Способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и злаковых культур Советский патент 1982 года по МПК A01H1/04 A01G7/00 

1

Изобретение относится к селекции растений и к прикладной ботанике и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Известно, что качество зерна определяется не только содержанием в нем белков, незаменимых аминокислот, углеводородов, минеральных веществ, но в значительной мере наличием в семенах антипитательных компонентов, влияющих на усвояемость растительных белков организмом животного и человека. К антипитательным веществам относятся, в частности, и ингибиторы протеаз, например, ингибиторы трипсина, которые инактивируются протеолитическую активность ферментов пищеварительного тракта, нарушают усвояемость белков организмом.

Ингибиторы трипсина cocтaвляюt особую группу растительных белков, способных образовывать с трипсином устойчивые комплексы, угнетающие активность фермента. Они широко распространены в растительном мире и составляют значительную часть суммарного белка семян важнейщих сельскохозяйственных культур.

Наиболее эффективным путем уменьщения содержания ингибиторов трипсина в

семянах является селекция сортов, свободных от ингибиторов или содержащих их в минимальных количествах.

Известен способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых по

S скорости гидролиза белкового или синтетического субстратов 1.

Однако способ очень трудоемок. Известен также способ определения трипсинингибирующей активности семян

Q бобовых и .злаковых культур, включающий измельчение семян, экстрагирование раствором хлористого натрия, инкубирование экстракта на фотопленке, покрытой белковым веществом в присутствии трипсина и последующий учет результатов реакции.

15 Белки ингибитора подвергают электрофорезу в агаровом геле, содержащих казеин.

После чего казеин гидролизуют раствором трипсина. Казеиновый субстрат, защищенный от гидролиза присутствием ингибитора,

20 проявляется при окрашивании белковым красителем в виде голубых пятен, по которым судят о присутствии ингибитора 2. Способ также трудоемок и низкопроизводителен, так как он предполагает обязательную процедуру очистки от балластных

ioLлч: ; : чг-гЧггор-ь.х- фракций, ДЛЯ чего Не; с л , - .: ,:::;ь:-:; ;ii « сложные приемы о; ;;;;.Ь- ,. м:;ц. зьгсаливание, диализ, лио4.,ja,,S о и др Длительная npoueAvpa под./;:jeKii с йстрата (агаровый 1е;.о с ка ., и проведение опыта в течение около J ч), на еще способ требует наличия спеЩ5ального электрофоретического оборудования и значительного количества испытуемого материала - все это не позволяет обнаруживать ингибиторы трипсина в части отдельных семян при сохранении их жизнеспособности.

Целью изобретения является сохранение жизнеспособности исследуемых семян и упрощение самого процесса.

Указанная цель достигается тем, что трипсин используют в концентрации 0,23°/о для .экстракта из семян бобовых и 0,02-0,03% для экстракта из семян злаков, причем инкубирование экстракта проводят на фотопленке, предварительно экспонированной, проявленной и фиксированной, для покрытия ее в качестве белкового вещества используют желатину, и процесс инкубирования ведут для экстракта из семян бобовых в течение 8-12 мин, а для экстракта из семян злаков в течение 18-22 мин, при этом учет реакции осуществляют по степени прочности образующихся на желатине гидролизованных зон на фотопленке в сравне1ти исследуемых семян с семянами эталонного сорта.

Пример 1. Отбор проводят на селекционно-генетическом материале сои (500 образцов) коллекции Отдела генетики расте,ий АН Молдавской СССР, включающий ссрт, линии, отдельные растения. Средняя проЗа материала выполнена по общепринятой методике.

Навеску средней пробы семян сои, измель ценной в электрической мельнице до размера частиц муки 0,1 мм, экстрагируют 0,1 - 0,3 М раствором хлористого натрия в соотношении 1:75 (г/мл) в течение не менее 1 ч. К полученному экстракту ингибиторов приливают раствор трипсина 0,17-0,33% и трисбуфер рН 8,2 (содержащий 0,2 М NaCl) в соотнощении 1:1:1 (мл). Смесь выдерживают 3-5 мин, одинаковые капли инкубационной смеси (0,01-0,03 мл) контрольных и исследуемых образцов наносят на желатиновый слой предварительно экспонированной, проявленной и фиксированной фотопленки и инкубируют 8-12 мин при 25°С. После чего пленку промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Отбор генотипов по указанному признаку производят путем сравнения степени прозрачности гидролизованных зон желатинового слоя фотопленки остаточным количеством трипсина (после ингибирования экстрактами семян) исследуемого материала и контрольных образцов. Трипсинингибирующую активность оценивают в баллах по степени

Прозрачности пятна, исходя из экспериментальных данных о том, что низкоингибиторный образец образует прозрачное пятно, средпеингибитЬрный - серое, высркоингибиторный - черное пятно.

