ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ НАНОЧАСТИЦЫ, СОДЕРЖАЩИЕ НЕРАСТВОРИМОЕ СОЕДИНЕНИЕ НА ОСНОВЕ КАМПТОТЕЦИНА, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, И КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2024 года по МПК A61K9/51 A61K31/337 A61K31/4745 A61K31/7068 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[1] Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет и преимущество корейской патентной заявки №110-2020-0163156, поданной в корейское ведомство по интеллектуальной собственности 27 ноября 2020 г., раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

[2] Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей наночастицы плохо растворимого соединения камптотецина, для лечения рака и комбинированной терапии при раке.

[3] ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[4] Лечение рака включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию и медикаментозное лечение (например, химиотерапию или гормональную терапию). При злокачественных опухолях, когда первичное хирургическое вмешательство невозможно, подбирается химиотерапия (отдельно или в комбинации). Цитотоксические противоопухолевые средства, используемые в химиотерапии злокачественных опухолей во всем мире, включают противоопухолевые лекарственные средства на основе камптотецина, такие как ингибитор ДНК-топоизомеразы иринотекан, гемцитабин, который относится к антиметаболитам, и паклитаксел, который представляет собой ингибитор микротрубочек.

[5] Иринотекан, известный как СРТ-11, является полусинтетическим и водорастворимым аналогом природного алкалоида камптотецина и блокирует топоизомеразное раскручивание ДНК для предотвращения репликации ДНК, тем самым ингибируя пролиферацию клеток. Иринотекан в настоящее время выпускают в форме водного раствора и продают под торговой маркой Camptosar™ (инъекция гидрохлорида иринотекана). Иринотекан представляет собой противоопухолевое лекарственное средство пролекарственного типа и в организме превращается карбоксилэстеразой 2 (CES2) в SN-38, активный метаболит. Активная форма SN-38 обладает противоопухолевой активностью, которая в 100-1000 раз выше, чем у иринотекана, но нестабильна при рН организма и ее трудно превратить в препарат из-за чрезвычайно плохой растворимости. Кроме того, коэффициент превращения иринотекана в SN-38 в организме составляет всего 2-8%, с большим разбросом (более чем в 4 раза) среди пациентов. Таким образом, иринотекан, являясь цитотоксическим противораковым лекарственным средством, дозу которого необходимо точно рассчитывать (мг/м²) для каждого пациента, имеетнедостаток, заключающийся в том, что его точные эффекты или побочные эффекты невозможно спрогнозировать. Активная форма SN-38 представляет собой чрезвычайно плохо растворимое вещество и не растворяется обычным способом растворения, поэтому в настоящее время проводится множество исследований и разработок в области солюбилизации. Карбоксилэстераза 2 (CES2), которая превращает иринотекан в активный SN-38, демонстрирует большие отклонения в скорости экспрессии от одной опухолевой ткани к другой. CES2 главным образом экспрессируется в тонком и толстом кишечнике, что является основным показанием к применению иринотекана, но CES2 практически не экспрессируется при раке поджелудочной железы, раке желчного пузыря, раке молочной железы, раке легкого, раке почки, раке простаты и т.д.. Поэтому, если активную форму SN-38 можно вводить напрямую, ожидается, что противоопухолевый эффект может оказываться даже на опухолевую ткань, которая почти не экспрессирует CES2RK.

[6] При этом гемцитабин является полезным противораковым средством и в настоящее время используется в качестве стандартного лечения первой линии при раке поджелудочной железы. Однако эффективность подавления опухоли является низкой, и эффект продления периода выживания онкологических больных также низок. Кроме того, монотерапия противораковыми средствами на основе таксанов, такими как паклитаксел или наб-паклитаксел (паклитаксел в форме альбуминовых наночастиц), имеет разную чувствительность в зависимости от опухоли, поэтому существует ограничение, заключающееся в том, что противораковый эффект не является постоянным для каждого пациента. Поэтому для преодоления клинических ограничений монотерапии каждого цитотоксического противоракового средства активно проводятся исследования, направленные на повышение эффективности лекарственных средств и повышение безопасности за счет совершенствования технологии доставки лекарственных средств или комбинирования различных по механизму действия противоопухолевых лекарственных средств.

[7] Во всем описании приведены ссылки на многие патентные документы и их цитирование. Раскрытие цитируемых статей и патентных документов полностью включено в настоящее описание посредством ссылки, а уровень технической области, в которую попадает настоящее раскрытие, и детали настоящего раскрытия пояснены более ясно.

[8] РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[9] Техническая проблема

В целом известно, что слабый противоопухолевый эффект от химиотерапии обусловлен не только коротким временем удерживания лекарственного средства вкрови и низкой эффективностью селективной доставки лекарственного средства в опухолевую ткань, но и тем, что чувствительность к лекарственным средством сильно варьируется в зависимости от типа опухоли из-за особенностей опухолей с высокой частотой мутаций. Таким образом, авторы настоящего изобретения провели интенсивные и тщательные исследования по разработке комбинированной терапии, адаптированной для использования противоопухолевых средств с различными механизмами действия в комбинации и эффективной доставки противоопухолевых средств с высокой противоопухолевой активностью для повышения чувствительности к опухолям с последующим достижением максимальной противоопухолевой эффективности, а также повышенной безопасности. В результате было обнаружено, что превосходный противоопухолевый эффект достигается при использовании комбинации противоопухолевого средства и препарата в виде наночастиц, содержащего гидрофобный камптотецин и гидрофильный камптотецин, что привело к настоящему изобретению.

[10] Соответственно, один из аспектов настоящего изобретения заключается в создании фармацевтической композиции для лечения рака, предназначенной для введения в комбинации с противоопухолевым средством.

[11] Другим аспектом настоящего изобретения является создание фармацевтического комбинированного препарата, который включает: частицы, содержащие гидрофобное соединение на основе камптотецина, гидрофильное соединение на основе камптотецина и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока; и противоопухолевое средство в качестве активного ингредиента, и вводят одновременно, по отдельности или последовательно для лечения рака.

[12] Решение проблемы

[13] Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предложена

фармацевтическая композиция для лечения рака, которую вводят в комбинации с противоопухолевым средством.

[14] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает в качестве активного ингредиента частицы, содержащие гидрофобное соединение на основе камптотецина, гидрофильное соединение на основе камптотецина и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока.

[15] В контексте данного документа камптотецин представляет собой ингибитор топоизомеразы, обнаруженный в коре и стебле дерева Камптотека («счастливое» дерево), и демонстрирует превосходный противораковый эффект на доклинической стадии, однако не может использоваться из-за его плохойрастворимости. Поэтому многие исследователи разработали аналоги камптотецина для улучшения растворимости камптотецина. В настоящее время одобрены три типа производных камптотецина: иринотекан, топотекан и белотекан и используются в химиотерапии рака.

[16] Используемый в данном документе термин «гидрофобность» относится к вытеснению из молекул воды и агломерации, как тенденции, проявляющейся в неполярных веществах. Когда гидрофобное вещество присутствует в гидрофильной жидкости, то гидрофобное вещество агломерируется, одновременно увеличивая число гидрофобных связей, как будто гидрофобное вещество боится воды.

[17] Используемый в данном документе термин «гидрофильность» относится к свойству растворяться в полярном растворителе, таком как вода, с сильной аффинностью к нему, как тенденция, проявляющаяся в полярных веществах. Например, гидрофильное полимерное соединение или мицеллярная коллоидная поверхность поверхностно-активного вещества обладают сильной гидрофильностью.

[18] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гидрофобное соединение на основе камптотецина представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из 7-этил-10-гидроксикамптотецина (SN-38), камптотецина, 10-гидроксикамптотецина и их фармацевтически приемлемой соли, но не ограничивается ими.

[19] В другом варианте осуществления настоящего изобретения гидрофильное соединение на основе камптотецина выбрано из иринотекана, топотекана, белотекана, экзатекана, луртотекана, синотекана, рубитекана, 9-нитрокамптотецина, 9-аминокамптотецина, гиматекана, каренитецина, силатекана, дифломотекана, эломотекана, их фармацевтически приемлемой соли, их глюкуронидного метаболита и глюкуронидного метаболита гидрофобного соединения на основе камптотецина, но не ограничивается ими. Вышеупомянутое гидрофильное соединение на основе камптотецина может включать тип соединения, обычно классифицируемого как гидрофильное лекарственное средство. Под «гидрофильностью» следует понимать относительную гидрофильность по сравнению с вышеописанными типами гидрофобных соединений на основе камптотецина среди компонентов, составляющих частицы настоящего изобретения. То есть, гидрофильное соединение на основе камптотецина означает относительно гидрофильное соединение на основе камптотецина по сравнению с гидрофобным соединением на основе камптотецина, включенным в частицы по настоящему изобретению.

[20] Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, гидрофобное соединение на основе камптотецина, которое входит в состав частиц по настоящему изобретению, может представлять собой камптотецин, SN-38 или их смесь, а гидрофильное соединение на основе камптотецина, которое входит в состав частиц по настоящему изобретению, может представлять собой гидрохлорид иринотекана, гидрохлорид топотекана и глюкуронидный аналог SN-38.

[21] Используемый в настоящем документе термин «сополимер» относится к полимеру, полученному из двух или более мономеров разных типов. Например, реакция стиролакрилонитрила в реакционной емкости приводит к получению сополимера, содержащего оба указанных мономера. Термин «блок-сополимер» относится к сополимеру, имеющему форму, в которой блок одного типа мономеров связан с блоком другого типа мономеров. Случай, когда за блоком вещества А следует блок вещества В, выражается формулой -[-АВ-]-. Цепь относится к типу АВ, если данная цепь состоит только из одной нити каждого мономера, типу ABA, если блоки А присутствуют на обоих концах блока В, расположенного в центре, и типу ABC, если в главной цепи присутствуют три разных типа блоков. Блок-сополимер главным образом образуется за счет ионной полимеризации. В отличие от других сополимеров, данный блок-сополимер обладает рядом физических свойств гомополимера, образованного из двух типов мономеров.

[22] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения амфифильный блок-сополимер, входящий в состав частицы по настоящему изобретению, состоит из блоков А-В или блоков А-В-А. В контексте данного документа А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер, но не ограничивается ими.

