ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ МЕТАБОЛИТЫ ОГМ, ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО БАРЬЕРА Российский патент 2024 года по МПК A23L33/10 A23L33/21 

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к питательной композиции для младенцев и детей младшего возраста, содержащей метаболиты ОГМ, и терапевтическому применению таких композиций, например, для применения в улучшении желудочно-кишечного барьера. В частности, настоящее изобретение относится к метаболитам ОГМ для применения в терапии младенцев и детей младшего возраста, предпочтительно младенцев и детей младшего возраста с нарушенной микробиотой, поскольку их микробиота может быть неспособна соответствующим образом метаболизировать ОГМ.

Предпосылки создания изобретения

Материнское молоко рекомендовано всем младенцам. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным или неэффективным по медицинским причинам либо мать решает не кормить грудью. Для этих ситуаций были разработаны детские смеси. Были разработаны также обогатители для витаминизации материнского молока или детской смеси определенными ингредиентами. Однако младенцы, которых вскармливали смесью, ранее были определены как имеющие проблемы со здоровьем, которые реже встречаются у младенцев на грудном вскармливании, такие как, например, нарушение желудочно-кишечного барьера. В таких случаях было бы еще более предпочтительно обеспечить терапевтические композиции, а именно для улучшения здоровья и, в частности, желудочно-кишечного барьера у младенцев и детей младшего возраста посредством вмешательства в питание.

Во время постнатального развития кишечник новорожденного подвергается процессу матурации, который завершается формированием функционального барьера для макромолекул и патогенных бактерий. Это явление называется закрытием кишечника и, по-видимому, зависит от рациона питания. Следовательно, различные исследования младенцев (JPGN, 1995, 21: 383-6) и животных моделей (Pediatr Res, 1990, 28: 31-7) показывает, что матурация барьера происходит быстрее при грудном вскармливании, чем у новорожденных, которых кормят детской смесью. Это может объяснить более высокую распространенность аллергии и инфекции у детей грудного возраста, вскармливаемых смесью, чем у детей грудного возраста, вскармливаемых материнским молоком.

Некоторые конкретные группы младенцев и детей младшего возраста особенно нуждаются в композициях, способных обеспечивать полезные для здоровья эффекты, такие как улучшение барьерной функции кишечника. Такими младенцами и детьми младшего возраста являются, например, недоношенные младенцы, младенцы с низким весом при рождении и/или младенцы или дети младшего возраста с задержкой роста. Действительно, кишечный барьер более проницаем и более подвержен повреждениям, и его структура и функции у таких младенцев становятся менее зрелыми, чем у здорового доношенного младенца. Это, в свою очередь, может приводить к другим проблемам, таким как инфекция или аллергия. Для таких младенцев особенно предпочтительно дополнять фармакологическое лечение питательными композициями, способными улучшить барьерную функцию кишечника.

Ранее было исследовано влияние питательных ингредиентов, таких как олигосахариды грудного молока, на обеспечение полезных для здоровья эффектов у младенцев. ОГМ, помимо прочих преимуществ, описаны как эффективные для улучшения желудочно-кишечного барьера.

Например, в WO2013/032674 описаны питательные композиции, включающие в себя олигосахариды грудного молока, которые можно вводить субъектам, включая недоношенных младенцев, младенцев, детей, начинающих ходить, детей и взрослых, для профилактики травмы и/или улучшения заживления желудочно-кишечного тракта.

Олигосахариды грудного молока представляют собой неперевариваемые олигосахариды и, таким образом, не могут быть метаболизированы ферментами, вырабатываемыми младенцем или ребенком младшего возраста. Однако эти олигосахариды сталкиваются с бактериями микробиоты в желудочно-кишечном тракте младенца или ребенка младшего возраста и метаболизируются такими бактериями. Метаболизм ОГМ в желудочно-кишечном тракте младенца был исследован ранее. Бактерии метаболизируют ОГМ двумя различными классами механизмов в зависимости от рода/вида бактерий. Bifidobacterium longum subsp infantis поглощает ОГМ в нативной форме, не расщепляя их до более мелких фрагментов, а затем метаболизирует ОГМ внутриклеточным механизмом. Благодаря этому механизму B. infantis высвобождает в желудочно-кишечный тракт младенца важные метаболиты, такие как уксусная и молочная кислоты. Такие метаболиты полезны для роста других бактерий в микробиоте, таких как Bifidobacterium bifidum. Bifidobacterium bifidum имеет совершенно иной способ метаболизации ОГМ. Эти виды бактерий действительно высвобождают ферменты, которые расщепляют ОГМ посредством внеклеточного механизма и, таким образом, расщепляют ОГМ на более мелкие фрагменты в желудочно-кишечном тракте ребенка, и такие более мелкие фрагменты впоследствии доступны для потребления целым множеством видов бактерий в микробиоте. Например, в публикации Sela et al.; Nursing our microbiota: molecular linkages between bifidoacteria and milk oligosaccharides; Trends Microbiol, 2010, 18(7): 298-307 подробно описаны разнообразные механизмы, используемые бактериями микробиоты для метаболизации ОГМ. В частности, на Фиг. 3 показано графическое представление таких механизмов.

Особым преимуществом будет обеспечение улучшенных питательных композиций и, в частности, более эффективной и/или надежной питательной композиции для младенцев и детей младшего возраста с нарушенной микробиотой, таких как, например, младенцы, находящиеся на вскармливании смесью, и еще более недоношенные младенцы, младенцы, рожденные посредством кесарева сечения, и младенцы и дети младшего возраста, которые получали или получают лечение антибиотиками. Например, в публикации Chemikova et al.; The premature infant gut microbiome during the first 6 weeks of life differs based on gastrointestinal maturity at birth, Pediatric Research, 2018, 84: 71—79 показано, как отличается микробиота недоношенного младенца от микробиоты доношенного младенца (см., например, таблицу 1 на стр. 72). Кроме того, в работе Korpela et al.; Early life colonization of the human gut: microbes matter everywhere; Current Opinion on Microbiology,2018, 44: 70—78 представлен метаанализ многих исследований, в которых оценивают диапазон пяти основных родов, присутствующих в микробиоте младенцев в возрасте от рождения до двух лет, для доношенных младенцев, рожденных через естественные родовые пути (находящихся на грудном вскармливании и находящихся на искусственном вскармливании), младенцев, рожденных с помощью кесарева сечения, и младенцев, получавших антибиотики. Эта публикация показывает, что микробиота младенцев, рожденных посредством кесарева сечения, и младенцев, получавших антибиотики, существенно отличается от микробиоты доношенных младенцев, рожденных посредством вагинальных родов.

В нескольких публикациях также подчеркивается значительное различие между микробиотой младенцев, находящихся на вскармливании детской смесью, и младенцев, находящихся на грудном вскармливании. См., например, публикацию Lee et al.; Comparison of the gut microbiota profile in breast-fed and formula-fed Korean infants using pyrosequencing; Nutrition Research and Practice, 2015, 9(3):242–248.

Известно, что типичная микробиота младенцев, находящихся на грудном вскармливании, особенно эффективна для метаболизации ОГМ.

Было бы полезно дополнительно улучшить влияние питательных композиций на здоровье всех младенцев и детей, в частности, младенцев и детей младшего возраста с нарушенной микробиотой.

Существует очевидная потребность в разработке приемлемых способов улучшения желудочно-кишечного барьера у младенцев и детей младшего возраста, в частности у младенцев и детей младшего возраста с нарушенной микробиотой.

Также существует потребность в обеспечении таких полезных для здоровья эффектов способом, который особенно приемлем для субъектов младшего возраста (младенцев и детей младшего возраста), при этом способ не должен включать классическое фармацевтическое вмешательство, поскольку эти младенцы или дети младшего возраста особенно уязвимы.

Существует потребность в обеспечении у этих младенцев или детей младшего возраста таких полезных для здоровья эффектов способом, который не вызывает побочных эффектов и/или который можно легко предоставлять и который приемлем для родителей или медицинских работников.

Также существует потребность в обеспечении таких полезных эффектов способом, который позволит сохранять разумную и доступную для большинства стоимость такого обеспечения.

Таким образом, существует очевидная потребность в разработке альтернативных способов, отличных от классического фармацевтического вмешательства, такого как применение фармацевтических препаратов, по меньшей мере из-за связанного риска возникновения побочных эффектов.

Изложение сущности изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что преимущество улучшенных питательных композиций заключается в том, что субъект, потребляющий композицию, должен обладать микробиотой, способной метаболизировать ОГМ, чтобы иметь возможность получать пользу от эффектов композиции. Иными словами, также субъекты с нарушенной микробиотой могут получать полный полезный эффект ОГМ.

Такие композиции особенно адаптированы для младенцев и детей младшего возраста с нарушенной микробиотой (т. е. младенцев, у которых нет детской микробиоты, напоминающей микробиоту младенца на грудном вскармливании, предпочтительно младенца, рожденного посредством вагинальных родов, доношенного младенца), и, следовательно, подверженных риску метаболизации ОГМ способом, который не является оптимальным. Такими младенцами и детьми младшего возраста являются, например, младенцы, находящиеся на вскармливании смесью, младенцы, рожденные посредством кесарева сечения, недоношенные младенцы и младенцы, получавшие лечение антибиотиками.

Настоящие улучшенные питательные композиции содержат метаболиты ОГМ. Метаболиты ОГМ получают/можно получать путем ферментации композиции, содержащей один или более ОГМ, в композиции, содержащей (здоровую) детскую микробиоту.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к питательной композиции для младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) или детей младшего возраста (с 1 года до 3 лет), содержащей метаболиты ОГМ;

или

питательной композиции в форме молочной смеси для детей (в возрасте от 3 до 8 лет), содержащей метаболиты ОГМ.

Другой аспект настоящего изобретения относится к питательной композиции, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в качестве лекарственного средства (или для применения в терапии) для младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) и/или детей младшего возраста (с 1 года до 3 лет);

или

питательной композиции в форме молочной смеси, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в качестве лекарственного средства (или для применения в терапии) для детей (в возрасте от 3 до 8 лет).

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении питательной композиции, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в улучшении желудочно-кишечного барьера у младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) и/или детей младшего возраста (в возрасте от 1 года до 3 лет);

или

питательной композиции в форме молока, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в улучшении желудочно-кишечного барьера у детей ((в возрасте от 3 до 8 лет).

Аспект настоящего изобретения также относится к применению метаболитов ОГМ в качестве ингредиента в питательной композиции для младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) и/или детей младшего возраста (с 1 года до 3 лет). Он также относится к применению метаболитов ОГМ в качестве ингредиента в молочной смеси для детей в возрасте от 3 до 8 лет.

Другим аспектом являются метаболиты ОГМ для применения в качестве лекарственного средства (или для применения в терапии) для младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) и/или детей младшего возраста (от 1 года до 3 лет).

