другие маркеры кукурузы. Что касается сои, то в качестве некоторых (но не всех возможных) маркеров для нее могут быть использованы зеленые и желтые семядоли. В качестве некоторых (но не всех возможных) неспецифичных для сельскохозяйственных культур маркеров могут быть использованы цветовые маркерные гены (такие как DsRed2) или какие-либо трансгены, изменяющие обычный фенотип семян, например, трансгены, повышающие уровень антоцианина или других пигментов у семян, или трансгены, изменяющие цвет семядолей. С другими примерами такого рода маркеров можно ознакомиться в международной патентной публикации WO 2014/147005.

[0049] Дополнительная операция сортировки с использованием маркера представляется уместной и экономически выгодной, когда достигается уровень генетической чистоты гибридных семян значительно более высокий, чем тот, который мог бы быть получен известными способами без применения мужской стерилизации и (или) при изоляции слабее стандартной, но не обеспечивая уровня генетической чистоты, достаточного для поставки на рынок. В частности, согласно оценке, основанной на данных, которыми располагают авторы предлагаемого изобретения, генетическое загрязнение (по большей части по причине самоопыления назначенных женских родительских растений) гибридных семян для производства кукурузы без обычной мужской стерилизации или изоляции превышало бы 70%, в то время как уровни генетического загрязнения для партии семян, выращенных с использованием технологии согласно предлагаемому изобретению и тоже без применения мужской стерилизации или изоляции, был бы в два или более раз меньше, то есть, составил бы 35% или меньше. Уровень генетического загрязнения 35% не настолько низок, насколько это может требоваться в отношении некоторых сельскохозяйственных культур, например, таких как кукуруза, однако для сельскохозяйственных культур, которые на данный момент не являются гибридными, например, таких как соя это вполне приемлемый уровень, чтобы начать производство этой сельскохозяйственной культуры как гибридной. Например, одним из более ранних способов, применявшихся к сое, была достигнута генетическая чистота 70% при ручном скрещивании для разработки воспроизводящихся гибридов. Для кукурузы тоже есть подтвержденные полевыми испытаниями свидетельства понижения уровня генетического загрязнения занесенной пыльцой при более высокой урожайности (Astini, J.P. et al. (2009) Agronomy J. 101: 373-380). Обычно негибридные семена, отсеянные в процессе операции сортировки, продают как пищевой или фуражный продукт. При использовании предлагаемого изобретения появляется возможность отсортировывать негибридные семена по двум категориям: одна в пищу или на корм (семена, полученные от случайного скрещивания и по другим причинам, не связанным с самоопылением), а другая (семена, полученные самоопылением) - на продажу в качестве самоопыленного вариетета, то есть, имеющего дополнительную ценность побочного продукта сортировки.

[0050] Как должно быть понятно специалистам соответствующего профиля, дополнительным преимуществом, обеспечиваемым предлагаемым изобретением, является повышенная урожайность семян. Целенаправленное нанесение пыльцы на готовые к оплодотворению назначенные женские родительские растения имеет результатом повышение числа событий опыления по сравнению с опылением, протекающим естественным образом. В зависимости от пыльцы мужского родительского растения, отобранной для использования при осуществлении предлагаемого изобретения, интенсивность опыления может быть значительно повышена, результатом чего урожайность тоже будет существенно выше, чем та, которая достигается иным образом. Авторы предлагаемого изобретения ожидают, что в результате применения предлагаемого изобретения средний прирост урожайности составит по меньшей мере 15%. В зависимости от состояния женских родительских растений, выбора используемой пыльцы, условий окружающей среды и других факторов ожидаемый прирост урожайности значительно превышает 10%, в некоторых обстоятельствах ожидается прирост урожайности более, чем на 100% по сравнению с урожайностью, ожидаемой без применения предлагаемого изобретения.

[0051] Далее предлагаемое изобретение будет более подробно проиллюстрировано на примерах его осуществления применительно к кукурузе. Основы предлагаемого способа применимы к любой сельскохозяйственной культуре при конкретных модификациях сельскохозяйственной культуры сообразно обстоятельствам. Примеры 1-4 были осуществлены в полях центральной Айовы (штат США) в течение лета 2015 года.

