Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к питательным композициям для младенцев или детей младшего возраста и их влиянию на здоровье. Такие композиции содержат особые олигосахариды и эффективны для профилактики и/или лечения не-ротавирусной диареи у младенцев или детей младшего возраста. В частности, оно относится к смеси для младенцев, содержащей олигосахариды грудного молока (ОГМ), которые приближают состав общей кишечной микробиоты к нормальному.
Уровень техники
Материнское молоко рекомендовано всем младенцам. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным или неэффективным по медицинским причинам, или мать отказывается от грудного вскармливания. Для этих случаев были разработаны питательные композиции, такие как детские смеси.
Питательные композиции для младенцев и детей младшего возраста часто поступают в продажу в виде порошков для растворения в воде или в некоторых случаях - в виде готового к употреблению напитка или концентрированных жидких композиций. Эти композиции предназначены для удовлетворения большинства или всех потребностей в питании младенцев или детей младшего возраста.
Однако известно, что человеческое грудное молоко представляет собой неоспоримый «золотой стандарт» в сфере питания младенцев. Следовательно, производители детских смесей много раз пытались обеспечить питательное влияние на здоровье, близкое к или аналогичное полезному воздействию грудного молока. Однако многие исследования показали, что детская смесь не обеспечивает в отношении организма воздействие, идентичное тому, которое обеспечивается грудным молоком. Например, у младенцев, находящихся на вскармливании детской смесью, и младенцев, находящихся на вскармливании грудным молоком (HBM), может наблюдаться различная кишечная микробиота.
Раннее детство, особенно первые недели, 3 месяца, 6 месяцев или 12 месяцев жизни, являются критически важными периодами для установления баланса кишечной микробиоты.
Известно, что модуляция кишечной микробиоты в младенчестве в перспективе может оказать большое влияние на будущее состояние здоровья организма. Например, кишечная флора может оказывать влияние на развитие сильной иммунной системы в дальнейшей жизни, нормальный рост и даже на развитие ожирения в дальнейшей жизни.
Однако кишечная микробиота и ее развитие в течение развития младенца представляют собой тонкий баланс между наличием и уровнем распространения (количеством) многих популяций кишечных бактерий. Некоторые кишечные бактерии относят к категории «в целом полезных», а другие — «в целом вредных» (или патогенных) из-за их воздействия на общее состояние здоровья младенца.
Определенные виды «в целом полезных» бактерий, такие как бифидобактерии, могут быть представлены у младенцев, находящихся на вскармливании традиционной детской смесью, в недостаточной степени по сравнению с таковыми у младенцев на грудном вскармливании. Аналогично некоторые популяции бактерий считаются патогенными, и необходимо поддерживать низкий уровень их распространения в кишечной микробиоте.
Действительно, младенец, вскармливаемый детскими смесями, может не пользоваться преимуществами, которые обеспечивает естественная, хорошо сбалансированная кишечная флора (кишечная микробиота) младенцев, вскармливаемых исключительно или преимущественно грудным молоком. Такая естественная микробиота, наблюдаемая у младенцев на грудном вскармливании, действительно является хорошо контролируемой на протяжении времени (развитие со временем) и сложной. Многие таксоны микроорганизмов сосуществуют в очень сложной микросреде кишечника, и все они находятся в последовательно формируемых пропорциях. При описании микробиоты младенцев или детей младшего возраста следует учитывать количественные и качественные параметры. Кроме того, дополнительная сложность заключается в том, что кишечная микробиота изменяется со временем.
Здоровая кишечная флора является показателем здоровья младенца, а измененная кишечная микробиота может быть показателем (и/или причиной) аномальных состояний здоровья, таких как диарея, недостаточное всасывание питательных веществ, колики, нарушение сна и/или нарушение роста и развития.
Диарея, также называемая поносом, — это состояние, при котором по меньшей мере трижды в сутки происходит дефекация неоформленным или жидким стулом. Диарея зачастую длится несколько дней и может приводить к обезвоживанию организма из-за потери жидкости. Признаки обезвоживания часто начинаются с потери нормальной растяжимости кожи и изменений личности. С усилением тяжести состояния они могут прогрессировать к снижению мочевыделения, бледности кожи, частому сердцебиению, торможению реакций. Диарея также характеризуется дисбиозом общей кишечной микробиоты, который предшествует проявлению (-ям) диареи и продолжается после него (них). Диарея является одной из главных причин детской смертности, входя в четыре важнейших фактора сокращения продолжительности жизни в Африке к югу от Сахары и в южной Азии. Долю смертности среди детей до 5 лет по причине диареи во всем мире оценивают приблизительно в 15%. Самая распространенная причина заключается в инфекциях кишечника, вызываемых вирусами, бактериями или паразитами; то есть в состояниях, известных как гастроэнтерит. У детей в развивающихся странах основным возбудителем диареи после ротавируса является Escherichia coli. Выжившие дети также подвержены риску. Частые случаи диареи в возрасте до 2 лет связаны с последующим уменьшенным ростом в среднем на 3,6 см, частым сердцебиением после нагрузки, снижением IQ на 10 баллов, примерно годовой задержкой начала обучения в школе. Таким образом, важно сокращать случаи диареи, а также улучшать восстановление и выздоровление после них.
Этот тип кишечной инфекции, как правило, разрешается самостоятельно, но неспецифическая терапия может приносить облегчение некоторым пациентам, а специфическая терапия может сократить продолжительность заболевания и остановить фекальные выбросы из организма. В лечении пациентов с диареей и обезвоживанием основными направлениями терапии являются введение жидкости и электролитов, упорядочение диеты (а восстановление кормления важно для возмещения дефицита питания), неспецифическая терапия средствами против диареи (для ослабления симптомов) и специфическая терапия противомикробными агентами (как правило, только в случае дизентерии).
Однако такие существующие решения не вполне пригодны для младенцев и детей младшего возраста из-за их младшего возраста и слабости, в особенности применение антидиарейных соединений не утверждено для детей младшего возраста до 2 лет.
Антибиотики также непригодны для младенцев и детей младшего возраста в связи с их возрастом, а также с тем, что E. coli устойчива ко многим антибиотикам (Jiang ZD, et al. Prevalence of enteric pathogens among international travelers with diarrhea acquired in Kenya (Mombasa), India (Goa), or Jamaica (Montego Bay). J. Infect. Dis. 2002; 185 (4): 497–502).
Поэтому были разработаны альтернативные методы терапии.
Против диареи, вызванной E. coli, исследовали фаговую терапию (Brüssow H. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16000704). В российских аптеках продаются смеси фагов против многих бактериальных инфекций, включая диарею E. coli, но их эффективность не была документирована в подробных научных отчетах. В опытных клинических испытаниях с участием детей, инфицированных большей частью энтеротоксигенной E. coli (ETEC), ни подобные Т4 фаги, ни коммерческая смесь коли-фагов из России не оказывали никакого влияния на количественные критерии диареи. Пик выведения ETEC с калом был кратковременным, с низким титром, и лишь половина изолятов E. coli из кала была чувствительна к фагу.
В частности, проводятся исследования применения пробиотиков. Например, штамм ST11 Lactobacillus paracasei улучшает исход не-ротавирусной диареи у детей в Бангладеш, но не оказывает действия на ротавирусную диарею, см. A. Sarker, Pediatrics 2005. Пробиотики не представляют собой наилучшего решения для лечения или профилактики диареи в полной мере, так как они могут лишь увеличивать определенные таксоны микробиоты. Действительно, пробиотики считаются препаратами на основе жизнеспособных микроорганизмов, которые укрепляют здоровье индивида путем сохранения естественной микрофлоры в кишечнике. Предполагают, что они прикрепляются к слизистой оболочке кишечника, колонизируют кишечный тракт и таким же путем предотвращают прикрепление к нему вредных микроорганизмов. Важнейшее условие их действия заключается в том, что они должны достичь слизистой оболочки кишечника в надлежащей жизнеспособной форме и не должны разрушиться в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта, в частности, под влиянием низкого рН, преобладающего в желудке. Еще одна сложность заключается в том, что кишечная микробиота очень разнообразна и сложна, и бактерии вступают в различные взаимодействия между собой.
Исследовали также другие ингредиенты, такие как неперевариваемые углеводы (пребиотики). Олигосахариды грудного молока (ОГМ), как в частности сообщалось, сокращали продолжительность ротавирусной диареи у свиней, которых кормили такой смесью (см. Li et al. ISME J 2014; исследование 2015 г. в Иллинойском университете).
Эти субстанции могут играть в кишечнике роль растворимых рецепторов-ловушек, защищающих новорожденного от возбудителей заболеваний кишечника (Newburg et al, Human milk glycans protect infants against enteric pathogens. Annual Review of Nutrition 2005;25:37–58), и они также могут напрямую взаимодействовать с эпителиальными клетками кишечника, вызывая изменения, которые могут препятствовать взаимодействиям хозяина-микроорганизма (Bode et al, 2012).
В EP1531832 от Glykos упомянуто свойство ОГМ действовать в качестве природных рецепторов, которые связывают патогены. В особенности там упомянуто содержащее олигосахариды вещество или рецептор, которое связывает диареегенную Escherichia coli. Среди примеров ОГМ названы 2FL и LNnT.
Аналогичным образом в WO9956754 компании Abbott описаны композиции с 2FL, которые препятствуют прикреплению E. coli или V. cholerae к рецептору клетки-хозяина.
Однако поскольку такие вещества, по существу, действуют как рецепторы-ловушки, они обладают высокой специфичностью к типу патогенов. В этих решениях также не принят во внимание дисбиоз микробиоты, который возникает до, во время и/или после проявления (-ий) диареи.
Также известно, что пребиотики влияют на стимуляцию определенных кишечных микроорганизмов. Например, было показано, что определенные галактоолигосахариды (GOS) и/или определенные фруктоолигосахариды (FOS) могут активировать рост и распространение бифидобактерий в кишечнике, особенно у младенцев.
В публикации WO9843495 от Abbott указана питательная рецептура, содержащая эффективное количество лакто-N-неотетраозы для стимуляции роста и/или метаболической активности бактерий Bifidobacterium infantis.
Публикация WO2009060073 от Nestec SA относится к применению олигосахарида, такого как лакто-N-тетраоза или лакто-N-неотетраоза, для активации развития в первые несколько недель жизни младенца полезной кишечной микробиоты, сравнимой с обнаруживаемой у младенцев на грудном вскармливании, особенно кишечной микробиоты, в которой доминируют существенные популяции Bifidobacterium и Lactobacillus с исключением других популяций, таких как Bacteroides, Clostridia и Streptococci.
В публикации WO2012158517 описано применение очищенных ОГМ, таких как 2’-FL, 3-FL или LDFT, для стимуляции роста бактерий в желудочно-кишечном тракте субъекта-млекопитающего, в том числе бифидобактерий.
Однако большинство из этих исследований предлагают решения, которые не нацелены на лечение или профилактику состояний не-ротавирусной диареи и всех сопутствующих симптомов. Они могут действовать на микробиоту только путем модулирования определенных таксонов микробиоты, например, приводить к увеличению числа бифидобактерий или к уменьшению числа клостридий.
Однако в настоящее время не существует решений для лечения или профилактики не-ротавирусной диареи путем приведения общей кишечной микробиоты (т.е. всей/целой/совокупной/полной микробиоты) ближе к норме.
Никакие существующие решения, по-видимому, также не принимают в расчет функцию кишечной микробиоты.
Следовательно, для младенцев или детей младшего возраста существует потребность в снижении риска не-ротавирусной диареи и/или в улучшении излечения путем сокращения продолжительности не-ротавирусной диареи и/или ослабления симптомов и последствий не-ротавирусной диареи, особенно посредством действия на дисбиоз общей кишечной микробиоты, возникающий до, во время и/или после проявлений не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста.
Существует потребность в компенсации аномальной общей кишечной микробиоты, наблюдаемой у младенцев или детей младшего возраста в случае не-ротавирусной диареи. Существует потребность в восстановлении такой общей кишечной микробиоты в отношении как ее состава, так и функции.
Существует потребность в усилении оптимального баланса в общей кишечной микробиоте младенцев, особенно путем угнетения или подавления роста патогенных бактерий, в течение первых недель жизни, когда устанавливается такой баланс.
Существует потребность в питательных композициях для младенцев или детей младшего возраста, которые обеспечивают их общей кишечной микробиотой и метаболическим профилем, более близким к получаемым в нормальных ситуациях (т.е. в здоровом состоянии без диареи) и/или для младенцев на грудном вскармливании.
Существует потребность в обеспечении указанных младенцев или детей младшего возраста наилучшим питанием, которое способствует развитию общей кишечной микробиоты, приближенной к таковой в отсутствие не-ротавирусной диареи и/или приближенной к таковой у младенцев на грудном вскармливании, причем указанное развитие является кратковременным (т.е. в период введения питания) и/или долговременным (т.е. после периода введения питания).
Существует потребность в питательных композициях для младенцев или детей младшего возраста, которые обеспечивают состав микробиоты, не допускающий развития не-ротавирусной диареи и/или способствующий быстрому выздоровлению после не-ротавирусной диареи.
Существует потребность в обеспечении у этих младенцев или детей младшего возраста таких полезных для здоровья эффектов способом, который не вызывает побочных эффектов и/или который можно легко предоставлять и который приемлем для родителей или практических медицинских работников.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к питательной композиции, содержащей по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид, для применения в профилактике и/или лечении не-ротавирусной диареи у младенцев или детей младшего возраста посредством действия на дисбиоз общей кишечной микробиоты, который возникает до, во время и/или после явлений не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста.
Благодаря этой питательной композиции общая кишечная микробиота у указанных младенцев или детей младшего возраста будет приближена к таковой у младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи.
Она также будет приближена к общей кишечной микробиоте у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых исключительно грудным молоком, по сравнению с общей кишечной микробиотой у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов.
Преимущество питательной композиции настоящего изобретения заключается в том, что она оказывает влияние на композицию и/или функцию всей микробиоты кишечника, например на относительное таксономическое богатство (или количество), разнообразие, активность и/или функциональность указанной микробиоты.
В особенно преимущественном варианте осуществления питательная композиция содержит 2’-фукозиллактозу (2-FL) и лакто-N-неотетраозу (LNnT). В особенно преимущественном варианте осуществления она содержит 2’-фукозиллактозу (2-FL) в количестве 0,8–1,5 г/л питательной композиции и LNnT в количестве 0,5–0,8 г/л питательной композиции.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена динамика титров совокупности бактерий, E.coli и энтеротоксигенной E.coli в серийных образцах кала младенцев и детей младшего возраста в стационаре в течение эпизода острой диареи.
Фиг. 1A. Медиана титра с межквартильным размахом для совокупности бактерий в кале, определяемого методом кПЦР в реальном времени с универсальными праймерами к бактериальной 16S рДНК; выраженная в виде log10 КОЕ/г эквивалентов кала от здоровых местных контрольных младенцев и детей младшего возраста (H) и пациентов с диареей в указанный день после госпитализации. Только H статистически значимо отличается от других моментов времени (критерии для множественных сравнений Данна).
Фиг. 1B. Медиана количества жизнеспособных E. coli с межквартильным размахом, определяемого на агаре по Мак-Конки в виде log10 КОЕ/г свежего кала (ордината) в указанный день после госпитализации пациентов с диареей (статистически значимое различие отсутствует).
Фиг. 1C и 1D. Распределение титров и медиана титров для термоустойчивых (st-ETEC, C) и термолабильных (lt-ETEC, D) несущих эндотоксин бактерий в кале пациентов с диареей, госпитализированных с микробиологически подтвержденной инфекцией ETEC. Титры, определенные методом ПЦР в реальном времени, относятся к указанным дням после госпитализации и сравниваются со здоровыми контрольными младенцами и детьми младшего возраста (H). Титры представлены как log10 медиан титров в эквивалентах КОЭ ETEC.
Фигуры 2 относятся к анализу фекальной микробиоты путем секвенирования гена 16S рРНК в серийных образцах кала от младенцев и детей младшего возраста, госпитализированных с острой бактериальной диареей.