[23] Кроме того, В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D, L-лактид, поли(лактид-согликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир, их производное или сополимер одного или нескольких соединений, выбранных из вышеперечисленного, но не ограничивается ими. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что любое соединение, которое может составлятьамфифильный блок-сополимер, пригодный для использования в данной области техники, может быть использовано без ограничений.

[24] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения амфифильный блок-сополимер представляет собой mPEG-PDLLA (mPEG-поли(D,L) молочная кислота); PEG-PCL [поли(этиленгликоль)-b-поли(карпролактон)]; PEG-PLA [поли(этиленгликоль)-b-поли(молочная кислота)]; mPEG-PGA[MOHOMeTOKcn поли(этиленгликоль)-b-поли(гликолевая кислота)]; mPEG-PLGA [монометокси поли(этиленгликоль)-b-поли(лактид-ко-гликолид)]; PEG-PBLA [поли(этиленгликоль)-b-поли(β-бензил-1_-аспарагиновая кислота)]; PEG-p(Glu) [поли(этиленгликоль)-b-поли(глутаминовая кислота)]; PEG-(Asp) [поли (этиленгликоль)-b-поли (аспарагиновая кислота)]; и/или PEG-PLA-PEG [поли(этиленгликоль)-Ь-поли(молочная кислота)-b-поли(этиленгликоль)].

[25] Согласно наиболее конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, свойства частиц и способ их изготовления подробно описаны в корейском патенте No 10-2094543, выданном настоящему заявителю, раскрытие которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

[26] Частицы, полученные в соответствии с патентом или следующими примерами, содержащие SN-38 в качестве гидрофобного соединения на основе камптотецина и гидрохлорид иринотекана в качестве гидрофильного соединения на основе камптотецина, а также mPEG-PDLLA в виде амфифильного блок-сополимера, были названы SNB-101.

[27] В другом варианте осуществления настоящего изобретения массовое соотношение гидрофобного соединения на основе камптотецина и гидрофильного соединения на основе камптотецина, которые входят в состав частицы по настоящему изобретению, составляет 1-10:1-10, 1-10:1-5, 1-10:1-3, 1-10:1, 1-5:1-10, 1-3:1-10, or 1:1-10, в частности, 1-5:1-5, 1-5:1-3, 1-5:1, 1-3:1-5, или 1:1-5, и более конкретно 1-3:1-3, 1-3:1, или 1:1-3, но не ограничивается этим.

[28] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения массовое соотношение гидрофобного соединения на основе камптотецина и гидрофильного соединения на основе камптотецина может составлять, без ограничения, 1:1-10, 1:1-5,1:1-3 или 1:1-2, и наиболее конкретно, может составлять 1:1,59, но не ограничивается этим.

[29] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения массовое соотношение (а) суммы гидрофобного соединения на основе камптотецина и гидрофильного соединения на основе камптотецина и (b) амфифильного блок-сополимера составляет 1:0.1-200, 1:0.5-200, 1:1-200, 1:2-200, 1:5-200, 1:10-200, 1:50-200, 1:100-200, 1:150-200, 1:0.1-100, 1:0.5-100, 1:1-100, 1:2-100, 1:5-100, 1:10-100, 1:20-100, 1:50-100, 1:0.1-50, 1:0.5-50, 1:1-50, 1:5-50, 1:10-50, 1:20-50, 1:0.1-20, 1:0.5-20, 1:1-20, 1:5-20, 1:10-20, 1:0.1-10, 1:0.5-10, или 1:1-10, но не ограничивается указанными значениями.

[30] Используемый в данном документе термин «до», «-» или «~» между двумя числовыми значениями означает участок между числовыми значениями, включая числовые значения, охарактеризованные до и после термина.

[31] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения частицы по настоящему изобретению получают следующим способом. Сначала гидрофобный камптотецин (например, SN-38) помещают вместе с гидрофильным камптотецином (например, гидрохлоридом иринотекана) в органический растворитель и полностью растворяют перемешиванием, а амфифильный блок-сополимер (например, mPEG-PDLLA), предварительно растворенный в органическом растворителе, добавляют к ним при перемешивании. Данную смесь сушат с помощью вакуумной сушилки с ротационным выпариванием или вакуумной сушилки. Водный растворитель (например, дистиллированная вода, PBS) добавляют к остатку с последующей ультразвуковой обработкой в ультразвуковом очистителе с получением частиц по настоящему изобретению.

[32] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения органический растворитель представляет собой без ограничений С₁-С₅ спирт (метанол, этанол, пропанол, бутанол, н-бутанол, изопропанол, 1-пентанол, 2-бутоксиэтанол, изобутиловый спирт и т.д.), алкилацетат, ацетон, ацетонитрил, хлороформ, бензол, толуол, ксилол, ацетон, фторалкан, пентан, гексан, 2,2,4-триметилпентан, декан, циклогексан, циклопентан, диизобутилен, 1-пентен, 1-хлорбутан, 1-хлорпентан, диизопропиловый эфир, 2-хлорпропан, 1-хлорпропан, хлорбензол, бензол, диэтиловый эфир, диэтилсульфид, дихлорметан, 1,2-дихлорэтан, анилин, диэтиламин, простой эфир, четыреххлористый углерод, тетрагидрофуран (ТГФ) или их смесь.

[33] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает противоопухолевое средство.

[34] Противоопухолевое средство включает по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из противоопухолевого средства на основе таксана, противоопухолевого средства на основе таксана, связанного с альбумином, ингибитора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и гемцитабина.

[35] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения противоопухолевое средство на основе таксана может быть, без ограничения, по меньшей мере, одним, выбранным из группы, состоящей из паклитаксела, доцетаксела, ларотаксела, кабазитаксела и их фармацевтически приемлемых солей.

[36] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения противоопухолевое средство на основе связанного с альбумином таксана представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей, без ограничений, из паклитаксела, связанного с альбумином (наночастицы паклитаксела, связанного с альбумином или наб-паклитаксела) и доцетаксела, связанного с альбумином (наночастицы доцетаксела, связанного альбумином или на6 -доцетаксела).

[37] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) может представлять собой, без ограничения, по меньшей мере один из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[38]

[39]

[40]

[41] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофобное соединение на основе камптотецина представляет собой SN-38, гидрофильное соединение на основе камптотецина представляет собой гидрохлорид иринотекана, а амфифильный блок-сополимер представляет собой mPEG-PDLLA(mPEO-поли(D,L) молочная кислота).

[42] Частицы по настоящему изобретению, полученные в соответствии с приведенным выше конкретным вариантом осуществления, были обозначены авторами настоящего изобретения как SNB-101.

[43] Стабильный препарат наночастиц (SNB-101) из SN-38 и гидрохлорида иринотекана представляет собой препарат, полученный путем растворения и приготовления SN-38, который было трудно использовать из-за его чрезвычайно плохой растворимости, несмотря на превосходный противораковый эффект, и позволяет осуществлять прямое введение SN-38 при раке поджелудочной железы, раке яичников, раке легкого, раке молочной железы и т.д., при которых отсутствует карбоксилэстераза, с вероятностью появления новых показаний к применению.

[44] Что касается частиц, используемых в качестве активного ингредиента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, то согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, SN-38 предпочтительно содержится в количестве от 0,1 до 1 мг/мл и более предпочтительно в количестве от 0,2 до 1,0 мг/мл в составе частиц. Кроме того, гидрохлорид иринотекана предпочтительно содержится в количестве от 0,1 до 2 мг/мл и более предпочтительно в количестве от 0,2 до 1,6 мг/мл в составе частиц.

[45] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения частица имеет двойную структуру. Двойная структура может включать внутреннююструктуру, обеспечиваемую гидрофильным соединением на основе камптотецина и гидрофобным соединением на основе камптотецина; и внешнюю структуру, образованную амфифильным блок-сополимером.

[46] В способе изготовления частиц, имеющих двойную структуру по настоящему изобретению, сначала гидрофильное соединение на основе камптотецина и гидрофобное соединение на основе камптотецина смешивают и растворяют в органическом растворителе, а раствор амфифильного полимера (амфифильного блок-сополимера) в органическом растворителе добавляют к смеси при перемешивании, а затем сушат. Затем полученные таким образом остатки эмульгируют в водном растворителе, например, путем обработки ультразвуком, с образованием диспергируемых в воде наночастиц.

[47] Известно, что амфифильный блок-сополимер, в котором гидрофильный блок и гидрофобный блок скомбинированы в определенном соотношении, образует мицеллоподобную диспергируемую в воде частицу путем самосборки в водном растворе. Предполагается, что диспергируемые в воде частицы по настоящему изобретению включают в своей внутренней части гидрофильное соединение на основе камптотецина и гидрофобное соединение на основе камптотецина, а также амфифильный блок-сополимер, ответственный за их внешнюю оболочку. Более конкретно, в структуре вододиспергируемых частиц по настоящему изобретению гидрофобный блок амфифильного блок-сополимера обращен к внутренней структуре, образованной относительно гидрофобными соединениями на основе камптотецина, в то время как гидрофильный блок обращен ко внешнему водному растворителю, образуя таким образом оболочку.

[48] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения диспергируемые в воде частицы с двойной структурой по настоящему изобретению характеризуются тем, что они самопроизвольно образуют частицы при диспергировании в водном растворе.

[49] В другом варианте осуществления настоящего изобретения частицы имеют средний диаметр от 2 до 200 нм. В случае, когда частицы, изготовленные в соответствии с настоящим изобретением, имеют размер частиц 200 нм или менее, можно избежать неселективного удаления ретикулоэндотелиальной (РЭС) системы в организме, и, таким образом, предпочтительно изготавливать частицы, имеющие одинаковый размер, составляющий 200 нм или менее.

[50] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения диспергируемые в воде частицы по настоящему изобретению могут быть смешаны с криопротектором, таким кактрегалоза или маннит, перед лиофилизацией.