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к метаболитам ОГМ для применения в улучшении желудочно-кишечного барьера у младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) и/или детей младшего возраста (от 1 года до 3 лет) или для применения в молочной смеси для детей в возрасте от 3 до 8 лет.

В предпочтительном варианте осуществления метаболиты ОГМ получают/можно получать путем ферментации композиции, содержащей один или более ОГМ, в композиции, содержащей (здоровую) детскую микробиоту.

Как указано в разделе примеров, было установлено, что метаболизированные посредством ферментации детской микробиотой ОГМ особенно благоприятны для улучшения желудочно-кишечного барьера у детей. Например, в примере 4 описано, что метаболиты ОГМ могут

- Обеспечивать профилактическую защиту эпителиального барьера (см. Фиг. 1).

- Индуцировать резистентность к дисфункции индуцированного воспалением эпителиального барьера (см. Фиг. 2).

- Ограничить восприимчивость к дисфункции эпителиального барьера, вызванной воспалением (см. Фиг. 3).

- Уменьшить тяжесть симптомов индуцированной воспалением дисфункции эпителиального барьера (см. Фиг. 4 и 5).

В целом эти данные показывают, что метаболиты ОГМ и, в частности, метаболиты 2'FL, 3'SL, 6'SL, LNT, LNnT и DiFL, а более предпочтительно 2'FL и LNnT эффективно улучшают матурацию, структуру, функцию, защиту и восстановление желудочно-кишечного барьера.

Таким образом, цель настоящего изобретения относится к питательным композициям, которые могут усиливать желудочно-кишечный барьер.

В частности, целью настоящего изобретения является обеспечение питательной композиции для младенцев или детей младшего возраста с нарушенной микробиотой, т. е. имеющих микробиоту, которая отличается от микробиоты младенцев и детей младшего возраста на грудном вскармливании, таких как младенцы и дети младшего возраста, вскармливаемые смесью, недоношенные младенцы, младенцы, рожденные посредством кесарева сечения, и младенцы и дети младшего возраста, которые получают или получали лечение антибиотиками.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Эффективность продуктов ферментации ОГМ для обеспечения профилактической защиты эпителиального барьера. Совместные культуры обрабатывают ОГМ, а затем посредством опосредованного цитокинами воспаления индуцируют дисфункцию эпителиального барьера. Все группы, кроме контроля с резус-отрицательной кровью (интактный барьер), провоцировали воспалительным процессом. Коэффициент защиты рассчитывается путем анализа изменения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) относительно контроля с резус-отрицательной кровью (100% защита) и контроля с резус-положительной кровью (0% защита) до воспалительной провокации. Планки погрешностей отражают минимально значимое различие. A) 2 дня кормления. B) 21 день кормления.

Фиг. 2: Эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении индукции резистентности к дисфункции эпителиального барьера, вызванной воспалением. Совместные культуры обрабатывают ОГМ, а затем посредством опосредованного цитокинами воспаления индуцируют дисфункцию эпителиального барьера. Все группы, кроме контроля с резус-отрицательной кровью (интактный барьер), провоцировали воспалительным процессом. Задержка рассчитывается как время, необходимое для того, чтобы трансэпителиальная электрическая резистентность (TEER) упала ниже контроля с резус-отрицательной кровью (интактный барьер) после индукции воспаления. Планки погрешностей отражают минимально значимое различие. A) 2 дня кормления. B) 21 день кормления.

Фиг. 3. Эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении ограничения восприимчивости к дисфункции эпителиального барьера, вызванной воспалением. Совместные культуры обрабатывают ОГМ, а затем посредством опосредованного цитокинами воспаления индуцируют дисфункцию эпителиального барьера. Все группы, кроме контроля с резус-отрицательной кровью (интактный барьер), провоцировали воспалительным процессом. На графике представлено медианное трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) во время воспалительной провокации. Планки погрешностей отражают минимально значимое различие. A) 2 дня кормления. B) 21 день кормления.

Фиг. 4. Эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении уменьшения тяжести симптомов вызванной воспалением дисфункции эпителиального барьера. Совместные культуры обрабатывают ОГМ, а затем посредством опосредованного цитокинами воспаления индуцируют дисфункцию эпителиального барьера. Все группы, кроме контроля с резус-отрицательной кровью (интактный барьер), провоцировали воспалительным процессом. На графике представлено конечное трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) в конце воспалительной провокации. Планки погрешностей отражают минимально значимое различие. A) 2 дня кормления. B) 21 день кормления.

Фиг. 5. Эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении уменьшения тяжести симптомов вызванной воспалением дисфункции эпителиального барьера. Совместные культуры обрабатывают ОГМ, а затем посредством опосредованного цитокинами воспаления индуцируют дисфункцию эпителиального барьера. Все группы, кроме контроля с резус-отрицательной кровью (интактный барьер), провоцировали воспалительным процессом. На графике представлена транслокация меченного флуоресцеин изотиоцианатом декстрана (FD4) от апикального до базолатерального отделения после воспалительной провокации. Планки погрешностей отражают минимально значимое различие. A) 2 дня кормления. B) 21 день кормления.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже.

Подробное описание изобретения

Определения

До более подробного описания настоящего изобретения будут приведены определения указанных ниже терминов и условных обозначений.

В настоящем контексте под термином «метаболиты ОГМ» следует понимать продукт ферментации ОГМ младенческой микробиотой, напоминающей микробиоту младенца на грудном вскармливании, предпочтительно младенческую микробиоту, напоминающую микробиоту доношенного младенца, рожденного посредством вагинальных родов, на грудном вскармливании, более предпочтительно детскую микробиоту, происходящую от младенца на грудном вскармливании, и наиболее предпочтительно детскую микробиоту, происходящую от доношенного младенца, рожденного посредством вагинальных родов, на грудном вскармливании.

В настоящем контексте термин «детская микробиота, напоминающая микробиоту младенца на грудном вскармливании» следует понимать как микробиоту, содержащую по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% актинобактерий и наиболее предпочтительно бифидобактерий. Более предпочтительно микробиота содержит по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, более предпочтительно по меньшей мере 20% Bifidobacterium bifidum. Такие процентные доли даны в расчете на общее количество бактерий в микробиоте.

Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев (<12 месяцев). Выражение «ребенок младшего возраста» означает ребенка в возрасте от одного до трех лет (≥1 году, ≤3 лет) (также называют ребенком, начинающим ходить). Выражение «ребенок» означает ребенка в возрасте от трех до восьми лет (>3 лет, <8 лет).

«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством кесарева сечения» означает младенца или ребенка младшего возраста, рожденного посредством кесарева сечения. Это означает, что младенец или ребенок младшего возраста не был рожден посредством вагинальных родов.

«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством вагинальных родов» означает младенца или ребенка младшего возраста, который был рожден посредством вагинальных родов, а не посредством кесарева сечения.

«Недоношенный» или «преждевременно родившийся» означает младенца или ребенка младшего возраста, который родился раньше срока. По существу, этот термин относится к младенцу или ребенку младшего возраста, рожденному до 37-й недели беременности.

«Младенец с низким весом при рождении» означает новорожденного, имеющего массу тела менее 2500 г (5,5 фунта) по причине либо преждевременных родов, либо ограниченного роста плода. Таким образом, этот термин включает:

- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел вес при рождении от 1500 до 2500 г (обычно называемый «низким весом при рождении» или НВР);

- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел вес при рождении от 1000 до 1500 г (обычно называемый «очень низким весом при рождении» или ОНВР);

- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел массу тела менее 1000 г при рождении (обычно называемую «крайне низкий вес при рождении» или КНВР).

«Младенец, родившийся маленьким для своего гестационного возраста (SGA)» означает ребенка с весом при рождении менее 10-го процентиля для детей того же гестационного возраста.

Выражение «питательная композиция» означает композицию, которой питается субъект. Данная питательная композиция обычно предназначена для перорального или энтерального применения и обычно включает источник липидов или жира и источник белка.

В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой гипоаллергенную питательную композицию. Выражение «гипоаллергенная питательная композиция» означает питательную композицию, которая с низкой вероятностью вызовет аллергические реакции.

В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой «искусственную питательную композицию». Выражение «искусственная питательная композиция» означает смесь, полученную с помощью химических и/или биологических средств, которые могут быть химически идентичны смеси природного происхождения, присутствующей в молоке млекопитающих (т. е. искусственная композиция не является грудным молоком).

Выражение «детская смесь» при использовании в настоящем документе относится к продукту питания, который специально предназначен для употребления в пищу младенцами в течение первых месяцев жизни и сам по себе удовлетворяет потребности в питании этой категории лиц (статья 2(c) Директивы Европейской комиссии 91/321/EEC 2006/141/EC от 22 декабря 2006 г. о детских смесях и смесях для прикармливаемых детей). Оно также относится к питательной композиции, предназначенной для младенцев, как определено в Codex Alimentarius (Codex STAN 72-1981) и Infant Specialities (включая статью Food for Special Medical Purpose). Выражение «детская смесь» охватывает как «начальную детскую смесь», так и «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей».

«Смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей» дают, начиная с 6-го месяца. Она составляет главный жидкий элемент в постепенно увеличивающемся разнообразии рациона питания для данной категории лиц.

Выражение «детское питание» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.

Выражение «детская композиция на зерновой основе» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.

Выражение «молочная смесь для детей от 1 до 3 лет» (или GUM) относится к напитку на основе молока, как правило, с добавлением витаминов и минеральных веществ, который предназначен для детей младшего возраста или детей.

Термин «обогатитель» относится к жидким или твердым питательным композициям, подходящим для смешивания с грудным молоком или детской смесью.

Выражение «период отлучения от груди» означает период, в течение которого в рационе младенца или ребенка младшего возраста материнское молоко заменяют другой пищей.

Выражения «в возрасте дней/недель/месяцев/лет» и «дней/недель/месяцев/лет после рождения» могут использоваться как взаимозаменяемые.

Выражение «улучшенный желудочно-кишечный барьер» может включать в себя одно или несколько из следующего:

– Более эффективная репарация барьера, например (без ограничений) восстановление целостности желудочно-кишечного барьера, например репарация разорванного барьера, снижение проницаемости после воспалительной провокации слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и репарация слизистой оболочки.

– Улучшенная матурация барьера, например (без ограничений) матурация и/или развитие барьера у младенца, предпочтительно недоношенного младенца.

– Улучшенная структура барьера, например (без ограничений) укрепление желудочно-кишечного барьера, целостность желудочно-кишечного барьера, структура с плотным соединением клеток и целостность эпителиальной выстилки кишечника.

– Улучшенная барьерная функция, например улучшение барьерной функции желудочно-кишечного тракта, снижение барьерной проницаемости желудочно-кишечного тракта, например сокращение патогенов, мигрирующих из кишечника через кишечный барьер, например, сокращение миграции симбиотических бактерий из кишечника через кишечный барьер, сокращение миграции аллергенов из кишечника через кишечный барьер, сокращение миграции токсичных соединений из кишечника через кишечный барьер и сокращение восприимчивости к заболеванию.