[0052] Пример 1

[0053] Предлагаемое изобретение осуществляли на практике в отношении гибрида кукурузы сахарной, который был гомозиготным по рецессивному гену, детерминирующему фенотип сморщенного зерна на стадии зрелости (ген морщинистости или сахаристости) (Jennings, Р.Н. and C.L. McCombs, (1969) Phytochemistry 8(8): 1357-1363) и гомозиготным по рецессивным генам желтизны, результатом чего является белый эндосперм (Buckner, В. et al. (1990) The Plant Cell, Vol 2, 867-876). Растения этого гибрида кукурузы сахарной использовались в качестве назначенных женских родительских растений, они были высажены в два ряда длиной 36,5 м (120 футов) без изоляции от нормальных растений товарной зерновой кукурузы (имеет зерна с желтым эндоспермом) и не подвергались мужской стерилизации (то есть, метелки у них не удаляли). Назначенные мужские родительские растения имели белый эндосперм и не морщинистые зерна, они были высажены в десять рядов длиной 4,5 м (15 футов), которые находились в среднем на расстоянии 6 м (20 футов) от рядов с женскими растениями кукурузы сахарной. Предлагаемое изобретение осуществляли на практике путем принудительного опыления женских родительских растений пыльцой из метелок упомянутых мужских родительских растений с белым эндоспермом на самой ранней стадии периода естественного испускания пыльцы приблизительно в 8.30 утра. Пыльцу собирали, заключая метелки в мешочки, в которых и собиралась пыльца. Затем эту пыльцу мужских родительских растений без промедления наносили на пестики кукурузы сахарной вручную, используя хорошо известную в отрасли технологию, заключающуюся в осторожном постукивании по мешочку с пыльцой, чтобы выпустить пыльцевые зерна на пестики. При использовании этого способа полученные сморщенные зерна кукурузы появились в результате самоопыления (это семена-загрязнители), желтые зерна появились в результате опыления из посторонних источников (это тоже семена-загрязнители), а белые зерна являются целевым продуктом - гибридом первого поколения (F1). По этому способу было получено 30821 зерно кукурузы. На несколько женских родительских растений эту пыльцу назначенных мужских родительских растений не наносили, им было позволено опыляться вольным образом. От них было получено 28896 зерен кукурузы, и они использовались в качестве контрольной группы.

[0054] Данные, приведенные в Таблице 2, демонстрируют снижение общего уровня генетического загрязнения (как от самоопыления, так и от перекрестного опыления посторонней пыльцой) на 18%. Это более низкое уменьшение генетического загрязнения, чем ожидалось, но все же имеет место значительное повышение уровней генетической чистоты. После обдумывания, анализа и более тщательного изучения этого примера стало ясно, что было несколько факторов, воспрепятствовавших достижению еще большего понижения уровня генетического загрязнения. Кукуруза сахарная была использована в данном примере для удобства, так как она обеспечивает простой маркер для идентификации загрязнителей, однако у нее слишком большие метелки, в которых пыльцы в пять-десять раз больше, чем у среднего женского родительского растения-гибрида. Эффект этого большого количества пыльцы легко видеть по высокой доле самоопылений у открытых для вольного опыления початков, которые играли роль контрольной группы, - в данном примере эта доля составляла 93%, а в рассматриваемом ниже Примере 2 - 96%. Для обычных женских растений выращиваемой на зерно кукурузы ожидаемая величина этой доли составляет от 50% до 80% при использовании подобных агротехнических приемов. В Примере 4, который будет рассмотрен далее, при использовании женских родительских растений белозерной кукурузы доля семян, полученных в результате самоопыления, составила только 78%. Еще один фактор, повлиявший на результат данного примера, состоит в том, что авторы предлагаемого изобретения не стремились к тому, чтобы, для осуществления предлагаемого изобретения в полной мере, осуществлять опыление гарантированно до того, как назначенные женские родительские растения начнут испускать пыльцу. Авторы предлагаемого изобретения старались просто осуществить изобретение в части целенаправленного опыления в самом начале естественного испускания пыльцы в попытке вытеснить загрязнители. Этот подход просто должен был продемонстрировать потенциал предлагаемого изобретения при только частичном его осуществлении. Наконец, еще один фактор, воспрепятствовавший дальнейшему понижению уровня генетического загрязнения, состоит в том, что пыльца от белой кукурузы была взята от инбридинговых растений и по сравнению с гибридной пыльцой (то есть, пыльцой кукурузы сахарной) оказалась менее конкурентоспособной. В свете этих факторов 18%-ное сокращение количества семян-загрязнителей представляется приемлемым повышением уровня генетической чистоты.