[51] При среднем диаметре (размере частиц) 200 нм или менее, частицы согласно настоящему изобретению могут максимизировать доставкулекарственных средств в опухолевые ткани, используя преимущество свойства усиленного проникновения и удержания (EPR) опухолевых тканей. Что касается EPR, то нормальная целостность сосудистой системы (особенно капилляров) нарушена, так что такие частицы, как наноразмерные носители-частицы (наночастицы, липосомы, мицеллы), вытекают из капилляра и откладываются на очаге опухоли.

[52] Следовательно, благодаря свойствам частиц (SNB-101) по настоящему изобретению, SN-38 и иринотекан, содержащиеся в SNB-101, могут находиться в крови в течение длительного периода времени, тем самым способствуя накоплению лекарственного средства в опухолевой ткани. Таким образом, ожидается, что максимально переносимая доза (MTD) лекарственного средства может быть повышена за счет увеличения лекарственного воздействия на раковые клетки в опухоли и снижения лекарственного воздействия на нормальные ткани, тем самым повышая безопасность.

[53] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция согласно одному аспекту настоящего изобретения предназначена для лечения рака. Рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желудка, рака яичников, рака матки, рака шейки матки, мел ко клеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака пищевода, ретинобластомы, рака полости рта, рака слюнной железы, рака гортани, рака глотки, рака прямой кишки, рака толстой кишки, колоректального рака, рака почки, рака простаты, меланомы, рака печени, рака желчного пузыря и других видов рака желчных протоков, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря, рака головного мозга и центральной нервной системы, опухоли кости, рака кожи, неходжкинской лимфомы и лимфомы Ходжкина, но не ограничивается ими. Рак головного мозга может представлять собой глиому, менингиому, шванному, опухоль гипофиза, метастатическую опухоль головного мозга или опухоль основания черепа. Глиома включает астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому или их комбинацию.

[54] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения рак, являющийся целевым заболеванием для фармацевтической композиции, представляет собой рак поджелудочной железы, рак желудка, рак молочной железы, рак легкого, коло ректальный рак или их комбинацию.

[55] Когда частицы по настоящему изобретению или содержащую их композицию готовят в виде фармацевтической композиции, то фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель обычно используется в процессе приготовления препарата, и его примеры могут включать, помимо прочего, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метил целлюлозу, метил гид роксибензоат, пропил гид роксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать смазочное вещество, смачиватель, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант и т.п., в дополнение к вышеуказанным ингредиентам. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и агенты подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19-е изд., 1995).

[56] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать сахарозу, маннит, сорбит, глицерин, трегалозу, вспомогательное вещество на основе полиэтиленгликоля и вспомогательное вещество на основе циклодекстрина (альфа-, бета - и гамма-циклодекстрина, гидроксициклодекстрина или производного циклодекстрина). Вспомогательное вещество добавляют к частицам, которые соответствуют активному ингредиенту настоящей фармацевтической композиции, оно служит крио протектором или осморегулятором, и готовят путем лиофилизации, выпаривания растворителя или тому подобного.

[57] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально, и примеры парентерального введения могут включать внутривенное введение, внутриартериальное введение, ректальное введение, подкожное введение, внутрикожное введение, внутримышечное введение, интраназальное введение, введение через слизистую оболочку, интрадуральное введение, внутрибрюшинное введение, внутриглазное введение и т.п., и, в частности, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить внутривенно.

[58] Подходящая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьируется в зависимости от таких факторов, как способ приготовления, способ введения, возраст пациента, масса тела, пол, заболеваемость и пища, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность. Обычные практикующие врачи могут без труда определить и назначить дозу, которая эффективна для требующегося лечения или профилактики. Согласно варианту осуществления настоящего изобретения суточная доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению составляет 0,001-100 мг/кг.

[59] Что касается дозы и частоты введения SN-38 и гидрохлорида иринотекана, содержащихся в SNB-101 по настоящему изобретению, SN-38 можно вводить в дозе от 1 до 5 мг/м² в сутки однократно или разделить на несколько аликвот согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения. Для инъекции, например, пациенту-человеку внутривенно может быть введена суточная доза от 1 до 100 мг, в частности от 20 до 85 мг и более конкретно от 30 до 85 мг (в расчете на массу тела 60 кг; площадь поверхности тела 1,67 м²). Введение можно осуществлять, среди прочего, в виде разделенных доз в количестве от одной до трех.

[60] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в виде единичной лекарственной формы или может быть приготовлена в многодозовом контейнере с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или вспомогательного вещества в соответствии со способом, который легко осуществим человеком, имеющим стандартные навыки в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В контексте данного документа лекарственная форма может представлять собой раствор в масляной или водной среде, суспензию, эмульсию, экстракт, порошок, гранулы, таблетку или капсулу и может дополнительно содержать диспергатор или стабилизатор.

[61] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить параллельно с известным соединением или фармацевтической композицией, оказывающими лечебный эффект при раке.

[62] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения известное соединение или фармацевтическая композиция включает в себя, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из противоопухолевого средства на основе таксана, противоопухолевого средства на основе таксана, связанного с альбумином, ингибитора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и гемцитабина.

[63]

[64] Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, предложен способ лечения рака, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся во введении, (а) первой фармацевтической композиции, содержащей частицы, содержащие гидрофобное соединение на основе камптотецина, гидрофильное соединение на основе камптотецина и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока, в комбинации со (b) второй фармацевтической композицией, содержащей противоопухолевое средство в качестве активного ингредиента, или противоопухолевой терапией.

[65] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию вводят одновременно, по отдельности или последовательно.

[66] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию вводят в виде комбинированного препарата или одного препарата.

[67] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения противоопухолевая терапия включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию или их комбинацию.

[68] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желудка, рака яичников, рака матки, рака шейки матки, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака пищевода, ретинобластомы, рака полости рта, рака слюнной железы, рака гортани, рака глотки, рака прямой кишки, рака толстой кишки, колоректального рака, рака почки, рака простаты, меланомы, рака печени, рака желчного пузыря и других видов рака желчных протоков, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря, рака головного мозга, рака центральной нервной системы, опухоли кости, рака кожи, неходжкинской лимфомы и лимфомы Ходжкина, но не ограничивается ими. Рак головного мозга может представлять собой глиому, менингиому, шванному, опухоль гипофиза, метастатическую опухоль головного мозга или опухоль основания черепа. Глиома включает астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому или их комбинацию.

[69] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения рак представляет собой рак поджелудочной железы, рак желудка, рак молочной железы, рак легкого, коло ректальный рак или их комбинацию.

[70]

[71] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая комбинация, включающая: частицы, содержащие гидрофобное соединение на основе камптотецина, гидрофильное соединение на основе камптотецина и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока; и противоопухолевое средство в качестве активных ингредиентов.

[72] В фармацевтической комбинации каждый из активных ингредиентов вводят одновременно, по отдельности или последовательно для лечения рака.

[73]

[74] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен набор для лечения рака, включающий: первую фармацевтическую композицию, включающую частицы, содержащие гидрофобное соединение на основе камптотецина, гидрофильное соединение на основе камптотецина и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока игидрофильного блока; и вторую фармацевтическую композицию, включающую противоопухолевое средство.

[75] Первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию в наборе для лечения рака вводят одновременно, по отдельности или последовательно для лечения рака.

[76] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию вводят в форме комбинированного препарата или одного препарата.

[77] Используемый в настоящем документе термин «введение» или «вводить» относится к прямому применению терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению на субъекте (т.е. индивидууме) с раком, тем самым образуя такое же его количество в организме субъекта.

[78] Термин «терапевтически эффективное количество» композиции относится к содержанию композиции, которое является достаточным для обеспечения терапевтического или профилактического эффекта у субъекта, которому осуществляют введение, и, таким образом, этот термин имеет значение, включающее «профилактически эффективное количество». Используемый в настоящем документе термин «субъект» включает, среди прочего, человека, мышь, крысу, морскую свинку, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, обезьяну, шимпанзе, бабуина или макаку-резуса. В частности, субъектом по настоящему изобретению является человек.

[79] Способ лечения рака, фармацевтический комбинированный препарат и набор для лечения рака по настоящему изобретению включают тот же активный ингредиент, что и фармацевтическая композиция для лечения рака согласно варианту осуществления настоящего изобретения, и в них используется противоопухолевое средство для комбинации. Следовательно, описание, приведенное выше в отношении одного аспекта настоящего изобретения, в равной степени применимо к частично перекрывающему содержанию.

[80] Полезные эффекты изобретения

[81] Настоящее изобретение относится к применению наночастиц, содержащих плохо растворимое соединение на основе камптотецина, для лечения рака, и схеме введения в комбинации с противоопухолевым средством на основе таксана. Проявляя синергический эффект при лечении рака при использовании в комбинации с противоопухолевым средством на основе таксана, фармацевтическая композиция, содержащая наночастицы по настоящему изобретению, может без труда использоваться в качестве средства для лечения рака и в качестве средства комбинированной терапии.

[82] КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[83] Фиг. 1 представляет собой график изменения массы тела мышей во времени после введения, на модели рака поджелудочной железы, которым подкожно трансплантировали AsPC-1.

[84] Фиг. 2 представляет собой график изменения объема опухоли во времени у мышей с моделью рака поджелудочной железы, которым подкожно трансплантировали AsPC-1, на котором продемонстрировано ингибирующее действие тестируемых веществ на опухоли.

[85] Фиг. 3 представляет собой график массы опухоли у мышей с моделью рака поджелудочной железы, которым подкожно трансплантировали AsPC-1, на котором продемонстрировано ингибирующее действие тестируемых веществ на опухоли.

[86] Фиг. 4 представляет собой фотографическое изображение опухолей, удаленных на 22-е сутки после введения тестируемых веществ мышам с моделью рака поджелудочной железы, которым подкожно трансплантировали AsPC-1.

[87] Фиг. 5 представляет собой график изменения массы тела мышей со временем после введения мышам с моделью рака желудка, которым подкожно трансплантировали Hs746T.

[88] Фиг. 6 представляет собой график изменения объема опухоли со временем у мышей с моделью рака желудка, которым подкожно трансплантировали Hs746T, на котором продемонстрировано ингибирующее действие тестируемых веществ на опухоли.

