Способ получения белково-фосфатного комплекса из фасоли, обладающего ингибиторной активностью по отношению к α-амилазам Российский патент 2024 года по МПК A61K36/48 C07K1/02 C07K1/14 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения белково-фосфатного комплекса из бобовых культур - ингибитора α-амилаз.

Белковые вещества из бобового сырья, в частности, из семян фасоли обыкновенной обладают высокой биологической активностью по отношению к амилазам растительного и грибного происхождения (Яруллина Л.Г. Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы в регуляции взаимоотношений растений с патогенами. Физиология растений. 2016. Т. 63. №2. С.205-217). Они могут быть использованы в биотехнологии для получения биопрепаратов, пищевых добавок с целью ингибирования амилолитических ферментов различных организмов и регуляторов роста клеточных культур.

Известен способ получения белкового продукта из бобового сырья, где экстрагируют источник бобового белка водным раствором соли кальция для солюбилизации бобового белка и для получения водного раствора бобового белка. Отделяют раствор бобового белка для удаления более мелких остаточных твердых веществ, не удаленных на исходном этапе отделения. Промывают более мелкие твердые вещества, извлеченные на втором этапе отделения для удаления примесей. Сушат промытые более мелкие твердые вещества, извлеченные на втором этапе отделения для получения продукта из бобового белка с содержанием белка, по меньшей мере, 50 мас. % (N х 6,25) с. в (RU2727479, A23J1/14, A23J3/14, опубл.21.07.2020).

Однако применение высоких температур (от 15°С до 65°С) при солюбилизации белка, может приводить к снижению биологической активности получаемых продуктов. Также применение таких кислот как соляная и фосфорная в экстракции может приводить к гидролизу белков, что существенно влияет на выход целевого продукта. Также при взаимодействии с соляной кислотой образуются побочные продукты, известные как хлоргидрины, то есть хлорпропанол и диоловые соединения, которые могут вызывать проблемы со здоровьем.

Известен способ получения белкового продукта из бобовых с применением экстракции хлоридом кальция. Экстрагируют из источника бобового белка водным раствором соли кальция для солюбилизации и образования водного раствора белка бобовых. Отделяют водный раствор белка бобовых от остального материала источника белка бобовых. Концентрируют с использованием селективной мембраны водного раствора белка бобовых при поддержании в основном постоянной ионной силы. Диафильтруют сконцентрированный раствор белка бобовых и высушивают раствор белка бобовых (RU, №2715596, A23J1/14, A23J3/14, опубл.02.03.2020).

Однако такой способ производства характеризуется наличием большого количества стадий, что влияет на энергозатраты. Также возникает сложность поддержания постоянной ионной силы раствора белка, чтобы белок не перешел в изоэлектрическое состояние и не перешел в раствор.

Известны композиции и способы контроля вредителей растений, включающие в частности молекулу нуклеиновой кислоты для экспрессии инсектицидного белка Cry, а также конструкции, вектор, клетку, трансгенное растение и семя, содержащие вышеуказанную молекулу. Также раскрыты синтетические полинуклеотиды, которые кодируют инсектицидные белки Cry, являющиеся токсичными для вредителя, относящегося к чешуекрылым, а также способ его получения. Изобретение позволяет эффективно бороться с чешуекрылым вредителем, выбранным из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostriniarmbilalis), совки травяной (Spodopterafrugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpazea), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsiagemmatalis), соевой совки (Chrysodeixisincludes) и табачной совки (Heliothisvirescens).(RU, №2759224, С07К14/325, C12N15/82, C12N15/75, опубл.11.11.2021).

Однако при таком способе используются методы генной инженерии, в частности, экспрессия полинуклеотидов. Метод характеризуется дороговизной и малодоступностью.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения соевого белкового продукта, который включает такие стадии, как измельчение соевых бобов в горячем водном растворе при температуре 80-84°С, разделение суспензии на растворимую и нерастворимую фракции, дополнительный нагрев растворимой фракции до температуры 120-140°С с выдержкой не более 80 с и последующей дезодорацией ее в вакууме при резком охлаждении до 65-75°С. Преобразование растворимой фракции в готовый продукт осуществляют после ее пастеризации путем коагуляции 40%-ным водным раствором хлористого кальция при температуре 95-97°С, или 7%-ным раствором лимонной кислоты при температуре 92°С, или с введением в соевый белок специй и/или сушеной зелени петрушки, укропа и др. (RU, №2185074, A23J1/14, A23L1/20, опубл. 20.07.2002).

