Способ изучения биологического действия потенциальных биомедицинских клеточных продуктов на основе клеток человека при субретинальной ксеногенной трансплантации в эксперименте Российский патент 2024 года по МПК A61K38/13 A61K31/45 A61K31/56 A61P27/02 A61F9/07 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для изучения биологического действия потенциальных биомедицинских клеточных продуктов на основе клеток человека при субретинальной ксеногенной трансплантации в эксперименте (в том числе доклинических исследованиях).

Дегенеративные заболевания сетчатки, такие как болезнь Штаргардта, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), пигментный ретинит, болезнь Беста и пр. характеризуются прогрессирующим поражением ретинального пигментного эпителия (РПЭ), не имеют лечения и приводят к необратимой потере зрения, слепоте и инвалидности [Georgiou М., Fujinami К., Michaelides М. Inherited Retinal Diseases: Therapeutics, Clinical Trials and End Points-a Review // ClinExpOphthalmol (2021) 49:270-88. doi: 10.111 l/ceo.13917].

Благодаря стремительному развитию биомедицинских наук, в частности, клеточных технологий и успехам витреоретинальной хирургии стала возможной разработка новых подходов к лечению заболеваний, связанных с дегенерацией РПЭ.

Наиболее перспективным методом для замены поврежденного пигментного эпителия представляется заместительная трансплантация плюрипотентных стволовых клеток (эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), индуцированные плюрипотентные СК (ИПСК)) в РПЭ.

Известно, что глаз, как и мозг, волосяные фолликулы и репродуктивные органы, обладает иммунной привилегией, что обеспечивает, по мнению Zhou R., Caspi R.R., относительно безопасные условия для клеточной терапии в субретинальное пространство [Zhou R., Caspi R.R. Ocular immune privilege // Biol Rep.- 2010 Jan 18; 2:3. DOI: 10.3410/В2-3].

Как отмечает ряд авторов, помимо иммунопривилегированности СРП, повышению совместимости донорского материала в среде реципиента также способствуют противовоспалительные свойства ИПСК - РПЭ [Jiang L.Q., Jorquera М., Streilein J.W. Subretinal space and vitreous cavity as immunologically privileged sites for retinal allografts // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 1993 Nov; 34(12):3347-54; Sugita S., Futatsugi Y., Ishida M., Edo A., Takahashi M. Retinal Pigment Epithelial Cells Derived from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells Suppress or Activate T Cells via Costimulatory Signals // Int J Mol Sci. - 2020 Sep 5; 21(18):6507. doi: 10.3390/ijms21186507].

Однако, несмотря на уникальные условия, субретинальная трансплантация СК вызывает тяжелое воспаление в заднем отрезке глаза и приводит к отторжению донорского материала у экспериментальных животных в отсутствие иммуносупрессии [Rezai К.А., Farrokh-Siar L., Godowski К., Patel S.C., Ernest J.Т. A model for xenogenic immune response // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. - 2000 Apr; 238(4):352-8. DOI: 10.1007/s004170050364].

При исследовании биологических эффектов клеточных продуктов серьезные требования предъявляются к модели животного, которая должна обладать достаточной иммунологической толерантностью к ксеногенным человеческим клеткам для того, чтобы в полной мере оценить безопасность и эффективность лечебного воздействия.

Для предотвращения трансплантационного иммунного ответа в доклинических исследованиях используются линии иммуномодифицированных/гуманизированных животных, как правило, мелких грызунов [Тихомирова А.В., Горячев Д.В., Меркулов В.А., Лысикова И.В., Губенко А.И., Зебрев А.И., Соловьева А.П., Ромодановский Д.П., Мельникова Е.В. Доклинические и клинические аспекты разработки биомедицинских клеточных продуктов // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения - 2018. Т. 8, №1, С. 23-35].

Однако особенности строения и размеры глаза крыс и мышей не позволяют осуществить манипуляции, выполняемые при витреоретинальных вмешательствах у человека [Koster С, Wever К.Е., Wagstaff E.L., Vanden Hurk K.T., Hooijmans C.R., Bergen A.A. A Systematic Review on Transplantation Studies of the Retinal Pigment Epithelium in Animal Models // Int J Mol Sci. -2020 Apr; 21(8): 2719. DOI: 10.3390/ijms21082719], тогда как модели крупных иммунодефицитных животных с большим глазным яблоком не разработаны.

Анализ научной литературы показал, что наиболее часто в работах, посвященных исследованиям субретинальной трансплантации в эксперименте, с целью профилактики тканевой несовместимости применяют кортикостероидные препараты и циклоспорин А (ЦсА), которые в настоящее время являются средствами выбора в офтальмологической практике при пересадке роговицы.