Фиг. 2A. Профили структуры бактериального сообщества в пробах кала от 20 здоровых контрольных младенцев и детей младшего возраста (H) и 56 пациентов с диареей в указанный день после госпитализации (D01–D21). На панели приведена относительная численность в процентах родов бактерий, идентифицированных по легенде с правой стороны.
Фиг. 2B, 2C и 2D. Медиана численности указанного рода бактерий (Bifidobacterium; Streptococcus; Escherichia; соответственно) в процентах в указанный день диареи по сравнению со здоровыми контрольными младенцами и детьми младшего возраста (H).
На фиг. 3 представлен общий профиль общей средней микробиоты на уровне родов в сравнении между референтной группой, находящейся на грудном вскармливании (BF), группой, вскармливаемой контрольной смесью (контроль), и исследуемой группой, вскармливаемой смесью с ОГМ, оцениваемый по профилированию гена 16S рРНК.
На фиг. 4 представлена относительная композиция трех основных таксонов в трех группах — BF, контрольной и исследуемой группе, — которая демонстрирует статистически значимые различия между исследуемой и контрольной группами по данным профилирования гена 16S рРНК: Bifidobacterium (фиг. 4A), Escherichia (Фиг. 4B) и Peptostreptococacceae uncl (фиг. 4C). Показана медиана с межквартильными размахами. Статистически значимое различие обозначено символом *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001. BF - референтная группа, находящаяся на грудном вскармливании.
На фиг. 5 представлено значение альфа-разнообразия общей микробиоты в трех группах - BF, контрольной и исследуемой группе, — рассчитанное с параметром PD_whole_tree (филогенетическое разнообразие по всему филогенетическому древу) на основании профилирования гена рРНК 16S. Статистически значимое различие обозначено символом *, p < 0,05; **, p < 0,01.
На фиг. 6 представлен анализ избыточности, основанный на данных на уровне родов, измеренных путем профилирования гена рРНК 16S и показывающих статистически значимое разделение трех групп p < 0,001.
На фиг. 7 представлена таблица, демонстрирующая перечень выявленных генов, кодирующих известные болезнетворные факторы, измеренных по метагеномам. C/T, C/B и T/B означают статистически значимые различия между контрольной и исследуемой группами, контрольной группой и группой, находящейся на грудном вскармливании, а также исследуемой группой и группой, находящейся на грудном вскармливании, соответственно. Статистическую значимость различий между группами оценивали по аппроксимации моделью отрицательной биномиальной регрессии, учитывая при необходимости лишние нулевые данные. Для каждой группы также показано количество младенцев с определенными генами.
На фиг. 8 представлена таблица, демонстрирующая перечень выявленных генов, кодирующих известные гены резистентности к антибиотикам, измеренных по метагеномам. C/T, C/B и T/B означают статистически значимые различия между контрольной и исследуемой группами, контрольной группой и группой, находящейся на грудном вскармливании, а также исследуемой группой и группой, находящейся на грудном вскармливании, соответственно. Статистическую значимость различий между группами оценивали по аппроксимации моделью отрицательной биномиальной регрессии, учитывая при необходимости лишние нулевые данные. Для каждой группы также показано количество младенцев с определенными генами.
На фиг. 9 представлена относительная концентрация важных метаболитов, полученных по результатам анализа кала методом 1H ЯМР спектроскопии, относящимся к метаболизму аминокислот и других органических кислот: фенилаланина (фиг. 9A), тирозина (фиг. 9B), лактата (фиг. 9C) и изолейцина (фиг. 9D). * означает статистически значимое различие по критерию Краскела - Уоллиса (p < 0,05). BF — референтная группа, находящаяся на грудном вскармливании.
Осуществление изобретения
В настоящем документе следующие термины имеют приведенные ниже определения.
Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев.
Выражение «ребенок младшего возраста» означает ребенка в возрасте от одного до трех лет (также называют ребенком, начинающим ходить).
«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством кесарева сечения» означает младенца или ребенка младшего возраста, рожденного посредством кесарева сечения. Это означает, что младенец или ребенок младшего возраста не был рожден посредством вагинальных родов.
«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством вагинальных родов» означает младенца или ребенка младшего возраста, который был рожден посредством вагинальных родов, а не посредством кесарева сечения.
«Недоношенный» или «преждевременно родившийся» означает младенца или ребенка младшего возраста, который родился раньше срока. По существу этот термин относится к младенцу или ребенку младшего возраста, рожденному до конца 37-й недели беременности.
Под выражением «маленький для своего гестационного возраста» или SGA подразумевают младенца или ребенка младшего возраста, размеры которого меньше нормы для его гестационного возраста при рождении, что чаще всего определяют как массу тела ниже 10-го процентиля для данного гестационного возраста. В некоторых вариантах осуществления изобретения состояние SGA может быть связано с задержкой внутриутробного развития (ЗВУР), которая относится к состоянию, при котором плод не может достичь своего потенциального размера.
Под выражением «низкий вес при рождении» следует понимать любую массу тела менее 2500 г при рождении.
Выражение «питательная композиция» означает композицию, которой питается субъект. Данная питательная композиция обычно предназначена для перорального или внутривенного применения и обычно включает в себя источник липидов или жира и источник белка.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой гипоаллергенную питательную композицию. Выражение «гипоаллергенная питательная композиция» означает питательную композицию, для которой вероятность того, что она вызовет аллергические реакции, является малой.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой «искусственную питательную композицию». Выражение «искусственная питательная композиция» означает смесь, полученную с помощью химических и/или биологических средств, которые могут быть химически идентичны смеси природного происхождения, присутствующей в молоке млекопитающих (т.е. синтетическая композиция не является грудным молоком).
Выражение «детская смесь» при использовании в настоящем документе относится к продукту питания, специально предназначенному для кормления младенцев в течение первых месяцев жизни, который сам по себе удовлетворяет потребности в питании этой возрастной категории (статья 2(c) Директивы Европейской комиссии 91/321/EEC 2006/141/EC от 22 декабря 2006 г. о детских смесях и смесях для прикармливаемых детей). Оно также относится к питательной композиции, предназначенной для младенцев, как определено в Codex Alimentarius (Codex STAN 72-1981) и стандарте «Специальные продукты для младенцев» (включая статью «Продукты питания для специальных медицинских целей»). Выражение «детская смесь» охватывает как «начальную детскую смесь», так и «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей». В некоторых вариантах осуществления детская смесь представляет собой детскую смесь для недоношенных младенцев.
«Смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей» дают, начиная с 6-го месяца. Она составляет главный жидкий элемент в постепенно увеличивающемся разнообразии рациона для лиц данной категории.
Выражение «детское питание» означает продукт питания, специально предназначенный для применения в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Выражение «детская композиция на зерновой основе» означает продукт питания, специально предназначенный для применения в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Термин «обогатитель» относится к жидким или твердым питательным композициям, которые подходят для смешивания с грудным молоком или детской смесью.
Термин «ОГМ» относится к олигосахариду (-ам) грудного молока. Эти углеводы обладают высокой устойчивостью к ферментативному гидролизу, что указывает на то, что они могут проявлять существенные функции, непосредственно не относящиеся к их калорийности. В первую очередь было показано, что они играют жизненно важную роль в раннем развитии младенцев и детей младшего возраста, например в развитии иммунной системы. В грудном молоке обнаружено много различных видов ОГМ. Каждый отдельный олигосахарид основан на комбинации глюкозы, галактозы, сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты), фукозы и/или N-ацетилглюкозамина с образованием многочисленных и разнообразных связей между ними, что обусловливает присутствие огромного числа различных олигосахаридов в грудном молоке — на данный момент было выявлено более 130 таких структур. Почти все они на своем восстанавливающем конце имеют лактозный фрагмент, в то время как сиаловая кислота и/или фукоза (при наличии) занимают концевые положения на невосстанавливающих концах. ОГМ могут быть кислыми (например, содержащий заряженную сиаловую кислоту олигосахарид) или нейтральными (например, фукозилированный олигосахарид).
«Фукозилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, имеющий остаток фукозы. Он имеет нейтральный характер. Некоторыми примерами являются 2-FL (2’-фукозиллактоза), 3-FL (3-фукозиллактоза), дифукозиллактоза, лакто-N-фукопентаоза (например, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V), лакто-N-фукогексаоза, лакто-N-дифукогексаоза I, фукозиллакто-N-гексаоза, фукозиллакто-N-неогексаоза, дифукозиллакто-N-гексаоза I, дифукозиллакто-N-неогексаоза II и любая их комбинация.
Выражения «фукозилированные олигосахариды, содержащие 2’-фукозил-эпитоп» и «2-фукозилированные олигосахариды» включают фукозилированные олигосахариды с определенной гомологией формы, поскольку они содержат 2’-фукозил-эпитоп, следовательно, можно ожидать определенную гомологию функции.
Выражение «N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы)» подразумевает как «N-ацетиллактозамин», так и «олигосахарид (-ы), содержащий (-ие) N-ацетиллактозамин». Они являются нейтральными олигосахаридами, имеющими остаток N-ацетиллактозамина. Подходящими примерами являются LNT (лакто-N-тетраоза), пара-лакто-N-неогексаоза (пара-LNnH), LNnT (лакто-N-неотетраоза) и любые их комбинации. Другими примерами являются лакто-N-гексаоза, лакто-N-неогексаоза, пара-лакто-N-гексаоза, пара-лакто-N-неогексаоза, лакто-N-октаоза, лакто-N-неооктаоза, изо-лакто-N-октаоза, пара-лакто-N-октаоза и лакто-N-декаоза.
Выражения «по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид» и «по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид» означают «по меньшей мере один тип фукозилированного олигосахарида» и «по меньшей мере один тип N-ацетилированного олигосахарида».
«Предшественник ОГМ» представляет собой ключевое соединение, которое включается в выработку ОГМ, такое как сиаловая кислота и/или фукоза.
«Сиалилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, содержащий заряженную сиаловую кислоту, т.е. олигосахарид, имеющий остаток сиаловой кислоты. Он имеет кислотный характер. Некоторыми примерами являются 3-SL (3’-сиалиллактоза) и 6-SL (6’-сиалиллактоза).
Питательная композиция согласно настоящему изобретению может присутствовать в твердой форме (например, порошок) или в жидком виде. Количество различных ингредиентов (например, олигосахаридов) может выражаться в г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, если она представлена в твердой форме, например в порошке, или как концентрация в г/л композиции, если она относится к жидкой форме (последний случай также включает жидкую композицию, которую можно получать из порошка после растворения в жидкости, например в молоке, воде и т. п., например растворенную детскую смесь, или смесь для прикармливаемых детей/смесь последующего уровня, или зерновой продукт для детского питания, или любую другую смесь, предназначенную для детского питания). Они также могут быть выражены в г/100 ккал.
Выражение «период отлучения от груди» означает период, в течение которого в рационе младенца или ребенка младшего возраста материнское молоко заменяют другой пищей.
Выражения «в возрасте X дней/недель/месяцев/лет», «X дней/недель/месяцев/лет жизни» и «X дней/недель/месяцев/лет от рождения» могут использоваться взаимозаменяемо.
Под «материнским молоком» следует понимать грудное молоко или молозиво матери. HBM означает человеческое грудное молоко.
Выражения «младенцы/дети младшего возраста, вскармливаемые исключительно человеческим грудным молоком», «младенцы или дети младшего возраста, находящиеся исключительно на грудном вскармливании», «вскармливаемые исключительно грудным молоком младенцы или дети младшего возраста» и «младенцы/дети младшего возраста, находящиеся на грудном вскармливании» могут использоваться взаимозаменяемо. Они означают младенцев или детей младшего возраста, получающих подавляющее большинство (т.е. по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%) или все (100%) питательные вещества и/или энергию из человеческого грудного молока.
Выражение «младенцы или дети младшего возраста, вскармливаемые исключительно питательными композициями» относится к младенцам или детям младшего возраста, получающим подавляющее большинство (т.е. по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%) или все (100%) питательные вещества и/или энергию из искусственных питательных композиций, таких как детская смесь, молочная смесь для прикармливаемых детей или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет.
Выражение «младенцы или дети младшего возраста, вскармливаемые преимущественно питательными композициями» относится к младенцам или детям младшего возраста, получающим питательные вещества и/или энергию преимущественно из искусственных питательных композиций, таких как детская смесь, молочная смесь для прикорма детей или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет. «Преимущественно» означает по меньшей мере 50% (или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 75%) таких питательных веществ и/или энергии, например от 50% до 90%, или от 60% до 80%.
Выражение «стимулирующий и/или индуцирующий» у младенцев или детей младшего возраста относительно определенной общей микробиоты кишечника означает развитие, увеличение, установление, появление и/или смещение конкретной общей микробиоты у указанных младенцев или детей младшего возраста.
Выражение «традиционная питательная композиция» означает стандартные искусственные питательные композиции, такие как детская смесь, молочная смесь для прикармливаемых детей или молочная смесь для детей от 1 года до 3 лет, которые уже имеются на рынке. Выражение «традиционная питательная композиция без содержания указанных олигосахаридов» относится к стандартной питательной композиции, которая не содержит «по меньшей мере одного фукозилированного олигосахарида и по меньшей мере одного N-ацетилированного олигосахарида».
Термины «микробный», «микрофлора» и «микробиота» могут использоваться взаимозаменяемо.
Выражения «микробиота в кишечнике», «микробиота кишечника» и «кишечная микробиота» могут использоваться взаимозаменяемо.
Термины «общий», «весь», «целый», «полный» и «суммарный» могут использоваться взаимозаменяемо, особенно в выражении «общая микробиота». Выражения «общая микробиота в кишечнике/кишечника» или «общая кишечная микробиота» относятся ко всей (или полной, целой, суммарной) микробиоте в кишечнике. Она включает в себя:
- композицию общей микробиоты, т.е. относительное таксономическое богатство (количество) и/или разнообразие полной микробиоты кишечника, иными словами, «количественные» и/или «качественные» аспекты микробиоты; и/или
- функцию общей микробиоты, т.е. активность и/или функциональность общей микробиоты кишечника, особенно метаболическую активность/функциональность. Ее можно оценить путем измерения относительной численности предсказанных генов по метагеному или методом количественного профилирования основных метаболитов, включая аминокислоты, основные органические кислоты (лактат, сукцинат, цитрат и т.п.) и/или углеводы.
Подходящая и здоровая кишечная микробиота является ключевым фактором для развития иммунной системы в слизистой оболочке младенца.
Термин «дисбиоз» относится к микробиологическому дисбалансу внутри организма. Выражения «дисбиоз (общей) микробиоты кишечника» или «дисбиоз (общей) кишечной микробиоты» относятся к (общему) дисбалансу микроорганизмов в кишечнике.
Выражение «действие на дисбиоз общей кишечной микробиоты» охватывает «профилактику и/или лечение дисбиоза общей кишечной микробиоты», т.е.:
- профилактику дисбиоза общей микробиоты в кишечнике: например, предотвращение проявлений дисбиоза общей кишечной микробиоты (до, во время, после эпизодов диареи, либо во все периоды, предпочтительно во время эпизодов);
- лечение дисбиоза общей микробиоты в кишечнике: например, уменьшение, либо сокращение, либо ограничение дисбиоза общей кишечной микробиоты, который проявляется в случае диареи (либо до, во время, после эпизодов диареи, либо во все периоды, предпочтительно во время эпизодов); и/или
- оба действия.
Выражения «диарея», «диарейный» и «эпизоды диареи» можно использовать взаимозаменяемо. Выражение «не-ротавирусная диарея» может относиться к диарее, вызванной Escherichia coli, также называемой E. coli (например, энтеротоксигенной E. coli (ETEC), энтеропатогенной E. coli (EPEC) и/или энтероагрегативной E. coli (EAEC)), Salmonella, Shigella, Aeromonas и/или Campylobacter.
В предпочтительном варианте осуществления выражение относится к диарее, вызванной E. coli.
Выражения «угнетение» и «уменьшение» могут использоваться взаимозаменяемо.