– Улучшенная защита барьера, например (без ограничений) предотвращение дисфункции барьера, предотвращение проницаемости барьера, защита структуры с плотным соединением клеток, защита целостности эпителиальной выстилки кишечника.

В предпочтительном варианте осуществления улучшение кишечного барьера относится к матурации желудочно-кишечного барьера.

Под «материнским молоком» следует понимать грудное молоко или молозиво матери.

«Олигосахарид» представляет собой сахаридный полимер, содержащий небольшое число (как правило, от трех до десяти) простых сахаров (моносахаридов).

Термин «ОГМ» относится к олигосахариду (-ам) грудного молока. Эти углеводы обладают высокой устойчивостью к ферментативному гидролизу, что указывает на то, что они могут проявлять существенные функции, непосредственно не относящиеся к их калорийности. В первую очередь было показано, что они играют жизненно важную роль в раннем развитии младенцев и детей младшего возраста, например в развитии иммунной системы. В грудном молоке обнаружено много различных видов ОГМ. Каждый отдельный олигосахарид основан на комбинации глюкозы, галактозы, сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты), фукозы и/или N-ацетилглюкозамина с образованием многочисленных и разнообразных связей между ними, что обусловливает присутствие огромного числа различных олигосахаридов в грудном молоке — на данный момент было выявлено более 130 таких структур. Почти все они на своем восстанавливающем конце имеют лактозный фрагмент, в то время как сиаловая кислота и/или фукоза (при наличии) занимают концевые положения на невосстанавливающих концах. ОГМ могут быть кислыми (например, содержащий заряженную сиаловую кислоту олигосахарид) или нейтральными (например, фукозилированный олигосахарид).

«Фукозилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, имеющий остаток фукозы. Он имеет нейтральный характер. Некоторыми примерами являются 2-FL (2’-фукозиллактоза), 3-FL (3-фукозиллактоза), дифукозиллактоза, лакто-N-фукопентаоза (например, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V), лакто-N-фукогексаоза, лакто-N-дифукогексаоза I, фукозиллакто-N-гексаоза, фукозиллакто-N-неогексаоза, дифукозиллакто-N-гексаоза I, дифукозиллакто-N-неогексаоза II и любая их комбинация. Хотя авторы не желают ограничиваться какой-либо теорией, считается, что фукозил-эпитоп фукозилированных олигосахаридов может выступать в качестве «ловушки» на поверхности слизистой оболочки. Посредством конкурентного эффекта он может предотвращать и/или ограничивать действие патогенов, вызывающих инфекции (вирусного или бактериального происхождения), или секретируемых ими компонентов (например, токсинов), в первую очередь исключая их связывание с природными лигандами, и, безотносительно к какой-либо теории, считается, что за счет этого будет снижаться риск возникновения инфекций/воспалений, и в частности риск возникновения инфекций и/или воспалений нижних дыхательных путей (НДП)/уха. Дополнительно принято считать, что фукозилированные олигосахариды стимулируют рост и метаболическую активность специфических симбиотических микробов, снижающих воспалительную реакцию и создающих неблагоприятную среду для патогенов, тем самым обеспечивая колонизационную резистентность.

Выражения «фукозилированные олигосахариды, содержащие 2’-фукозил-эпитоп» и «2-фукозилированные олигосахариды» охватывают фукозилированные олигосахариды с определенной гомологией формы, поскольку они содержат 2’-фукозил-эпитоп; следовательно, можно ожидать определенную гомологию функции. Хотя авторы не желают ограничиваться какой-либо теорией, считается, что 2’-фукозил-эпитоп этих фукозилированных олигосахаридов особо характерен для патогенов (или секретируемых ими компонентов), вызывающих инфекции НДП и/или уха.

Выражение «N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы)» охватывает как «N-ацетиллактозамин», так и «олигосахарид (-ы), содержащий (-ие) N-ацетиллактозамин». Они являются нейтральными олигосахаридами, имеющими остаток N-ацетиллактозамина. Подходящими примерами являются LNT (лакто-N-тетраоза), пара-лакто-N-неогексаоза (пара-LNnH), LNnT (лакто-N-неотетраоза) и любые их комбинации. Другими примерами являются лакто-N-гексаоза, лакто-N-неогексаоза, пара-лакто-N-гексаоза, пара-лакто-N-неогексаоза, лакто-N-октаоза, лакто-N-неооктаоза, изо-лакто-N-октаоза, пара-лакто-N-октаоза и лакто-N-декаоза.

Выражения «по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид» и «по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид» означают «по меньшей мере один тип фукозилированного олигосахарида» и «по меньшей мере один тип N-ацетилированного олигосахарида».

«Предшественник ОГМ» представляет собой ключевое соединение, которое включается в выработку ОГМ, такое как сиаловая кислота и/или фукоза.

«Сиалилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, содержащий заряженную сиаловую кислоту, т. е. олигосахарид, имеющий остаток сиаловой кислоты. Он имеет кислотный характер. Некоторыми примерами являются 3-SL (3’-сиалиллактоза) и 6-SL (6’-сиалиллактоза).

Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой форме (например, в форме порошка) или в жидком виде. Количество различных ингредиентов (например, олигосахаридов) может выражаться в г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, если она представлена в твердой форме, например в порошке, или как концентрация в г/л композиции, если она относится к жидкой форме (последний случай также включает жидкую композицию, которую можно получать из порошка после растворения в жидкости, например в молоке, воде и т. п., например растворенную детскую смесь, или смесь для прикармливаемых детей / смесь последующего уровня, или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, или зерновой продукт для детского питания, или любую другую смесь, предназначенную для детского питания).

Термин «пребиотик» означает неперевариваемые углеводы, которые благоприятно влияют на организм-хозяина, избирательно стимулируя рост и/или активность полезных для здоровья бактерий, например бифидобактерий, в толстом кишечнике человека (Gibson GR, Roberfroid MB. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr. 1995;125:1401–12).

Термин «пробиотик» означает препараты клеток микроорганизмов или компонентов клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или самочувствие организма-хозяина. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. Probiotics: how should they be defined. Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107–10). Клетки микроорганизмов, по существу, представляют собой бактерии или дрожжи.

Под термином «КОЕ» следует понимать колониеобразующую единицу.

Если не указано иное, все процентные содержания даны по массе.

Питательная композиция

Как указано выше, авторы настоящего изобретения обнаружили, что преимущество улучшенных питательных композиций заключается в том, что субъект, потребляющий композицию, должен обладать микробиотой, способной метаболизировать ОГМ, чтобы иметь возможность получать пользу от эффектов композиции. Иными словами, также субъекты с нарушенной микробиотой могут получать полный полезный эффект ОГМ.

Такие композиции в особенности адаптированы для младенцев и детей младшего возраста с нарушенной микробиотой (т. е. младенцев, у которых нет детской микробиоты, напоминающей микробиоту младенца на грудном вскармливании), и, следовательно, подверженных риску метаболизации ОГМ способом, который не является оптимальным. Такие улучшенные питательные композиции содержат метаболиты ОГМ. Метаболиты ОГМ получают/можно получать путем ферментации композиции, содержащей один или более ОГМ, в композиции, содержащей (здоровую) детскую микробиоту, т. е. детскую микробиоту, напоминающую микробиоту младенца на грудном вскармливании.

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к питательной композиции для младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) или детей младшего возраста (в возрасте от 1 года до 3 лет), содержащей метаболиты ОГМ;

или

питательной композиции в форме молочной смеси для детей (в возрасте от 3 до 8 лет), содержащей метаболиты ОГМ.

Питательные композиции изобретения могут быть особенно полезны для младенцев с нарушенной микробиотой. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к питательной композиции, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в качестве лекарственного средства для младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) и/или детей младшего возраста (с 1 года до 3 лет);

или

питательной композиции в форме молочной смеси, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в качестве лекарственного средства (или для применения в терапии) для детей (в возрасте от 3 до 8 лет).

Питательные композиции изобретения могут быть, в частности, полезны в отношении усиления желудочно-кишечного барьера. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к питательной композиции, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в улучшении желудочно-кишечного барьера у младенцев (детей в возрасте до 12 месяцев) и/или детей младшего возраста (в возрасте от 1 года до 3 лет);

или

питательной композиции в форме молочной смеси третьего уровня, содержащей метаболиты ОГМ, для применения в улучшении желудочно-кишечного барьера у детей (в возрасте от 3 до 8 лет).

Поскольку в изобретении используется преимущество обработки in vitro ОГМ выделенной микробиотой вместо обработки in vivo микробиотой в желудочно-кишечном тракте субъекта, композиции считаются особенно полезными для младенцев или детей с нарушенной микробиотой. Таким образом, в одном варианте осуществления младенец или ребенок имеет нарушенную микробиоту. Действительно, таким младенцам или детям труднее метаболизировать ОГМ, входящие в их рацион.

В одном варианте осуществления нарушенная микробиота представляет собой несбалансированную микробиоту, имеющую аномально низкую долю Bifidobacterium, предпочтительно аномально низкую долю Bifidobacterium longum и/или Bifidobacterium bifidum, более предпочтительно аномально низкую долю Bifidobacterium bifidum и/или Bifibactrerium longum subsp. infantis.

В другом варианте осуществления нарушенная микробиота содержит менее 80%, предпочтительно менее 70%, более предпочтительно менее 60% актинобактерий и еще более предпочтительно бифидобактерий, причем такое процентное содержание приведено в расчете на общее количество бактерий в микробиоте.

В еще одном варианте осуществления нарушенная микробиота содержит менее 20%, предпочтительно менее 15%, более предпочтительно менее 10% Bifidobacterium bifidum, причем такое процентное содержание приведено в расчете на общее количество бактерий в микробиоте.

В одном варианте осуществления указанное улучшение желудочно-кишечного барьера представляет собой улучшенную барьерную структуру, улучшенную барьерную защиту, улучшенное восстановление барьера и/или улучшенную матурацию барьера.

В дополнительном варианте осуществления указанное улучшение желудочно-кишечного барьера представляет собой улучшенную барьерную структуру, улучшенную барьерную функцию и/или улучшенную барьерную защиту.

В еще одном варианте осуществления указанное улучшение желудочно-кишечного барьера представляет собой барьерную защиту.

В другом варианте осуществления указанное применение предназначено для повышения прочности желудочно-кишечного барьера, целостности желудочно-кишечного барьера, плотной соединительной структуры и/или целостности эпителиальной выстилки кишечника.

В другом варианте осуществления указанное применение предназначено для повышения барьерного сопротивления в желудочно-кишечном тракте, для снижения барьерной проницаемости в желудочно-кишечном тракте и/или для снижения восприимчивости к заболеванию.