[0055] Пример 2. В другом рабочем примере предлагаемое изобретение было осуществлено с использованием гибрида кукурузы сахарной, который был гомозиготным по рецессивному гену, детерминирующему фенотип сморщенного зерна на стадии зрелости (ген морщинистости или сахаристости) и гомозиготным по рецессивным генам желтизны, результатом чего является белый эндосперм. Растения этого гибрида кукурузы сахарной использовались в качестве назначенных женских родительских растений, они были высажены в два ряда длиной 69 м (225 футов) без изоляции от растений обычной товарной кукурузы (желтый эндосперм) и не подвергались мужской стерилизации (то есть, у них не удаляли метелки). Окружающие растения обычной товарной кукурузы были использованы в качестве назначенных мужских родительских растений и имели обычные характеристики эндосперма (без сморщенности), они располагались рядами в непосредственном соседстве с упомянутыми женскими растениями. Кроме того, для задержки испускания пыльцы женскими растениями на их метелки в период времени от приблизительно 8.15 до приблизительно 8.45 утра брызгали воду. После разбрызгивания воды на метелки женских растений сразу выполнялся способ согласно предлагаемому изобретению, а именно, на метелки назначенных мужских родительских растений с желтым эндоспермом надевали мешочки, собирая в эти мешочки их пыльцу. Затем эту пыльцу назначенных мужских родительских растений без промедления наносили на пестики растений сладкой кукурузы вручную, используя хорошо известную в отрасли технологию, заключающуюся в осторожном постукивании по мешочку с пыльцой, чтобы выпустить пыльцевые зерна на пестики. Эту операцию выполняли до того, как эти женские растения начинали испускать пыльцу. При выполнении этого способа полученные сморщенные зерна кукурузы появились в результате самоопыления (это семена-загрязнители), а желтые зерна являются целевым продуктом - гибридом первого поколения (F1). Всего этим способом было получено 34473 зерна. На несколько женских родительских растений пыльцу назначенных мужских родительских растений не наносили, им было позволено опыляться вольным образом. От них было получено 4914 зерна кукурузы, и они использовались в качестве контрольной группы.

[0056] Данные Таблицы 3 свидетельствуют о 31%-ном уменьшении общего генетического загрязнения от самоопыления и нежелательного перекрестного опыления. Это уменьшение генетического загрязнения является существенным, особенно с учетом таких факторов, как трудный прототип, представленный в данном примере, и изобилие пыльцы, производимой метелками назначенных женских родительских растений (в пять-десять раз больше, чем у обычных женских родительских растений, используемых для получения гибридных семян). Эти данные отражают результат применения предлагаемого изобретения, но при более строгом подходе могли бы быть получены еще более впечатляющие результаты. При использовании консервированной пыльцы опыление можно было бы провести раньше в утреннее время, чтобы дать целенаправленно наносимой пыльце больше времени на то, чтобы прорасти в пестики и оплодотворить гаметы женских родительских растений.