Под выражениями «проводить профилактику» или «профилактика» понимают избегание возникновения и/или уменьшение вероятности (т.е. снижение частоты) появления физического состояния, ситуации или их последствий.
Под выражениями «лечить» или «лечение» понимают уменьшение продолжительности и/или тяжести физического состояния, ситуации или их последствий.
Профилактика и/или лечение физического состояния, ситуации или их последствий может происходить в ходе лечения (т.е. в ходе введения композиции настоящего изобретения, либо непосредственно после начала введения, либо через некоторое время после начала, например через несколько дней или недель после начала введения). Но это также может включать в себя профилактику и/или лечение указанных нарушений в дальнейшей жизни. Термин «в дальнейшей жизни» включает в себя эффект после прекращения вмешательства или лечения. Эффект «в дальнейшей жизни» может длиться от 1 недели до нескольких месяцев, например от 2 до 4 недель, от 2 до 6 недель, от 2 до 8 недель, от 1 до 6 месяцев или от 2 до 12 месяцев.
Термин «пребиотик» означает неперевариваемые углеводы, которые благоприятно влияют на организм-хозяина, избирательно стимулируя рост и/или активность полезных для здоровья бактерий, например бифидобактерий в толстом кишечнике человека (Gibson GR, Roberfroid MB. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr. 1995;125:1401-12).
Термин «пробиотик» означает препараты клеток микроорганизмов или компонентов клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или самочувствие организма-хозяина. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. «Probiotics: how should they be defined» Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107–10). Клетки микроорганизмов, по существу, представляют собой бактерии или дрожжи.
Под термином «КОЕ» следует понимать колониеобразующую единицу.
Если не указано иное, все процентные содержания представляют собой мас.%.
Дополнительно в контексте изобретения термины «содержащий» или «содержит» не исключают других возможных элементов. Композиция настоящего изобретения, включая многие варианты осуществления, описанные в настоящем документе, может содержать существенные элементы и ограничения изобретения, описанные в настоящем документе, а также любые дополнительные или необязательные ингредиенты, компоненты или ограничения, описанные в настоящем документе или иным образом, в зависимости от потребностей, состоять или, по существу, состоять из них.
Любую ссылку на документы предшествующего уровня техники в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такой предшествующий уровень техники является широко известным или составляет часть общеизвестных знаний в данной области.
Ниже представлено более подробное описание изобретения. Следует отметить, что различные аспекты, признаки, примеры и варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, могут быть совместимыми и/или комбинированными друг с другом.
Поэтому первым объектом настоящего изобретения является питательная композиция, содержащая по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид, для применения в профилактике и/или лечении не-ротавирусной диареи у младенцев или детей младшего возраста путем воздействия на дисбиоз общей кишечной микробиоты, который возникает до, во время и/или после не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста.
Как проиллюстрировано в примере 2, авторы настоящего изобретения доказали, что общая кишечная микробиота у младенцев, имеющих не-ротавирусную диарею, была модифицирована (т.е. присутствовал дисбиоз общей кишечной микробиоты) во время и после эпизодов не-ротавирусной диареи. В частности, при не-ротавирусной диарее у младенцев отмечено сильное увеличение количества Streptococcus, незначительное увеличение количества Escherichia и сильное уменьшение количества Bifidobacteria.
Как показано в примере 3, авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что композиция, содержащая по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид (2FL) и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид (LNnT), может с преимуществом применяться для обеспечения у младенцев общей микробиоты кишечника, приближенной к микробиоте младенцев, вскармливаемых исключительно грудным молоком, по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев, вскармливаемых традиционной детской смесью, не содержащей указанных олигосахаридов. Совместно микробиота кала и характерные метаболические признаки показывают, что добавление 2 индивидуальных и обладающих высокой специфичностью структуры олигосахаридов грудного молока (ОГМ) вызывает смещение оцениваемой в кале общей кишечной микробиоты как по композиции, так и по функциям в направлении микробиоты, наблюдаемой у младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Без ограничений, накладываемых какой-либо конкретной теорией, считают, что эти олигосахариды действуют синергетически, обеспечивая такое влияние на общую микробиоту кишечника. В особенности отмечено повышение численности Bifidobacterium и снижение Escherichia.
Таким образом, данные конкретные ОГМ положительно влияют на выздоровление после не-ротавирусной диареи и даже на частоту ее новых случаев благодаря их действию на общую кишечную микробиоту, которая противостоит дисбиозу, наблюдаемому в случае не-ротавирусной диареи.
Питательная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид. В ней может присутствовать один или несколько типов фукозилированных олигосахаридов. Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может быть фактически выбран из перечня, включающего в себя 2’-фукозиллактозу, 3’-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу (например, лакто-N-фукопентаозу I, лакто-N-фукопентаозу II, лакто-N-фукопентаозу III, лакто-N-фукопентаозу V), лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу I, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу (например, фукозиллакто-N-неогексаозу I, фукозиллакто-N-неогексаозу II), дифукозиллакто-N-гексаозу I, дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу I, дифукозиллакто-N-неогексаозу II, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу, три-фуко-пара-лакто-N-гексаозу I и любую их комбинацию.
В некоторых конкретных вариантах осуществления фукозилированный олигосахарид представляет собой 2’-фукозил-эпитоп. Он может быть, например, выбран из перечня, включающего 2’-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу, лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-гексаозу дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу и любую их комбинацию.
В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция в соответствии с изобретением содержит 2’-фукозиллактозу (или 2FL, или 2’FL, или 2-FL, или 2’-FL). В конкретном варианте осуществления не используется никакой другой тип фукозилированного олигосахарида, кроме 2’-фукозиллактозы, т.е. питательная композиция настоящего изобретения в качестве фукозилированного олигосахарида содержит только 2’-фукозиллактозу.
Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления его можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических фукозилтрансфераз и/или фукозидаз, либо посредством применения метода ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида и/или смешанные культуры. Образование фукозилированного олигосахарида может быть инициировано акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления фукозилированные олигосахариды можно получать с помощью химического синтеза из лактозы и свободной фукозы. Кроме того, в продаже доступны, например, фукозилированные олигосахариды производства компании Kyowa, Hakko, Kogyo, Япония.
Питательная композиция настоящего изобретения также содержит по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид. В ней может присутствовать один или несколько типов N-ацетилированных олигосахаридов. N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) представлять собой, например, лакто-N-тетраозу (LNT), лакто-N-неотетраозу (LNnT) или любую их комбинацию. В некоторых конкретных вариантах осуществления N-ацетилированный олигосахарид представляет собой лакто-N-неотетраозу (LNnT), пара-лакто-N-неогексаозу (пара-LNnH) или любую их комбинацию. В некоторых конкретных вариантах осуществления N-ацетилированный олигосахарид представляет собой LNnT. В некоторых конкретных вариантах осуществления N-ацетилированный олигосахарид представляет собой LNT. В некоторых других конкретных вариантах осуществления N-ацетилированный олигосахарид представляет собой смесь LNT и LNnT. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция содержит как LNT, так и LNnT в соотношении LNT : LNnT от 5 : 1 до 1 : 2, или от 2 : 1 до 1 : 1, или от 2 : 1,2 до 2 : 1,6.
В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция в соответствии с изобретением содержит лакто-N-неотетраозу (LNnT). В конкретном варианте осуществления не используется никакой другой тип N-ацетилированного олигосахарида, кроме лакто-N-неотетраозы (LNnT), т.е. питательная композиция изобретения в качестве N-ацетилированного олигосахарида содержит только лакто-N-неотетраозу (LNnT).
N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) можно синтезировать химическим путем с помощью ферментативного переноса сахаридных единиц с донорных фрагментов на акцепторные фрагменты с использованием гликозилтрансфераз, как описано, например, в патенте США № 5,288,637 и в WO 96/10086. В альтернативном варианте осуществления LNT и LNnT можно получать путем химического преобразования кетогексоз (например, фруктозы), либо свободных, либо связанных с олигосахаридом (например, лактулозой), в N-ацетилгексозамин или N-ацетилгексозамин-содержащий олигосахарид, как описано в Wrodnigg, T.M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38: 827–828. Полученный таким образом N-ацетиллактозамин может затем переноситься на лактозу в качестве акцепторного фрагмента.
В наиболее преимущественном варианте осуществления настоящего изобретения питательная композиция содержит 2’-фукозиллактозу (2FL) и лакто-N-неотетраозу (LNnT).
В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения содержит смесь олигосахаридов, состоящую из 2’-фукозиллактозы (2-FL) и лакто-N-неотетраозы (LNnT). Иными словами, питательная композиция изобретения в качестве фукозилированного олигосахарида содержит только 2’-фукозиллактозу (2-FL) и в качестве N-ацетилированного олигосахарида — только лакто-N-неотетраозу (LNnT).
Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) присутствовать в питательной композиции в соответствии с настоящим изобретением в общем количестве 0,5–3 г/л, например 0,8–1,5 г/л, композиции. В некоторых вариантах осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) присутствовать в общем количестве 0,85–1,3 г/л композиции, например 0,9–1,25 г/л, или 0,9–1,1 г/л, или 1–1,25 г/л, или 1–1,2 г/л композиции.
Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) присутствовать в питательной композиции в общем количестве 0,38–2,32 г/100 г, например 0,62–1,16 г/100 г, композиции в расчете на массу сухого вещества. Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) присутствовать в общем количестве 0,66–1 г/100 г композиции, например 0,70–0,97 г/100 г, или 0,70–0,85 г/100 г, или 0,78–0,97 г/100 г или 0,78–0,93 г/100 г композиции.
N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) присутствовать в питательной композиции в соответствии с настоящим изобретением в общем количестве 0,5–0,8 г/л композиции.
В некоторых вариантах осуществления N-ацетилированный (-ые)
олигосахарид (-ы) может (могут) присутствовать в общем количестве 0,5–0,75 г/л, или 0,5–0,7 г/л, или 0,5–0,6 г/л композиции.
N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) присутствовать в питательной композиции в общем количестве 0,39–0,62 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например 0,39–0,58 г/100 г, или 0,39–0,54 г/100 г, или 0,39–0,47 г/100 г.
Все эти разные диапазоны можно комбинировать.
Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения питательная композиция содержит по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид, причем:
- фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 0,8–1,5 г/л композиции и/или в общем количестве 0,62–1,16 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 0,5–0,8 г/л композиции и/или в общем количестве 0,39–0,62 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид, причем:
- фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 0,9–1,25 г/л композиции и/или в общем количестве 0,70–0,97 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 0,5–0,7 г/л композиции и/или в общем количестве 0,39–0,54 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид, причем:
- фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 1–1,2 г/л композиции и/или в общем количестве 0,78–0,93 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 0,5–0,6 г/л композиции и/или в общем количестве 0,39–0,47 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы), включенные в питательную композицию в соответствии с изобретением, как правило, присутствуют в соотношении фукозилированный (-ый) олигосахарид (-ы) : N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) от 2 : 0,54 до 2 : 2,26, например от 2 : 0,76 до 2 : 1,8 или от 2 : 0,8 до 2 : 1,4. В особенно преимущественном варианте осуществления такое соотношение составляет 2 : 1 или примерно 2 : 1.
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением может также содержать по меньшей мере другой (-ие) олигосахарид (-ы) (т.е. отличные от фукозилированного (-ых) олигосахарида (-ов) и N-ацетилированного (-ых) олигосахарида (-ов), которые в обязательном порядке присутствуют в композиции), и/или по меньшей мере пищевое (-ые) волокно (-а), и/или по меньшей мере их предшественник (-и). Другой олигосахарид, и/или пищевые волокна, и/или их предшественник могут быть выбраны из перечня, включающего галактоолигосахариды (GOS), фруктоолигосахариды (FOS), инулин, ксилоолигосахариды (XOS), полидекстрозу, сиалилированные олигосахариды, сиаловую кислоту, фукозу и любую их комбинацию. Они могут присутствовать в количестве от 0 до 10 мас.% композиции.
Подходящие доступные в продаже продукты, которые можно применять дополнительно к олигосахаридам, содержащимся в смеси олигосахаридов, для получения питательных композиций согласно настоящему изобретению, включают в себя комбинации FOS с инулином, как например, продукт, продаваемый компанией BENEO под торговым названием Orafti, или полидекстрозу, продаваемую компанией Tate & Lyle под торговым названием STA-LITE®.
В одном конкретном варианте осуществления питательная композиция в соответствии с изобретением может содержать по меньшей мере около 0,4 г или по меньшей мере 0,7 г олигофруктозы на 100 ккал композиции, например от около 0,4 до около 0,9 г, от около 0,4 до около 0,7 г, от около 0,4 до около 0,5 г, от около 0,7 до около 0,8 г, или от около 0,7 до около 0,9 г олигофруктозы на 100 ккал.
В некоторых вариантах осуществления олигофруктоза имеет степень полимеризации от 2 до 10. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 99% или 100% олигофруктозы имеют степень полимеризации от 2 до 8 (в диапазоне от 2 до 8).
В конкретном варианте осуществления питательная композиция в соответствии с изобретением может содержать GOS. «Галактоолигосахарид» представляет собой олигосахарид, который содержит две или более незаряженных молекул галактозы и не содержит остатка N-ацетила. Приемлемые галактоолигосахариды, которые также можно добавлять в питательную композицию согласно настоящему изобретению, включают Galβ1,3Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,4Glc, Galβ1,3Galβ1,3Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,4Glc, Galβ1,3Galβ1,6Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,3Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,6Glc, Galβ1,3Galβ1,3Glc, Galβ1,4Galβ1,4Glc, Galβ1,4Galβ1,4Galβ1,4Glc, а также любую их смесь. Синтетические галактоолигосахариды, такие как Galβ1,6Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,6Glc, Galβ1,3Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,3Galβ1,4Glc, Galβ1,3Galβ1,6Galβ1,4Glc, Galβ1,4Galβ1,4Glc, Galβ1,4Galβ1,4Galβ1,4Glc и их смеси, имеются в продаже под товарными знаками Vivinal ® и Elix’or®. Другими поставщиками олигосахаридов являются компании Dextra Laboratories, Sigma-Aldrich Chemie GmbH и Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. В альтернативном варианте осуществления для получения нейтральных олигосахаридов можно применять специфические гликозилтрансферазы, такие как галактозилтрансферазы.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция может также содержать по меньшей мере один олигосахарид коровьего молока. Можно применять традиционные технологии фракционирования и обогащения фракций коровьего молока в олигосахаридах из коровьего молока (такие традиционные технологии включают в себя колонную экстракцию, фильтрацию с помощью смол, нанофильтрацию, специальную ферментную обработку бета-галактозидазой, осаждение белков, кристаллизацию и отделение лактозы и т.п.). Некоторые фракции коровьего молока, обогащенные олигосахаридами, доступны в продаже или описаны, например, в публикации EP2526784 A1.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция может также дополнительно содержать смесь олигосахаридов (BMOS), которая содержит от 0,1 до 4,0 мас.% N-ацетилированного (-ых) олигосахарида (-ов), от 92,0 до 98,5 мас.% галактоолигосахарида (-ов) и от 0,3 до 4,0 мас.% сиалилированного (-ых) олигосахарида (-ов).
В конкретном варианте осуществления питательная композиция в соответствии с изобретением может содержать сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы). В ней может присутствовать один или несколько сиалилированных олигосахаридов.
Сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) можно выбирать из группы, содержащей 3’-сиалиллактозу (3-SL), 6’-сиалиллактозу (6-SL) и любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция содержит 3-SL и 6-SL. В некоторых конкретных вариантах осуществления соотношение 3’-сиалиллактозы (3-SL) и 6’-сиалиллактозы (6-SL) может находиться в диапазоне от 5 : 1 до 1 : 10 или от 3 : 1 до 1 : 1, или от 1 : 1 до 1 : 10.
В некоторых конкретных вариантах осуществления сиалилированный олигосахарид композиции представляет собой 6'-сиалиллактозу (6-SL).
Сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления их можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических сиалилтрансфераз или сиалидаз, нейраминидаз методом ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), путем химического синтеза или методом микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры микроорганизмов одного вида или смешанные культуры. Образование сиалилолигосахаридов можно инициировать акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления сиалиллактозы можно получать путем химического синтеза из лактозы и свободной N’-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты). Сиалиллактозы также доступны в продаже, например, от компании Kyowa Hakko Kogyo, Япония.
В конкретных примерах композиция может содержать от 0,05 до 5 г/л сиалилированного (-ых) олигосахарида (-ов), или от 0,1 до 4 г/л, или от 0,3 до 2 г/л, или от 0,4 до 1,5 г/л, или от 0,4 до 1 г/л, например 0,5 или 0,9 г/л сиалилированного (-ых) олигосахарида (-ов). В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция может содержать от 0,8 до 1,7 г/л сиалилированного (-ых) олигосахарида (-ов).
Композиция в соответствии с изобретением может содержать 0,03–3,88 г сиалилированного (-ых) олигосахарида (-ов) на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например 0,08–3,10 г, или 0,23–1,55 г, или 0,31–1,16 г, или 0,31–0,77 г, или 0,39–0,7 г, 0,62–1,32 г сиалилированного (-ых) олигосахарида (-ов) на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения питательная композиция содержит сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) в количестве менее 0,1 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения питательная композиция не содержит никаких сиалилированных олигосахаридов.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может также необязательно содержать по меньшей мере один предшественник олигосахарида. В ней может присутствовать один или несколько предшественников олигосахарида. Например, предшественником олигосахарида грудного молока является сиаловая кислота, фукоза или их смесь. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция содержит сиаловую кислоту.
В конкретных примерах композиция содержит от 0 до 3 г/л предшественника (-ов) олигосахарида, или от 0 до 2 г/л, или от 0 до 1 г/л, или от 0 до 0,7 г/л, или от 0 до 0,5 г/л, или от 0 до 0,3 г/л, или от 0 до 0,2 г/л предшественника (-ов) олигосахарида.
Композиция в соответствии с изобретением может содержать от 0 до 2,1 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например от 0 до 1,5 г, или от 0 до 0,8 г, или от 0 до 0,15 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
Питательная композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать по меньшей мере один пробиотик (или пробиотический штамм), такой как пробиотический бактериальный штамм.
Чаще всего применяются пробиотические микроорганизмы, которые главным образом представляют собой бактерии и дрожжи следующих родов: Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. и Saccharomyces spp.
В некоторых конкретных вариантах осуществления пробиотик представляет собой пробиотический бактериальный штамм. В некоторых конкретных вариантах осуществления он представляет собой, в частности, штаммы Bifidobacteria и/или Lactobacilli.
Приемлемые пробиотические бактериальные штаммы включают Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, доступный для приобретения у компании Valio Oy, Финляндия, под товарным знаком LGG; Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116, Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Streptococcus salivarius DSM 13084, продаваемые компанией BLIS Technologies Limited, Новая Зеландия, под названием KI2; Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, продаваемый в числе прочих компанией Christian Hansen, Дания, под товарным знаком Bb 12; Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, продаваемый компанией Morinaga Milk Industry Co. Ltd., Япония, под товарным знаком BB536; Bifidobacterium breve, продаваемый компанией Danisco под товарным знаком Bb-03; Bifidobacterium breve, продаваемый компанией Morinaga под товарным знаком M-16V; Bifidobacterium infantis, продаваемый компанией Procter & GambIe Co. под товарным знаком Bifantis; и Bifidobacterium breve, продаваемый компанией Institut Rosell (Lallemand) под товарным знаком R0070.
В одном конкретном варианте осуществления пробиотик представляет собой Bifidobacterium lactis, например Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446.
Питательная композиция в соответствии с изобретением может содержать от 10e3 до 10e12 КОЕ пробиотического штамма, более предпочтительно от 10e7 до 10e12 КОЕ, например от 10e8 до 10e10 КОЕ пробиотического штамма на грамм композиции в расчете на массу сухого вещества.
В одном варианте осуществления пробиотики являются жизнеспособными. В другом варианте осуществления пробиотики являются нерепликативными или инактивированными. В некоторых других вариантах осуществления можно использовать как жизнеспособные пробиотики, так и инактивированные пробиотики.
Питательная композиция изобретения может дополнительно содержать по меньшей мере один фаг (бактериофаг) или смесь фагов, предпочтительно направленных против патогенных микроорганизмов Streptococci, Haemophilus, Moraxella и Staphylococci.
Питательная композиция в соответствии с изобретением может, например, представлять собой детскую смесь, начальную детскую смесь, смесь для прикармливаемых детей или смесь последующего уровня, смесь для недоношенных детей, детское питание, детскую композицию на зерновой основе, обогатитель, такой как обогатитель грудного молока, или добавку. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция изобретения представляет собой детскую смесь, обогатитель или добавку, которые могут предназначаться для первых 4 или 6 месяцев жизни. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь.
В некоторых других вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой обогатитель. Обогатитель может представлять собой обогатитель грудного молока (например, обогатитель человеческого грудного молока) или обогатитель смеси, такой как обогатитель детской смеси или обогатитель смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.
Если питательная композиция представляет собой добавку, она может быть обеспечена в форме стандартных доз.
Питательная композиция настоящего изобретения может быть представлена в твердой (например, порошок), жидкой или клейстеризованной форме.
Питательная композиция в соответствии с изобретением, по существу, содержит источник белка. Белок может содержаться в количестве от 1,6 до 3 г на 100 ккал. В некоторых вариантах осуществления, в частности, когда композиция предназначена для преждевременно родившихся младенцев, такое количество может составлять от 2,4 до 4 г/100 ккал или более 3,6 г/100 ккал. В некоторых других вариантах осуществления количество белка может составлять менее 2,0 г на 100 ккал, например от 1,8 до 2,1 г/100 ккал, или 1,8–2 г/100 ккал, или 1,9–2,1 г белка на 100 ккал, или количество может составлять менее 1,8 г на 100 ккал, например 1,4–1,8 г/100 ккал или 1,5–1,7 г/100 ккал.
Тип белка не считается критическим для настоящего изобретения при условии, что соблюдены минимальные требования по содержанию незаменимых аминокислот и обеспечивается удовлетворительной рост. Таким образом, можно применять источники белка на основе молочной сыворотки, казеина и их смесей, а также источники белка на основе сои. Что касается сывороточных белков, источник белка может быть основан на кислой молочной сыворотке или сладкой молочной сыворотке или их смесях и может включать альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых желаемых пропорциях. «Альфа-лактальбумин» относится к высококачественному легкоперевариваемому сывороточному белку, который составляет 20–25% от общего количества белка человеческого грудного молока (HBM) и является основным белком, присутствующим в HBM. Структура альфа-лактальбумина состоит из 123 аминокислот и 4 дисульфидных мостиков, а молекулярная масса белка составляет 14,2 килодальтона. Благодаря высокому содержанию незаменимых аминокислот, особенно триптофана, альфа-лактальбумин идеально подходит для детских смесей с пониженным содержанием белка. В одном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения содержит альфа-лактальбумин в количестве от около 0,2 до около 0,4 г/100 ккал питательной композиции, или в количестве по меньшей мере 1,7 г/л, или по меньшей мере 2,0 г/л, или по меньшей мере 2,3 г/л, или по меньшей мере 2,6 г/л питательной композиции.
В некоторых преимущественных вариантах осуществления в источнике белка преобладает молочная сыворотка (т.е. более 50% белков происходят из сывороточных белков, например 60% или 70%).
Белки могут быть нативными или гидролизованными, либо они могут представлять собой смесь нативных и гидролизованных белков. Под термином «нативный» подразумевают, что основная часть белков является нативной, т.е. их молекулярная структура не изменена, например не изменено по меньшей мере 80% белков, например не изменено по меньшей мере 85% белков, предпочтительно не изменено по меньшей мере 90% белков, еще более предпочтительно не изменено по меньшей мере 95% белков, например не изменено по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления 100% белков не изменено.
Термин «гидролизованный» в контексте настоящего изобретения означает белок, который был гидролизован или расщеплен на составляющие его аминокислоты.
Белки могут быть полностью (т.е. глубоко) или частично гидролизованными. Может быть желательным вводить частично гидролизованные белки (степень гидролиза от 2 до 20%), например, младенцам или детям младшего возраста, предположительно подверженным риску развития аллергии на коровье молоко. При необходимости использования гидролизованных белков процесс гидролиза можно проводить по желанию и способом, известным в данной области. Например, гидролизаты сывороточного белка можно получать ферментативным гидролизом фракции молочной сыворотки в одну или более стадий. Если фракция молочной сыворотки, применяемая в качестве исходного материала, по существу, не содержит лактозы, то установлено, что в процессе гидролиза блокировка лизина белка проявляется в гораздо меньшей степени. Это позволяет снизить степень блокировки лизина с около 15 мас.% общего лизина до менее около 10 мас.% лизина; например до около 7 мас.% лизина, что значительно улучшает питательное качество источника белка.
В одном варианте осуществления изобретения гидролизовано по меньшей мере 70% белков, предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 80% белков, например гидролизовано по меньшей мере 85% белков, еще более предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 90% белков, например гидролизовано по меньшей мере 95% белков, в частности гидролизовано по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления гидролизовано 100% белков.
В одном конкретном варианте осуществления белки питательной композиции гидролизованы, полностью гидролизованы или частично гидролизованы. Степень гидролиза (DH) белка может составлять от 8 до 40, или от 20 до 60, или от 20 до 80 или более 10, 20, 40, 60, 80 или 90.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную композицию. В другом конкретном варианте осуществления композиция в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную питательную композицию.
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением, по существу, содержит источник углеводов. Это особенно предпочтительно в том случае, когда питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае можно применять любой источник углеводов, обычно находящийся в детских смесях, такой как лактоза, сукроза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси, хотя одним из предпочтительных источников углеводов является лактоза.
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением, по существу, содержит источник липидов. Это особенно важно, если питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае источником липидов может быть любой липид или жир, который подходит для применения в детских смесях. Некоторые подходящие источники жира включают в себя пальмовое масло, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты. Можно также добавлять незаменимые жирные кислоты — линолевую кислоту и α-линоленовую кислоту, а также небольшие количества масел, содержащих большие количества арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в готовом виде, например рыбьи жиры или микробные масла. Соотношение n-6 и n-3 жирных кислот в источнике жира может составлять от около 5 : 1 до около 15 : 1, например от около 8 : 1 до около 10 : 1.
В одном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения содержит триглицериды с высоким содержанием sn-2-пальмитата, предпочтительно триглицериды, имеющие более 33% пальмитиновых кислот в положении sn-2.
В одном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения содержит около 5 или 6 г на 100 ккал жира, и, например, по меньшей мере около 7,5 мас.% этого жира, например около 7,5–12,0%, состоят из пальмитиновой кислоты в положении sn-2.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит по меньшей мере 7,5%, предпочтительно 8%, более предпочтительно по меньшей мере 9,6% жира, представляющего собой sn-2 пальмитат, например около 7,8–11,8%, около 8,0–11,5 мас.%, около 8,5–11,0% или около 9,0–10,0 мас.% жира представляют собой пальмитиновую кислоту в положении sn-2 триглицерида.
В некоторых вариантах осуществления пальмитиновая кислота составляет от около 15 до около 25%, например от около 15 до около 20 мас.%, от общего содержания жирных кислот в смеси, и по меньшей мере от около 30%, например от около 35, до около 43% от общего содержания пальмитиновой кислоты находятся в положении sn-2.
В продаже доступна композиция BetapolTM B-55 от компании Lipid Nutrition, которая представляет собой смесь триглицеридов, полученную из растительного масла, в которой по меньшей мере 54% пальмитиновой кислоты находятся в положении sn-2 молекулы глицерина. В одном варианте осуществления содержание жира питательной композиции изобретения — около 40–50 мас.% BetapolTM B-55, например от около 43% до около 45 мас.%. Для специалистов в данной области очевидно, что процентное содержание используемого жира с высоким содержанием sn-2-пальмитата и общее количество sn-2-пальмитата в смеси может варьироваться и что можно использовать другое масло с содержанием sn-2-пальмитата без отступления от сущности и объема изобретения.
Питательная композиция изобретения может также содержать все витамины и минеральные вещества, которые считаются обязательными в повседневном рационе, в значимых с точки зрения питания количествах. Для некоторых витаминов и минеральных веществ установлены минимальные требования. Примеры минеральных веществ, витаминов и других питательных веществ, которые необязательно присутствуют в композиции изобретения, включают в себя витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозит, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлор, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минеральные вещества обычно добавлены в форме солей. Присутствие и количества конкретных минеральных веществ и других витаминов могут варьироваться в зависимости от предполагаемой популяции.
Если это необходимо, питательная композиция согласно настоящему изобретению может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соя, лецитин, моно- и диглицериловые сложные эфиры лимонной кислоты и т. п.
Питательная композиция изобретения может также содержать другие вещества, которые могут оказывать благоприятное воздействие, такие как лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.
Питательная композиция изобретения также может содержать каротиноид (-ы). В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения питательная композиция изобретения не содержит каротиноидов.
Питательную композицию в соответствии с изобретением можно получать любым подходящим способом. Далее композиция будет описана на конкретном примере.
Например, смесь, такую как детская смесь, можно получать путем смешивания источника белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих пропорциях. На данном этапе можно включать эмульгаторы в случае их применения. На данном этапе можно добавлять витамины и минеральные вещества, но обычно их добавляют позднее для предотвращения термического разложения. Перед смешиванием в источнике жира можно растворять любые липофильные витамины, эмульгаторы и т. п. Затем можно примешивать воду, предпочтительно очищенную обратным осмосом, с образованием жидкой смеси. Температура воды для удобства находится в диапазоне между около 50°С и около 80°С для облегчения диспергирования ингредиентов. Для образования жидкой смеси можно использовать доступные в продаже разжижители.
На данном этапе можно добавлять фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы), особенно если конечный продукт должен иметь жидкую форму. Если конечный продукт должен представлять собой порошок, эти компоненты при необходимости также можно добавлять на данной стадии.
Затем жидкую смесь гомогенизируют, например, в две стадии.
Затем жидкую смесь можно термически обрабатывать для снижения бактериальной нагрузки путем быстрого нагрева жидкой смеси, например, до температуры в диапазоне от около 80°C до около 150°C, в течение периода времени от около 5 секунд до около 5 минут. Нагревание можно осуществлять путем нагнетания пара с помощью автоклава или теплообменника, например пластинчатого теплообменника.
Затем жидкую смесь можно охлаждать до температуры от около 60°C до около 85°C, например, путем мгновенного охлаждения. Затем жидкую смесь можно снова гомогенизировать, например, в две стадии: под давлением от около 10 МПа до около 30 МПа на первой стадии и от около 2 МПа до около 10 МПа на второй стадии. Затем гомогенизированную смесь можно дополнительно охлаждать для добавления любых термочувствительных компонентов, например витаминов и минеральных веществ. На данном этапе для удобства регулируют рН и содержание сухих веществ в гомогенизированной смеси.
Если конечный продукт должен представлять собой порошок, гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, такой как распылительная сушилка или сублимационная сушилка, и превращают в порошок. Влагосодержание порошка должно составлять менее около 5 мас.%. На данном этапе или в альтернативном варианте осуществления также можно добавлять фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) путем сухого смешивания или путем перемешивания их в форме сиропа из кристаллов вместе с пробиотическим (-ими) штаммом (-ами) (при использовании), и смесь подвергают распылительной сушке или сублимационной сушке.
Если предпочтительна жидкая композиция, гомогенизированную смесь можно стерилизовать, а затем асептически разливать в подходящие контейнеры или можно сначала разливать в контейнеры, а затем стерилизовать в автоклаве.
В другом варианте осуществления композиция изобретения может представлять собой добавку.