В еще одном варианте осуществления упомянутое применение предназначено для предотвращения дисфункции барьера, предотвращения утечки барьера, защиты плотной соединительной структуры и/или защиты целостности выстилки эпителия кишечника.

В конкретном варианте осуществления указанное применение предназначено для повышения прочности желудочно-кишечного барьера, повышения барьерного сопротивления в желудочно-кишечном тракте, снижения восприимчивости к заболеванию, уменьшения тяжести симптомов после воспалительной провокации слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и/или снижения барьерной проницаемости в желудочно-кишечном тракте.

В сходном варианте осуществления упомянутое снижения барьерной проницаемости в желудочно-кишечном тракте представляет собой уменьшение количества патогенов, аллергенов и/или токсичных соединений, мигрирующих из кишечника в организм через кишечный барьер.

В одном варианте осуществления питательная композиция не содержит пробиотиков, таких как жизнеспособные пробиотики. Поскольку ОГМ уже были метаболизированы, пробиотики для этой цели не требуются.

Метаболиты ОГМ могут представлять собой метаболиты отдельных ОГМ или смеси двух или более различных ОГМ. Метаболиты смесей, более конкретно смесей, содержащих 2'FL и LNnT, считаются особенно преимущественными. Как видно из примеров, смеси (2'FL + LNnT и 2'FL + LNnT + DiFL + 3'SL + 6'SL + LNT) обеспечивают значительный положительный эффект после уже 48 часов лечения (и затем эффект сохраняется), тогда как эффект метаболитов 2'FL более эффективно действует в среднесрочной перспективе. Таким образом, в одном варианте осуществления применения изобретения предназначены для быстрого улучшения желудочно-кишечного барьера, например, в пределах 72 часов, предпочтительно в пределах 48 часов или, например, в пределах 24 часов.

В дополнительном варианте осуществления питательная композиция содержит метаболиты ОГМ, полученные из 0,004–5 г/л ОГМ, например 0,008–2,5 г/л, например 0,01–1 г/л, например 0,02–0,7 г/л или например 0,03–0,5 г/л. Метаболиты можно получать из ОГМ способом, описанным в настоящем документе.

Как указано выше, метаболиты могут быть получены путем ферментации в композиции, содержащей детскую микробиоту. Таким образом, в одном варианте осуществления метаболиты ОГМ получают/можно получать путем ферментации композиции, содержащей один или более ОГМ, в композиции, содержащей детскую микробиоту.

В еще одном варианте осуществления детская микробиота содержит по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% актинобактерий и более предпочтительно бифидобактерий. В сходном варианте осуществления детская микробиота содержит по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, более предпочтительно по меньшей мере 20% Bifidobacterium bifidum. Процентные доли определяются по числу от общего числа бактерий в микробиоте.

Аспект настоящего изобретения также относится к применению метаболитов ОГМ в качестве ингредиента в питательной композиции.

Как указано выше, а также представлено в разделе примеров, метаболиты ОГМ могут быть получены путем ферментации ОГМ детской микробиотой, предпочтительно детской микробиотой, напоминающей микробиоту младенца на грудном вскармливании. Таким образом, способ получения метаболитов ОГМ может включать:

a) получение первой композиции, содержащей один или более ОГМ;

b) получение второй композиции, содержащей детскую микробиоту;

c) смешивание указанной первой композиции и указанной второй композиции с получением третьей композиции;

d) ферментация указанной третьей композиции; таким образом,

e) получение четвертой композиции, содержащей один или более метаболитов ОГМ;

f) необязательно повторение стадий от a) до e); и

g) необязательно смешивание четвертой композиции, содержащей метаболиты ОГМ, с одной или более другими композициями, содержащими метаболиты ОГМ, такими как другие композиции, полученные/получаемые способом из стадий a) – e).

В одном варианте осуществления детская микробиота, используемая при ферментации, представляет собой фекальную микробиоту, выделенную у младенца в возрасте от 1 до 6 месяцев, например, от 2 до 4 месяцев, предпочтительно приблизительно 3 месяцев.

В другом варианте осуществления детская микробиота выделена из кала младенца, рожденного посредством вагинальных родов, предпочтительно в возрасте от 2 до 4 месяцев. Младенцы, рожденные посредством вагинальных родов, обычно имеют более здоровую микробиоту. Предпочтительно такой младенец представляет собой доношенного младенца, поскольку доношенные младенцы также обычно имеют более здоровую микробиоту.

В еще одном варианте осуществления детскую микробиоту получают путем продуцирования детской микробиоты, выделенной из кала младенца, рожденного посредством вагинальных родов, предпочтительно в возрасте от 2 до 4 месяцев. Младенцы, рожденные посредством вагинальных родов, обычно имеют более здоровую микробиоту. Предпочтительно такой младенец представляет собой доношенного младенца, поскольку доношенные младенцы также обычно имеют более здоровую микробиоту.

В еще одном варианте осуществления детская микробиота содержит по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% актинобактерий и более предпочтительно бифидобактерий. В сходном варианте осуществления детская микробиота содержит по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, более предпочтительно по меньшей мере 20% Bifidobacterium bifidum. Процентные доли определяются по числу от общего числа бактерий в микробиоте.

В одном варианте осуществления стадию ферментации d) выполняют в течение по меньшей мере 12 часов, например 12–48 часов, например 20–30 часов, например около 24 часов.

В еще одном варианте осуществления на указанной стадии ферментации d) смесь ежедневно дают с общим содержанием ОГМ в концентрации 0,005–10 г/л, например 0,05–10 г/л, например 0,5–10 г/л, например 1–10 г/л, например 3–7 г/л.

Стадию ферментации d предпочтительно проводят до тех пор, пока не будет обнаружено отсутствие интактных ОГМ с помощью способов, известных в данной области, таких как высокоэффективная анионообменная хроматография с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD).

В дополнительном варианте осуществления в способ дополнительно включает очистку метаболитов ОГМ, например посредством центрифугирования и/или концентрации культуральной среды.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию h) смешивания композиции, содержащей один или более метаболитов ОГМ, с питательной композицией для получения питательной композиции, содержащей метаболиты ОГМ.

В одном варианте осуществления метаболиты ОГМ получают/можно получать описанным выше способом.

В предпочтительном варианте осуществления метаболиты получают путем ферментации ОГМ, как описано в настоящем документе, более предпочтительно фукозилированного олигосахарида, N-ацетилированных олигосахаридов и/или сиалилированных олигосахаридов, как описано в настоящем документе. Такие ОГМ и количества являются следующими.

В одном варианте осуществления ОГМ содержат по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид. В ней может присутствовать один или несколько типов фукозилированного (-ых) олигосахарида (-ов). Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) можно фактически выбирать из перечня, включающего 2’-фукозиллактозу, 3’-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу (например, лакто-N-фукопентаозу I, лакто-N-фукопентаозу II, лакто-N-фукопентаозу III, лакто-N-фукопентаозу V), лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу I, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу (например, фукозиллакто-N-неогексаозу I, фукозиллакто-N-неогексаозу II), дифукозиллакто-N-гексаозу I, дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу I, дифукозиллакто-N-неогексаозу II, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу, три-фуко-пара-лакто-N-гексаозу I и любую их комбинацию.

В некоторых конкретных вариантах осуществления фукозилированный олигосахарид включает 2’-фукозил-эпитоп. Он может быть, например, выбран из перечня, включающего 2’-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу, лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-гексаозу дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу и любую их комбинацию.

Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (-гут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления его (их) можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических фукозилтрансфераз и/или фукозидаз, либо посредством применения метода ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае или микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида и/или смешанные культуры. Образование фукозилированного олигосахарида может быть инициировано акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления фукозилированные олигосахариды можно получать из лактозы и свободной фукозы с помощью химического синтеза. Фукозилированные олигосахариды также доступны, например от компании Kyowa, Hakko, Kogyo, Япония.

Метаболиты фукозилированных олигосахаридов, предназначенных для введения субъекту или для добавления в композицию, как правило, присутствуют в количестве на литр, соответствующем количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества фукозилированных олигосахаридов 0,01–3 г или 0,02–2 г, или 0,1–2,5 г, или 0,15–2 г, или 0,25–1,9 г, или 0,75–1,65 г, например, по меньшей мере 0,1 г, по меньшей мере 0,2 г, по меньшей мере 0,25 г, по меньшей мере 0,26 г, по меньшей мере 0,5 г, по меньшей мере 0,7 г, по меньшей мере 0,8 г, по меньшей мере 1 г, по меньшей мере 1,25 г, по меньшей мере 1,5 г или по меньшей мере 2 г.

Метаболиты фукозилированных олигосахаридов, предназначенных для введения субъекту или для добавления в композицию, как правило, присутствуют в количестве на 100 г твердой композиции, соответствующем количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества фукозилированных олигосахаридов 0,004–3,8 г или 0,008–2,3 г, например, 0,015–1,5 г или 0,08–1,9 г, или 0,12–1,5 г, или 0,15–1,5 г, или 0,19–1,5 г. В конкретном варианте осуществления количество метаболитов соответствует количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества фукозилированных олигосахаридов 0,075 г или 0,78 г, или 0,2 г. В другом конкретном варианте осуществления количество метаболитов соответствует количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества фукозилированных олигосахаридов по меньшей мере 0,01 г, по меньшей мере 0,02 г, по меньшей мере 0,05 г, по меньшей мере 0,1 г, по меньшей мере 0,2 г, по меньшей мере 0,25 г, по меньшей мере 0,4 г, по меньшей мере 0,5 г, по меньшей мере 0,75 г, по меньшей мере 0,9 г, по меньшей мере 1 г, по меньшей мере 1,5 г, по меньшей мере 2 г или по меньшей мере 3 г.

Метаболиты фукозилированных олигосахаридов для добавления в питательную композицию, как правило, обеспечивают в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, потребляющего его суммарную суточную дозу, соответствующую количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества фукозилированных олигосахаридов 0,003–6,5 г, предпочтительно 0,006–3,9 г, например 0,012–2,6 г. Считается, что для достижения желаемого эффекта необходимо минимальное количество метаболитов фукозилированного олигосахарида.

Метаболиты фукозилированных олигосахаридов для добавления в питательную композицию, как правило, обеспечивают в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для недоношенного младенца с низким весом при рождении или маленьким для своего гестационного возраста, потребляющего его суммарную суточную дозу на кг массы тела, соответствующую количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества фукозилированных олигосахаридов от 0,05 до 1 г, предпочтительно 0,06–0,9 г, или 0,07–0,8 г, или 0,08–0,7 г, или 0,09–0,6 г, или 0,1–0,5 г, или 0,2–0,4 г, наиболее предпочтительно 0,34 г.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ОГМ состоят из 2'-фукозиллактозы (2FL).