Однако для этого способа характерны повышенные трудо- и энергозатраты в процессе получения белкового продукта.

Фасоль является доступным растительным сырьевым материалом и характеризуется большим количеством белковых веществ (до 40% (Гагарина И.Н. «Белковый комплекс семян фасоли и испытание биологической активности его компонентов», дис. На соиск. к.х.н.,03.00.23, 2009. С.147)) по сравнению с горохом (не более 30%) или соей (не более 35%). Также у гороха содержание ингибиторов амилаз значительно ниже по сравнению с другими культурами.

В процессе получения белково-фосфатного комплекса из фасоли используются фосфатные соединения, которые быстро связываются с белками, в результате чего образуется комплекс с гидрофильными свойствами. Фосфатный буфер включает в себя одно- и двузамещенный фосфорнокислый натрий. Буфер не смещает рН среды, не вызывает деградацию белков и обеспечивает эффективное экстрагирование. Для получения белкового концентрата без содержания фосфатов необходимо производить дополнительную очистку, например, в виде диализа. Это является экономически не выгодным, поскольку приводит к удорожанию конечного продукта и к снижению растворимости получаемого белкового продукта.

Технической проблемой, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание способа получения белково-фосфатного комплекса - ингибитора α-амилаз из фасоли.

Техническим результатом является достижение максимального выхода целевого продукта - белково-фосфатного комплекса и сохранение его биологической активности.

Техническая проблема решается и технический результат достигается за счет того, что способ получения белково-фосфатного комплекса из бобов фасоли обыкновенной, обладающего ингибиторной активностью по отношению к α-амилазам, включает измельчение бобов фасоли в мельнице до состояния муки, просеивание через сито с диаметром отверстий 1 мм, экстрагирование белковых веществ в ультразвуковой ванне с параметрами 95 В, 50/60 Гцс использованием фосфатного буферного раствора с рН 8 в течение 15 минут при соотношении фасолевая мука: буферный раствор 1:15, центрифугирование при 4000 об/мин при температуре 5°С в течение 5 минут, вакуум-фильтрование, осаждение белково-фосфатного комплекса охлажденным ацетоном в соотношении 1:2, вторичное вакуум-фильтрование, промывание охлажденным диэтиловым эфиром в количестве 7,5 мл на 1 г сырья, сушку белково-фосфатного комплекса.

Просеивание фасолевой муки через сито с диаметром отверстий 1 мм необходимо для того, чтобы отделить посторонние включения и крупные немолотые частицы, следовательно, будет достигнуто наиболее полное экстрагирование белков из навески фасолевой муки. Если использовать диаметр отверстий больше 1 мм, то будет загрязнение общей массы крупными частицами и снизится выход белка в раствор из-за снижения диффузии экстрагента в твердую фазу.

Использование ультразвуковой ванны с параметрами 95 В, 50/60 Гц необходимо для того, чтобы интенсифицировать процесс экстрагирования белков из фасолевой муки и уменьшения время процесса. Под действием кавитации происходит разрушение растительной клеточной стенки и благодаря этому, белковые вещества в большем количестве высвобождаются из клетки и попадают в экстрагент - фосфатный буфер.

Использование фосфатного буферного раствора с рН 8 необходимо для того, чтобы в процессе экстрагирования полностью извлекались из фасолевой муки белковые вещества. При снижении рН и повышении рН происходит уменьшение количества белковых веществ на выходе. Так при рН 7 выход уменьшился на 8%, а при рН 9 - на 5%.

По окончании процесса экстрагирования образуется суспензия, содержащая белковые вещества, фосфатный буфер и растительный жмых, который состоит из крахмала, целлюлозы, гемицеллюлозы и других не растворимых в воде веществ. Для разделения жидкой и твердой фаз необходимо проводить центрифугирование при температуре 5°С при 4000 об/мин (Сильченко В.А. Разработка технологии выделения ингибиторов пищевых ферментов из растительного сырья для создания диагностических препаратов. Вестник Тверского государственного технического университета, вып.31, 2017. С.138-142). Время центрифугирования менее 5 минут приводят к снижению выхода белка и появлению в целевом продукте крахмала, при увеличении времени процесса более 5 минут происходит снижение выхода белка за счет осаждения пептидов с высокой молекулярной массой вместе с крахмалом. Предлагаемые условия учитывают изменения, происходящие с крахмалом под воздействием ультразвука при процессе экстракции и с белково-фосфатным комплексом при осаждении ацетоном. Ультразвуковое воздействие приводит кмодификации крахмала, а именно к увеличению его влагопоглощающей способности и растворимости в водных растворах при температуре выше 18°C (HercegI. L. Textureanad Pasting Propertiesof Ultrasonically Treated Corn Starch Czech Joumalof FoodSciences. 2010. No.2(28).P. 83-93). Повышение температуры центрифугирования выше 18°С способствует появлению крахмала в экстракте и увеличению его вязкости, что приведет к снижению выхода белково-фосфатного комплекса.