Добавка может быть представлена, например, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости. Добавка может дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы стенок/оболочек, соединения матриц, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т. п.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, маскирующие вкус агенты, утяжеляющие агенты, желирующие агенты и гелеобразующие агенты. Добавка также может содержать традиционные фармацевтические добавки и адъюванты, вспомогательные вещества и разбавители, в том числе, без ограничений, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизирующие агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, смазывающие вещества, красители, увлажняющие агенты, наполнители и т.п.
Дополнительно добавка может содержать органический или неорганический материал-носитель, подходящий для перорального или парентерального введения, а также витамины, минеральные микроэлементы и другие микроэлементы в соответствии с рекомендациями государственных органов, такими как рекомендуемые нормы потребления (RDA) США.
Питательная композиция в соответствии с изобретением применяется для младенцев или детей младшего возраста. Особенно она рассчитана на младенцев в возрасте менее 6 месяцев.
Питательную композицию можно вводить (или давать, или вскармливать ею) в возрасте и в течение периода времени в зависимости от потребности и от применения для профилактической или терапевтической цели.
В некоторых вариантах осуществления возраст младенцев или детей младшего возраста составляет 0–36 месяцев, например 0–12 месяцев или 0–6 месяцев. Ожидают, что еще большую пользу композиция изобретения может принести новорожденным младенцам (в возрасте 0–4 недель или 0–8 недель), поскольку их кишечный тракт может быть более ослабленным.
В некоторых конкретных вариантах осуществления питательная композиция может представлять собой детскую смесь и может быть специально предназначена для младенцев в возрасте от 0 до 12 месяцев, вскармливаемых преимущественно детской смесью.
В некоторых конкретных вариантах осуществления питательная композиция предназначена для вскармливания младенцев или детей младшего возраста от 6–12 месяцев или от 12–36 месяцев. В эти периоды младенцы или дети младшего возраста подвергаются особому риску, поскольку уменьшается защита материнского молока и возрастает воздействие патогенов.
В некоторых вариантах осуществления питательную композицию можно, например, давать младенцам сразу же после рождения. Композицию изобретения также можно давать в течение первой недели жизни младенца или в течение первых 2 недель жизни, или в течение первых 3 недель жизни, или в течение первого месяца жизни, или в течение первых 2 месяцев жизни, или в течение первых 3 месяцев жизни, или в течение первых 4 месяцев жизни, или в течение первых 6 месяцев жизни, или в течение первых 8 месяцев жизни, или в течение первых 10 месяцев жизни, или в течение первого года жизни, или в течение первых двух лет жизни, или даже дольше. В некоторых особенно преимущественных вариантах осуществления настоящего изобретения питательную композицию дают (или вводят) младенцу в течение первых 4 или 6 месяцев после рождения указанного младенца.
В некоторых других вариантах осуществления питательную композицию изобретения дают в течение несколько дней (например, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20 …) или нескольких недель (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 …), или нескольких месяцев (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 …) после рождения.
В некоторых преимущественных вариантах осуществления питательную композицию дают сразу после начала проявлений не-ротавирусной диареи у младенца или ребенка младшего возраста, заболевшего не-ротавирусной диареей.
В зависимости от потребностей питательную композицию настоящего изобретения можно давать в течение нескольких дней (1, 2, 3, 4, 5, 6 и т. п.), или в течение нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или даже более), или в течение нескольких месяцев (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или даже более).
В некоторых вариантах осуществления питательную композицию дают до тех пор, пока не исчезнут симптомы не-ротавирусной диареи у младенца или ребенка младшего возраста, заболевшего не-ротавирусной диареей, либо до нескольких дней, или недель, или месяцев после указанного исчезновения.
В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с изобретением может быть предназначена для применения до и/или во время периода отлучения от груди.
В одном варианте осуществления композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве композиции, дополнительной к материнскому молоку. В некоторых вариантах осуществления изобретения младенец или ребенок младшего возраста получает материнское молоко в течение по меньшей мере первых 2 недель или первых 1, 2, 4 или 6 месяцев. В одном варианте осуществления питательную композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста после такого периода питания материнским молоком или дают во время такого периода питания материнским молоком. В другом варианте осуществления композицию дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве единственной или основной питательной композиции в течение по меньшей мере одного периода времени, например после 1, 2-го или 4-го месяца жизни, в течение по меньшей мере 1, 2, 4-го или 6-го месяцев.
В одном варианте осуществления питательная композиция изобретения является полной питательной композицией (удовлетворяющей все или большинство потребностей субъекта в питании). В другом варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку или обогатитель, предназначенные, например, для дополнения грудного молока или для дополнения детской смеси или смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.
Младенцы или дети младшего возраста могут рождаться в срок или недоношенными. В конкретном варианте осуществления питательную композицию изобретения применяют для младенцев или детей младшего возраста, которые были рождены недоношенными. В конкретном варианте осуществления питательная композиция изобретения предназначена для применения у недоношенных младенцев.
В одном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения может также применяться у младенцев или детей младшего возраста, которые родились маленькими для своего гестационного возраста или имели низкий вес при рождении.
Младенцы или дети младшего возраста с низким весом при рождении могут быть или не быть недоношенными, и, таким же образом, младенцы или дети младшего возраста, маленькие для своего гестационного возраста, могут быть или не быть недоношенными.
Питательную композицию настоящего изобретения можно также применять для младенцев или детей младшего возраста, рожденных посредством кесарева сечения или посредством вагинальных родов.
Все младенцы и дети младшего возраста могут получать пользу от изобретения, поскольку все они являются или могут быть в определенном возрасте подвержены возникновению дисбаланса кишечной микробиоты.
В некоторых преимущественных вариантах осуществления изобретения питательная композиция предназначена для применения у младенцев или детей младшего возраста, уже имеющих ослабленную или несбалансированную микробиоту или дисбиоз микробиоты, например недоношенных младенцев, младенцев, рожденных посредством кесарева сечения, младенцев, рожденных маленькими для своего гестационного возраста или с низким весом при рождении, госпитализированных младенцев/детей младшего возраста, младенцев/детей младшего возраста, получавших или получающих лечение антибиотиками, и/или младенцев/детей младшего возраста, страдающих или страдавших от кишечной инфекции и/или воспаления кишечника.
В вариантах осуществления изобретения целью для терапии композицией настоящего изобретения являются младенцы, родившиеся недоношенными или родившиеся посредством кесарева сечения, или родившиеся маленькими для своего гестационного возраста, или имевшие низкий вес при рождении, или проявляющие дисбаланс или аномальную кишечную микробиоту, страдающие или страдавшие от кишечной инфекции и/или воспаления кишечника, особенно если возраст младенцев составляет 0–6 месяцев. Без ограничений, накладываемых какой-либо конкретной теорией, считают, что композиция настоящего изобретения даже еще полезнее младенцам младшего возраста, особенно если у младенцев имеется дисбаланс кишечной микробиоты (или они подвержены такому риску). У таких младенцев особый интерес представляет приобретение кишечной микробиоты, которая похожа на кишечную микробиоту младенцев, находящихся на грудном вскармливании (предпочтительно находящихся исключительно на грудном вскармливании). Действительно, это обеспечивает им нормальное количество необходимых для здоровья элементов, что может быть полезным, особенно для таких ослабленных младенцев.
Питательная композиция настоящего изобретения будет, конечно, еще полезнее младенцам, имеющим возможные нарушения кишечной микробиоты, или слабым младенцам/детям младшего возраста (таким как недоношенные младенцы и/или младенцы, рожденные посредством кесарева сечения).
Кроме того, ожидают, что еще большую пользу композиция изобретения приносит младенцам/детям младшего возраста, у которых наблюдаются кишечные расстройства (такие как диарея, инфекции или колики), особенно после рождения, например в течение первых 4 недель после рождения.
В особенно преимущественном варианте осуществления питательную композицию применяют для младенцев или детей младшего возраста, заболевших не-ротавирусной диареей, например, вызванной E. coli диареей, или имеющих высокий риск заболевания не-ротавирусной диареей (например, живущих в таких местностях высокого риска, как Африка к югу от Сахары и южная Азия). Питательная композиция по настоящему изобретению позволит младенцам или детям младшего возраста:
- получать общую кишечную микробиоту, которая приближена к норме (или к нормальной обстановке), например, получать лучше сбалансированную микробиоту, например, общую кишечную микробиоту, которая приближена к таковой же у них в отсутствие не-ротавирусной диареи. Это особенно относится к тем случаям, когда младенцы или дети младшего возраста уже заболели не-ротавирусной диареей.
- получать общую кишечную микробиоту, которая приближена к таковой у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых исключительно грудным молоком, по сравнению с общей кишечной микробиотой у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов. Это может относиться к тем случаям, когда младенцы или дети младшего возраста уже заболели не-ротавирусной диареей, или когда они рискуют заболеть не-ротавирусной диареей.
Композиция настоящего изобретения оказывает положительное влияние на общую микробиоту младенцев или детей младшего возраста: она стимулирует и/или индуцирует в кишечнике младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых питательной композицией настоящего изобретения, общую микробиоту кишечника, приближенную к нормальной или приближенную к микробиоте младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых исключительно человеческим грудным молоком, по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов (т.е. не содержащей по меньшей мере одного фукозилированного олигосахарида и по меньшей мере одного N-ацетилированного олигосахарида).
Главный и неожиданно обнаруженный полезный для здоровья эффект питательной композиции настоящего изобретения состоит в том, что композиция глобальным образом модулирует общую микробиоту младенцев, вскармливаемых питательной композицией изобретения, делая ее похожей на микробиоту младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Меняются не только некоторые определенные таксоны микробиоты, но питательная композиция, в частности, индуцирует сдвиг композиции общей микробиоты в сторону такой композиции, которая индуцируется грудным вскармливанием. Кроме этого, как показывают эксперименты, сходство с теми же аспектами у младенцев, находящихся на грудном вскармливании, наблюдается как у композиции кишечной микробиоты (т.е. относительное таксономическое богатство и/или разнообразие общей микробиоты), так и функции кишечной микробиоты (т.е. ее активность и/или функциональность, например образующиеся в результате метаболиты). Таким образом, в случае композиции кишечной микробиоты индуцированная/стимулированная микробиота является специфичной по 2 аспектам:
«количественному»: кишечная флора включает в себя больше полезных бактерий и меньше неполезных или вредных бактерий;
«качественному»: разнообразие бактериальных таксонов больше напоминает микробиоту младенцев, находящихся на грудном вскармливании.
Разнообразие общей микробиоты может быть альфа-разнообразием (подробности показаны в разделе примеров), и его можно иллюстрировать, например, как измеренное индексом филогенетического разнообразия Фэйта (PD_whole_tree).
Влияние на здоровье, обеспечиваемое питательной композицией изобретения, можно измерить у младенцев или детей младшего возраста в возрасте 0–36 месяцев, необязательно 0–12 месяцев. Его можно наблюдать после нескольких дней или недель применения композиции — например, после 4 недель, или 6 недель, или 8 недель применения. Однако наблюдение этой стимулированной/индуцированной общей микробиоты может занять 4, 6 или 8 недель до того, как ее можно будет увидеть. Влияние можно измерить, например, в кале младенцев/детей младшего возраста.
В контексте изобретения полезный для здоровья эффект приближает общую микробиоту кишечника младенцев или детей младшего возраста к норме и/или к микробиоте младенцев или детей младшего возраста, находящихся на грудном вскармливании. Эффект особенно виден при сравнении с младенцами или детьми младшего возраста, которые не получают композицию настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения позволит стимулировать и/или индуцировать у младенцев или детей младшего возраста общую микробиоту кишечника, которая приближена к таковой у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи и/или которая приближена к таковой у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых исключительно человеческим грудным молоком, по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов.
Такой положительный эффект может включать в себя i) угнетение, уменьшение или ингибирование роста патогенных бактерий или снижение нагрузки патогенными бактериями и/или ii) усиление, увеличение или стимуляцию роста полезных бактерий. В некоторых вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения предусматривает (или включает, или сопровождается, или характеризуется) увеличение популяции Bifidobacterium и/или угнетение популяции Escherichia и/или Peptostreptococcaceae по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией. Этот эффект можно измерить в кале указанных младенцев или детей младшего возраста, например в возрасте 1, 4, 6 или 8 недель или старше и, например, после 1, 4, 6 или 8 недель вскармливания указанной питательной композицией. Композицию микробиоты кала можно измерить, например, анализом рДНК 16S или метагеномным анализом (подробности приводятся в разделе с примером).
За счет угнетения, снижения и/или ингибирования роста популяций патогенных бактерий и/или индукции более полезных бактерий, в количественном и качественном аспектах, композиция изобретения обеспечивает положительное влияние на здоровье. Такая здоровая кишечная микробиота в конечном счете связана с надлежащим всасыванием питательных веществ, адекватным ростом, уменьшением колик, уменьшением инфекции, уменьшением диареи и улучшением состояния кишечника.
Влияние изобретения может быть профилактическим (например, предотвращение дисбаланса кишечной микробиоты, предотвращение не-ротавирусной диареи, поддержание здоровой кишечной микробиоты, введение здоровой кишечной микробиоты) или лечебным (восстановление здоровой кишечной микробиоты при ее нарушении, помощь в устранении или сокращении популяций не-ротавирусных патогенных микроорганизмов в кишечнике, помощь в выздоровлении после не-ротавирусной диареи, введение здоровой микробиоты после нарушений, вызванных не-ротавирусной диареей).
В некоторых вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения предусматривает (или включает, или сопровождается, или характеризуется) уменьшение патогена (-ов) и/или уменьшение болезнетворного (-ых) фактора (-ов) по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией без содержания олигосахаридов. Эти эффекты можно измерить в кале указанных младенцев или детей младшего возраста, например в возрасте 1, 4, 6 или 8 недель или старше и, например, после 1, 4, 6 или 8 недель вскармливания указанной питательной композицией.
Уменьшение патогена (-ов) означает уменьшение частоты появления и/или количества (например, нагрузки, числа) патогена (-ов). Ее можно измерить, например, методом Luminex ПЦР (подробности приводятся в разделе с примером). Возможно уменьшение таких патогенов, как вирусы, бактерии и/или протисты. К конкретным примерам вирусных патогенов относятся норовирус (например, норовирус GI/GII) и/или ротавирус (например, ротавирус A). К конкретным примерам бактериальных патогенов относятся Clostridium difficile (например, токсин A/B Clostridium difficile), Campylobacter, Escherichia coli (например, E. coli O157). К конкретным примерам патогенных простейших относится Cryptosporidium.
В конкретных вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения вызывает уменьшение количества не-ротатирусных патогенов.
В одном конкретном примере питательная композиция предусматривает уменьшение количества патогенных бактерий Clostridium difficile.
В еще одном конкретном примере питательная композиция вызывает уменьшение количества патогенных бактерий E. coli.
Болезнетворный (-ые) фактор (-ы) может (могут) представлять собой болезнетворные гены и/или гены резистентности к антибиотикам, которые могут быть обнаружены, например, метагеномным анализом (подробности приводятся в разделе с примером). Конкретными примерами болезнетворных генов являются gi:16767513 (yjcB — предполагаемый внутренний мембранный белок) из Salmonella enterica LT2, gi:21284341 (cna — предшественник адгезина-коллагена) из Staphylococcus aureus MW2, gi:24528016 (l7045 — L7045) из Escherichia coli 536, gi:15808725 (fecB — FecB) из Shigella flexneri YSH6000 и gi:21282741 (isdA — белок клеточной поверхности) из Staphylococcus aureus MW2.
В некоторых вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения вызывает (или содержит, или сопровождается, или характеризуется ими) уменьшение продукции свободных аминокислот и/или стимуляцию продукции лактата по сравнению с общей микробиотой кишечника у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи, и/или по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей олигосахаридов.