В отдельном варианте осуществления настоящего изобретения ОГМ содержат 2'-фукозиллактозу (2FL) и другой олигосахарид, предпочтительно N-ацетилированный олигосахарид, более предпочтительно лакто-N-неотетраозу (LNnT) или лакто-N-тетраозу (LNT). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ОГМ содержат 2’-фукозиллактозу (2FL) и лакто-N-неотетраозу (LNnT).

В другом конкретном варианте осуществления ОГМ может содержать сиалилированный(-ые) олигосахарид(-ы). В ней может присутствовать один или несколько сиалилированных олигосахаридов. Сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (-гут) быть выбран (-ы) из группы, включающей 3’-сиалиллактозу (3-SL), 6’-сиалиллактозу (6-SL) и любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения ОГМ содержит 3-SL и 6-SL. В некоторых конкретных вариантах осуществления соотношение 3’-сиалиллактозы (3-SL) и 6’-сиалиллактозы (6-SL) может находиться в диапазоне от 5 : 1 до 1 : 10 или от 3 : 1 до 1 : 1, или от 1 : 1 до 1 : 10. В некоторых конкретных вариантах осуществления сиалилированный олигосахарид композиции представляет собой 6'-сиалиллактозу (6-SL).

Сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (-гут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления их можно получать с помощью биотехнологических средств с применением специфических сиалилтрансфераз или сиалилдаз, нейраминидаз либо методом ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), путем химического синтеза либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида или смешанные культуры. Образование сиалилированных олигосахаридов можно инициировать акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления сиалиллактозы можно получать путем химического синтеза из лактозы и свободной N’-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты). Сиалиллактозы также доступны в продаже, например производства Kyowa Hakko Kogyo, Япония.

Метаболиты сиалилированных олигосахаридов, предназначенных для введения субъекту или для добавления в композицию, как правило, присутствуют в количестве на литр, соответствующем количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества сиалилированных олигосахаридов 0,005–5 г или 0,008–2,5 г, или 0,01–1 г, или 0,02–0,7 г, например 0,03–0,5 г.

Метаболиты сиалилированных олигосахаридов, предназначенных для введения субъекту или для добавления в композицию, как правило, присутствуют в количестве на 100 г твердой композиции, соответствующем количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества сиалилированных олигосахаридов 0,004–3,8 г, например, 0,006–1,9 г или 0,008–0,8 г, или 0,015–0,5 г, например 0,023–0,4 г.

В некоторых конкретных вариантах осуществления метаболиты сиалилированных олигосахаридов, предназначенных для введения субъекту или для добавления в композицию, как правило, присутствуют в количестве на 100 г твердой композиции, соответствующем количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества менее 0,1 г.

В конкретном варианте осуществления метаболиты сиалилированных олигосахаридов для добавления в питательную композицию, как правило, обеспечивают в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно, ребенка, потребляющего его общую суточную дозу, соответствующую количеству метаболитов, полученному путем ферментации общего количества сиалилированных олигосахаридов 0,003–6,5 г, предпочтительно 0,005–3,3 г или 0,006–1,3 г, или 0,01–0,9 г, например 0,018–0,65 г.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ОГМ не содержит никаких (-ого) сиалилированных (-ого) олигосахаридов (-а).

В одном варианте осуществления ОГМ содержит по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид. N-ацетилированный олигосахарид предпочтительно представляет собой лакто-N-неотетраозу (LNnT), лакто-N-тетраозу (LNT), пара-лакто-N-неогексаозу (пара-LNnH), дисиалиллакто-N-неотетраозу (DSLNT) или любую их комбинацию. N-ацетилированный олигосахарид более предпочтительно представляет собой LNnT.

В одном варианте осуществления метаболиты N-ацетилированных олигосахаридов, предназначенных для введения субъекту или для добавления в композицию, как правило, присутствуют в количестве на литр, соответствующем количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества N-ацетилированных олигосахаридов в диапазоне от 0,025–1,5 г, предпочтительно по меньшей мере 0,1 г или по меньшей мере 0,25 г.

Метаболиты N-ацетилированных олигосахаридов, предназначенных для введения субъекту или для добавления в композицию, как правило, присутствуют в количестве на 100 г твердой композиции, соответствующем количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества N-ацетилированных олигосахаридов 0,003–0,23 г, предпочтительно по меньшей мере 0,015 г или по меньшей мере 0,03 г.

N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) можно синтезировать химическим путем с помощью ферментативного переноса сахаридных звеньев с донорных фрагментов на акцепторные фрагменты с использованием гликозилтрансфераз, как описано, например, в патенте США № 5,288,637 и WO 96/10086. В альтернативном варианте осуществления LNT и LNnT можно получать путем химического превращения кетогексоз (например, фруктозы), либо свободных, либо связанных с олигосахаридом (например, лактулозой), в N-ацетилгексозамин или N-ацетилгексозамин-содержащий олигосахарид, как описано в Wrodnigg, T.M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38:827–828. Полученный таким образом N-ацетиллактозамин можно затем переносить на лактозу в качестве акцепторного фрагмента.

В конкретном варианте осуществления N-ацетилированный олигосахарид содержится в питательной композиции настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–3,9 г, предпочтительно 0,006–3,25 г, или 0,03–1,95 г, или 0,03–1,3 г, или 0,03–1 г, например 0,05–1 г.

Метаболиты N-ацетилированных олигосахаридов для добавления в питательную композицию, как правило, обеспечивают в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для недоношенного младенца с низким весом при рождении или маленьким для своего гестационного возраста, потребляющего его суммарную суточную дозу на кг массы тела, соответствующую количеству метаболитов, полученных путем ферментации общего количества N-ацетилированных олигосахаридов от 0,005 до 0,1 г, предпочтительно 0,006–0,09 г или 0,007–0,08 г, или 0,008–0,07 г, или 0,009–0,06 г, или 0,01–0,05 г, или 0,02–0,04 г, наиболее предпочтительно 0,034 г.

В варианте осуществления ОГМ содержат один или более ОГМ, выбранных из группы, состоящей из 2'FL, DiFL, 3'SL, 6'SL, LNT и LNnT.

В варианте осуществления ОГМ содержат смесь фукозилированных олигосахаридов и N-ацетилированных олигосахаридов. В сходном варианте осуществления ОГМ содержит 2'FL и/или LNnT, предпочтительно 2'FL и LNnT.

В другом предпочтительном варианте осуществления ОГМ содержат смесь олигосахаридов, состоящую из 2’-фукозиллактозы (2-FL) и лакто-N-неотетраозы (LNnT). Иными словами, ОГМ в качестве фукозилированного олигосахарида содержит только 2’-фукозиллактозу (2-FL) и в качестве N-ацетилированного олигосахарида — только лакто-N-неотетраозу (LNnT). Более предпочтительно, чтобы ОГМ в качестве олигосахаридов грудного молока содержали только 2'-фукозиллактозу (2-FL) и лакто-N-неотетраозу (LNnT).

Если ОГМ содержат смесь фукозилированных олигосахаридов и N-ацетилированных олигосахаридов, метаболиты таких ОГМ, как правило, присутствуют в соотношении «метаболиты N-ацетилированного(-ых) олигосахарида(-ов):метаболиты фукозилированного(-ых)олигосахарида(-ов)» от 1:20 до 2:1, предпочтительно от 1:15 до 1:1, наиболее предпочтительно от 1:10 до 1:2. В особенно преимущественном варианте осуществления такое соотношение равно (или приблизительно равно) 1:2, 1:5 или примерно 1:10.

В предпочтительном варианте осуществления ОГМ содержат 2'FL, DiFL, 3'SL, 6'SL, LNT и LNnT.

В другом варианте осуществления упомянутые ОГМ не содержат ОГМ, отличных от 2'FL, DiFL, 3'SL, 6'SL, LNT и LNnT, или содержат ОГМ, отличные от 2'FL, DiFL, 3'SL, 6'SL, LNT и LNnT в общем количестве менее чем 0,1% (мас./мас.), предпочтительно таком как менее чем 0,01% (мас./мас.) или более предпочтительно таком как менее чем 0,001% (мас./мас.). В другом варианте осуществления упомянутые ОГМ не содержат ОГМ, отличных от 2'FL и/или LNnT, или содержат ОГМ, отличные от 2'FL и/или LNnT, в общем количестве менее 0,1% (мас./мас.), предпочтительно, например, менее 0,01% (мас./мас.) или более предпочтительно, например, менее 0,001% (мас./мас.).

Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением может также содержать другие типы олигосахарида (-ов) (т. е. отличающийся (-иеся) от указанных выше олигосахаридов грудного молока) и/или по меньшей мере волокно (-а), и/или по меньшей мере его (их) предшественник (-и). Другой олигосахарид, и/или волокно, и/или их предшественник могут быть выбраны из перечня, включающего галактоолигосахариды (GOS), фруктоолигосахариды (FOS), инулин, ксилоолигосахариды (XOS), полидекстрозу и любую их комбинацию. Они могут присутствовать в количестве от 0 до 10 мас.% композиции. В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет может также включать по меньшей мере один олигосахарид коровьего молока (BMO).

Подходящие доступные в продаже продукты, которые можно применять для получения питательных композиций или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением, включают в себя комбинации FOS с инулином, такие как продукт, продаваемый компанией BENEO под товарным знаком Orafti, или полидекстрозу, продаваемую компанией Tate & Lyle под товарным знаком STA-LITE®.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением может также необязательно включать по меньшей мере один предшественник олигосахарида. В нем может присутствовать один или несколько прекурсоров олигосахарида. Например, прекурсором олигосахарида грудного молока является сиаловая кислота, фукоза или их смесь. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция содержит сиаловую кислоту.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения может дополнительно включать по меньшей мере один пробиотик (или пробиотический штамм), такой как пробиотический бактериальный штамм.

Чаще всего применяют пробиотические микроорганизмы, которые главным образом представляют собой бактерии и дрожжи следующих родов: Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. и Saccharomyces spp.

В некоторых конкретных вариантах осуществления пробиотик представляет собой пробиотический бактериальный штамм. В некоторых конкретных вариантах осуществления он представляет собой, в частности, штаммы Bifidobacteria и/или Lactobacilli.

Подходящие пробиотические бактериальные штаммы включают Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 производства Valio Oy, Финляндия, под товарным знаком LGG; Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116, Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Streptococcus salivarius DSM 13084, продаваемые BLIS Technologies Limited, Новая Зеландия, под названием KI2; Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, продаваемый в числе прочих Christian Hansen, Дания, под товарным знаком Bb 12; Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, продаваемый компанией Morinaga Milk Industry Co. Ltd., Япония, под товарным знаком BB536; Bifidobacterium breve, продаваемый Danisco под товарным знаком Bb-03; Bifidobacterium breve, продаваемый Morinaga под товарным знаком M-16V; Bifidobacterium infantis, продаваемый Procter & GambIe Co. под товарным знаком Bifantis; и Bifidobacterium breve, продаваемый Institut Rosell (Lallemand) под товарным знаком R0070.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением может включать от 10e3 до 10e12 КОЕ пробиотического штамма, более предпочтительно от 10e7 до 10e12 КОЕ, например от 10e8 до 10e10 КОЕ, пробиотического штамма на грамм композиции в расчете на массу сухого вещества.