[89] Фиг. 7 представляет собой график массы опухолей у мышей с моделью рака желудка, которым подкожно трансплантировали Hs746T, демонстрирующих ингибирующее действие тестируемых веществ на опухоли.

[90] Фиг. 8 представляет собой фотографическое изображение опухолей, удаленных на 22 сутки после введения тестируемых веществ мышам с моделью рака желудка, которым подкожно трансплантировали Hs746T.

[91] Фиг. 9 представляет собой график изменения объема опухоли со временем у мышей с моделью рака молочной железы, которым подкожно трансплантировали MDA-MB23, демонстрирующий ингибирующее действие тестируемых веществ на опухоли.

[92] Фиг. 10 представляет собой график изменения массы тела мышей со временем после введения тестируемых веществ мышам с моделью рака молочной железы, которым подкожно трансплантировали MDA-MB231.

[93] Фиг. 11 представляет собой график изменения объема опухоли с течением времени у мышей с моделью рака легкого, которым подкожно трансплантировали А549, демонстрирующий ингибирующее действие тестируемых веществ на опухоли.

[94] Фиг. 12 представляет собой график изменения массы тела мышей с течением времени у мышей с моделью рака легкого, которым подкожно трансплантировали А549.

[95] Фиг. 13 представляет собой график изменения объема опухоли с течением времени после введения тестируемых веществ мышам с моделью колоректального рака, которым подкожно трансплантировали НТ-29.

[96] Фиг. 14 представляет собой график изменения объема опухоли с течением времени после введения тестируемых веществ мышам с моделью мелкоклеточного рака легкого, которым подкожно трансплантировали NCI-H69.

[97] Фиг. 15 представляет собой фотографическое изображение опухолей после введения тестируемых веществ мышам с моделью мелкокпеточного рака легкого, которым подкожно трансплантировали NCI-H69.

[98] Фиг. 16 представляет собой график изменения объема опухоли с течением времени после введения тестируемых веществ мышам с моделью колоректального рака, которым подкожно трансплантировали НСТ116.

[99] Фиг. 17 представляет собой фотографическое изображение опухолей после введения тестируемых веществ мышам с моделью колоректального рака, которым подкожно трансплантировали НСТ116.

[100] Фиг. 18 представляет собой график изменения объема опухоли со временем после введения тестируемых веществ мышам с моделью немелкоклеточного рака легкого, которым подкожно трансплантировали А549.

[101] СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[102] Далее настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на примеры. Данные примеры предназначены только для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

[103]

[104] ПРИМЕРЫ

[105]

[106] В настоящем описании термин «%», используемый для выражения концентрации конкретного вещества, если не указано иное, обозначает (мас./мас.)% для соотношения твердое/твердое вещество, (мас./об.)% для соотношения твердое/жидкое вещество, и (об/об)% для соотношения жидкость/жидкость.

[107]

[108] ПРИМЕР 1: Получение наночастиц по изобретению (SNB-101)

[109] В круглодонной колбе 10 мл ацетонитрила добавляли к 20 мг SN-38 (7-этил-10-гидрокси камптотецин) в качестве гидрофобного камптотецина и 30 мг гидрохлорида иринотекана (тригидрата) в качестве гидрофильного камптотецина с последующей обработкой ультразвуком в ультразвуковом аппарате, для полного растворения двух лекарственных средств. Затем 100 мг метоксиполиэтиленгликоль-поли(0,1_-молочной кислоты) (mPEG-PDLLA) взвешивали в круглодонной колбе и полностью растворяли в органическом растворителе (этанол-ацетонитрил 50:50) (об./об., смешанный раствор) при перемешивании в течение 30 минут. Затем раствор с полностью растворенным mPEG-PDLLA несколько раз медленно добавляли к раствору лекарственного средства, в котором были растворены SN-38 и гидрохлорид иринотекана, каждый раз перемешивая по 10-15 секунд. После смешивания двух растворов в круглодонной колбе органический растворитель полностью удаляли путем сушки на ротационном испарителе с получением тонкой пленки. Затем к пленке добавляли 20 мл стерильной дистиллированной воды с последующей обработкой ультразвуком в ультразвуковом аппарате для полного растворения пленки лекарственного средства.

[110] Полученные таким образом наночастицы с двойной структурой разводили до концентрации SN-38 1 мг/мл в дистиллированной воде и измеряли средневзвешенный по интенсивности диаметр методом динамического рассеяния света с использованием системы Zetasizer Nano System от Malvern (Великобритания).

[111] Затем 200 мг трегалозы и 300 мг маннита (D-маннита) в качестве криопротекторов полностью растворяли в 20 мл стерильной дистиллированной воды при перемешивании.

[112] Наконец, весь раствор криопротектора добавляли к раствору наночастиц смеси лекарственных средств при перемешивании каждый раз в течение 10-15 секунд. Конечный смешанный раствор фильтровали через мембранный фильтр из ацетата целлюлозы с размером пор 0,22 мкм и загружали в упаковочные флаконы. Заполненные флаконы лиофилизировали с получением готового продукта в форме сухого порошка или лепешки (наименование SNB-101).

[113]

[114] ПРИМЕР 2: эффект совместного введения наночастиц (SNB-101) на рак поджелудочной железы

[115]

[116] 2-1 Материал для проведения эксперимента

[117] В качестве веществ для проведения тестирования использовали 5%-ный раствор глюкозы для инъекций, гидрохлорид иринотекана (иринотекан HCI; CalmtopTM Inj. CJ Healthcare, Корея), наб-паклитаксел (AbraxaneTM, Abraxis Bioscience, LLC) и композицию наночастиц (обозначенную как SNB-101), содержащую SN-38 и гидрохлорид иринотекана. Гидрохлорид иринотекана (CalmtopTM Inj.) в концентрации 100 мг/5 мл был приобретен у CJ Healthcare. Абраксан был приобретен у Abraxis Bioscience, LLC (США) и использовался в форме лиофилизированного препарата для инъекций в дозе 100 мг/флакон.

[118] Композиция наночастиц (SNB-101), содержащая SN-38 и гидрохлорид иринотекана, используемая в настоящем изобретении, представляет собой стабильный препарат наночастиц для инъекций, а способ ее получения изложен в корейском патенте №10-2094543. Препарат для внутривенной инъекции SNB-101 содержал 10 мг SN-38 и 15,9 мг гидрохлорида иринотекана на флакон. Перед использованием инъекционный препарат можно развести в 9,64 мл 5% раствора декстрозы для инъекций USP, и разведенный препарат можно вводить в течение 90 минут.

[119]

[120] 2-2. Способ проведения тестирования

[121] Культура клeтoк AsPC-1

[122] В качестве клеточной линии рака поджелудочной железы для ксенотрансплантатной модели рака поджелудочной железы использовали AsPC-1. Клетки AsPC-1 являются агрессивными клетками и, как известно, обладают устойчивостью к гемцитабину. Клетки AsPC-1 культивировали в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином, в колбе площадью 175 см². FBS, RPMI-1640 и пенициллин-стрептомицин были приобретены у АТСС (Манассас, Вирджиния) и использованы в эксперименте. Клетки культивировали при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂. Каждую культивированную раковую клетку подпитывали 2-3 раза в неделю и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4). Затем закрепленные клетки отделяли с помощью смеси 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Отделенные клетки центрифугировали (3 мин, 1500 об/мин). Осадок из раковых клеток добавляли к среде и суспендировали пипетированием. После пассажей клетки использовали в эксперименте.

[123]

[124] 2) Индукция ксенотрансплантата рака поджелудочной железы на мышиной модели

[125] Животные, используемые в данном исследовании, представляли собой мышей-самцов линии BALB/c nu/nu (возраст около 5 недель, средняя масса тела 19 г±20%), которые широко используются для животных моделей ксенотрансплантации и акклиматизируются в течение примерно 5-7 суток послепокупки. В день инокуляции культивированные раковые клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4) и трипсинизировали смесью 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА для отделения клеток. Клетки собирали путем кратковременного центрифугирования (3 минуты, 1500 об/мин), разводили в PBS, а затем подкожно вводили в дозе 5×10⁶ клеток/0,2 мл на животное в правый бок мыши, и подтверждалось, что суспензия опухолевых клеток не вытекала из места инъекции.

[126] Разделение на группы и дозирование

[127] Мышей группировали, исходя из среднего объема опухоли рака поджелудочной железы, равного 200±20 мм³, а контрольная и тестируемая группы и дозы для них были следующими.

[128]

[132] 3) Место инъекции и способ инъецирования

[133] Тестируемые вещества вводили через хвостовую вену (внутривенно, в.в.) в соответствующих дозах, рассчитанных на основе массы тела мышей непосредственно перед введением. Тестируемые вещества вводили один раз в неделю, в общей сложности 5 раз (сутки 0, 7, 14, 17 и 21), а аутопсию проводили на 22-е сутки.

[134]

[135] 4) Объекты наблюдения и обследования

[136] Клинические симптомы регистрировали один раз в сутки в течение периода проведения испытаний, и во время введения лекарства, объем опухоли измеряли три раза в неделю. После завершения испытаний животных обезболивалиизофлураном, а затем обескровливали. Опухолевые ткани иссекали у каждого индивидуума. Вырезанные опухоли взвешивали и фотографировали. Размеры опухоли по длинной и короткой оси измеряли с помощью штангенциркуля (Mitutoyo Corp., номер модели: CD-15CPX, Япония), а объем опухоли рассчитывали в соответствии с уравнением 1, приведенным ниже.

[137] Уравнение 1

[138] Объем опухоли=(короткая ось)²хдлинная осьх0.5

[139]

[140] 5) Статистика

[141] Был проведен статистический анализ результатов испытаний с помощью теста Манна-Уитни с использованием коммерческой статистической программы (IBM SPSS statistics версии 19.0).

[142]

[143] 2-3. Результаты проведения испытания

[144] 1) Масса тела

[145] Измеренные значения массы тела на 22-е сутки (день аутопсии) введения тестируемого вещества суммированы в таблице 2 и на фиг. 1.