[0057] Пример 3. В этом примере предлагаемое изобретение было осуществлено с использованием гомозиготных по гену «восковости» женских родительских растений и смеси мужских родительских растений, которая содержала функциональный или дикого типа аллель в восковидном локусе (Nelson, О.Е. (1968) Genetics 60: 507-524). Аллель «восковости» является рецессивным и в гомозиготном состоянии, являя полученные самоопылением семена-загрязнители, он придает зернам кукурузы характерный матовый фенотип, что позволяет их легко отличить невооруженным глазом. Женские родительские растения были высажены в три ряда длиной 4,6 м (15 футов) без изоляции и не подвергались мужской стерилизации (то есть, у них не удаляли метелки). Мужские родительские растения были высажены по соседству с примыканием к рядам женских родительских растений со всех сторон. Практическое осуществление предлагаемого изобретения состояло в том, что метелочные побеги мужских родительских растений заключали в мешочки, принудительно собирая таким образом пыльцу назначенных мужских родительских растений в мешочки в самом начале периода естественного испускания пыльцы приблизительно в 8.30 утра. Затем собранную пыльцу назначенных мужских родительских растений без промедления наносили на пестики назначенных женских родительских растений восковой кукурузы вручную, используя хорошо известную в отрасли технологию, заключающуюся в осторожном постукивании по мешочку с пыльцой, чтобы выпустить пыльцевые зерна на пестики. В этом примере было получено 14 початков, которые дали всего 3217 зерен. В Таблице 4 приведены данные, характеризующие результаты, полученные в этом примере практического осуществления предлагаемого изобретения. В этом эксперименте не было явно выделенной контрольной группы, однако согласно основывающимся на литературе априорным ожиданиям, генетическое загрязнение от самоопыления без применения предлагаемого изобретения составило бы минимум 50% (См., например, Paterniani Е. & Stort, А.С. (1974) Euphytica 23: 129-134; Ma, B.L. et al. (2004) Crop Sci. 44: 1273-1282). Используя данные по контрольной группе из Примера 4, который будет описан ниже, без применения предлагаемого изобретения можно было бы ожидать степени генетического загрязнения приблизительно 78%. В рассматриваемом примере генетическое загрязнение от самоопыления было сокращено до 2%. Это представляет уменьшение генетического загрязнения от самоопыления на 97%. В рассматриваемом примере были бы получены гибридные семена, удовлетворяющие стандарту уровня генетической чистоты 95%.

*Примечание. Использована контрольная группа желтый/белый для контроля воскового. Контролируемые восковые растения в одних и тех же рядах были восковысм на 100%.

[0058] Пример 4. Предлагаемое изобретение было осуществлено также в отношении женских родительских растений, гомозиготных по гену, детерминирующему белый эндосперм (то есть, гомозиготных по рецессивному гену в желтых локусах (у/у)) и смеси мужских родительских растений с желтым эндоспермом. Женские родительские растения были высажены на поле в штате Айова в один ряд длиной 4,6 м (15 футов) без изоляции и не подвергались мужской стерилизации (то есть, у них не удаляли метелки). Мужские родительские растения были высажены по соседству с женскими родительскими растениям с примыканием к ним со всех сторон. Практическое осуществление предлагаемого изобретения состояло в том, что метелочные побеги мужских родительских растений заключали в мешочки, принудительно собирая таким образом пыльцу назначенных мужских родительских растений в мешочки в самом начале периода естественного испускания пыльцы приблизительно в 8.30 утра. Затем собранную пыльцу назначенных мужских родительских растений без промедления наносили на пестики назначенных женских родительских растений вручную, используя хорошо известную в отрасли технологию, заключающуюся в осторожном постукивании по мешочку с пыльцой, чтобы выпустить пыльцевые зерна на пестики. В этом примере было получено пять початков, которые дали всего 888 зерен кукурузы. В этом ряду и в других близлежащих рядах было несколько женских растений с белым эндоспермом, которым было позволено вольное опыление и которые использовались в качестве контрольной группы, - они дали 6061 зерно. Данные, приведенные в помещаемой ниже Таблице 5 свидетельствуют о 79%-ном уменьшении генетического загрязнения в этом примере. Этим примером иллюстрируется тот случай, когда можно использовать служащий маркером цвет эндосперма для повышения генетической чистоты путем отсортировки зерен с белым эндоспермом (то есть, являющихся результатом самоопыления), чтобы привести уровень генетической чистоты к 95%-ному стандарту.

[0059] Пример 5. Блок растений для производства гибридных семян кукурузы выращивают в точном соответствии с применяемой в настоящее время практикой за исключением того, что дистанции изоляции сокращены на 50% или более, удаление метелок у женских родительских растений выполняют с пониженной тщательностью, оставляя у назначенных женских родительских растений 10% пыльцевых метелок (в то время как допустимым является только 1% оставленных метелок), а количество назначенных мужских родительских растений уменьшено на 50% или более. Пыльца мужских родительских растений собрана и законсервирована, затем получена из хранилища и нанесена на пестики женских растений в 6 часов утра.