Использование ацетона в качестве осадителя белково-фосфатного комплекса обусловлено его способностью влиять на коагуляцию белков, белки из раствора под действием ацетона переходят полностью, в отличие от белков, осажденных спиртом или толуолом. Ацетон обладает меньшим денатурирующим действием, чем этанол. Он имеет более низкую температуру кипения (Е. Снигирева. Справочник физико-химических величин. 2019 г. ),в результате быстрее испаряется из полученного белково-фосфатного комплекса при сушке.

Осаждение белково-фосфатного комплекса охлажденным ацетоном в соотношении 1:2 необходимо для того, чтобы получить высокий выход конечного продукта.

При изменении соотношения в большую сторону происходит перерасход реагента - ацетона. При изменении соотношения в меньшую сторону происходит уменьшение выхода белково-фосфатного комплекса.

Процесс осаждения белково-фосфатного комплекса необходимо проводить ацетоном при пониженных температурах 5-0°С. При введении органического растворителя в водную среду происходит разогрев смеси, что может привести к необратимой денатурации белковых веществ в комплексе (Сова В.В., Кусайкин М.И. Выделение и очистка белков. Методическое пособие. 2006. С.14), поэтому ацетон и центрифугат должны быть перед смешением температурой не выше 5°С.

Использование диэтилового эфира обусловлено его способностью связывать липидные фракции, что, тем самым, обеспечивает освобождение белков от жиров (Вострикова Н.Л. Методические аспекты извлечения липидов из биологических матриц. Теория и практика переработки мяса. 2018.№2. С.4-12). Охлаждение диэтилового эфира до 5°С и ниже необходимо для того, чтобы избежать отрицательного воздействия на белково-фосфатный комплекс и для проведения эффективной холодовой экстракции липидов (Биотехнология. Подред. Е.С. Воронина. 2005 г. 792 с.) Повышение температуры выше 5°С диэтилового эфира приводит к неполному очищению белков от липидных фракций и перерасходу диэтилового эфира из-за его высокой летучести.

Промывание охлажденным диэтиловым эфиром в количестве 7,5 мл на 1 г сырья необходимо для того, чтобы полностью удалить свободные липидные фракции из белково-фосфатного комплекса.

Увеличение количества диэтилового эфира приводит к тому, что происходит перерасход реагента - диэтилового эфира.

Уменьшение количества диэтилового эфира приводит к тому, что в белково-фосфатном комплексе остаются свободные фракции липидов, что приводит к загрязнению целевого продукта и соответственно к уменьшению ингибиторной активности белково-фосфатного комплекса по отношению к амилазам.

Использование каждой стадии способа является обязательным, и ни одна стадия процесса не может быть исключена, так как это существенно снизит эффективность переработки и не позволит достичь указанного технического результата.

Содержание белка в экстракте определяют на спектрофотометре при длине 540 нм с использованием биуретового реактива (ОФС.1.2.3.0012.15 Определение белка). Методика основана на построении калибровочного графика по стандартным белкам с различными концентрациями и в дальнейшем определяют оптическую плотность комплекса, образуемого в результате взаимодействия биуретового реактива с белком. По графику определяют концентрацию белка в экстракте.

Расчет амилолитической активности для α-амилазы ведут по ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности. В качестве субстрата используется раствор крахмала с концентрацией 1%, на который воздействуют амилазой (исходная амилолитическая активность фермента 36 ед/г) и останавливают ферментативный процесс с помощью белково-фосфатного комплекса. Пробы, полученные в ходе реакций, анализируются на спектрофотометре, фиксируются оптические плотности. И затем производятся вычисления по следующим формулам:

m - масса прогидролизованного крахмала, г;

D₁ - оптическая плотность контрольного раствора;

D₂ - оптическая плотность опытного раствора;

0,1 - масса крахмала, взятая для анализа, г.

Масса прогидролизованного крахмала необходима для нахождения амилолитической активности, расчет которой ведется следующим образом:

АС - амилолитическая активность, ед/г;

m₁ - масса ферментного препарата, содержащаяся в 5 см³ рабочего раствора, мг;

7,264, 0,03766 - коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа в пересчете на 1 ч действия фермента.