[147] По сравнению с G1 (группа, получающая носитель), в группах, которым вводили тестируемое вещество (G3-G8), наблюдались темпы потери массы тела, составляющие 10,0%, 10,0%, 10,0%, 15,4%, 12,4% и 17,4% соответственно, что было ниже критической скорости потери массы тела, составляющей 20% (фиг. 1).

[148]

[149] 2) Измерение объема опухолей

[150] Измеренные значения объема опухолей рака поджелудочной железы суммированы в таблице 3 и изображены на фиг. 2.

[151]

[153] Объем опухоли рака поджелудочной железы продолжал расти в группе, получавшей носитель (G1) и в группе, получавшей только наб-паклитаксел (G2; 5 мг/кг), в течение 22 суток после разделения групп, при этом рост опухоли был больше, чем у остальных групп.

[154] По сравнению с группой, получавшей носитель, объем опухоли значительно уменьшился в группе (G8), получавшей наб-паклитаксел+SNB-101 (высокая доза) с 7-х суток, а также во всех группах, получавших только SNB-101 (низкая, высокая доза) (G5, G6) и группе, получавшей комбинацию наб-паклитаксел+SNB-101 (высокая доза) (G8), с 17 по 22 сутки (р<0,05).

[155] На 22-е сутки в группе, получавшей комбинацию наб-паклитаксел+гидрохлорид иринотекана (G4) объем опухоли уменьшился на 32,4% по сравнению с группой, получавшей только наб-паклитаксел (G2), и на 12,8% по сравнению с группой, получавшей только гидрохлорид иринотекана (G3), но статистической значимости не наблюдалось (р>0,05).

[156] При сравнении групп, получавших только SNB-101 (низкую и высокую дозу) (G5 и G6), в группе с высокой дозой (G6) рост опухоли значительно снизился на 11,0% по сравнению с группой, получавшей низкую дозу (G5), что указывало на то, что SNB-101 осуществляла ингибирование дозозависимым образом (10/15,9 мг/кг в сравнении с 20/31,8 мг/кг в виде SN-38/иринотекан HCI).

[157] При сравнении между группой, получавшей только наб-паклитаксел (G2) или группой, получавшей только SNB-101 (низкая и высокая дозы) (G5 и G6), и группами, получавшими комбинацию наб-паклитаксел+SNB-101 (низкая и высокая дозы) (G7 и G8), обе группы, получавшие комбинацию, продемонстрировали более сильное ингибирующее действие на рост опухоли, чем каждая из групп, получавшая монолечение (р<0,05, р<0,01). При сравнении между группами, получавшими наб-паклитаксел+SNB-101 (низкая и высокая дозы) (G7 и G8), ингибирующее действие на рост опухоли также усиливалось со статистической значимостью (р<0,05) по мере увеличения дозы SNB-101.

[158] Наб-паклитаксел в отдельности (5 мг/кг) (G2) не смог подтвердить свое ингибирующее действие на опухоль, при этом более сильное ингибирующее действие на рост опухоли наблюдалось в группе, получавшей наб-паклитаксел+SNB-101 в высокой дозе (G8) (20/31,9 мг/кг в виде SN-38/иринотекан HCI) (52,6%), чем в группе, получавшей только высокую дозу SNB-101 (G6) (38,4%). Кроме того, группа, получавшая наб-паклитаксел+высокие дозы SNB-101 (G8), продемонстрировала ингибирующее действие на рост опухоли (29,5%) по сравнению с группой, получавшей комбинацию наб-паклитаксел+иринотекан HCI (G4) со статистической значимостью (р<0,05).

[159] Приведенные результаты показывают, что совместное введение наб-паклитаксела и SNB-101 может демонстрировать синергическое ингибирующее действие на рост опухоли поджелудочной железы.

[160]

[161] 3) Измерение массы опухоли

[162] Результаты измерения массы опухолей приведены в таблице 4 ниже и представлены на фиг. 3.

[165] Как показано в Таблице 4 и на Фиг. 3, средняя масса опухоли составляла 0,62±0,11 г для группы, не получавшей лечения (группа носителя, G1), 0,64±0,15 г для группы, получавшей наб-паклитаксел (G2), и 0,47±0,10 г и 0,38±0,11 г для групп, получавших только SNB- 101 (низкая и высокая дозы) (G5 и G6) соответственно. Кроме того, масса опухолей в группах, получавших комбинацию наб-паклитаксел+SNB-101 (низкая и высокая дозы) (G7 и G8) составляла 0,43±0,10 и 0,31±0,05 г соответственно. В группах, получавших комбинацию, наблюдалось более сильное ингибирование опухоли более чем на 50%, чем в группе, получавшей только наб-паклитаксел (G2), и на 10-22,5% больше, чем в группах, получавших только SNB-101 (низкая и высокая дозы) (G5 и G6). Изприведенных выше результатов стало понятно, что наб-паклитаксел и SNB-101 обладают потенциалом в качестве превосходной комбинированной терапии для лечения рака поджелудочной железы.

[166] В группе, получавшей комбинацию наб-паклитаксел+гидрохлорид иринотекана (G4) наблюдалось значительное уменьшение на 30,8% по сравнению с группой, получавшей только наппаклитаксел (G2). При сравнении групп, получавших только SNB-101 (низкую и высокую дозу), в группе высокой дозы (G6) наблюдалось снижение на 20,0% по сравнению с группой низкой дозы (G5).

[167]

[168] ПРИМЕР 3: эффект совместного введения наночастиц (SNB-101) на рак желудка [169]

[170] 3-1. Материалы эксперимента

[171] В качестве веществ для тестирования использовали 5% раствор глюкозы для инъекций, гидрохлорид иринотекана (иринотекан HCI; CalmtopTM Inj., CJ Healthcare, Корея), доцетаксел (TaxotereTM, Sanofi-Aventis Korea) и композицию наночастиц (обозначенную как SNB-101), содержащую SN-38 и гидрохлорид иринотекана. Гидрохлорид иринотекана (CalmtopTM Inj.) в концентрации 100 мг/5 мл был приобретен у CJ Healthcare. Доцетаксел был приобретен у Sanofi-Aventis Korea и использовался в форме лиофилизированного препарата для инъекций в дозе 20 мг/флакон. Композиция наночастиц (SNB-101), содержащая SN-38 и гидрохлорид иринотекана, используемая в настоящем изобретении, представляет собой стабильный композицию наночастиц для инъекций, а способ ее получения изложен в корейском патенте №10-2094543. Препарат для внутривенной инъекции SNB-101 содержал 10 мг SN-38 и 15,9 мг гидрохлорида иринотекана на флакон. Перед использованием инъекционный препарат можно развести в 9,64 мл 5% раствора декстрозы для инъекций USP, и инъекцию разведенного препарата можно осуществлять в течение 90 минут.

[172]

[173] 3-2 Способ проведения испытания

[174] Культура клеточной линии рака желудка Hs746T

[175] В качестве клеточной линии рака желудка для ксенотрансплантатной модели рака желудка использовали Hs746T. Клетки Hs746T культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином, в колбе площадью 175 см². FBS, DMEM и пенициллин-стрептомицин были приобретены у АТСС (Манассас, Вирджиния) и использованы в эксперименте. Клетки культивировали при 37°С в инкубаторе с 5% CO2. Каждую культивированную раковую клеткуподпитывали 2-3 раза в неделю и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4). Затем закрепленные клетки отделяли с помощью смеси 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Отделенные клетки центрифугировали (3 мин, 1500 об/мин). Осадок раковых клеток добавляли к среде и суспендировали пипетированием. После пассажей клетки использовали в эксперименте.

[176] В день инокуляции культивированные раковые клетки промывали PBS и отделяли обработкой смесью 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Отделенные клетки собирали путем кратковременного центрифугирования (3 мин, 1500 об/мин) и разводили в PBS для получения дозы 4х10⁶ клеток/0,2 мл на животное.

[177]

[178] 2) Индукция ксенотрансплантата рака желудка на мышиной модели

[179] Животные, используемые в данном исследовании, представляли собой мышей-самцов линии BALB/c nu/nu (возраст около 5 недель, средний вес 19 г±20%), которые широко используются для животных моделей ксенотрансплантации и акклиматизируются в течение примерно 5-7 суток после покупки. В день инокуляции культивированные раковые клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4) и трипсинизировали смесью 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА для отделения клеток. Клетки собирали путем кратковременного центрифугирования (3 минуты, 1500 об/мин), разводили в PBS, а затем подкожно вводили в дозе 5×10⁶ клеток/0,2 мл на животное в правый бок мыши, и подтверждалось, что суспензия опухолевых клеток не вытекала из места инъекции.

[180]

[181] Разделение на группы и дозирование

[182] Мышей группировали, исходя из среднего объема опухоли рака желудка, равного 80±20 мм³, а контрольная и тестируемая группы и дозы для них были следующими.

[186] 3) Место инъекции и способ инъецирования

[187] Тестируемые вещества вводили через хвостовую вену (внутривенно, в.в.) в соответствующих дозах, рассчитанных на основе массы тела мышей непосредственно перед введением. Тестируемые вещества вводили один раз в неделю, в общей сложности 3 раза (сутки 0, 7 и 14), а аутопсию проводили на 15-е сутки.

[188]

[189] 4) Объекты наблюдения и обследования

[190] Клинические симптомы регистрировали один раз в сутки в течение периода проведения испытаний, и во время введения лекарства, объем опухоли измеряли три раза в неделю. После завершения испытаний животных обезболивали изофлураном, а затем обескровливали. Опухолевые ткани иссекали у каждого индивидуума. Вырезанные опухоли взвешивали и фотографировали. Размеры опухоли по длинной и короткой оси измеряли с помощью штангенциркуля (Mitutoyo Corp., номер модели: CD-15CPX, Япония), а объем опухоли рассчитывали в соответствии с уравнением 1, приведенным ниже.

[191] Уравнение 1

[192] Объем опухоли=(короткая ось)²×длинная ось×0.5

[193]

[194] 5) Статистика

[195] Был проведен статистический анализ результатов испытаний с помощью теста Манна-Уитни с использованием коммерческой статистической программы (IBM SPSS statistics версии 19.0).