Так, Stanzel B.V. и соавт. проводили трансплантацию клеток человеческого РПЭ на кроликах с использованием двух режимов введения стероидов (интравитреально (1 группа) и внутримышечно (2 группа)). Авторы показали, что выживаемость донорского материала была лучше у животных с интравитреальным введением препарата и составила 1 месяц [Stanzel B.V., Liu Z., Somboonthanakij S., Wongsawad W., Brinken R., Eter N., et al.Human RPE Stem Cells Grown Into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix are Maintained After Grafting Into Rabbit Subretinal Space // Stem Cell Rep (2014) 2:64-77]

Однако длительное лечение кортикостероидными средствами или применение их в высоких дозировках может привести к появлению целого ряда побочных эффектов, таких как: развитие и прогрессирование катаракты, повышение внутриглазного давления [Kiddee W., TropeG.E., ShengL., Beltran-AgulloL., SmithM., Strungaru M. H., BaathJ., BuysY. M. Intraocular pressure monitoring post intravitreal steroids: a systematic review //Review Surv Ophthalmol. - 2013 Jul-Aug;58(4):291-310. DOI: 10.1016/j.survophthal.2012.08.003].

В исследовании группы Ilmarinen Т. и соавт.представлены данные по трансплантации РПЭ, дифференцированного из ЭСК человека, кроликам на фоне системной иммуносупрессивной терапии ЦсА: препарат в дозе 25 мг/кг вводился животным с питьевой водой за два дня до офтальмохирургического вмешательства и на протяжении всего периода наблюдения (три месяца) [Ilmarinen Т., Hiidenmaa Н., КббЫ P., Nymark S., Sorkio A., Wang J.H., Stanzel B.V., Thieltges F., Alajuuma P., Oksala O., Kataja M., Uusitalo H., Skottman H. Ultrathin Polyimide Membrane as Cell Carrier for Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium // PLoS One. 2015 Nov 25;10(11): e0143669. DOI: 10.1371/journal.pone.0143669. PMID: 26606532; PMCID: РМС4659637]. Несмотря на то, что в данной работе субретинальная трансплантация выполнялась в здоровый глаз с интактным РПЭ, который, как известно, продуцирует в норме широкий спектр иммуносупрессивных факторов, происходило отторжение донорского материала, которое авторы объяснили недостаточной дозировкой вводимого ЦсА.

Следует отметить, что при разработке подходов к заместительной клеточной трансплантации важно учитывать, что имеющийся патологический процесс в СРП, как, например, хроническое воспаление при ВМД, способствует ослаблению иммуносупрессивной активности РПЭ, приводит к снижению системной толерантности (на уровне организма) и может вызвать усиление посттрансплантационного иммунного ответа.

Ранее в эксперименте нами было показано, что дегенеративные изменения РПЭ сопровождаются выраженным ростом экспрессии генов, кодирующих провоспалительные белки, связанные с активацией врожденного иммунитета в сетчатке [Нероев В.В., Балацкая Н.В., Светлова Е.В., Нероева Н.В., Рябина М.В., Кармокова А.Г., Лосанова О.А., Черноморец И.Ю., Илюхин П.А. Особенности локальной экспрессии мРНК, IL-1β, IL-18, CCL2/MCP-1 при моделировании атрофии пигментного эпителия и дегенерации сетчатки в эксперименте на кроликах // Молекулярная медицина. - 2021, т.19, №2, с. 54-62.; Нероева Н.В., Свитич О.А., Нероев В.В., Кинкулькина А.Р., Балацкая Н.В., Сорожкина Е.С.Изучение локальной экспрессии генов инфламмасомного комплекса при моделировании дегенерации сетчатки in vivo // Медицинская иммунология. -2023;25(3):631-636. https://doi.org/10.15789/1563-0625-IOL-2780.]

Также в нашем исследовании факторов иммунологического гомеостаза в СК животных при поражении РПЭ было обнаружено значительное, более чем в 4 раза, снижение TGFβ1 (ρ<0,05), что указывало на ослабление системной иммунологической толерантности (на уровне всего организма).