В одном варианте осуществления пробиотики являются жизнеспособными. В другом варианте осуществления пробиотики являются неразмножающимися или инактивированными. В некоторых других вариантах осуществления можно использовать как жизнеспособные пробиотики, так и инактивированные пробиотики. Также можно добавлять пробиотические компоненты и метаболиты.

В одном варианте осуществления питательная композиция изобретения является полной питательной композицией (удовлетворяющей все или большинство потребностей субъекта в питании). В другом варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку или обогатитель, предназначенные, например, для дополнения человеческого грудного молока или для дополнения детской смеси или смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.

В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция изобретения представляет собой детскую смесь, обогатитель или добавку, которые могут предназначаться для первых 4, 6 или 12 месяцев жизни. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. Действительно, считается, что вмешательство в питание изобретения может быть наиболее эффективным при воздействии на раннюю стадию жизни (например, в возрасте первых 1, 4, 6, 12 месяцев).

Питательная композиция в соответствии с изобретением может, например, представлять собой детскую смесь, начальную детскую смесь, смесь для прикармливаемых детей или смесь последующего уровня, молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, детское питание, детскую композицию на зерновой основе, обогатитель, такой как обогатитель человеческого грудного молока, или добавку. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция изобретения представляет собой детскую смесь, обогатитель или добавку, которые могут предназначаться для первых 4 или 6 месяцев жизни. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь.

В некоторых других вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой обогатитель. Обогатитель может представлять собой обогатитель грудного молока (например, обогатитель человеческого грудного молока) или обогатитель смеси, такой как обогатитель детской смеси или обогатитель смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.

Если питательная композиция представляет собой добавку, она может быть обеспечена в форме стандартных доз. В таких случаях особенно полезно определить количество метаболитов ОГМ и необязательно других олигосахаридов в отношении суточной дозы для введения младенцу или ребенку младшего возраста, как описано выше.

Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой (например, в форме порошка), жидкой или клейстеризованной форме.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку в форме порошка и предложена в пакете-саше, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости, например жидкости, предназначенной для выдачи в виде капель в грудное молоко, или в питательную композицию, или непосредственно в рот младенца или ребенка младшего возраста.

В другом варианте осуществления добавка может дополнительно содержать носитель, защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы стенок/оболочек, соединения матриц, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т. п.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, маскирующие вкус агенты, утяжеляющие агенты, желирующие агенты и гелеобразующие агенты. Добавка также может содержать традиционные фармацевтические добавки и вспомогательные вещества, эксципиенты и разбавители, включая, без ограничений, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизирующие агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, смазывающие вещества, красители, увлажняющие агенты, наполнители и т. п. Если добавка находится в форме порошка, она может включать носитель. Однако предпочтительно, чтобы носитель в добавке отсутствовал. Если добавка находится в форме сиропа, ОГМ предпочтительно растворяют или суспендируют в воде, подкисленной цитратом.

Дополнительно добавка может содержать витамины, минеральные вещества, микроэлементы и другие микроэлементы в соответствии с рекомендациями государственных органов, такими как рекомендуемые нормы потребления (RDA) США.

Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой (например, в форме порошка), жидкой или клейстеризованной форме. В конкретном варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку, содержащую метаболиты ОГМ, причем добавка находится в порошковой форме и предложена в пакете-саше, предпочтительно в пакете-саше с метаболитами, полученными из 0,005–5 г/л ОГМ, метаболизированных в соответствии со способами изобретения на пакет-саше, или в форме сиропа, предпочтительно сиропа с общей концентрацией твердых веществ от 5 до 75 г/100 мл (от 5 до 75% (масс./об.)). Если добавка находится в форме порошка, она может включать носитель. Однако предпочтительно, чтобы носитель в добавке отсутствовал. Если добавка находится в форме сиропа, ОГМ предпочтительно растворяют или суспендируют в воде, подкисленной цитратом.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением обычно содержит источник белка. Белок может содержаться в количестве от 1,6 до 3 г на 100 ккал. В некоторых вариантах осуществления, в частности когда композиция предназначена для преждевременно родившихся младенцев, количество белка может составлять от 2,4 до 4 г / 100 ккал или более 3,6 г / 100 ккал. В некоторых других вариантах осуществления количество белка может быть ниже 2,0 г на 100 ккал, например от 1,8 до 2 г/100 ккал, или белок может содержаться в количестве ниже 1,8 г на 100 ккал.

Тип белка не считается критическим для настоящего изобретения при условии, что соблюдены минимальные требования по содержанию незаменимых аминокислот и обеспечен удовлетворительный рост. Таким образом, можно применять источники белка на основе молочной сыворотки, казеина и их смесей, а также источники белка на основе сои. Что касается сывороточных белков, источник белка может быть основан на кислой молочной сыворотке или сладкой молочной сыворотке или их смесях и может включать альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых желаемых пропорциях.

В некоторых преимущественных вариантах осуществления в источнике белка преобладает молочная сыворотка (т. е. более 50% белков происходят из сывороточных белков, например 60% или 70%).

Белки могут быть нативными или гидролизованными, либо они могут представлять собой смесь нативных и гидролизованных белков. Под термином «нативный» подразумевают, что основная часть белков является нативной, т. е. их молекулярная структура не изменена, например не изменено по меньшей мере 80% белков, например не изменено по меньшей мере 85% белков, предпочтительно не изменено по меньшей мере 90% белков, еще более предпочтительно не изменено по меньшей мере 95% белков, например не изменено по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления не изменено 100% белков.

Термин «гидролизованный» в контексте настоящего изобретения означает белок, который был гидролизован или расщеплен на составляющие его аминокислоты. Белки могут быть полностью или частично гидролизованными. Может быть желательным вводить частично гидролизованные белки (степень гидролиза от 2 до 20%), например младенцам или детям младшего возраста, предположительно подверженным риску развития аллергии на коровье молоко. При необходимости использования гидролизованных белков процесс гидролиза можно проводить по желанию и способом, известным в данной области. Например, гидролизаты сывороточного белка можно получать ферментативным гидролизом фракции молочной сыворотки в одну или более стадий. Если фракция молочной сыворотки, применяемая в качестве исходного материала, по существу, не содержит лактозы, то установлено, что в процессе гидролиза блокировка лизина белка проявляется в гораздо меньшей степени. Это позволяет снизить степень блокировки лизина с около 15 мас.% общего лизина до менее около 10 мас.% лизина; например до около 7 мас.% лизина, что значительно улучшает питательное качество источника белка.

В одном варианте осуществления изобретения гидролизовано по меньшей мере 70% белков, предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 80% белков, например гидролизовано по меньшей мере 85% белков, еще более предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 90% белков, например гидролизовано по меньшей мере 95% белков, в частности гидролизовано по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления гидролизовано 100% белков.

В одном конкретном варианте осуществления белки питательной композиции гидролизованы, полностью гидролизованы или частично гидролизованы. Степень гидролиза (DH) белка может составлять от 8 до 40, или от 20 до 60, или от 20 до 80, или более 10, 20, 40, 60, 80 или 90.

В альтернативном варианте осуществления белковый компонент может быть заменен смесью или искусственной аминокислотой, например для недоношенных младенцев или младенцев с низким весом при рождении.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную композицию. В другом конкретном варианте осуществления композиция в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит источник углеводов. Это особенно предпочтительно в том случае, когда питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае можно применять любой источник углеводов, обычно находящийся в детских смесях, такой как лактоза, сахароза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси, хотя одним из предпочтительных источников углеводов является лактоза.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит источник липидов. Это особенно важно, если питательная композиция настоящего изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае источником липидов может быть любой липид или жир, который подходит для применения в детских смесях. Некоторые подходящие источники жира включают пальмовое масло, структурированное триглицеридное масло, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, масло триглицерида средней цепи. Можно также добавлять незаменимые жирные кислоты — линолевую кислоту и α-линоленовую кислоту, а также небольшие количества масел, содержащих большие количества арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в готовом виде, например рыбьи жиры или микробные масла. Соотношение n-6 и n-3 жирных кислот в источнике жира может составлять от около 5 : 1 до около 15 : 1; например от около 8 : 1 до около 10 : 1.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать все витамины и минеральные вещества, считающиеся обязательными в повседневном рационе питания, в значимых с точки зрения питания количествах. Для некоторых витаминов и минеральных веществ установлены минимальные требования. Примеры минеральных веществ, витаминов и других питательных веществ, которые необязательно присутствуют в композиции изобретения, включают витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозит, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлор, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минеральные вещества обычно добавляют в форме солей. Присутствие и количества конкретных минеральных веществ и других витаминов будут варьироваться в зависимости от предполагаемой популяции.

Если это необходимо, питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соя, лецитин, моно- и диглицериловые сложные эфиры лимонной кислоты и т. п.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать другие вещества, которые могут оказывать благоприятное воздействие, такие как лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и т. п.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать каротиноид (-ы). В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения питательная композиция изобретения не содержит каротиноидов.

Питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением можно получать любым подходящим способом. Далее композиция будет описана на конкретном примере.

Например, смесь, такую как детская смесь, можно получать путем смешивания источника белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих пропорциях. На данном этапе можно включать эмульгаторы в случае их применения. На данном этапе можно добавлять витамины и минеральные вещества, но обычно их добавляют позднее для предотвращения термического разложения. Перед смешиванием в источнике жира можно растворять любые липофильные витамины, эмульгаторы и т. п. Затем можно домешивать воду, предпочтительно очищенную обратным осмосом, с образованием жидкой смеси. Температура воды для удобства находится в диапазоне от около 50°С до около 80°С для облегчения диспергирования ингредиентов. Для образования жидкой смеси можно применять доступные в продаже разжижители.

На данном этапе можно добавлять фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы), особенно если конечный продукт должен иметь жидкую форму. Если конечный продукт должен представлять собой порошок, эти компоненты при желании также можно добавлять на данной стадии.

Затем жидкую смесь гомогенизируют, например в две стадии.

Затем жидкую смесь можно термически обрабатывать для снижения бактериальной нагрузки путем быстрого нагрева жидкой смеси, например до температуры в диапазоне от около 80°C до около 150°C в течение периода времени от около 5 секунд до около 5 минут. Нагревание можно осуществлять путем нагнетания пара с помощью автоклава или теплообменника, например пластинчатого теплообменника.