Способ получения белково-фосфатного комплекса из бобов фасоли, обладающего ингибиторной активностью по отношению к α-амилазам, иллюстрируется примерами 1-19, таблицей 1. В таблице 1 представлены количество экстрагируемого белка из фасоли в мг/г, выход белка от количества экстрагируемого белка в %, количество фосфатов в %, амилолитическая активность α-амилазы в ед/г, при ингибировании полученным белково-фосфатным комплексом в зависимости от параметров осуществления способа согласно примерам 1-19.

Пример 1.

Бобы фасоли перемалывают в мельнице для получения фасолевой муки. Затем полученную муку просеивают через сита с диаметром отверстий 1 мм. Экстрагирование из фасолевой муки белковых веществ проводят с применением фосфатного буфера с рН 8 с использованием ультразвуковой ванны с параметрами 95 В, 50/60 Гц в течение 15 минут. Соотношение фасолевая мука: фосфатный буферный раствор составляет 1:15. Затем проводят центрифугирование при 4000 об/мин в течение 5 минут при 5°С, вакуум-фильтрование. Осаждение белково-фосфатного комплекса в виде хлопьевидного осадка из маточного раствора осуществляют охлажденным ацетоном в соотношении 1:2. Отделение белково-фосфатного комплекса проводят на вакуум-фильтре с последующим промыванием от липидов охлажденным диэтиловым эфиром в количестве 7,5 мл на 1 г сырья. Затем осуществляют сушку полученного белково-фосфатного комплекса.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 300 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 5 ед/г.

Расчет амилолитической активности для примера 1 исходя из найденных

параметров (D₁=0,527, D₂=0,135, m₁=25000 мг):

Пример 2.

Аналогичен примеру 1, однако экстрагирование проводят в фосфатном буферном растворе с использованием ультразвуковой ванны в течение 5 минут.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 290 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 21 ед/г.

Пример 3.

Аналогичен примеру 1, однако экстрагирование проводят в фосфатном буферном растворе с использованием ультразвуковой ванны в течение 10 минут.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 340 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 15 ед/г.

Пример 4.

Аналогичен примеру 1, однако экстрагирование проводят в фосфатном буферном растворе с использованием ультразвуковой ванны в течение 20 минут.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило236 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 15 ед/г.

Пример 5.

Аналогичен примеру 1, однако холодное экстрагирование проводят с использованием фосфатного буферного раствора с рН 8 при периодическом перемешивании в течение 30 минут без ультразвуковой обработки.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило263 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 28 ед/г.

Пример 6.

Аналогичен примеру 1, только соотношение фасолевая мука: фосфатный буферный раствор составляет 1:6.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 120 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 29 ед/г.

Пример 7.

Аналогичен примеру 1, только соотношение фасолевая мука: фосфатный буферный раствор составляет 1:6 и экстрагирование проводят в фосфатном буферном растворе с использованием ультразвуковой ванны в течение 10 минут.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 175 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 29 ед/г.

Пример 8.

Аналогичен примеру 1, только соотношение фасолевая мука: фосфатный буферный раствор составляет 1:6 и экстрагирование проводят в фосфатном буферном растворе с использованием ультразвуковой ванны в течение 20 минут. Количество экстрагируемого белка из фасоли составило75 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 30 ед/г.

Пример 9.

Аналогичен примеру 1, только соотношение фасолевая мука: фосфатный буферный раствор составляет 1:25.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило280 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 20 ед/г.

Пример 10.

Аналогичен примеру 1, только соотношение фасолевая мука: фосфатный буферный раствор составляет 1:25 и экстрагирование проводят в фосфатном буферном растворе с использованием ультразвуковой ванны в течение 10 минут.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 305 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 9 ед/г.

Пример 11.

Аналогичен примеру 1, только соотношение фасолевая мука: фосфатный буферный раствор составляет 1:25 и экстрагирование проводят в фосфатном буферном растворе с использованием ультразвуковой ванны в течение 20 минут

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило240 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 15 ед/г.

Пример 12

Аналогичен примеру 1, только центрифугирование проводят при 4000 об/мин в течение 3 минут при 5°С.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 240 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 19 ед/г.

Пример 13

Аналогичен примеру 1, только центрифугирование проводят при 4000 об/мин в течение 7 минут при 5°С.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 270 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 16 ед/г.

Пример 14.

Аналогичен примеру 1, только осаждение белков проводили ацетоном в соотношении белковый раствор: ацетон -1:1.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 300 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 11 ед/г.