Таким образом, на основании вышеизложенных выводов, учитывая высокий риск отторжения ксеногенного трансплантата, альтернативным решением может стать применение комбинированной фармакологической иммуносупрессии, направленной, с одной стороны, на подавление локального (интраокулярного) воспаления, а с другой - системного трансплантационного иммунного ответа.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ того же назначения, представленный в работе Fujii S. и соавт., по трансплантации человеческих ИПСК-РПЭ яванским макакам на фоне различных вариантов иммуносупрессивной терапии, в том числе и в одном случае (у одного животного) комбинированной (КИТ), включающей однократную интравитреальную инъекцию Триамцинолона и системное пероральное введение ЦсА [Fujii S., Sugita S., Futatsugi Y., Ishida M., Edo A., Makabe K., Kamao H., Iwasaki Y., Sakaguchi H., Hirami Y., Kurimoto Y., Takahashi M. A Strategy for Personalized Treatment of iPS-Retinal Immune Rejections Assessed in Cynomolgus Monkey Models // Int J Mol Sci.- 2020 Apr 27;21(9):3077. DOI: 10.3390/ijms21093077].

Существенным недостатком данного способа является его применение при субретинальной трансплантации животным без офтальмопатологии (в условиях интактной иммунной привилегии глаза), в то время как хронический вялотекущий воспалительный процесс в сетчатке, как уже отмечалось выше, приводит к снижению иммуносупрессивной емкости среды СРП, способствуя ослаблению общей толерантности организма.

Несмотря на благоприятные условия, создаваемые применением комбинации иммуносупрессивных препаратов, вышеуказанный способ не может быть использован для изучения биологических эффектов клеток в доклинических исследованиях, для проведения которых требуются животные с моделью патологии, подобной таковой у человека.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа изучения биологических эффектов потенциальных биомедицинских клеточных продуктов на основе клеток человека, трансплантируемых субретинально крупным животным (кроликам) в эксперименте.

Техническим результатом предлагаемого способа является возможность воспроизведения состояния иммунологической толерантности у экспериментальных животных с моделью атрофии РПЭ для изучения биологических эффектов потенциальных биомедицинских клеточных продуктов.

Технический результат достигается за счет использования комбинированной иммуносупрессивной терапии, включающей однократное интравитреальное введение кеналога (40 мг/мл) и пероральное введение раствора Циклоспорина А в составе пищевой смеси 1 раз в сутки.

Способ осуществляют следующим образом

Кролику с моделью атрофии ретинального пигментного эпителия сразу после трансплантации производят однократную интравитреальную инъекцию 0,2 мл препарата кеналог в концентрации 40 мг/мл. С первых суток послеоперационного периода осуществляют пероральное введение раствора Циклоспорина А в составе стандартной пищевой смеси в концентрации 100 мг/мл и в дозе 10 мг на 1 кг массы тела 1 раз в сутки в течение всего периода изучения.

Животных обезболивали внутримышечным введением Золетила и Ксилазина. Мидриаз достигали закапыванием Аппамида.

Перед хирургическим вмешательством вводили 0,3 мл 0,4% раствора Дексаметазона, 0,5 мл Этамзилата для снижения риска развития экссудативно-геморрагических интра- и послеоперационных осложнений, как это принято.

Экспериментальные исследования были проведены на 24 кроликах (порода альбино, масса 2,0-2,5 кг), распределенных на 2 равные по численности подгруппы в зависимости от условий трансплантации: животным 1 группы ИПСК-РПЭ вводили в глаз с атрофией РПЭ, 2 группы - трансплантацию выполняли в здоровый глаз.

На 14, 28, 60 сутки после трансплантации проводилось офтальмологическое обследование, животные были выведены из эксперимента методом воздушной эмболии после введения в наркоз, выполнялась энуклеация (Приказ МинВуза СССР №724 от 13.11.184). Материалы энуклеированных глаз передавали для патогистологических исследований.

Пример 1. Кролик №2. Была создана модель атрофии РПЭ по ранее разработанному нами способу (патент RU 2709247, 17.12.19). Кролику в субретинальное пространство вводили раствор бевацизумаба ниже диска зрительного нерва на расстоянии 0,5 pd, с формированием субретинального пузыря. Через 1 месяц в область предварительно сформированной атрофии произведена трансплантация ИПСК-РПЭ в виде суспензии в количестве 50000 клеток по способу, описанному в патенте RU 2729937, 13.08.2020 (Способ субретинальной трансплантации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при атрофии ретинального пигментного эпителия в эксперименте). В соответствии с заявленным способом однократно интравитреально инъекцировали 0,2 мл препарата кеналог в концентрации 40 мг/мл, а с первых суток послеоперационного периода осуществляли пероральное введение раствора Циклоспорина А в составе стандартной пищевой смеси в концентрации 100 мг/мл и в дозе 10 мг на 1 кг массы тела 1 раз в сутки в течение 60 суток.