[0060] Ожидается, что удалось бы уменьшить генетическое загрязнение на 50% или более по сравнению с обычной практикой производства семян без применения способа согласно предлагаемому изобретению. Используемые в данном примере параметры надлежащим образом могли бы быть применены к блокам для производства гибридных семян, в которых использованы мужские родительские растения, испускающие пыльцу на уровне от среднего до несколько выше среднего, и женские родительские растения, испускающие пыльцу на среднем уровне.

[0061] Пример 6. Блок растений для производства гибридных семян кукурузы выращивают в точном соответствии с применяемой в настоящее время практикой, включая стандартную дистанцию изоляции и стандартную практику удаления метелок (допускается оставить у женских родительских растений не более 1% испускающих пыльцу метелок), а также с использованием стандартного числа мужских родительских растений, рассчитанного на основе количества испускаемой ими пыльцы. Например, можно предположить, что мужское растение является репродуктивно слабым и испускает меньше двух миллионов пыльцевых зерен на метелку. В этом случае стандартами некоторых компаний - производителей семян это мужское растение может быть отнесено к недостаточно качественным и выбраковано независимо от того, насколько высокоурожайными могут быть полученные с его участием гибриды. Другие компании - производители семян могут взять на себя риск и высадить это мужское растение в блоке для производства гибридных семян в большом количестве относительно женских родительских растений.

[0062] В данном примере мужские родительские растения высажены в соотношении 2:4 (два ряда мужских растений на каждые четыре ряда женских растений) с окаймлением из десяти рядов мужских растений вокруг всего производственного блока. Осуществление способа согласно предлагаемому изобретению состояло в том, что пыльцу мужских родительских растений собирали и консервировали, а полученную из хранилища законсервированную пыльцу наносили точно на пестики женских родительских растений в 6 часов утра.

[0063] Ожидается, что генетическое загрязнение было бы уменьшено до уровней, удовлетворяющих стандартам сертификации гибридных семян и их поставки на рынок. По причине использования «репродуктивно слабых» мужских родительских растений в обычных условиях производственное поле, описанное в данном примере, обеспечило бы уровень генетического загрязнения в среднем 5%. Разброс относительно этого среднего значения может составлять уровень генетического загрязнения от 1% до 8% в зависимости от факторов окружающей среды для данного поля (например, ветер и близость соседнего кукурузного поля). Это значит, что половина производственных полей, находящихся в таких условиях, будут давать продукцию в виде гибридных семян, не отвечающих требованиям стандарта (генетическая чистота ниже 95%) и потенциально подлежащих отбраковке. На тех полях, где применено предлагаемое изобретение, в соответствии с рассматриваемым примером обеспечивающее уменьшение генетического загрязнения на 50%, средняя величина генетического загрязнения составит 2,5% с возможным разбросом от 0% до 5%. В этом случае по закону нормального распределения можно ожидать, что от 90% до 100% полей дадут продукцию в виде гибридных семян, удовлетворяющих 95%-ному стандарту генетической чистоты.

[0064] Пример 7. Поле для производства семян родительских растений представляет собой изолированное поле (201 м (660 футов) или более), которое содержит только одного родителя данного гибрида. Этому родителю разрешено вольное опыление или, по существу, самоопыление, чтобы увеличить количество его семян, так чтобы этих семян было достаточно для выращивания из них родительских растений, которые можно бы было использовать для производства гибридных семян. Чтобы получить достаточное количество семян растения, которое впоследствии можно было бы использовать в качестве родительского растения в блоке по производству гибридных семян, требуется несколько поколений.

[0065] В этом примере, относящемся к производству семян родительского растения, не требуется изоляции от другой кукурузы, представляющей потенциальную угрозу генетического загрязнения. Предлагаемое изобретение практически осуществляют с использованием пыльцы родительского растения, которую собирали и консервировали, а полученную из хранилища законсервированную пыльцу наносили точно на пестики родительского растения в 6 часов утра. Ожидается, что удалось бы уменьшить генетическое загрязнение на 50% или более по сравнению с обычной практикой производства семян без применения способа согласно предлагаемому изобретению. Используемые в данном примере параметры могли бы быть применены в тех случаях, когда невозможно обеспечить дистанции изоляции, а родительские растения тем не менее нужно размножить для дальнейшего их использования для производства гибридных семян для выращивания важного продукта. С таким сценарием можно столкнуться в местах контрсезонного выращивания (например, Гавайи), когда специализирующаяся на производстве семян компания пытается размножить родительское растение для выращивания в наступающем сезоне.