Лактат продуцируется молочнокислыми бактериями, такими как лактобактерии и бифидобактерии, и он может препятствовать росту других бактерий, в том числе патогенных. К конкретным примерам свободных аминокислот относятся фенилаланин, тирозин и изолейцин. Эти эффекты можно измерить в кале указанных младенцев или детей младшего возраста, например в возрасте 1, 4, 6 или 8 недель или старше и, например, после 1, 4, 6 или 8 недель вскармливания указанной питательной композицией. Измерения можно выполнять с использованием общепризнанного метабономного подхода, основанного на протонной ядерной магнитно-резонансной спектрометрии (1H ЯМР) (Moco et al, 2013, Metabolomics perspectives in Pediatric Research, Pediatr. Res. 73, 570–576).
Влияние на здоровье, оказываемое на младенцев или детей младшего возраста, можно измерить различными методами, как показано ниже в примере.
В одном варианте осуществления влияние на общую микробиоту измеряют путем вычисления альфа-разнообразия в каждом образце и анализа распределения (подробности представлены в разделе с примером).
В одном варианте осуществления влияние на общую микробиоту измеряют путем вычисления бета-разнообразия между группами с использованием показателя, учитывающего филогенетические расстояния между OTU (операционными таксономическими единицами), например с использованием метода UniFrac, и анализа распределения. В альтернативном варианте бета-разнообразие между контрольной группой, исследуемой группой и группой, находящейся на грудном вскармливании, можно оценить при помощи многопараметрической ординации с проверкой гипотезы на основе процедур рандомизации (например, канонический корреспондентный анализ (CCA), анализ избыточности (RDA)) или многовариантный параметрический или непараметрический тест (например, Adonis, ANOSIM, многопараметрический дисперсионный анализ). В одном конкретном примере бета-разнообразие вычисляют с использованием RDA.
В одном варианте осуществления изобретения стимулированная и/или индуцированная общая микробиота кишечника у младенцев и/или детей младшего возраста, вскармливаемых питательной композицией настоящего изобретения, имеет существенно сниженное альфа-разнообразие (например, сниженное на по меньшей мере 0,10 единицы, например, по меньшей мере на 0,12 единицы или по меньшей мере на 0,15 единицы, например, на 0,19 единицы) по сравнению с общей микробиотой кишечника у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи, и/или по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей олигосахаридов, присутствующих в питательной композиции изобретения (например, по меньшей мере одного фукозилированного олигосахарида и по меньшей мере одного N-ацетилированного олигосахарида), и следовательно, приближена к таковой у младенцев на грудном вскармливании.
Питательную композицию настоящего изобретения можно применять для целей профилактики и/или лечения.
В одном конкретном аспекте настоящее изобретение также относится к питательной композиции для применения при обеспечении здорового роста, для применения при обеспечении здоровой иммунной системы, для применения при обеспечении нормальной работы кишечника и/или для применения в профилактике и/или лечении дисбиоза микробиоты кишечника у младенцев или детей младшего возраста.
Полезные для здоровья эффекты, которые обеспечиваются композицией изобретения, могут представлять собой кратковременные, средне- и/или долговременные эффекты.
Эффект может наблюдаться сразу после введения композиции настоящего изобретения и/или проявляться в дальнейшей жизни, т.е. после введения композиции, например от 1 недели до нескольких месяцев, например от 2 до 4 недель, от 2 до 6 недель, от 2 до 8 недель, от 1 до 6 месяцев или от 2 до 12 месяцев после указанного введения.
Другие объекты
Еще одним объектом настоящего изобретения является применение по меньшей мере одного фукозилированного олигосахарида и по меньшей мере одного N-ацетилированного олигосахарида в препарате питательной композиции для профилактики и/или лечения не-ротавирусной диареи у младенцев или детей младшего возраста путем воздействия на дисбиоз общей кишечной микробиоты, который возникает до, во время и/или после не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста.
Еще один объект настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид для профилактики и/или лечения не-ротавирусной диареи у младенцев или детей младшего возраста путем воздействия на дисбиоз общей кишечной микробиоты, который возникает до, во время и/или после не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста.
Еще один объект настоящего изобретения относится к способу профилактики и/или лечения не-ротавирусной диареи у младенцев или детей младшего возраста путем воздействия на дисбиоз общей кишечной микробиоты, который возникает до, во время и/или после не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста, причем указанный способ включает введение указанному младенцу или ребенку младшего возраста питательной композиции, содержащей по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид.
Указанные ранее варианты осуществления и примеры (например, относящиеся к типам и количествам олигосахарида, питательной композиции, введению, целевой популяции и т. п.) также применимы к перечисленным различным объектам (т.е. фармацевтическим композициям, способам и т.п.).
Примеры
Следующие примеры демонстрируют некоторые конкретные варианты осуществления композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением. Эти примеры приведены исключительно с целью иллюстрации, и их не следует рассматривать как ограничения настоящего изобретения, поскольку в пределах сущности изобретения возможны его многочисленные варианты.
Пример 1
Ниже в таблице 1 приведен пример состава питательной композиции (например, детской смеси) в соответствии с настоящим изобретением. Эта композиция приводится исключительно в качестве иллюстрации.
Таблица 1. Пример состава питательной композиции (например, детской смеси) в соответствии с настоящим изобретением
Пример 2
Описание клинического исследования
120 младенцев и детей младшего возраста, госпитализированных с острой диареей, были включены в данное проспективное одноцентровое исследование. В испытание были включены младенцы и дети в возрасте 6–24 месяцев, мальчики (чтобы легче отделять кал от мочи), с водянистой диареей в течение менее 48 часов в анамнезе, от родителей которых было получено письменное информированное согласие. Исключали пациентов с системной инфекцией, недостаточностью питания (балл Z < -3) и значимыми медицинскими отклонениями от нормы. Из испытания также исключали пациентов, получавших антибиотики или нуждавшихся в них. Для включения в исследование у младенцев и детей младшего возраста должен быть получен отрицательный результат анализа кала на инвазивную диарею, Vibrio cholerae по микроскопии в темном поле и на ротавирус методом ИФА. Образцы кала исследовали на наличие ETEC, EPEC и EAEC согласно стандартным процедурам в Международном центре исследования заболеваний диареей, Бангладеш (icddr, b) (Svenungsson B, et al. Enteropathogens in adult patients with diarrhea and healthy control subjects: a 1-year prospective study in a Swedish clinic for infectious diseases. Clin. Infect. Dis. 2000 May; 30 (5): 770–8; Vidal M, et al. Single multiplex PCR assay to identify simultaneously the six categories of diarrheagenic Escherichia coli associated with enteric infections. J. Clin. Microbiol. 2005 Oct; 43(10): 5362–5).
Кормление в соответствии с возрастом проводили рано в виде кормления грудью до насыщения или стандартизованного больничного рациона питания с обеспечением приблизительно 100 ккал/кг массы тела в день.
Материалы и методы
Полный подсчет бактерий в кале и обнаружение и количественный анализ вирулентных генов E. coli выполняли методом ПЦР, как описано в Nadkarni et al, Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology. 2002 Jan; 148 (Pt 1): 257–66, и в Guion et al, Detection of diarrheagenic Escherichia coli by use of melting-curve analysis and real-time multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 2008 May; 46(5): 1752–7.
Выделение ДНК из кала
Суммарную ДНК выделяли с использованием набора QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя за исключением добавления ряда стадий механического измельчения (11 × 45 с) с использованием аппарата FastPrep и пробирок Lysing Matrix B (MP Biochemicals) (Junick J, Blaut M. Quantification of human fecal bifidobacterium species by use of quantitative real-time PCR analysis targeting the groEL gene. Appl. Environ. Microbiol. 2012 Apr; 78 (8): 2613–22. doi: 10.1128/AEM.07749–11. Epub 2012 Feb 3).
Пиросеквенирование и анализ генов 16S
Вариабельную область 16S от V1 до V3 амплифицировали в ПЦР и секвенировали на приборе Roche 454 GS-FLX-Titanium Sequencer, как описано в Sanchez M, et al. Effect of Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 supplementation on weight loss and maintenance in obese men and women. Br. J. Nutr. 2014 Apr 28; 111 (8): 1507–19. Исходные данные последовательности депонировали в GenBank Short Read Archive и анализировали с помощью программ Mothur v.1.33.0 (Schloss, P. D., et al., 2009,. “Introducing mothur: Open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.” Applied and Environmental Microbiology 75(23): 7537–7541) и QIIME v.1.8 (Caporaso J.G., et al., 2010b, QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods 7: 335–336). Фон в результатах пиросеквенирования снижали с помощью функции PyroNoise в программе Mothur (Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T.P., Davenport, R.J., Hall, N., Head, I.M. et al., 2009, Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat Methods 6: 639–641) согласно описанной стандартной процедуре СОП 454 (Schloss et al, 2011, Assessing and improving methods used in operational taxonomic unit-based approaches for 16S rRNA gene sequence analysis. Appl Environ Microbiol 77: 3219–3226). Химеры идентифицировали с помощью функции usearch61 в QIIME (Edgar et al, 2011, UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27: 2194–2200). Затем последовательности обрезали, как описано в 454 SOP Mothur, чтобы последовательности содержали перекрытие одной и той же области 16S. Подбор операционных таксономических единиц (OTU) de novo с идентичностью 97% выполняли с помощью функции uclust (Edgar R.C., 2010, Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26: 2460–2461). Таксономическое назначение репрезентативных последовательностей OTU выполняли с помощью функции RDP Classifier при доверительном пороге 0,6 (Wang Q. et al, 2007, Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl Environ Microbiol 73: 5261–5267) в справочной базе данных Greengenes v.13.8 (McDonald D. et al, 2012, An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. ISME J 6: 610–618). Анализы разнообразия выполняли в программе QIIME, а корреляции с помощью Calypso на сайте http://bioinfo.qimr.edu.au/calypso. Анализ модели полиномиальной смеси по Дирихле (Holmes I. et al., 2012, Dirichlet Multinomial mixtures: Generative models for microbial metagenomics. PLoS One 7:e30126) выполняли в программе Mothur.
Результаты
Проводили детальный микробиологический анализ серийных образцов кала от первых 56 пациентов; у 77% в результате посева в клинической лаборатории выявлены патогенные E. coli (ETEC: 23; энтероагрегативные (EAEC): 10; энтеропатогенные (EPEC): 2; смешанная E. coli: 8 пациентов). С помощью ПЦР всей ДНК кала был подтвержден диагноз E. coli: 28 ETEC (23 elt+est+; 3 elt; 2 est+); 5 EPEC (4 eae+bfp+; 1 eae+); 7 EAEC (daaD+).
Суммарные количества бактерий в кале, определенные методом кПЦР, были стабильными в течение госпитализации, но меньшими, чем в контроле (см. фиг. 1A). Количества жизнеспособных E. coli составляли < 5% от всех бактерий в кале пациентов с диареей (фиг. 1B) и были только в 10 раз больше у пациентов с ETEC, чем у пациентов с диареей, вызванной не E. coli. Количества генов термоустойчивых (фиг. 1C) и термолабильных (фиг. 1D) токсинов при микробиологически подтвержденных инфекциях ETEC достигали пиковых титров на день 2 госпитализации (составляя < 1% от всех бактерий кала) с последующим быстрым падением во всех трех группах лечения. Как проиллюстрировано на фиг. 1, сначала наблюдали незначительное увеличение количества Escherichia coli, а затем его уменьшение, но E. coli не преобладала в кишечной микробиоте при вызванной E. coli диарее у детей.
На фиг. 2 показано, что Streptococcus составлял 52% бактерий в кале в острую фазу диареи по сравнению с 7% Escherichia (фиг. 2C и 2D). Не-ротавирусная диарея, вызванная E. coli, сопровождается, в частности, сильным увеличением количества Streptococcus, незначительным увеличением количества Escherichia и сильным уменьшением количества Bifidobacteria. В течение госпитализации наблюдалось пересекающееся повышение численности Bifidobacterium и снижение численности Streptococcus (фиг. 2B и 2C). В день 4 состав общей микробиоты кала был подобен таковому через 21 день после госпитализации, однако не восстанавливался до состава здоровых младенцев и детей младшего возраста (фиг. 2A).
Интересно, что у младенцев и детей младшего возраста с более ранним разрешением диареи (< 4 дней) отношение Bifidobacterium/Streptococcus также показало более раннюю нормализацию, а процентное содержание Escherichia было меньшим, чем у тех, у кого разрешение диареи наступало позже (> 5 дней).
У пациентов с диареей показано массивное размножение стрептококков в кале, которые в процессе выздоровления последовательно замещались бифидобактериями.
Пример 3
Описание клинического исследования
Исследование безопасности было проведено в Dipartimento Materno Infantile, Unità Operativa Complessa di Neonatologia e Terapia Intensiva Neonatale, AOUP “Paolo Giaccone”, г. Палермо, Италия и Kinderartsenpraktijk, г. Хасселт, Бельгия.
Это исследование представляло собой рандомизированное контролируемое двухцентровое интервенционное клиническое исследование с 2 параллельными группами вскармливания смесями. Исследуемая популяция для групп, вскармливаемых смесями, состояла из здоровых полностью доношенных младенцев мужского и женского пола в возрасте от 0 до 14 дней на момент включения в исследование, которых на момент включения в исследование вскармливали исключительно смесями. Пригодных для участия младенцев случайным образом распределяли в группы двух исследуемых смесей (контрольной или испытуемой), используя в качестве факторов стратификации способ родов (вагинальные или кесарево сечение) и пол. На стадии 1 этих рандомизированных младенцев вскармливали исключительно испытуемой или контрольной смесью с момента начала исследования и до возраста 4 месяцев в количестве, соответствующем их массе, возрасту и аппетиту. Родители/специалисты по уходу, исследователи, вспомогательный персонал исследования и руководитель клинического проекта не имели возможности идентифицировать исследуемые смеси.
В исследовании применяли следующие детские смеси:
• контрольную смесь давали контрольной группе: это была стандартная начальная детская смесь с преобладанием молочной сыворотки, содержащая длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LC-PUFA) и не содержащая пробиотиков (66,9 ккал/100 мл растворенной смеси, 1,889 г белка/100 ккал порошка с соотношением сыворотка : казеин 71,6% : 28,4%, подробная композиция приведена в таблице 2);
• испытуемую смесь давали исследуемой группе: это была контрольная смесь за исключением того, что часть лактозы заменили двумя 2 ОГМ (2FL и LNnT) в следующих количествах: 0,5–0,6 г LNnT и 1,0–1,2 г 2’FL на литр растворенной смеси (подробная композиция приведена в таблице 2).
В качестве референтной группы (группы, находящейся на грудном вскармливании = группа BF) у младенцев, находящихся исключительно на грудном вскармливании по меньшей мере в течение 3 месяцев, отбирали образцы кала по меньшей мере в возрасте 3 месяцев.
Таблица 2. Композиция контрольной смеси и исследуемой смеси
Оценку микробиоты кала делали для каждой группы в возрасте 3 месяцев с использованием разных методов, см. таблицу 3.
рДНК 16S
вскармливании
Таблица 3. Количество младенцев в группах выборки «начавшие получать лечение» (ITT), выборки «выполнившие требования протокола» (PP) и количество образцов кала, доступных для групп, выполнивших требования протокола, или референтной группы, находящейся на грудном вскармливании, для анализа микробиоты методами общего секвенирования рДНК 16S, патоген-специфической амплификации Luminex ПЦР, глобального метагеномного секвенирования и профилирования метаболитов по ЯМР.
Материалы и методы
Забор образцов кала
Родители дома отбирали образцы кала у всех участников исследования за 48 часов до посещения в возрасте 3 месяцев. Для этого родителям был предоставлен набор (мешок-термос, пузырь со льдом, сосуды со шпателем, запечатываемые пластиковые пакеты, лист с инструкцией). Родителей попросили взять 2 образца, хранить их дома в морозильнике при -20°C и принести образцы кала в мешке-термосе, содержащем пузырь с замороженным льдом, в пункт посещения, где образцы хранились в замороженном виде при -80°C. Далее образцы транспортировали в Исследовательский центр Nestle, Швейцария, на сухом льду и до анализа хранили замороженными при -80°C.