[196]

[197] 3-3. Результаты проведения испытания

[198] 1) Масса тела

[199] Измерение массы тела на 15-е сутки (день аутопсии) введения тестируемого вещества суммированы в таблице 6 и на фиг. 5

[209] Когда мыши были приобретены и разделены на группы, среди них не наблюдалось значительной разницы в массе тела. На 15-е сутки (день аутопсии) введения тестируемых веществ наблюдалась потеря массы тела в группах G4 (Доцетаксел+Иринотекан HCI) и G6 (Доцетаксел+SNB-101). На 15-е сутки в комбинированных группах наблюдалось значительное снижение массы тела по сравнению с контрольной группой G1, получавшей носитель (инъекция 5% р-ра глюкозы), а также с группами, получавшими по одному веществу, G2 (доцетаксел), G3 (иринотекан HCI) и G4 (SNB-101). Ни в одной из групп, которым вводили тестируемые вещества (G2-G6), не наблюдалось снижения массы тела более чем на 20% по сравнению с G1 (группа, получавшая носитель), что указывает на то, что ни в одной из тестируемых групп не было достигнуто критически низкой массы тела (фиг. 5).

[210]

[211] 2) Измерение объема опухоли

[212] Результаты измерения объемов опухолей рака поджелудочной железы суммированы в таблице 7 и представлены на фиг. 6.

[223] Объем опухоли рака желудка продолжал увеличиваться в группе, получавшей носитель (G1) и в группе, получавшей только наб-паклитаксел (G2; 5 мг/кг), в течение 22 суток после разделения по группам, при этом рост опухоли был выше по сравнению с другими группами.

[224] По сравнению с контрольной группой G1, получавшей носитель, объем опухоли значительно уменьшился в G4 (комбинация доцетаксел+иринотекан HCI), G5 (только SNB-101) и G6 (комбинация доцетаксел+SNB-101) с 7-х суток и во всех группах положительного контроля (G2, G3 и G4) и группах тестируемых веществ (G5 и G6) на 15-е сутки.

[225] Начиная с 11-х суток в группе G4 (группа, получавшая комбинацию доцетаксел+иринотекан HCI) объем опухоли уменьшился по сравнению с G2 (группа, получавшая только доцетаксел) со статистической значимостью, а в группе G6 (группа, получавшая комбинацию доцетаксел+SNB-101) значительно уменьшился объем опухоли с 8-х суток по сравнению с G2 (группа, получавшая только доцетаксел) и G3 (группа, получавшая только иринотекан-HCI).

[226]

[227] 3) Измерение массы опухоли

[228] Результаты измерения массы опухоли суммированы в таблице 8 ниже и представлены на фиг.7

[241] Опухоли вырезали и взвешивали, и, как показано в Таблице 8 и на Фиг. 7, масса опухоли значительно снизилась во всех группах положительного контроля (G2, G3 и G4), в группе, получавшей одно тестируемое вещество (G5) и в группе, получавшей комбинацию (G6), по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, G1. Также наблюдалось значительное снижение массы опухоли в группах G4 (комбинация доцетаксел+иринотекан HCI), G5 (только SNB-101) и G6 (комбинация доцетаксел+SNB-101) по сравнению с G2 (только доцетаксел). Кроме того, в группе, получавшей только SNB-101, и в группе, получавшей комбинацию доцетаксел+SNB-101, наблюдалось значительное снижение массы опухоли по сравнению с группой, получавшей только иринотекан HCl.

[242] Как было продемонстрировано на ксенотрансплантантных моделях с использованием клеточной линии рака желудка Hs746T в условиях испытаний, все вещества положительного контроля G2 (5 мг/кг/сутки доцетаксела), G3 (60 мг/кг/сутки только иринотекан HCI), G4 (комбинация доцетаксела 5 мг/кг/сутки+60 мг/кг/сутки иринотекан HCl) и тестируемые вещества G5 (20/31,8 мг/кг/сутки (в виде SN-38/иринотекан HCI)) SNB-101 отдельно) и G6 (Доцетаксел в дозе 5 мг/кг/сутки+20/31,8 мг/кг/сутки (в виде комбинации SN-38/Иринотекан HCI) SNB-101) были эффективны для ингибирования роста опухоли, причем более высокая ингибирующая активность наблюдалась в группах, получавших комбинацию (G4 и G6), чем в группах положительного контроля, получавших по одному веществу (G2 и G3).

[243]

[244] ПРИМЕР 4: эффект совместного введения наночастиц (SNB-101) на рак молочной железы и рак легкого

[245]

[246] 4-1. Материал для проведения эксперимента

[247] В качестве веществ для проведения испытаний использовали 5% раствор глюкозы для инъекций, доцетаксел (TaxotereTM, Sanofi-Aventis Korea) и композицию наночастиц (обозначенную как SNB-101), включающую SN-38 и гидрохлорид иринотекана. Доцетаксел был приобретен у Sanofi-Aventis Korea и использовался в форме лиофилизированного препарата для инъекций в дозе 20 мг/флакон.

[248] Композиция наночастиц (SNB-101), содержащая SN-38 и гидрохлорид иринотекана, используемая в настоящем изобретении, представляет собой стабильный препарат наночастиц для инъекций, а способ ее получения изложен в корейском патенте №10-2094543. Препарат для внутривенной инъекции SNB-101 содержал 10 мг SN-38 и 15,9 мг гидрохлорида иринотекана на флакон. Перед использованием инъекцию можно развести в 9,64 мл 5% раствора декстрозы для инъекций USR и разведенный препарат можно вводить в течение 90 минут.

[249]

[250] 4-2. Способ проведения испытания

[251] 1) Культура клеточной линии рака молочной железы (MDA-MB-231) и клеточной линии рака легкого (А549).

[252] В качестве клеточных линий рака молочной железы и рака легкого для ксенотрансплантных моделей использовались MDA-MB-231 и А549 соответственно. Замороженные клетки MDA-MB-231 и А549 размораживали и культивировали в среде RPMI1640 - 10% FBS - 1% пенициллин-стрептомицин и среде RPMI1640 - 5% FBS - 1% пенициллин-стрептомицин, соответственно, при 37°С в атмосфере 5% CO2. Размороженные клетки культивировали в течение одной недели или дольше с проведением пассажей каждые два или три дня. Клетки анализировали на жизнеспособность (трипановый синий) и инфицированность бактериями и дрожжами (изображения клеток) и микоплазмой (набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert). Для трансплантации использовали клетки, которые не были инфицированы и имели жизнеспособность 90% или выше, измеряемую окрашиванием трипановым синим.

[253]

[254] 2) Индукция ксенотрансплантата рака молочной железы и легкого на мышиной модели

[255] Животные, используемые в данном исследовании, представляли собой мышей-самцов линии BALB/c nu/nu (возраст около 5 недель, средний вес 19 г±20%), которые широко используются для животных моделей ксенотрансплантации и акклиматизируются в течение примерно 5-7 суток после покупки. В день инокуляции культивированные раковые клетки промывали фосфатно-солевымбуфером (PBS, рН 7,4) и трипсинизировали смесью из 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА для отделения клеток. Клетки собирали путем кратковременного центрифугирования (3 минуты, 1500 об/мин), разводили в PBS, а затем подкожно вводили в дозе 5×10⁶ клеток/0,2 мл на животное в правый бок мыши, и подтверждалось, что суспензия опухолевых клеток не вытекала из места инъекции.

[256]

[257] 3) Разделение на группы и дозирование, место инъекции и способ инъецирования

[258] Мышей разделяли на группы, исходя из среднего объема опухоли рака желудка 90-105 мм³ с использованием метода парного сопоставления, а контрольная и тестируемая группы и дозы для них приведены в таблицах 9 и 10.

[269] Объем опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю (с интервалом 3 или 4 суток) от момента разделения на группы до окончания испытаний и строиликривую роста опухоли от момента начала введения лекарственных средств до окончания проведения испытаний.

[270] При обнаружении тяжелого некроза и потери массы тела испытание прекращали путем эвтаназии в соответствии с правилами Комитета по экспериментальной этике животных (IACUC) по согласованию со спонсором, а опухоль удаляли и визуализировали.

[271]

[272] 4-3. Результат проведения испытаний на ксенотрансплантной модели MDA-MB-231 рака молочной железы

[273] 1) Измерение объема опухоли и анализ результатов.

[274] По сравнению с G1 (носитель), эффективность ингибирования роста опухоли в группах G2 (только доцетаксел) или G3 (только SNB-101) и G4 (комбинация SNB-101+доцетаксел) измеряли в конце эксперимента (35 суток после введения лекарственного средства).

[275] Средние объемы опухолей в группах G1 (носитель), G2 (доцетаксел), G3 (SNB-101) и G4 (SNB-101+доцетаксел) составляли 1662,48 мм³, 1228,93 мм³, 657,30 мм³ и 364,10 мм³ соответственно. Совместное введение (G4) было более эффективным в ингибировании образования опухоли, чем введение одного лекарственного средства (G2, G3). Результаты показаны на фиг.9 ниже.

[276]

[277] По окончании эксперимента относительное ингибирование роста опухоли

(TGI) к носителю рассчитывали с использованием следующего уравнения.

[278] Уравнение 2

[279] Ингибирование роста опухоли (TGI) (%)={1-(_ΔТ/_ΔС)}×100

[280] TGI для каждой группы изложен в Таблице 11.

[283] Как показано в Таблице 11, относительное TGI в сравнении с носителем составляло 27,6% в группе, получавшей только доцетаксел (G2), 64,0% в группе, получавшей только SNB-101 (G3), и 82,6% в группе, получавшей комбинацию SNB-101+доцетаксел (G4). Из приведенных выше результатов понятно, что синергический эффект проявляется при совместном введении SNB-101 и доцетаксела по настоящему изобретению в клетки рака молочной железы.

[284]

[285] 2) Результат измерения массы тела

[286] Результаты измерения массы тела для каждой группы приведены на фиг. 10 ниже.

[287] Масса тела в группах, получавших носитель, доцетаксел, SNB-101 и SNB-101+доцетаксел составляла 19,70 г, 19,63 г, 20,99 г и 21,46 г соответственно в начале введения лекарственного средства (нулевые сутки) и 22,46 г, 20,25 г, 22,43 г и 19,37 г соответственно в конце проведения испытания (35-е сутки). То есть скорость потери массы не превышала 20%, что свидетельствует о том, что мыши не достигли критической минимальной массы тела.