[0066] Краткие выводы по рабочим примерам. Примеры 1-4 иллюстрируют, как может работать предлагаемое изобретение с разной степенью успеха в зависимости от мужских свойств назначенных мужских и женских родительских растений. Хотя уменьшение генетического загрязнения наблюдалось во всех этих четырех примерах при моделировании предлагаемого изобретения или при его практическом осуществлении, для иллюстрации полезности и потенциала предлагаемого изобретения идеальным представляется использование консервированной пыльцы, которая была бы доступна по запросу. При таком решении была бы обеспечена возможность наносить пыльцу на пестики в наиболее подходящее время, что позволило бы избежать конкуренции с естественным пыльцевым облаком и получить большое начальное преимущество во врастании в надлежащий пестик, так что вероятность оплодотворения женского родительского растения другой пыльцой, которая стала бы причиной генетического загрязнения, существенно снизилась бы. Таким образом, обеспечена возможность уменьшения генетического загрязнения до еще более низкого уровня, чем это достигнуто в рассмотренных выше примерах.

[0067] Выше с определенной степенью детализации были описаны различные варианты осуществления предлагаемого изобретения, однако специалисты соответствующего профиля в состоянии сделать многочисленные модификации описанных вариантов осуществления предлагаемого изобретения без отклонения от его духа и не выходя за пределы его объема, как он раскрыт в данном описании и прилагаемой формуле изобретения. В некоторых случаях в методике, которая здесь раскрыта прямо или косвенно, различные стадии и операции описаны при одном возможном порядке работы, но специалистам соответствующего профиля должно быть понятно, что переупорядочение, замена или устранения некоторых из этих стадий и операций не обязательно ведут к отклонению от духа предлагаемого изобретения и к выходу за пределы его объема. Предполагается, что весь материал, содержащийся в данном описании или на прилагаемых чертежах, следует интерпретировать как всего лишь иллюстративный, но не ограничивающий. Изменения в деталях или структуре могут быть сделаны без отклонения от духа предлагаемого изобретения и выхода за пределы его объема, который определен прилагаемой к сему формулой изобретения.

[0068] Предлагаемое изобретение было описано со ссылками на рассмотренные выше варианты его осуществления, однако тем, кто обладает хотя бы средней квалификацией в данной отрасли, станут понятны различные альтернативные варианты, модификации, вариации, усовершенствования и (или) эквиваленты по существу, как известные, так и такие, которые спрогнозированы или могут быть спрогнозированы. Перечисление стадий способа в определенном порядке не накладывает никаких ограничений на порядок выполнения этих стадий способа. Таким образом, описанные выше варианты осуществления предлагаемого изобретения следует понимать как иллюстративные, а не ограничивающие. Специалистам соответствующего профиля должно быть понятно, что изменения могут быть внесены в изобретение по форме и в деталях без отклонения от духа предлагаемого изобретения и выхода за пределы его объема. Поэтому предполагается, что объем предлагаемого изобретения охватывает все известные или ранее разработанные альтернативные варианты, модификации, вариации, усовершенствования и (или) эквиваленты по существу.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу установления по меньшей мере одного временного окна в пределах дня, в течение которого назначенные женские родительские растения кукурузы готовы для целевого целенаправленного перекрестного опыления пыльцой назначенных мужских растений кукурузы. Также раскрыт способ преднамеренного перекрестного опыления назначенных женских родительских растений кукурузы пыльцой назначенных мужских растений кукурузы для производства представляющих интерес гибридных семян кукурузы. Изобретение позволяет эффективно производить семена кукурузы. 2 н. и 26 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 7 пр.