Затем жидкую смесь можно охлаждать до температуры от около 60°C до около 85°C, например путем мгновенного охлаждения. Затем жидкую смесь можно снова гомогенизировать, например в две стадии: под давлением в диапазоне от около 10 МПа до около 30 МПа на первой стадии и от около 2 МПа до около 10 МПа на второй стадии. Затем гомогенизированную смесь можно дополнительно охлаждать для добавления любых термочувствительных компонентов, таких как витамины и минеральные вещества. На данном этапе для удобства регулируют рН и содержание твердых веществ в гомогенизированной смеси.

Если конечный продукт должен представлять собой порошок, гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, например в распылительную сушилку или сублимационную сушилку, и превращают в порошок. Влагосодержание порошка должно составлять менее около 5 мас.%. Также на этой стадии или в альтернативном варианте осуществления можно добавлять метаболиты путем сухого смешивания или путем перемешивания их в форме сиропа из кристаллов, вместе с пробиотическим (-ими) штаммом (-ами) (при использовании), и смесь подвергают распылительной сушке или сублимационной сушке.

Если предпочтительна жидкая композиция, гомогенизированную смесь можно стерилизовать, а затем асептически разливать в подходящие контейнеры, либо можно сначала разливать в контейнеры, а затем стерилизовать в автоклаве.

В другом варианте осуществления композиция изобретения может представлять собой добавку. Добавка может быть представлена, например, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости. Добавка может дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы стенок/оболочек, соединения матриц, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т. п.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, маскирующие вкус агенты, утяжеляющие агенты, желирующие агенты и гелеобразующие агенты. Добавка также может содержать традиционные фармацевтические добавки и вспомогательные вещества, эксципиенты и разбавители, включая, без ограничений, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизирующие агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, смазывающие вещества, красители, увлажняющие агенты, наполнители и т. п.

Дополнительно добавка может содержать органический или неорганический материал-носитель, подходящий для перорального или парентерального введения, а также витамины, минеральные микроэлементы и другие микроэлементы в соответствии с рекомендациями государственных органов, такими как рекомендуемые нормы потребления (RDA) США.

Питательная композиция в соответствии с изобретением предназначена для применения у младенцев или детей младшего возраста. Младенцы или дети младшего возраста могут быть рожденными в срок или недоношенными. В конкретном варианте осуществления питательная композиция изобретения предназначена для применения у младенцев или детей младшего возраста, родившихся недоношенными, имеющих низкий вес при рождении и/или родившихся маленькими для своего гестационного возраста (SGA). В конкретном варианте осуществления питательная композиция изобретения предназначена для применения у недоношенных младенцев, младенцев, имеющих низкий вес при рождении, и/или младенцев, родившихся маленькими для своего гестационного возраста (SGA).

Питательную композицию настоящего изобретения можно также применять у младенцев или детей младшего возраста, рожденных посредством кесарева сечения или посредством вагинальных родов.

В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с изобретением может быть предназначена для применения до и/или во время периода отлучения от груди.

Возраст для введения (или применения) питательной композиции или вскармливания ей, а также продолжительность такого введения зависят от потребностей.

Питательную композицию можно, например, давать младенцам сразу же после рождения. Композицию изобретения также можно давать в течение первой недели жизни младенца, или в течение первых 2 недель жизни, или в течение первых 3 недель жизни, или в течение первого месяца жизни, или в течение первых 2 месяцев жизни, или в течение первых 3 месяцев жизни, или в течение первых 4 месяцев жизни, или в течение первых 6 месяцев жизни, или в течение первых 8 месяцев жизни, или в течение первых 10 месяцев жизни, или в течение первого года жизни, или в течение первых двух лет жизни, или даже дольше. В некоторых особенно преимущественных вариантах осуществления изобретения питательную композицию дают (или вводят) младенцу в течение первых 4, 6 или 12 месяцев после рождения указанного младенца. В некоторых других вариантах осуществления питательную композицию изобретения дают в течение нескольких дней (например, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20 и т. д.), или нескольких недель (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т. д.), или нескольких месяцев (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т. д.) после рождения. В первую очередь это может быть актуально, но не обязательно, в том случае, когда младенец родился преждевременно.

В одном варианте осуществления композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве композиции, добавочной по отношению к материнскому молоку. В некоторых вариантах осуществления изобретения младенец или ребенок младшего возраста получает материнское молоко в течение по меньшей мере первых 2 недель, первых 1, 2, 4 или 6 месяцев. В одном варианте осуществления питательную композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста после такого периода питания материнским молоком или дают во время такого периода питания материнским молоком. В другом варианте осуществления изобретения композицию дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве единственной или основной питательной композиции в течение по меньшей мере одного периода времени, например после 1-го, 2-го или 4-го месяца жизни, в течение по меньшей мере 1, 2, 4 или 6 месяцев.

В одном варианте осуществления питательная композиция изобретения является полной питательной композицией (удовлетворяющей все или большинство потребностей субъекта в питании). В другом варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку или обогатитель, предназначенные, например, для дополнения человеческого грудного молока или для дополнения детской смеси или смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.

Дополнительно в контексте изобретения термины «содержащий» или «содержит» не исключают других возможных элементов. Композиция настоящего изобретения, включая многие варианты осуществления, описанные в настоящем документе, может содержать существенные элементы и ограничения изобретения, описанные в настоящем документе, а также любые дополнительные или необязательные ингредиенты, компоненты или ограничения, описанные в настоящем документе или иным образом, в зависимости от потребностей, состоять или по существу состоять из них.

Любую ссылку на документы предшествующего уровня техники в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такой предшествующий уровень техники широко известен или составляет часть общеизвестных знаний в данной области.

Более подробное описание изобретения будет представлено ниже. Следует отметить, что различные аспекты, признаки, примеры и варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, могут быть совместимыми и/или скомбинированными друг с другом.

Все патентные и непатентные ссылки, цитируемые в настоящей заявке, настоящим полностью включены путем ссылки.

Настоящее изобретение будет дополнительно подробно описано в представленных ниже примерах, не имеющих ограничительного характера.

Пример 1. Получение метаболитов ОГМ

Метаболиты ОГМ получали путем культивирования трехмесячной микробиоты младенцев, находящихся на грудном вскармливании, в непрерывной модели желудочно-кишечного тракта человека, называемой стимулятором кишечной микробной экосистемы человека (SHIME), полученной от компании ProDist, Gent, Бельгия. Четыре отдельных сосуда для культивирования SHIME инокулировали одной и той же микробиотой ребенка. Через 2 недели стабилизации микробиоты в сосуды микробиоты SHIME поступали 2'FL, 2'FL-LNnT или комбинация 6 ОГМ (2'FL, 3'SL, 6'SL, LNT, LNnT и DiFL) каждый день в концентрации 5 г/л в течение 21 дня.

Соотношения различных ОГМ в смеси 6 ОГМ были следующими:

Таблица 1. Соотношения ОГМ в смеси, содержащей 6 ОГМ

2'FL 3'SL 6’-SL LNnT LNT DiFL 0,55 0,07 0,09 0,05 0,18 0,06

Ферментированную культуральную среду в каждом сосуде для микробиоты собирали перед первым кормлением, а затем через 2 и 21 день после первого кормления. Затем все ферментированные культуральные среды центрифугировали и собирали надосадочную жидкость, содержащую метаболиты.

Пример 2. Композиция, содержащая метаболиты 2'FL

Метаболиты 2'FL получали так, как описано в примере 1. Полученную надосадочную жидкость смешивали с жидкой композицией детской смеси, представленной в таблице 2, в количестве 1 части надосадочной жидкости на 9 частей детской смеси. Один литр полученной детской смеси содержит метаболиты, соответствующие 0,5 г 2'FL.

Таблица 2. Состав детской смеси согласно примеру 2

Питательные вещества Количество на литр Энергетическая ценность (ккал) 744 Белок (г) 13,7 Жир (г) 39,7 Линолевая кислота (г) 5,9 α-Линоленовая кислота (мг) 750 Лактоза (г) 83 Минеральные вещества (г) 2,8 Na (мг) 167 K (мг) 656 Cl (мг) 478 Ca (мг) 456 P (мг) 233 Mg (мг) 56 Mn (мкг) 56 Se (мкг) 14 Витамин A (мкг РЭ) 778 Витамин D (мкг) 11 Витамин E (мг, ТЭ) 6 Витамин K1 (мкг) 60 Витамин С (мг) 74 Витамин В1 (мг) 0,52 Витамин В2 (мг) 1,1 Ниацин (мг) 7,4 Витамин В6 (мг) 0,56 Фолиевая кислота (мкг) 67 Пантотеновая кислота (мг) 3 Витамин B12 (мкг) 2 Биотин (мкг) 17 Холин (мг) 74 Fe (мг) 9 I (мкг) 111 Cu (мг) 0,4 Zn (мг) 6

Пример 3. Композиция, содержащая метаболиты 2'FL и LNnT

Метаболиты 2'FL и LNnT получали, как описано в примере 1. Полученную надосадочную жидкость смешивали с жидкой композицией детской смеси, представленной в таблице 3, в количестве 3 части надосадочной жидкости на 7 частей детской смеси.

Таблица 3. Состав детской смеси согласно примеру 3

Питательные вещества Количество на литр Энергетическая ценность (ккал) 957 Белок (г) 17,6 Жир (г) 51 Линолевая кислота (г) 7,6 α-Линоленовая кислота (мг) 964,3 Лактоза (г) 106,7 Минеральные вещества (г) 3,6 Na (мг) 214 K (мг) 842 Cl (мг) 614 Ca (мг) 586 P (мг) 300 Mg (мг) 71 Mn (мкг) 71 Se (мкг) 19 Витамин A (мкг РЭ) 1000 Витамин D (мкг) 14 Витамин E (мг, ТЭ) 7,7 Витамин K1 (мкг) 77 Витамин С (мг) 96 Витамин В1 (мг) 0,67 Витамин В2 (мг) 1,4 Ниацин (мг) 9,6 Витамин В6 (мг) 0,71 Фолиевая кислота (мкг) 86 Пантотеновая кислота (мг) 4 Витамин B12 (мкг) 3 Биотин (мкг) 21 Холин (мг) 96 Fe (мг) 11 I (мкг) 143 Cu (мг) 0,6 Zn (мг) 7

Пример 4. Влияние метаболитов ОГМ на желудочно-кишечный барьер

Цель исследования

Протестировать 2'FL, 2'FL + LNnT и комбинацию 6 ОГМ (2'FL, 3'SL, 6'SL, LNT, LNnT и DiFL) в отношении их способности опосредованно (посредством продуктов ферментации микробиоты) защищать и усиливать эпителиальный барьер до и после воспалительной провокации в модели клеток эпителия кишечника, содержащих клетки Caco-2 и HT29-MTX.