Пример 15.

Аналогичен примеру 1, только осаждение белков проводили ацетоном в соотношении белковый раствор: ацетон - 1:3.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 300 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 10 ед/г.

Пример 16.

Аналогичен примеру 1, только осаждение белков проводили этанолом в соотношении белковый раствор: этанол - 1:2.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 300 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 21 ед/г.

Пример 17.

Аналогичен примеру 1, только осаждение белков проводили толуолом в соотношении белковый раствор: толуол - 1:2.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 300 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 20 ед/г.

Пример 18.

Аналогичен примеру 1,толькопромыванием от липидов охлажденным диэтиловым эфиром в количестве 5 мл на 1 г сырья.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 300 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 11ед/г.

Пример 19.

Аналогичен примеру 1, только промыванием от липидов охлажденным диэтиловым эфиром в количестве 3 мл на 1 г сырья.

Количество экстрагируемого белка из фасоли составило 300 мг/г, амилолитическая активность α-амилазы при ингибировании полученными белковыми веществами составила 28 ед/г.

Из приведенных примеров 1-19 и таблицы 1 видно, что оптимальными условиями для получения максимального выхода по белку, ингибиторной активности в отношении амилазы и содержанию фосфатов являются следующие: ультразвуковая обработка в течение 15 минут при соотношении фасолевая мука: фосфатный буферный раствор 1: 15, центрифугирование в течение 5 минут, осаждение ацетоном при соотношении белковый раствор: ацетон 1: 2, промывание белково-фосфатного комплекса диэтиловым эфиром в количестве 7,5 мл на 1 г сырья.

Таким образом, получают максимальное количество белково-фосфатного комплекса, который обладает наибольшей амилолитической активностью по отношению к α-амилазам. Белково-фосфатный комплекс способен ингибировать α-амилазы организмов, а следовательно, как белковые ингибиторы, выделенные из фасоли может воздействовать на пищеварительную систему млекопитающих и насекомых (Masao Ishimoto and Keisuke Kitamura Growth Inhibitory Effectsofan α-Amylase Inhibitor from the Kidney Bean, Phaseolus vulgaris (L.) on Three Species of Bmchids (Coleoptera: Bruchidae). 1989. 24 (3).P.281-286), следовательно, может быть использован для проведения различных ферментативных реакций в биотехнологических процессах (Ngoh Y.Y. Enzyme-assistedextraction and identification of antioxidative and α-amylase inhibitory peptides from Pinto beans (Phaseolus vulgaris cv. Pinto). Food Chem. 2016.№190.P. 331-337).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения белково-фосфатного комплекса - ингибиторов α-амилаз из бобовых культур. Способ получения белково-фосфатного комплекса из фасоли, обладающего ингибиторной активностью по отношению к α-амилазам, включающий измельчение бобов фасоли в мельнице до состояния муки, просеивание через сито с диаметром отверстий 1 мм, экстрагирование белковых веществ в ультразвуковой ванне с параметрами 95 В, 50/60 Гц с использованием фосфатного буферного раствора с рН 8 в течение 15 минут при соотношении фасолевая мука : буферный раствор 1:15, центрифугирование при 4000 об/мин при температуре 5°С в течение 5 минут, вакуум-фильтрование, осаждение белково-фосфатного комплекса охлажденным ацетоном в соотношении 1:2, вторичное вакуум-фильтрование, промывание охлажденным диэтиловым эфиром в количестве 7,5 мл на 1 г сырья, сушку белково-фосфатного комплекса. Вышеописанный способ максимально повышает выход целевого продукта - белково-фосфатного комплекса и сохранение его биологической активности. 1 табл., 19 пр.

Способ получения белково-фосфатного комплекса из фасоли, обладающего ингибиторной активностью по отношению к α-амилазам, включающий измельчение бобов фасоли в мельнице до состояния муки, просеивание через сито с диаметром отверстий 1 мм, экстрагирование белковых веществ в ультразвуковой ванне с параметрами 95 В, 50/60 Гц с использованием фосфатного буферного раствора с рН 8 в течение 15 минут при соотношении фасолевая мука : буферный раствор 1:15, центрифугирование при 4000 об/мин при температуре 5°С в течение 5 минут, вакуум-фильтрование, осаждение белково-фосфатного комплекса охлажденным ацетоном в соотношении 1:2, вторичное вакуум-фильтрование, промывание охлажденным диэтиловым эфиром в количестве 7,5 мл на 1 г сырья, сушку белково-фосфатного комплекса.