1. Способ установления по меньшей мере одного временного окна в пределах дня, в течение которого назначенные женские родительские растения кукурузы готовы для целевого целенаправленного перекрестного опыления пыльцой назначенных мужских растений кукурузы и тем самым пригодны для производства представляющих интерес гибридных семян кукурузы,

при этом назначенные женские родительские растения кукурузы, имеющие женские репродуктивные компоненты, находятся в условиях воздействия нежелательной пыльцы, а именно

a. пыльцы от мужских репродуктивных компонентов назначенных женских родительских растений кукурузы, которая пыльца может произвести нежелательное самоопыление этих назначенных женских родительских растений кукурузы, и

b. пыльцы от неродственных растений кукурузы того же вида, переносимой ветром, насекомыми и другими природными факторами, которая пыльца может произвести нежелательное перекрестное опыление по отношению к целенаправленному перекрестному опылению,

при этом способ содержит следующие стадии:

- устанавливают, восприимчивы ли к приему пыльцы женские репродуктивные компоненты назначенных женских родительских растений кукурузы, и

- устанавливают для этих назначенных женских родительских растений кукурузы по меньшей мере одно временное окно в пределах дня, которое

i. имеет место до того, как начинается сброс нежелательной пыльцы, или

ii. имеет место до того, как высохнет роса.

2. Способ по п. 1, в котором пыльцу упомянутого мужского назначенного родительского растения используют в одной или более из следующих форм:

a. свежая пыльца,

b. консервированная пыльца.

3. Способ по п. 1, в котором в качестве упомянутой пыльцы назначенного мужского растения кукурузы используют свежую пыльцу, собранную в одном или более из следующего: поле, ростовая камера, вегетационный домик, теплица, теневой домик, арочная теплица, установка для вертикального выращивания культур, гидропонная установка.

4. Способ по п. 1, в котором в качестве упомянутой пыльцы назначенного мужского растения кукурузы используют консервированную пыльцу, ранее собранную и законсервированную путем охлаждения, вымораживания, криоконсервации, заморозки, лиофильной сушки или выдерживания в жидком азоте.

5. Способ по п. 1, в котором используют пыльцу назначенного мужского растения кукурузы, собранную с одного или более из следующих источников:

i. источник с измененным циркадным ритмом,

ii. источник с нормальным циркадным цветением, в котором сброс пыльцы мужскими репродуктивными компонентами упомянутых назначенных женских родительских растений кукурузы задержан, и

iii. источник с нормальным циркадным цветением, в котором мужским репродуктивным компонентам упомянутого назначенного женского родительского растения позволяют сбрасывать пыльцу без задержки.

6. Способ по п. 1, в котором зрелость мужских репродуктивных компонентов упомянутых назначенных женских родительских растений задерживают путем обработки.

7. Способ по п. 1, в котором упомянутую пыльцу назначенного мужского растения кукурузы получают из одного генетического источника.

8. Способ по п. 1, в котором упомянутую пыльцу назначенного мужского растения кукурузы получают из более чем одного генетического источника и смешивают перед нанесением.

9. Способ по п. 1, в котором несколько установленных временных окон устанавливают для нескольких дней.

10. Способ по п. 1, в котором временное окно в пределах дня устанавливают после появления «шелка» (совокупность пестичных столбиков в початке кукурузы) у назначенных женских родительских растений и до сброса нежелательной пыльцы.

11. Способ по п. 1, в котором временное окно в пределах дня устанавливают как после появления «шелка», так и после сброса пыльцы назначенным женским родительским растением, но во время, когда нет активного сброса нежелательной пыльцы.

12. Способ по п. 1, в котором временное окно в пределах дня устанавливают, когда назначенные женские родительские растения кукурузы восприимчивы к получению пыльцы и готовы к целенаправленному перекрестному опылению в течение временного окна в пределах дня, начинающегося в 6:00 (шесть часов утра).

13. Способ по п. 1, в котором используют назначенные женские родительские растения кукурузы, обладающие мужской стерильностью.

14. Способ по п. 1, в котором назначенные женские родительские растения кукурузы выращивают в поле или в контролируемой среде в условиях воздействия нежелательной пыльцы.