Способы

Для исследований эпителиального барьера клеточные линии Caco-2 и HT29-MTX человека получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур (ECACC) соответственно. Клетки Caco-2 и HT29-MTX культивировали отдельно в культуральных колбах при 37^OC в увлажненной атмосфере, содержащей 10% CO₂, в минимальной эссенциальной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) с добавлением GlutaMAX (Invitrogen), 1% минимальной эссенциальной среды, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина и инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; 15% для Caco-2 и 10% для HT29-MTX).

Для подготовки сокультивирования для изучения эпителиального барьера каждую клеточную линию размножали в соответствующих колбах до достижения 90% конфлюэнтных монослоев. Затем клеточные линии трипсинизировали 1-кратным трипсином. Сокультивирование Caco-2 и HT29-MTX высевали с плотностью 6 x 10⁴/см² на полупроницаемые мембраны из поликарбоната трансвел площадью 1,12 см² (0,4 мкм) и выращивали в среде DMEM с добавлением GlutaMAX, 1% минимальной эссенциальной среды, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина и 10% инактивированной нагреванием FBS в течение 21 дня.

В день эксперимента среду заменяли свежей средой за по меньшей мере 4 часа до обработки. Сначала совместные культуры предварительно обрабатывали ферментированной средой, собранной из экспериментов SHIME. В частности, ферментированные среды из детской микробиоты с поступлением 2'FL, 2' FL-LNnT или комбинацией 6 ОГМ (HMO6) (2'FL, 3'SL, 6'SL, LNT, LNnT и DiFL), добавляли в апикальное отделение трансвел в концентрации 20% об./об. В качестве контроля использовали неферментированную культуральную среду SHIME (без микробиоты ребенка). После 36 часов предварительной обработки дисфункцию эпителиального барьера индуцировали путем добавления TNF-α (2,5 нг/мл) и IFN-γ (10 нг/мл) в базолатеральное отделение трансвел в течение дополнительных 48 часов. В ходе эксперимента трансэпителиальное электрическое сопротивление непрерывно измеряли с помощью прибора Cellzscope. В конце эксперимента перемещение меченного FITC декстрана (4000 Да) из апикального в базолатеральное отделение количественно определяли в течение 2 часов.

Результаты

На Фиг. 1 показана эффективность продуктов ферментации ОГМ для обеспечения профилактической защиты эпителиального барьера. Можно видеть, что наибольшая эффективность достигается при использовании метаболитов только 2'FL и LNnT.

На Фиг. 2 показана эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении индукции резистентности к дисфункции эпителиального барьера, вызванной воспалением. Опять же, можно видеть, что наибольшая эффективность достигается при использовании метаболитов только 2'FL и LNnT.

На Фиг. 3 показана эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении ограничения восприимчивости к дисфункции эпителиального барьера, вызванной воспалением. Опять же, можно видеть, что наибольшая эффективность достигается при использовании метаболитов только 2'FL и LNnT.

На Фиг. 4 показана эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении уменьшения тяжести симптомов дисфункции эпителиального барьера, вызванного воспалением. Опять же, можно видеть, что наибольшая эффективность достигается при использовании метаболитов только 2'FL и LNnT.

На Фиг. 5 показана эффективность продуктов ферментации ОГМ в отношении уменьшения тяжести симптомов дисфункции эпителиального барьера, вызванного воспалением.

Заключение

В целом эти данные показывают, что метаболиты ОГМ и, в частности, метаболиты 2'FL, 3'SL, 6'SL, LNT, LNnT и DiFL, и, более конкретно, 2'FL и LNnT, эффективны для усиления желудочно-кишечного барьера.

Метаболиты смесей являются особенно предпочтительными, поскольку данные показывают, что смеси обеспечивают значительный положительный эффект уже после 48 часов обработки (и эффект сохраняется), тогда как эффект метаболитов 2'FL более эффективно действуют в среднесрочной перспективе.

Изобретение относится к питательным композициям, содержащим метаболиты ОГМ, для улучшения желудочно-кишечного барьера у младенца в возрасте до 12 месяцев, ребёнка младшего возраста от 1 года до 3 лет или ребёнка в возрасте от 3 до 8 лет. Питательная композиция содержит метаболиты ОГМ, источник углеводов, источник белка и источник липидов. Способ получения питательной композиции включает стадию смешивания композиции, содержащей метаболиты ОГМ, с питательной композицией, содержащей источник углеводов, источник белка и источник липидов, для получения питательной композиции, содержащей метаболиты ОГМ. Причём метаболиты ОГМ получены путём ферментации композиции, содержащей один или более ОГМ, выбранных из группы, состоящей из: 2’FL, 2’FL и LNnT, 2’FL, DiFL, 3’SL, 6’SL, LNT и LNnT, в композиции, содержащей детскую микробиоту. При этом детская микробиота содержит по меньшей мере 60% актинобактерий и более предпочтительно бифидобактерий в расчёте на общее количество бактерий в микробиоте. Изобретение позволяет улучшить желудочно-кишечный барьер у младенцев до 12 месяцев, или ребёнка младшего возраста от 1 года до 3 лет, или ребёнка в возрасте от 3 до 8 лет, имеющих нарушенную микробиоту. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Питательная композиция для улучшения желудочно-кишечного барьера у младенца, который представляет собой ребёнка в возрасте до 12 месяцев, ребёнка младшего возраста, который представляет собой ребёнка в возрасте от 1 года до 3 лет, или ребёнка, который представляет собой ребёнка в возрасте от 3 до 8 лет, имеющих нарушенную микробиоту, содержащая метаболиты ОГМ, источник углеводов, источник белка и источник липидов,

причём метаболиты ОГМ получены путём ферментации композиции, содержащей один или более ОГМ, выбранных из группы, состоящей из:

2’FL,

2’FL и LNnT,

2’FL, DiFL, 3’SL, 6’SL, LNT и LNnT, в композиции, содержащей детскую микробиоту,

при этом детская микробиота содержит по меньшей мере 60% актинобактерий и более предпочтительно бифидобактерий, причём процентное содержание определяется в расчёте на общее количество бактерий в микробиоте.

2. Питательная композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что детская микробиота содержит по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% актинобактерий и более предпочтительно бифидобактерий, причём процентное содержание определяется в расчёте на общее количество бактерий в микробиоте.

3. Питательная композиция по п. 1 или 2, характеризующаяся тем, что нарушенная микробиота представляет собой несбалансированную микробиоту, имеющую низкую долю Bifidobacterium, предпочтительно низкую долю Bifidobacterium longum и/или Bifidobacterium bifidum, более предпочтительно низкую долю Bifidobacterium bifidum и/или Bifidobacterium longum subsp. infantis, причём нарушенная микробиота содержит менее 80%, предпочтительно менее 70%, более предпочтительно менее 60% бифидобактерий, причём процентное содержание определяется в расчёте на общее количество бактерий в микробиоте.

4. Питательная композиция по любому из пп. 1-3, характеризующаяся тем, что нарушенная микробиота содержит менее 20%, предпочтительно менее 15%, более предпочтительно менее 10% Bifidobacterium bifidum, причём процентное содержание определяется в расчёте на общее количество бактерий в микробиоте.

5. Питательная композиция по любому из пп. 1-4, характеризующаяся тем, что указанное улучшение желудочно-кишечного барьера представляет собой улучшенную барьерную структуру, улучшенную барьерную защиту, улучшенное восстановление барьера и/или улучшенную матурацию барьера.

6. Питательная композиция по любому из пп. 1-5, характеризующаяся тем, что указанное улучшение барьера представляет собой барьерную защиту.

7. Питательная композиция по любому из пп. 1-6, характеризующаяся тем, что предназначена для повышения прочности желудочно-кишечного барьера, повышения барьерного сопротивления в желудочно-кишечном тракте, снижения восприимчивости к заболеванию, уменьшения тяжести симптомов после воспалительной провокации слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и/или снижения барьерной проницаемости в желудочно-кишечном тракте.

8. Питательная композиция по любому из пп. 1-7, характеризующаяся тем, что не содержит пробиотиков, таких как жизнеспособные пробиотики.

9. Питательная композиция по любому из пп. 1-8, характеризующаяся тем, что указанная детская микробиота представляет собой фекальную микробиоту, выделенную из младенца в возрасте от 1 до 6 месяцев, например в возрасте от 2 до 4 месяцев, предпочтительно в возрасте около 3 месяцев, при этом более предпочтительно ребёнок был рожден посредством вагинальных родов.

10. Питательная композиция по пп. 1-9, характеризующаяся тем, что метаболиты ОГМ получены способом ферментации, включающим:

a) получение первой композиции, содержащей один или более ОГМ;

b) получение второй композиции, содержащей детскую микробиоту;

c) смешивание указанной первой композиции и указанной второй композиции с получением третьей композиции;

d) ферментация указанной третьей композиции; таким образом,

e) получение четвертой композиции, содержащей метаболиты ОГМ;

f) необязательно повторение стадий от a) до e); и

g) необязательно смешивание четвертой композиции, содержащей метаболиты ОГМ, с одной или более другими композициями, содержащими метаболиты ОГМ, такими как другие композиции, полученные/получаемые способом из стадий a)–e).

11. Способ получения питательной композиции для улучшения желудочно-кишечного барьера у младенца, который представляет собой ребёнка в возрасте до 12 месяцев, ребёнка младшего возраста, который представляет собой ребёнка в возрасте от 1 года до 3 лет, или ребёнка, который представляет собой ребёнка в возрасте от 3 до 8 лет, имеющих нарушенную микробиоту, включающий стадию смешивания композиции, содержащей метаболиты ОГМ, с питательной композицией, содержащей источник углеводов, источник белка и источник липидов, для получения питательной композиции, содержащей метаболиты ОГМ;

причём метаболиты ОГМ получены путём ферментации композиции, содержащей один или более ОГМ, выбранных из группы, состоящей из:

2’FL,

2’FL и LNnT,

2’FL, DiFL, 3’SL, 6’SL, LNT и LNnT, в композиции, содержащей детскую микробиоту,

при этом детская микробиота содержит по меньшей мере 60% актинобактерий и более предпочтительно бифидобактерий, причём процентное содержание определяется в расчёте на общее количество бактерий в микробиоте.

12. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что детская микробиота содержит по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% актинобактерий и более предпочтительно бифидобактерий, причём процентное содержание определяется в расчёте на общее количество бактерий в микробиоте.

13. Способ по п. 11 или 12, в котором метаболиты ОГМ получены способом ферментации, включающим:

a) получение первой композиции, содержащей один или более ОГМ;

b) получение второй композиции, содержащей детскую микробиоту;

c) смешивание указанной первой композиции и указанной второй композиции с получением третьей композиции;

d) ферментация указанной третьей композиции; таким образом,

e) получение четвертой композиции, содержащей метаболиты ОГМ;

f) необязательно повторение стадий от a) до e); и

g) необязательно смешивание четвертой композиции, содержащей метаболиты ОГМ, с одной или более другими композициями, содержащими метаболиты ОГМ, такими как другие композиции, полученные/получаемые способом из стадий a)–e).