В результате из 500 исследуемых образцов сои отобрано 53 с низким содержанием ингибиторов трипсина, перспективных для включения в селекционный процесс на улучшение питательной ценности зерна сои.

Пример 2. Оценку трипсинингибирующей активности единичных семян проводят на контрастных по содержанию ингибиторов трипсина 13 сортах сои.

В этих опытах 20 семян каждого сорта разделяют на кожуру, соевую часть зародыша и семядоли, последние рассекают на 6 сегментов, в которых определяют трипсинингибирующую активность. В результате установлено незначительное содержание ингибиторов трипсина в кожуре (около 10% общей активности семени) и равномерное распределение их в семядоли. Соответственно отбор в этом случае производят путем отсечения участка семени для анализа как исследуемых, так и контрольных образцов из идентичных мест семядоли. Отрезанную часть семени (не менее 10 мг) взвещивают, растирают в ступице до размера частиц порядка 0,1 мм. и экстрагируют. Анализ и отбор низкоингибиторных семян аналогичен процедуре, описанный в примере 1.

Семена, подвергнутые такой процедуре, пригодны для высевания и проведения дальнейших селекционных работ.

Пример 3. Отбор по признаку трипсинингибирующей активности зерновых культур проведен на селекционно-генетическом ма-, териале пшеницы (100 образцов) коллекции отдела генетики растений АН Молдавской ССР.

Для образцов пшеницы экспериментально установлены оптимальные параметры фермент-ингибирующей системы: концентрация 0 трипсина - 0,02-0,03, соотношение мука: экстрагент - 1:4 (г/мл), соотношение буфер: фермент: ингибитор - 1,1:1 (мл), время инкубации фермента с субстратом - 18-22 мин при 25°С.

Выявлены образцы пшеницы, отличающиеся низкой, средней и высокой активностью ингибиторов трипсина, и которые составляют 15,50 и 35% от общего количества исследованного материала соответственио.

Процедура анализа и отбор зерна пшеницы по признаку трипсинингибирующей активности аналогичны процедуре, описанной в примере 1.

Разработанный способ позволяет использовать малые количества испытуемого материала (вплоть до 1/10-1/20 части зерна) 5 при хорошей воспроизводимости и необходимой точности, высокой производительности (100-200 анализов в день), простоте выполнения анализа и экономном расходоваНИИ реактивов отечественного производства, пригоден для отбора, по результатам анализа части семени с дальнейшим использованием остатка семени в селекционном процессе, позволяя, таким образом, сохранить ценный исходный и селекционный материал. Способ может быть использован дЛя скрининга большого набора селекционно-генетического материала (сорта, линии, отдельные растения, единичные семена) по признаку трансингибирующей активности и для выявления доноров низкоингибиторности, необходимых для селекции в направлении улучшения питательной ценности, усвояемости белков зерна бобовых и злаковых культур.

Формула изобретения

Способ определения трипсинингибируюшей активности семян бобовых и злаковых культур, включающий измельчение семян, экстрагирование раствором хлористого натрия, инкубирование экстрактов на фотопленке, покрытой белковым веществом в присутствии трипсина и последующий учет результатов реакции, отличающийся тем, что.

с целью сохранения жизнеспособности семян и упрощения процесса, трипсин используют в концентрации 0,17-0,23% для экстракта из семян бобовых и 0,02-0,03°/о для экстракта из семян злаков, причем инкубирование экстракта проводят на фотопленке, предварительно экспонированной, проявленной и фиксированной, для покрытия ее в качестве белкового вещества используют желатину и процесс инкубирования ведут для экстракта из семян бобовых в течение 8-12 мин, а для экстракта из семян злаков в течение 18-22 мин, при этом учет реакции осуществляют по степени прозрачности образующихся на желатине гидролизованных зон на фотопленке в сравнении исследуемых семян с семенами эталонного сорта.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Бенкен Н. И., Буданова В. И. Ингибиторы трипсина в семянах фасоли. Труды по прикладной ботанике, генетике, селекции.

М., 1Q76, 56,3, 67-73.

2.Seidl D S et al Microeleftrophoretic methog for. the detection of proteinase inhibitors. - Analyt. Biochem., 1978, 88, 2, 417- 424 (прототип).