Выделение ДНК из кала
Суммарную ДНК выделяли с использованием набора QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя за исключением добавления ряда стадий механического измельчения (11 × 45 с) с использованием аппарата FastPrep и пробирок Lysing Matrix B (MP Biochemicals) (Junick and Blaut, 2012, Quantification of human fecal bifidobacterium species by use of quantitative real-time PCR analysis targeting the groEL gene. Appl Environ Microbiol 78: 2613–2622).
Амплификация генов 16S и секвенирование
Далее выполняли ПЦР-амплификацию вариабельных участков 16S V3–V4, используя универсальные праймеры (Klindworth et al., 2013, Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res 41: e1) и секвенирование при помощи технологии Illumina Miseq, как описано ранее (Caporaso et al., 2012, Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J 6: 1621–1624).
Анализ данных 16S
После качественной фильтрации 6 710 039 последовательностей, описывающих микробиоту 154 образцов выборки «выполнившие требования протокола» (PP) (см. таблицу 3), со средним покрытием 42 739 последовательностей на образец, классифицировали на 173 OTU. Три образца с менее 10 000 последовательностей исключали из анализа рДНК 16S.
Необработанные данные последовательностей анализировали, используя комбинацию программных пакетов Mothur (Schloss et al., 2009, Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol 75: 7537–7541) и QIIME (Caporaso et al., 2010, QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods 7: 335–336). Спаренные концевые последовательности демультиплексировали и соединяли в соответствии с описанием (Kozich et al., 2013 Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl Environ Microbiol 79: 5112–5120). Далее последовательности расщепляли на отдельные fasta-файлы для каждого образца, используя команды Mothur [deunique.seqs(), degap.seqs() и split.groups()]. Преобразование в формат QIIME с использованием add_qiime_labels.py и дальнейшие стадии анализа выполняли в QIIME. Проверку на химеризацию и подбор OTU с идентичностью 97% выполняли с применением алгоритма Uchime (Edgar et al., 2011, UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27: 2194–2200), используя pick_open_reference.py. Назначение в таксономические категории выполняли на репрезентативных последовательностях с использованием RDP Classifier с доверительным порогом 0,6 (Wang et al., 2007, Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl Environ Microbiol 73: 5261–5267). Выполняли выравнивание репрезентативных последовательностей OTU, используя метод PyNast (Caporaso et al., 2010, PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics 26: 266–267), а также Uclust в качестве способа попарного выравнивания. Полученные множественные выравнивания затем подвергали фильтрации и использовали для построения филогенетического дерева методом FastTree (Price et al., 2009, FastTree: computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix. Mol Biol Evol 26: 1641–1650). После качественной фильтрации (Bokulich et al., 2013, Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nat Methods 10: 57–59) выполняли анализы альфа-разнообразия в QIIME, а также анализ избыточности (RDA) (Kindt R and Coe R., 2005, Tree diversity analysis. A manual and software for common statistical methods for ecological and biodiversity studies. Nairobi: World Agroforestry Centre — ICRAF) на уровне родов, используя веб-сайты Calypso по адресу http://bioinfo.qimr.edu.au/calypso.
Метагеномный анализ
Микробную композицию образцов кала из трех групп определяли путем высокопроизводительного секвенирования с мультиплексированием выделенной из кала ДНК с использованием прибора Illumina HiSeq, с применением парно-концевых ридов длиной 100 п. н. (PE 100). Библиотеки ДНК получали с использованием протокола Nextera XT. Образцы секвенировали на 6 высокопроизводительных проточных ячейках.
Первые риды разрезали, используя алгоритм DynamicTrim (v2.1) из пакета SolexaQA (Cox, M.P. et al., BMC Bioinformatics, 2010, SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics 11:485–490) с отсечкой вероятности 0,05. Полученные нарезанные последовательности затем фильтровали по порогу длины 25 п. н., используя алгоритм LengthSort (v2.1) из пакета SolexaQA. Прошедшие фильтрацию риды картировали на полном человеческом геноме hg19, используя алгоритм bowtie v2.2.5 (Langmead, B. and Salzberg, S., Nature Methods., 2012, Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods 9:357–359) для удаления человеческих ридов. В среднем, в контрольной группе, исследуемой группе и группе грудного вскармливания выявлено 0,9, 0,02 и 3,3% человеческих ридов соответственно. Для повышения эффективности вычислений количество ридов дополнительно уменьшали, используя функцию unique.seqs из пакета mothur v1.35 (Schloss, P.D., et al., Appl Environ Microbiol, 2009, Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol 75: 7537–7541), которая возвращает только уникальные найденные последовательности. Эта стадия уменьшила количество ридов на ~ 50%. После качественной фильтрации было получено медианное количество от 76 до 80 миллионов последовательностей из 157 образцов для выборки «выполнившие требования протокола» (PP) (см. таблицу 3) с равным покрытием в контрольной, исследуемой и референтной (BF) группе. Было получено медианное количество от 36 до 42 миллионов уникальных последовательностей, также равномерно распределенных между группами. Один образец, имевший всего 53661 последовательностей, был исключен из метагеномного анализа. Оставшиеся риды затем использовали для профилирования композиции микробных популяций с применением пакета MetaPhlAn v2 (Segata, N. et al., Nature Methods, 2012, Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 9:811–814).
Присутствие генов, кодирующих известные болезнетворные факторы, или генов резистентности к антибиотикам исследовали с использованием ShortBRED. ShortBRED представляет собой систему обработки информации, которая принимает набор белковых последовательностей, группирует их по семействам, извлекает набор отличительных строк («маркеров»), а затем производит поиск этих маркеров в метагеномных данных и определяет присутствие и количество интересующих семейств белков. Маркеры болезнетворных факторов были основаны на всех белковых последовательностях (2447 белковых последовательностей) из релиза R3 базы данных болезнетворных факторов патогенных бактерий Virulence Factor of Pathogenic Bacteria Database (http://www.mgc.ac.cn/VFs/ — Chen, L.H. et al., 2012, Toward the genetic diversity and molecular evolution of bacterial virulence factors. Nucleic Acids Res 40 (Database issue):D641–D645). Маркеры генов резистентности к антибиотикам были основаны на всех белковых последовательностях (7828 белковых последовательностей) из версии 1.1 базы данных генов резистентности к антибиотикам Antibiotic Resistance Genes Database (http://ardb.cbcb.umd.edu/ — Liu, B. and Pop., M., NAR, 2009, ARDB-Antibiotic Resistance Genes Database. Nucleic Acids Res 37(Database issue):D443–D447).
Статистическую значимость различий между группами оценивали по аппроксимации моделью отрицательной биномиальной регрессии, учитывая при необходимости лишние нулевые данные.
Определение патогенов методом Luminex в образцах кала
Образцы кала подвергали ряду стадий механического измельчения (3 × 60 с) с использованием аппарата FastPrep и пробирок Lysing Matrix B (MP Biochemicals), одновременное выделение ДНК и РНК выполняли с использованием набора QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN). Нуклеиновые кислоты определяли с использованием специфичных к последовательности праймеров из панели желудочно-кишечных патогенов (Gastrointestinal Pathogen Panel) (xTAG GPP) с применением системы Luminex 200 в соответствии с рекомендациями производителя (Luminex Molecular Diagnostics, Inc., г. Торонто, Канада). Определяемыми аналитами были аденовирусы серотипов 40/41, Campylobacter (C. jejuni, C. coli и C. lari), токсины A/B Clostridium difficile, Cryptosporidium (C. parvum и C. hominis), Entamoeba histolytica, Escherichia coli O157, энтеротоксигенные токсины LT/ST E. coli (ETEC), Giardia (G. lamblia также известная как G. intestinalis и G. duodenalis), норовирус GI/GII, ротавирус A, продуцирующие шигаподобный токсин E. coli (STEC) stx1/stx2, Vibrio cholera и Yersinia enterocolitica. Результаты определения Salmonella и Shigella не рассматривали из-за неединообразия в контрольных образцах.
Анализ кала на метаболиты
Для получения информации, выходящей за рамки аспекта композиции микробиоты кала, авторы изобретения исследовали биохимическую композицию кала, используя общепризнанный метабономный подход, основанный на протонной ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (1H ЯМР). 1H ЯМР-метабономика позволяет получить количественный профиль основных метаболитов, включая аминокислоты, основные органические кислоты (лактат, сукцинат, цитрат и т. п.) и углеводов и, следовательно, открывает уникальное окно для отслеживания метаболических функций кишечника.
Метаболическое профилирование образцов кала было адаптировано из ранее опубликованного метода (Martin et al., 2014, Impact of breast-feeding and high- and low-protein formula on the metabolism and growth of infants from overweight and obese mothers. Pediatr Res 75, 535–543. doi: 10,1038/pr,2013,250). Если коротко, 80–100 мг замороженного кала отбирали из пробирки с образцом кала, взвешивали и высушивали сублимацией. Высушенные образцы суспендировали в 1,2 мл дейтерированного фосфатного буферного раствора 0,2 M KH2PO4, содержащего 0,3 мМ азида натрия в качестве антибактериального средства и 1 мМ 3-(триметилсилил)-[2,2,3,3-2H4]-1-пропионата натрия в качестве референта химического сдвига ЯМР. Гомогенаты центрифугировали при 17 000 x g в течение 10 минут и 5 500 мкл супернатанта переносили в пробирки для ЯМР объемом 5 мм. Метаболические 1H ЯМР-профили получали при помощи спектрометра Bruker Avance III 600 МГц, оснащенного 5 мм криозондом при 300K (Bruker, Biospin, Германия), с использованием стандартной импульсной последовательности и импульсной последовательности спинового эхо с подавлением воды и обрабатывали с использованием программного пакета TOPSPIN (vs 3.2., Bruker). Обработку и анализ данных проводили, как описано ранее (Martin et al., 2014). Значимые матаболиты, идентифицированные при многопараметрическом анализе данных, оценивали относительно количественным методом с использованием интеграции сигнала и анализировали с применением критериев Краскела — Уоллиса. Учитывая исследовательский характер работы, значения p не корректировали на множественные сравнения.
Результаты
Композиция микробиоты кала на основе анализа рДНК 16S
Усредненный общий профиль для трех групп на уровне родов показал, что хотя композиция общей микробиоты контрольной и исследуемой групп продемонстрировала сходную картину, характерную для вскармливания смесью, исследуемая группа показала большую тенденцию к сходству с группой BF, чем контрольная группа. См. фиг. 3, где представлен общий профиль для 3 групп.
Статистический анализ выявил несколько таксонов, по-разному представленных в контрольной и исследуемой группах. Действительно, при проведении статистического анализа различий композиции микробиоты на уровне родов (ранговый критерий Уилкоксона без коррекции на множественные сравнения) контрольная и исследуемая группы отличались по шести таксонам (см. таблицу 4). Три таксона имели медианные нулевые значения во всех группах, и количества были представлены только по нескольким выпадающим значениям. Остальные показаны на фиг. 4. Значимость этих трех таксонов (Bifidobacterium, Escherichia и Peptostreptococacceae_uncl) в качестве основных отличительных признаков между контрольной и исследуемой группами была подтверждена анализом методом «случайный лес» (средняя погрешность уменьшения от 0,013 до 0,006). В частности, присутствует увеличение популяции Bifidobacteria и угнетение популяций Escherichia и/или Peptostreptococcaceae по сравнению с общей микробиотой контрольной группы.
Таблица 4. Для оценки статистически значимых различий между контрольной и исследуемой группами использовали ранговый критерий Уилкоксона на уровне родов, обозначенный p-значением. Группу BF не использовали в статистических тестах, но значения представлены как референтные. Значения для исследуемой группы, контрольной группы и группы BF представляют собой медианы относительной численности для указанного рода. Значения q FDR представляют собой значения p с коррекцией на множественные сравнения с заданной долей ложноположительных результатов.
Альфа-разнообразие для каждого образца вычисляли, используя показатель, учитывающий филогенетические расстояния между OTU и их распределение по трем сравниваемым группам, см. фиг. 5. Хотя разнообразие в группе BF существенно ниже разнообразия в группах обеих смесей, разнообразие в исследуемой группе достоверно снижено (среднее снижено на 0,19 единицы) по сравнению с контрольной группой и, следовательно, является более близким к группе BF.
Различие композиции общей микробиоты по данным рДНК 16S для трех групп оценивали при помощи ординации (см. фиг. 6). Статистика, основанная на случайных перестановках в анализе избыточности (RDA), показала, что три группы можно достоверно различать на уровне родов (p < 0,001). Центроиды группы BF и контрольной группы четко различались, тогда как испытуемая группа находилась в промежуточном положении между группой BF и контрольной группой.
Нагрузка патогенами образцов кала
Часть набора образцов кала была доступна для анализа нагрузки определенными патогенами с использованием панели желудочно-кишечных патогенов Luminex xTAG Gastrointestinal Pathogen Panel. В таблице 5 представлено количество младенцев, у которых в кале, собранном в возрасте 3 месяцев, определялся по меньшей мере один патоген. Количество младенцев с определяемым вирусным патогеном было очень сходным в испытуемой и контрольной группах и составило 28% и 31,5% соответственно. Чаще всего определялся норовирус. С другой стороны, определяемые бактериальные патогены находили в кале у 14% младенцев, вскармливаемых исследуемой смесью, тогда как в контрольной группе в 26% образцов кала определялся по меньшей мере один бактериальный патоген. Однако данное различие не достигало статистической значимости (коэффициент несогласия 0,46, p = 0,15). У этих европейских младенцев чаще всего определяемым патогеном с большим отрывом стал Clostridium difficile, по токсину A/B. Эукариотические патогены (простейших) были выявлены очень редко, у 2% младенцев, получавших испытуемую смесь, и у 5,6% младенцев, получавших контрольную смесь, причем в кале встречались Cryptosporidium.
%
%
Таблица 5. Количество младенцев, у которых в возрасте 3 месяцев в кале присутствовал по меньшей мере один патоген. Вычисляли коэффициент несогласия и p-значение двустороннего критерия точной вероятности Фишера.
Нагрузку патогенами образцов кала младенцев также оценивали с использованием метагеномного набора данных. В случае Clostridium difficile 36% младенцев в исследуемой группе и 46% в контрольной группе были носителями в соответствии с метагеномными данными. Сходная картина наблюдалась по токсину А/В C. difficile при анализе методом Luminex ПЦР, где определяемые уровни наблюдались у 14% младенцев в исследуемой группе и 22% младенцев в контрольной группе.
Выбранные первые функциональные аспекты микробиоты кала
Помимо изучения патогенов авторы изобретения также сделали запросы к метагеномным данным на присутствие генов, кодирующих известные болезнетворные факторы или гены резистентности к антибиотикам. На фиг. 8 приведены обобщенные результаты по известным болезнетворным генам с коррекцией на множественные сравнения или без нее. Всего авторы изобретения определили 7 генов, кодирующих известные болезнетворные факторы, уровень которых достоверно отличался в контрольной и исследуемой группах. Из этих 7 генов 5 генов очевидно различались между контрольной и испытуемой группами, а также между контрольной группой и группой BF, но не между испытуемой группой и группой BF, и это показывает, что испытуемая группа была ближе к референтной группе BF по этим генам. Еще 2 разных гена оказались различающимися между всеми 3 группами.
Что касается генов, кодирующих резистентность к антибиотикам, то авторы изобретения определили всего 8 генов, кодирующих известные гены резистентности к антибиотикам, уровни которых оказались достоверно различающимися между контрольной и исследуемой группами, см. фиг. 6. Из этих 8 генов 4 гена очевидно различались между контрольной и испытуемой группами, а также между контрольной группой и группой BF, но не между испытуемой группой и группой BF, и это показывает, что испытуемая группа была ближе к референтной группе BF по этим генам. 4 других гена различались между контрольной и испытуемой группами, но не имели различий между любой из групп смесей и референтной группой BF.