15. Способ преднамеренного перекрестного опыления назначенных женских родительских растений кукурузы пыльцой назначенных мужских растений кукурузы для производства представляющих интерес гибридных семян кукурузы,

при этом назначенные женские родительские растения кукурузы, имеющие женские репродуктивные компоненты, находятся в условиях воздействия нежелательной пыльцы, а именно:

a. пыльцы от мужских репродуктивных компонентов назначенных женских родительских растений кукурузы, которая может произвести нежелательное самоопыление этих назначенных женских родительских растений кукурузы, и

b. пыльцы от неродственных растений кукурузы того же вида, переносимой ветром, насекомыми и другими природными факторами, которая может произвести нежелательное перекрестное опыление по отношению к целенаправленному перекрестному опылению,

при этом способ содержит следующие стадии:

a. устанавливают, восприимчивы ли к приему пыльцы женские репродуктивные компоненты назначенных женских родительских растений кукурузы, и

b. устанавливают для этих назначенных женских родительских растений кукурузы по меньшей мере одно временное окно в пределах дня,

при этом временное окно в пределах дня выбирают:

i. до того, как начинается сброс нежелательной пыльцы, или

ii. до того, как высохнет роса, и

с. преднамеренно опыляют упомянутые назначенные женские родительские растения кукурузы пыльцой упомянутых назначенных мужских растений кукурузы в течение упомянутого по меньшей мере одного временного окна в пределах дня.

16. Способ по п. 15, в котором пыльцу упомянутого мужского назначенного родительского растения кукурузы используют в одной или более из следующих форм:

a. свежая пыльца,

b. консервированная пыльца.

17. Способ по п. 15, в котором в качестве упомянутой пыльцы назначенного мужского растения кукурузы используют свежую пыльцу, собранную в одном или более из следующего: поле, ростовая камера, вегетационный домик, теплица, теневой домик, арочная теплица, установка для вертикального выращивания культур, гидропонная установка.

18. Способ по п. 15, в котором в качестве упомянутой пыльцы назначенного мужского растения кукурузы используют консервированную пыльцу, ранее собранную и законсервированную путем охлаждения, вымораживания, криоконсервации, заморозки, лиофильной сушки или выдерживания в жидком азоте.

19. Способ по п. 15, в котором используют пыльцу назначенного мужского растения кукурузы, собранную с одного или более из следующих источников:

i. источник с измененным циркадным ритмом,

ii. источник с нормальным циркадным цветением, в котором сброс пыльцы мужскими репродуктивными компонентами упомянутых назначенных женских родительских растений кукурузы задержан, и

iii. источник с нормальным циркадным цветением, в котором мужским репродуктивным компонентам упомянутого назначенного женского родительского растения позволяют сбрасывать пыльцу без задержки.

20. Способ по п. 15, в котором зрелость мужских репродуктивных компонентов упомянутых назначенных женских родительских растений задерживают путем обработки.

21. Способ по п. 15, в котором упомянутую пыльцу назначенного мужского растения кукурузы получают из одного генетического источника.

22. Способ по п. 15, в котором упомянутую пыльцу назначенного мужского растения кукурузы получают из более чем одного генетического источника и смешивают перед нанесением.

23. Способ по п. 15, в котором несколько установленных временных окон устанавливают для нескольких дней.

24. Способ по п. 15, в котором временное окно в пределах дня устанавливают после появления «шелка» (совокупность пестичных столбиков в початке кукурузы) у назначенных женских родительских растений и до сброса нежелательной пыльцы.

25. Способ по п. 15, в котором временное окно в пределах дня устанавливают как после появления «шелка», так и после сброса пыльцы назначенным женским родительским растением, но во время, когда нет активного сброса нежелательной пыльцы.

26. Способ по п. 15, в котором временное окно в пределах дня устанавливают, когда назначенные женские родительские растения кукурузы восприимчивы к получению пыльцы и готовы к целенаправленному перекрестному опылению в течение временного окна в пределах дня, начинающегося в 6:00 (шесть часов утра).

27. Способ по п. 15, в котором используют назначенные женские родительские растения кукурузы, обладающие мужской стерильностью.

28. Способ по п. 15, в котором назначенные женские родительские растения кукурузы выращивают в поле или в контролируемой среде в условиях воздействия нежелательной пыльцы.