[288]

[289] 3) Заключение

[290] В совокупности данные показывают, что комбинация SNB-101+доцетаксел (G4) оказывает превосходное ингибирующее действие на рост опухоли по сравнению с доцетакселом (G2) и SNB-101 (G3) на ксенотрансплантантных моделях клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231.

[291]

[292] 4-4. Результат проведения испытания на ксенотрансплантантной модели рака легкого А549

[293] 1) Измерение объема опухоли и анализ результатов.

[294] Эффективность ингибирования роста опухоли в группах G2 (только доцетаксел) или G3 (только SNB-101) и G4 (комбинация SNB-101+доцетаксел) в сравнении с G1 (носитель) измеряли в конце эксперимента (37 суток после введения лекарственного средства).

[295] Средние объемы опухолей в группах G1 (носитель), G2 (доцетаксел), G3 (SNB-101) и G4 (SNB-101+доцетаксел) составляли 704,10 мм³, 402,70 мм³, 557,60 мм³ и 181,08 мм³ соответственно. Совместное введение (G4) было более эффективным в ингибировании образования опухоли, чем введение одного лекарственного средства (G2, G3). Результаты представлены на фиг. 11 ниже.

[296]

[297] В конце эксперимента относительное ингибирование роста опухоли (TGI) к носителю рассчитывали с использованием следующего уравнения.

[298] Уравнение 2

[299] Ингибирование роста опухоли (TGI)(%)={1-(_ΔТ/_ΔС)}×100

[300] TGI для каждой группы представлен в Таблице 12.

[303] Как показано в таблице 12, относительное TGI к носителю составляло 50,0% в группе, получавшей только доцетаксел (G2), 24,3% в группе, получавшей только SNB-101 (G3), и 86,7% в группе, получавшей комбинацию SNB-101+доцетаксел. (G4).

[304] Из приведенных выше результатов понятно, что синергический эффект проявляется при совместном введении SNB-101 и доцетаксела по настоящему изобретению ксенотрансплантатным моделям клеточной линии рака легкого А549.

[305]

[306] 2) Результат измерения массы тела

[307] Результаты измерения массы тела для каждой группы приведены на фиг.12 ниже.

[308] Масса тела в группах, получавших носитель, доцетаксел, SNB-101 и SNB-101+доцетаксел составляла 17,86 г, 17,93 г, 18,04 г и 18,68 г соответственно в начале введения лекарственного средства (сутки 0) и 20,19 г. г, 19,10 г, 19,79 г и 17,97 г соответственно в конце проведения испытания (37-е сутки). То есть скорость потери массы тела не превышала 20%, что свидетельствует о том, что мыши не достигли критической минимальной массы тела.

[309]

[310] 3) Заключение

[311] В совокупности данные показывают, что комбинация SNB-101+доцетаксел (G4) оказывает превосходное ингибирующее действие на рост опухоли по сравнению с доцетакселом (G2) и SNB-101 (G3) в ксенотрансплантатных моделях клеточной линии рака легкого А549.

[312]

[313] ПРИМЕР 5: Синергический эффект совместного введения наночастиц (SNB-101) и бевацизумаба (торговое наименование: Авастин) при лечении колоректального рака

[314] Был проведен эксперимент для оценки терапевтического синергического эффекта комбинации с бевацизумабом, который представляет собой моноклональное антитело и целевое противораковое лекарственное средство, на кол о ректальный рак.

[315]

[316] 5-1. Способ проведения испытания

[317] 1) Экспериментальное животное

[318] Всего было получено 150 бестимусных мышей BALB/c (5-недельные самцы) и акклиматизировано в течение примерно одной недели перед трансплантацией клеток колоректального рака НТ-29 в подкожную область правого бедра. Черезсемь суток после трансплантации было отобрано 50 мышей на основе объема опухоли и разделено на пять групп по 10 особей.

[319]

[320] 2) Трансплантация опухолевых клеток

[321] НТ-29 (KCLB №300038, Корейский банк клеточных линий), клетки колоректального рака человека, поддерживали пассированием в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 100 МЕ/мл пенициллина/стрептомицина при 37°С в инкубаторе с 5% CO2. Суспензию опухолевых клеток плотностью 3,0×10⁶ клеток/0,1 мл трансплантировали в дозе 0,1 мл в подкожную область правого бедра мышей для формирования массы солидной опухоли.

[322]

[323] 3) Разделение на группы

[324] Через восемь суток после трансплантации клеток колоректального рака НТ-29 мышей отбирали, исходя из объема опухоли и случайным образом делили на 5 групп (10 мышей/группа). Группа введения лекарственного средства была задана, как показано в Таблице 13 ниже.

[328] 4) Введение лекарственного средства

[329] Тестируемые вещества SNB-101 и бевацизумаб (5 мг/кг) вводили по отдельности или в комбинации всего три раза в один и тот же день (сутки 1, 4 и 7). SNB-101 вводили внутривенно в дозах, рассчитанных на основе массы тела индивидуумов, тогда как бевацизумаб вводили внутрибрюшинно. Вскрытие проводили на 28-е сутки. В качестве носителя для контроля аналогичным образом вводили 5% раствор декстрозы в дозе 10 мл/кг.

[330]

[331]5-2. Результаты проведения испытания

[332]Результаты проведения испытания выражены в виде среднего±S.D в таблице 14 ниже

[335] Как показано в Таблице 14, был выявлен превосходный синергический терапевтический эффект на кол о ректальный рак у комбинации SNB-101 и бевацизумаба (G5) по сравнению с группами, где вводили SNB-101 (G2) и бевацизумаб (G3) по отдельности. График роста опухоли, соответствующий данным таблицы 14, изображен на фиг. 13. Статистическую значимость различий в объеме опухоли в разное время между группами анализировали с помощью двустороннего дисперсионного анализа с критерием множественного сравнения Холма-Сидака (*, Р<0,05; **, Р<0,01; ***, Р<0,001, ns: несущественно).

[336]

[337] ПРИМЕР 6: Синергический эффект совместного введения наночастиц (SNB-101), наб-паклитаксела и гемцитабина при лечении рака поджелудочной железы

[338]

[339] 6-1. Материал для проведения эксперимента

[340] Мыши BALB/c-nu (Orient Bio, Центр Гапен), самцы, возраст 6 недель.

[341] Клеточная линия рака поджелудочной железы AsPC-1 (АТСС, кат.номер CRL-1682).

[342] Тестируемое лекарственное средство: SNB-101 (SN-38 10 мг, иринотекана HCl⋅3H2O 15,9 мг/флакон), наб-паклитаксел (Gelgene Korea, Abraxane, №партии 6200676 А), гемцитабин (Korea Lilly, №партии186053 А).

[343] Носитель: 5% раствор глюкозы для инъекций, 50 мл (CJ Healthcare, код страхования 640001361).

[344] Среда RPMI1640 (Gibco, А10491-01) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Кат.№16000).

[345] 1% пенициллин-стрептомицин (Gibco, кат.№15140122).

[346] Трипсин-ЭДТА (Gibco, кат.№25200-072).

[347] Cold-DPBS (гиклон, кат.№SH30258.02).

[348] Трипановый синий (Gibco, кат.№15250061).

[349] Набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert (LONZA, кат.номер LT-07-318).

[350] Чашка для клеточных культур диаметром 150 мм, конические пробирки, пипетки.

[351] Ушная бирка для мыши, шприц, штангенциркуль.

[352]

[353] 6-2 Способ проведения испытания

[354] Линию клеток рака поджелудочной железы AsPC-1, предоставленную Инфраструктурным центром расстройств пищеварения Т2 В (NCEED), культивировали при 37°С в среде RPMI1640-10% FBS- 1% пенициллин-стрептомицин в атмосфере 5% CO2. Размороженные клетки культивировали в течение одной недели или дольше, с пассажами каждые 2-3 суток. Клетки анализировали на жизнеспособность (трипановый синий) и инфицированность бактериями и дрожжами (изображения клеток) и микоплазмой (набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert). Для трансплантации использовали клетки, которые не были инфицированы и имели жизнеспособность 90% или выше, измеряемую окрашиванием трипановым синим. Клетки подвергали флоатингу с использованием трипсина-ЭДТА и суспендировали в холодном PBS. Клетки AsPC-1 имплантировали подкожно в дозе 5×10⁶ клеток/200 мкл в правое бедро мышам BALB/c-nu. Периодически осуществляли мониторинг мышей на образование и рост опухоли, а объем опухоли рассчитывали, используя измеренные значения длины опухоли в соответствии со следующим уравнением.

[355] [Объем опухоли=(a²b)/2, короткий диаметр, b длинный диаметр]

[356] Когда средний объем опухоли у всех мышей в сутки введения составлял 123,6 мм³, их группировали методом парного сопоставления. За мышами в каждой группе наблюдали в течение 2 недель после введения лекарственного средства по схеме приема, представленной в таблице 15 ниже.

[360] Объем и массу опухоли измеряли два раза в неделю (с интервалом 3 или 4 суток) от момента разделения на группы до окончания проведения испытания, а степень ингибирования роста опухоли оценивали с момента начала введения лекарственного средства до окончания проведения испытания.

[361]

[362] 6-3. Результат проведения испытания

[363] По состоянию на конец эксперимента относительное ингибирование роста опухоли (TGI) к носителю рассчитывали с использованием уравнения 2.

[364] TGI для каждой группы показан в Таблице 16.

[366] Как показано в Таблице 16, относительное TGI к носителю составляло 72,5% в группе, получавшей только SNB-101 (G2), и 56,3% в группе, получавшей наб-паклитаксел+гемцитабин (G3). Напротив, относительное TGI составило 83,4% в группе, получавшей комбинацию SNB-101+наб-паклитаксел+гемцитабин (G4), что указывает на то, что совместное введение SNB-101+наб-паклитаксела+гемцитабина оказывает превосходный синергический эффект при лечении рака поджелудочной железы.

[367] Кроме того, ни в одной из групп не наблюдалось явных побочных эффектов, потери массы тела, серологической токсичности.