Характерные метаболические признаки в кале
Многофакторный анализ данных выявил значимые метаболиты, различающие испытуемую группу и контрольную группу, а также референтную группу, находящуюся на грудном вскармливании (см. фиг. 9). Содержание в кале некоторых аминокислот и органических кислот было разным в исследуемой и контрольной группах, причем отличия, наблюдаемые в исследуемой группе, склонялись в сторону значений, наблюдаемых в кале младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Более конкретно, уровни фенилаланина и изолейцина различались между младенцами, вскармливаемыми испытуемой и контрольной смесями, и отличались от наблюдаемых в кале младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Уровни тирозина не различались между испытуемой и контрольной группами, но отличались от референтной группы, находящейся на грудном вскармливании. С другой стороны, уровни лактата были выше у младенцев, получавших испытуемую смесь, чем у младенцев, получавших контрольную смесь, тогда как референтные образцы от младенцев на грудном вскармливании не достигали статистически значимых различий от образцов младенцев, вскармливаемых смесями.
Заключение
Все эти разные анализы показывают, что композиция общей микробиоты испытуемой группы (т.е. младенцев, вскармливаемых детской смесью в соответствии с изобретением) имеет тенденцию к большему сходству с группой BF (т.е. младенцами, вскармливаемыми исключительно грудным молоком), чем контрольная группа (т.е. младенцы, вскармливаемые традиционной питательной композицией).
Действительно, это рандомизированное плацебо-контролируемое двухцентровое клиническое исследование показало, что обогащение стандартной начальной детской смеси двумя специфическими олигосахаридами человеческого молока 2’FL и LNnT изменяет кишечную микробиоту в возрасте 3 месяцев, что показывает анализ образцов кала. Следует отметить, что композиция общей микробиоты и функциональные показатели для младенцев, вскармливаемых испытуемой смесью, не только отличались от контрольной группы, но и приближались к референтной группе, находящейся на грудном вскармливании. В частности, это промежуточное положение микробиоты кала испытуемой группы между контрольной группой и референтной группой, находящейся на грудном вскармливании, наблюдается на графике альфа-разнообразия, при анализе избыточности на уровне родов, а также при сравнении относительной численности конкретных таксонов на уровне родов. Основной вклад в наблюдаемый сдвиг испытуемой группы в сторону референтной группы BF вносят бактерии из таксонов Bifidobacterium, Escherichia и Peptostreptococcaceae. Такой сдвиг композиции микробиоты дополнительно подтверждается наблюдаемым изменением содержания в кале метаболитов кишечных бактерий, образующихся при расщеплении молока, что видно по данным 1H-ЯМР-метабономики. Это показывает, что ОГМ 2’FL и LNnT в исследуемой смеси влияют не только на композицию, но также и на функции микроорганизмов кишечника.
Чтобы дополнительно подчеркнуть полезный для здоровья младенца эффект, авторы изобретения также изучили присутствие конкретных истинных патогенов и болезнетворных факторов в целом. Бактериальный патоген C. difficile демонстрирует очевидно более низкие уровни, как по данным специфичной к токсину A/B ПЦР-амплификации, так и по данным метагеномного анализа, в исследуемой группе по сравнению с контрольной группой и приближается к более низким уровням, наблюдаемым в референтной группе BF по метагеномным данным, хотя и не достигает статистической значимости. Следует отметить, что несколько известных болезнетворных генов и генов резистентности к антибиотикам, определяемых метагеномным анализом, в исследуемой группе имели иной уровень по сравнению с контрольной группой и были сходными с количеством, наблюдаемым в референтной группе BF. В совокупности, и при допущении, что референтная группа BF является стандартной, эти наблюдения указывают, что экология микроорганизмов в кишечнике организма-хозяина в исследуемой группе может быть менее благоприятной для предполагаемых вредных бактерий.
Более высокие уровни в кале свободных аминокислот фенилаланина, тирозина и изолейцина в группах смесей по сравнению с референтной группой BF могут быть либо связаны с повышенной протеолитической активностью, либо с избытком аминокислот, входящих в смесь, но не поглощенных в верхних отделах кишечника. Это предполагает повышенную переработку пищевых белков бактериями.
Настоящие данные по испытуемой смеси показывают, что добавление ОГМ 2’FL и LNnT к смеси, как правило, снижает содержание свободных аминокислот в кале и стимулирует продукцию лактата. Эти изменения описывают потенциал 2’FL и LNnT для индукции изменений микробного метаболизма в кишечнике в сторону уровня метаболитов, наблюдаемого в кале младенцев группы BF, и, следовательно, в сторону индукции метаболической эквивалентности с грудным молоком.
В совокупности, микробиота кала и характерные метаболические признаки показывают, что добавление двух индивидуальных и очень специфичных по структуре ОГМ к начальной детской смеси сдвигает кишечную микробиоту, оцениваемую в кале, как по композиции, так и по функции, в сторону микробиоты, наблюдаемой у младенцев группы BF. В целом испытуемая группа располагается между младенцами контрольной группы и младенцами группы BF. Однако по некоторым специфическим показателям исследуемая группа оказывается даже неотличимой от референтной группы BF.
Питательная композиция, содержащая по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид, такой как 2FL и LNnT, оказывается очень эффективной у младенцев или детей младшего возраста в плане стимуляции и/или индукции у указанных младенцев или детей младшего возраста общей микробиоты кишечника, которая похожа на общую микробиоту кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых исключительно человеческим грудным молоком, по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов.
Следовательно, ее также считают особенно эффективной для применения в обеспечении нормального действия кишечника и/или для применения в профилактике и/или лечении дисбиоза микробиоты кишечника у младенцев или детей младшего возраста.
Пример 4
Описание клинического исследования
Цели. Определить влияние перорального введения ОГМ на острую диарею и на развитие длительной и стойкой диареи у пациентов детского возраста, госпитализированных с острой диареей.
Способы. Одноцентровое, двойное слепое, рандомизированное клиническое испытание с контролем проводили на мальчиках и девочках, не вскармливаемых грудью, которых госпитализировали в icddr, b, b (г. Дакка, Бангладеш) с острой диареей. Детей случайно распределяли по группам (i) ОГМ и ORS-цинк (испытуемый продукт), и (ii) питьевая вода и ORS-цинк (стандартный уход при лечении). Сопоставимая по возрасту группа (iii) включала детей, находящихся на грудном вскармливании, госпитализированных с острой диареей, которых продолжали кормить грудью в течение госпитализации, и служила в качестве открытой референтной группы.
Детей, госпитализированных с острой диареей и подходящих по критериям включения, случайно распределяли по двум группам. Обе группы состояли из детей, не находящихся на грудном вскармливании, которые получали стандартный уход, состоящий в пероральной регидратации раствором на основе глюкозы с добавлением цинка. Группа (i) дополнительно получала испытуемый продукт, который представляет собой ОГМ в подкисленной питьевой воде, в дозе 1,5 г в сутки в течение 14 дней. ОГМ состояли из 2FL и LNnT, взятые в весовом соотношении 2 : 1. Группа (ii) получала в качестве плацебо только подкисленную питьевую воду, которую невозможно отличить по цвету и вкусу от испытуемого продукта. Сравнение между группами (i) и (ii) позволит оценить терапевтическую и профилактическую активность испытуемого продукта, состоящего из двух синтетических олигосахаридов грудного молока. Группа (iii) состояла из детей, находящихся на полном или частичном грудном вскармливании, госпитализированных с острой диареей, которые получали только стандартный уход, содержавший раствор для пероральной регидратации на основе глюкозы и с добавлением цинка. Сравнение между группами (i) и (iii) позволит оценить терапевтическую и профилактическую активность грудного вскармливания, а сравнение с группой (ii) покажет, воспроизводят ли два синтетических олигосахарида грудного молока в испытуемом продукте терапевтическую и профилактическую активность грудного молока, содержащего сложную смесь олигосахаридов и других защитных агентов.
Включенных в исследование детей наблюдали в отношении диареи в палате исследования в течение не более 5 дней. Детей, у которых диарея продолжалась в день 5, переводили в палату длительного наблюдения (LTW), в которой они оставались до разрешения диареи. Детей, у которых диарея разрешалась за время пребывания в палате исследования, выписывали из больницы в день прекращения диареи. Каждый включенный в исследование ребенок оставался под наблюдением в палате исследования в течение как минимум 48 час. Мать или опекун ребенка, выписанного из больницы, получала инструкцию, картинку Бристольской шкалы стула и сотовый телефон для ежедневного сообщения о консистенции стула, рецидиве диареи или нежелательных явлениях. На 7 и 14 дни после госпитализации мать/опекуна с ребенком приглашали на повторный визит в клинику для оценки. В течение 24 ч перед последним визитом должен быть собран образец кала.
Показатели/параметры исхода. Количественные параметры диареи (продолжительность диареи, количество стула, частота стула, наличие рвоты) и состояние питания для оценки эффекта лечения. По анализу микробиоты в кале оценивали стимулирующий эффект ОГМ на размножение Bifidobacteria и восстановление баланса после дисбиоза.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению питательной композиции, которая содержит фукозилированный олигосахарид и N-ацетилированный олигосахарид, в профилактике или лечении не-ротавирусной диареи, вызванной E. coli (ETEC, EPEC и/или EAEC), Salmonella, Shigella, Aeromonas и/или Campylobacter, у младенцев или детей младшего возраста путем профилактики или лечения дисбиоза общей кишечной микробиоты, который возникает до, во время и/или после не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста, где ребенок младшего возраста является ребенком от одного года до трех лет, причем олигосахариды в композиции содержатся в определенном количестве. Вышеописанное позволяет эффективно профилактировать и лечить не-ротавирусной диареи у детей. 15 з.п. ф-лы., 9 ил., 5 табл., 4 пр.
1. Применение искусственной питательной композиции, содержащей по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид, в профилактике или лечении не-ротавирусной диареи, вызванной E. coli (ETEC, EPEC и/или EAEC), Salmonella, Shigella, Aeromonas и/или Campylobacter, у младенцев или детей младшего возраста путем профилактики или лечения дисбиоза общей кишечной микробиоты, который возникает до, во время и/или после не-ротавирусной диареи у указанных младенцев или детей младшего возраста, где ребенок младшего возраста является ребенком от одного года до трех лет,
и где фукозилированный(-ые) олигосахарид(-ы) находится(-ятся) в общем количестве 0,5–3 г/л или в общем количестве 0,38–2,32 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества;
а N-ацетилированный(-ые) олигосахарид(-ы) находится(-ятся) в общем количестве 0,05–1 г/л композиции или в общем количестве 0,03–0,78 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
2. Применение по п.1, где фукозилированный(-ые) олигосахарид(-ы) находится(-ятся) в общем количестве 0,8–1,5 г/л композиции или в общем количестве 0,62–1,16 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
3. Применение по п.1 или 2, где N-ацетилированный(-ые) олигосахарид(-ы) находится(-ятся) в общем количестве 0,5–0,8 г/л композиции или в общем количестве 0,39–0,62 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где фукозилированный олигосахарид выбран из перечня, состоящего из 2'-фукозиллактозы, 3'-фукозиллактозы, дифукозиллактозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-фукогексаозы, лакто-N-дифукогексаозы I, фукозиллакто-N-гексаозы, фукозиллакто-N-неогексаозы I, фукозиллакто-N-неогексаозы II, дифукозиллакто-N-гексаозы I, дифукозиллакто-N-неогексаозы I, дифукозиллакто-N-неогексаозы II, фукозил-пара-лакто-N-гексаозы и любой их комбинации, причем предпочтительно фукозилированный олигосахарид представляет собой 2-фукозилактозу (2'FL).
5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где фукозилированный олигосахарид представляет собой 2'-фукозил-эпитоп.
6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где N-ацетилированный олигосахарид представляет собой лакто-N-тетраозу (LNT), лакто-N-неотетраозу (LNnT) или их комбинацию.
7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где N-ацетилированный олигосахарид представляет собой лакто-N-неотетраозу (LNnT), пара-лакто-N-неогексаозу (пара-LNnH) или их комбинацию, причем предпочтительно N-ацетилированный олигосахарид представляет собой лакто-N-неотетраозу (LNnT).
8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где композиция содержит 2'-фукозиллактозу и лакто-N-неотетраозу (LNnT) или смесь олигосахаридов, состоящую из 2'-фукозиллактозы (2’FL) и лакто-N-неотетраозы (LNnT).
9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере другой(-ие) олигосахарид(-ы), и/или пищевое(-ые) волокно(-а), и/или их предшественник(-и), выбранный(-ые) из перечня, содержащего галактоолигосахарид (GOS), ксилоолигосахарид (FOS), ксилоолигосахарид (XOS), инулин, полидекстрозу, сиалилированные олигосахариды, сиаловую кислоту, фукозу и любую их комбинацию.
10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один пробиотик в количестве от 103 до 1012 КОЕ/г указанной композиции по массе сухого вещества.
11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где композиция представляет собой детскую смесь, начальную детскую смесь, детскую смесь для прикармливаемых детей или детскую смесь последующего уровня, смесь для недоношенных детей, детское питание, детскую композицию на зерновой основе, обогатитель или питательную добавку.
12. Применение по любому из предшествующих пунктов, где композиция предназначена для младенцев в возрасте до 6 месяцев.
13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где общая микробиота кишечника относится к составу и/или функции всей микробиоты кишечника, такой как относительное таксономическое богатство, разнообразие, активность и/или функциональность указанной микробиоты.
14. Применение по любому из предшествующих пунктов, где обеспечивается стимулирование и/или индуцирование у младенцев или детей младшего возраста общей микробиоты кишечника, которая приближена к таковой у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи и/или которая приближена к таковой у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых исключительно человеческим грудным молоком, по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов.
15. Применение по п.14, где указанное стимулирование и/или индуцирование предусматривает увеличение популяции Bifidobacterium и/или угнетение популяций Escherichia, и/или Peptostreptococcaceae по сравнению с общей микробиотой кишечника у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи и/или по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей названных олигосахаридов, и/или указанное стимулирование и/или индуцирование предусматривает уменьшение количества патогенов, особенно количества бактериального патогена Clostridium difficile, и/или снижение болезнетворного(-ых) фактора(-ов) по сравнению с общей микробиотой кишечника у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи и/или по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов, и/или указанное стимулирование и/или индуцирование предусматривает снижение продукции свободных аминокислот, и/или стимуляцию продукции лактата по сравнению с общей микробиотой кишечника у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи, и/или по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей указанных олигосахаридов, и/или указанная стимулированная и/или индуцированная общая микробиота кишечника у младенцев или детей младшего возраста имеет альфа-разнообразие, значительно сниженное по сравнению с общей микробиотой кишечника у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи, и/или по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей этих олигосахаридов, и/или указанная стимулированная и/или индуцированная общая микробиота кишечника у младенцев или детей младшего возраста имеет альфа-разнообразие, сниженное на по меньшей мере 0,10 единицы, например по меньшей мере 0,12 единицы или по меньшей мере 0,15 единицы, например 0,19 единицы, по сравнению с общей микробиотой кишечника у этих младенцев или детей младшего возраста в отсутствие не-ротавирусной диареи, и/или по сравнению с общей микробиотой кишечника у младенцев или детей младшего возраста, вскармливаемых преимущественно или исключительно традиционной питательной композицией, не содержащей этих олигосахаридов, и/или указанное стимулирование и/или индуцирование общей микробиоты кишечника можно измерять в кале указанных младенцев или детей младшего возраста, например в возрасте 1, 4, 6 или 8 недель или старше и, например, после 1, 4, 6 или 8 недель вскармливания указанной питательной композицией.
16. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанную питательную композицию дают младенцам в первые 1, 2, 4, 8 или 12 недель жизни или в течение первых 2, 4, 6, 8, 12, 24 или 36 месяцев жизни.
| Токарный резец | 1924 |
|
SU2016A1 |
| Изложница с суживающимся книзу сечением и с вертикально перемещающимся днищем | 1924 |
|
SU2012A1 |
| NEWBURG D S ET AL, Innate protection conferred by fucosylated oligosaccharides of human milk against diarrhea in breastfed infants// GLYCOBIOLOGY, OXFORD UNIVERSITY PRESS, 2004, vol | |||
| Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью | 1916 |
|
SU14A1 |
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| Прибор для измерения угла наклона | 1921 |
|
SU253A1 |
| Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор | 1923 |
|
SU2005A1 |