[368]

[369] ПРИМЕР 7: Синергический эффект комбинации наночастиц (SNB-101) и радиации при лечении колоректального рака и рака легкого

[370]

[371] 7-1. Материал для проведения эксперимента

[372] Мыши BALB/c-nu (JoongA Bio), самцы, возраст 6 недель.

[373] Клеточная линия мел ко клеточного рака легкого NCI-H69 (АТСС, кат. номер НТВ-119).

[374] Клеточная линия немелкоклеточного рака легкого А549 (АТСС, кат. номер CCL-185).

[375] Клеточная линия колоректального рака НСТ116 (АТСС, кат. №CCL-247)

[376] Тестируемое лекарственное средство: SNB-101 (SN Bioscience Inc., SN-3810 мг, иринотекана HCl-3H2O 15,9 мг/флакон).

[377] Носитель: 5% раствор глюкозы для инъекций, 50 мл (CJ Healthcare, страховой код 640001361).

[378] Среда RPMI1640 (Gibco, 22400-089), F12K (Gibco, 21127-022), McCoy's 5А (Gibco, 16600-082) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Кат. №16000).

[379] 1% антибиотик-антимикотик (Gibco, кат. №15240-062).

[380] Трипсин-ЭДТА (Gibco, кат.№25200-072).

[381] Cold-DPBS (Gibco, кат. №14200-075).

[382] Трипановый синий (Gibco, кат. №15250061).

[383] Набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert (LONZA, кат. №LT-07-318).

[384] Чашка для культивирования клеток диаметром 150 мм, конические пробирки, пипетки.

[385] Ушная бирка для мыши, шприц, штангенциркуль.

[386]

[387] 7-2. Способ проведения испытания

[388] Замороженные клеточные линии NCI-H69 (мелкоклеточный рак легкого), НСТ116 (кол о ректальный рак) и А549 (немелкоклеточный рак легкого), предоставленные Инфраструктурным центром расстройств пищеварения Т2 В (NCEED), были разморожены и каждую из них культивировали, при 37°С в среде RPM11640-10% FBS- 1% пенициллин-стрептомицин в атмосфере 5% CO₂. Размороженные клетки культивировали в течение одной недели или дольше с пассажами каждые 2-3 суток. Клетки анализировали на жизнеспособность и инфицированность бактериями, дрожжами и микоплазмой (набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert). Для трансплантации использовали клетки, которые не были инфицированы и имели жизнеспособность 90% или выше, измеренную окрашиванием трипановым синим. Клетки подвергали флоатингу с использованием трипсина-ЭДТА и суспендировали в холодном PBS. В правое бедро мышей BALB/c-nu осуществляли подкожную трансплантацию клеток NCl-Н69 в дозе 1×10⁷ клеток/100 мкл, а также клеток А549 и клеток НСТ116 в дозе 1×10⁶ клеток/50 мкл. Осуществляли периодически мониторинг мышей на предмет образования и роста опухоли, а объем опухоли рассчитывали с использованием измеренных значений длины опухоли в соответствии со следующим уравнением.

[389] [Объем опухоли=(a²b)/2, короткий диаметр, b длинный диаметр]

[390] Когда средний объем опухоли у всех мышей в сутки введения составлял 100±20 мм³, их группировали методом парного сопоставления. За мышами в каждой группе наблюдали в течение 2-3 недель после введения лекарственного средства по схеме введения, представленной в таблицах 17 и 18 ниже.

[391] NCI-H69 и НСТ116 осуществляли введение по одному разу в неделю в течение одной недели, тогда как А549 осуществляли введение пять раз с частотой две инъекции в неделю. После введения лекарственного средства измеряли объем опухоли и массу тела в модели НСТ116 до 21-х суток, в модели NCI-H69 до 38-х суток и в модели А549 до 45-х суток.

[392]

[393] [общее для ксенотрансплантантной модели NCI-H69 (мелкоклеточный рак легкого), НСТ116 (кол о ректальный рак)]

[397] [общее для ксенотрансплантантной модели А549 (немелкоклеточный рак легкого).

[405] 7-3. Результат проведения испытания

[406] По состоянию на конец эксперимента относительное ингибирование роста опухоли (TGI) к носителю рассчитывали с использованием уравнения 2.

[407]

[408] Для NCl-H69 в каждой группе значения TGI представлены в Таблице 19.

[409] Изменения объема опухоли представлены на графике на фиг. 14.

[410] Изображения удаленных опухолей представлены на фиг. 15.

[412] Для НСТ116 значения TGI в каждой группе представлены в Таблице 20.

[413] Изменения объема опухоли представлены на графике фиг. 16.

[414] Изображения удаленных опухолей представлены на фиг. 17.

[416] Для А549 значения TGI в каждой группе представлены в Таблице 21.

[417] Изменения объема опухоли представлены на графике на фиг. 18.

[419] Как показано в Таблицах 19-21, относительное TGI к наполнителю было значительно выше в группе, получавшей комбинированное лечение SNB-101 и облучением (G4), чем в группе, получавшей только SNB-101 (G2) и только облучение (G3). Из представленных данных становится ясно, что комбинированное лечение SNB-101 и облучением оказывает превосходный синергический эффект при лечении рака толстой кишки и рака легкого.

[420] Кроме того, ни в одной из групп не наблюдалось явных побочных эффектов,

потери массы тела, серологической токсичности.

[421]

[422] В совокупности данные, полученные в примерах 2-7, показывают, что можно достигнуть значительных синергических эффектов при лечении раковых заболеваний, когда наночастицы по настоящему изобретению комбинируются с другими средствами или лучевой терапией, как изложено в Таблице 22 ниже.

Настоящее изобретение относится к применению наночастиц, содержащих плохо растворимые соединения на основе камптотецина, для лечения рака и комбинированной терапии с их использованием вместе с противоопухолевым средством. Фармацевтическая композиция, содержащая наночастицы по настоящему изобретению, демонстрирует синергический эффект в лечении рака при использовании в комбинации с противоопухолевым средством и, как таковая, может без труда использоваться в качестве терапевтического средства против рака и препарата для комбинированной терапии. 7 н. и 4 з.п. ф-лы, 18 ил., 22 табл., 7 пр.

1. Фармацевтическая комбинация для лечения рака поджелудочной железы, содержащая в качестве активного ингредиента:

частицы, содержащие SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин), иринотекан и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока; и

наппаклитаксел, гемцитабин или их комбинацию;

где амфифильный блок-сополимер состоит из блоков А-В или блоков А-В-А, где (а) А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер; и (b) В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D,L-лактид, поли(лактид-со-гликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир или их производное.

2. Фармацевтическая комбинация для лечения рака желудка, рака молочной железы или рака легкого, содержащая в качестве активного ингредиента:

частицы, содержащие SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин), иринотекан и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока; и

доцетаксел;

где амфифильный блок-сополимер состоит из блоков А-В или блоков А-В-А, где (а) А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер; и (b) В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D,L-лактид, поли(лактид-со-гликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир или их производное.

3. Фармацевтическая комбинация для лечения рака толстой кишки, содержащая в качестве активного ингредиента:

частицы, содержащие SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин), иринотекан и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока; и

бевацизумаб;

где амфифильный блок-сополимер состоит из блоков А-В или блоков А-В-А, где (а) А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер; и (b) В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D,L-лактид, поли(лактид-со-гликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир или их производное.

4. Фармацевтическая комбинация по любому из пп. 1-3, где частицы имеют средний диаметр от 2 до 200 нм.

5. Способ лечения рака поджелудочной железы, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся во введении,

(i) первой фармацевтической композиции, содержащей частицы, содержащие SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин), иринотекан и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока, где амфифильный блок-сополимер состоит из блоков А-В или блоков А-В-А, где (а) А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер; и (b) В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D,L-лактид, поли(лактид-со-гликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир или их производное; в комбинации со

(ii) второй фармацевтической композицией, содержащей наппаклитаксел, гемцитабин или их комбинацию в качестве активного ингредиента.

6. Способ лечения рака желудка, рака молочной железы или рака легкого, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся во введении,

(i) первой фармацевтической композиции, содержащей частицы, содержащие SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин), иринотекан и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока, где амфифильный блок-сополимер состоит из блоков А-В или блоков А-В-А, где (а) А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер; и (b) В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D,L-лактид, поли(лактид-со-гликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир или их производное; в комбинации со

(ii) второй фармацевтической композицией, содержащей доцетаксел в качестве активного ингредиента.

7. Способ лечения рака толстой кишки, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся во введении,

(i) первой фармацевтической композиции, содержащей частицы, содержащие SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин), иринотекан и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока, где амфифильный блок-сополимер состоит из блоков А-В или блоков А-В-А, где (а) А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер; и (b) В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D,L-лактид, поли(лактид-со-гликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир или их производное; в комбинации со

(ii) второй фармацевтической композицией, содержащей бевацизумаб в качестве активного ингредиента.

8. Способ лечения рака толстой кишки или рака легкого, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся во введении,

(i) фармацевтической композиции, содержащей частицы, содержащие SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин), иринотекан и амфифильный блок-сополимер, состоящий из гидрофобного блока и гидрофильного блока, где амфифильный блок-сополимер состоит из блоков А-В или блоков А-В-А, где (а) А представляет собой гидрофильный полимер, который представляет собой монометоксиполиэтиленленгликоль, диметоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, монометоксиполипропиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакриловую кислоту или ее полимер; и (b) В представляет собой гидрофобный полимер, который представляет собой полимолочную кислоту, поли-L-лактид, поли-D-лактид, поли-D,L-лактид, поли(лактид-со-гликолид), полигликолевую кислоту, полигликолид, сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, полиминдальную кислоту, поликапролактон, полидиоксан-2-он, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиорнитин, полиортоэфир или их производное; в комбинации с

(ii) противоопухолевой лучевой терапией.

9. Способ по пп. 5-7, где первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию вводят одновременно, по отдельности или последовательно.

10. Способ по пп. 5-7, где первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию вводят в виде составного препарата или одного препарата.

11. Способ по пп. 5-7, где частицы имеют средний диаметр от 2 до 200 нм.