В определяемые сроки наблюдения 14, 28 и 60 суток была проведена, биомикроскопия, офтальмоскопия, оптическая когерентная томография (ОКТ).

По данным биомикроскопии на протяжении всего периода наблюдения после трансплантации суспензии ИПСК-РПЭ передний отрезок животного был спокоен: конъюнктива имела бледно-розовый цвет, роговица, хрусталик и стекловидное тело сохраняли прозрачность. При офтальмоскопии в эти же сроки не визуализировалось патологических изменений на глазном дне (не наблюдалось воспалительных явлений в переднем и заднем отрезке глаза, не отмечено случаев отслойки сетчатки, образования шварт, кровоизлияний, экссудатов, побледнений сетчатки, патологических очагов).

До проведения оперативного вмешательства была проведена оптическая когерентная томография (ОКТ) с целью визуализации зоны предварительно созданной атрофии. На ОКТ-снимке определялась зона повышенного проникновения лазерного луча в подлежащие ткани, что соответствовало атрофии РПЭ. В зоне атрофии определялось также истончение хориоидеи. При анализе аутофлюоресценции глазного дна определялась гипофлюоресценция, соответствующая области атрофии (Фиг. 1. ОКТ-снимок сформированной атрофии РПЭ).

По данным ОКТ, на 14 сутки после субретинальной трансплантации суспензии ИПСК-ПЭС в группе животных с атрофией РПЭ профиль сетчатки был сохранен, ее слои дифференцированы. ОКТ-признаков воспалительных и других патологических изменений не выявлено (Фиг. 2 ОКТ-снимок, выполненный на 14 сутки после трансплантации клеток животным в глаз с атрофией РПЭ).

В позднем периоде наблюдения (28 - 60 сутки) определялось сглаживание гиперрефлективной области, позволяющее говорить о распределении субретинально введенного клеточного материала, отмечено частичное уменьшение прохождения сканирующего луча под сетчатку, что может указывать на частичное восстановление клеток РПЭ. Осложнений и отрицательной динамики не было выявлено, слои сетчатки дифференцированы. (Фиг. 3 ОКТ-снимок сетчатки животного с атрофией РПЭ в отдаленные сроки после трансплантации ИПСК-РПЭ).

Кролика подвергли эвтаназии спустя 60 суток после трасплантации ИПСК-РПЭ в виде суспензии, и энуклеированные глаза отправляли на морфологическое исследование. На гистологическом срезе на поздних сроках трансплантируемые клетки демонстрировали высокую выживаемость в среде хозяина-реципиента, сохраняясь в структуре монослоя РПЭ (Фиг. 4 Плоскостной препарат сосудистой оболочки и РПЭ с имплантированными ИПСК-ПЭС в форме монослоя на поздних сроках после трансплантации (Комбинированная окраска: ядра - гематоксилин Гарриса, клеточные мембраны - импрегнация серебром; масляная иммерсия, х 1 ООО).

Пример 2. Кролик №3. Кролику проводилось введение ИПСК-РПЭ в виде суспензии в субретинальное пространство по упомянутому выше способу в здоровый глаз с интактным РПЭ.

До проведения трансплантации животному измеряли показатели толщины сетчатки, которые соответствовали значениям нормы, и коррелировали с данными в работах Davis F.A. [Davis F.A. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit // Trans Am Ophthalmol Soc. 1929; 27: 400.2-441.] (Фиг. 5. ОКТ-снимок здоровой сетчатки кролика).

В соответствии с заявленным способом однократно интравитреально инъекцировали 0,2 мл препарата кеналог в концентрации 40 мг/мл, а с первых суток послеоперационного периода осуществляли пероральное введение раствора Циклоспорина А в составе стандартной пищевой смеси в концентрации 100 мг/мл и в дозе 10 мг на 1 кг массы тела 1 раз в сутки в течение 60 суток.

На сроках 14, 28 и 60 суток после трансплантации проводилась биомикроскопия, офтальмоскопия, ОКТ.

По данным биомикроскопии и офтальмоскопии у животного не было выявлено воспалительных и других патологических признаков на переднем и заднем отрезке.

На 14 сутки трансплантации у кролика, по данным ОКТ, профиль сетчатки не был изменен, все ее слои дифференцировались, под нейросенсорной сетчаткой визуализировалась зона умеренной гиперрефлективности (белая стрелка), соответствующая локализации трансплантированных клеток (Фиг 6. ОКТ- снимок сетчатки кролика на 14 день после трансплантации с интактным РПЭ).

К 28 суткам наблюдения и далее к 60 суткам отмечалась более ровная гиперрефлективность под нейросенсорной сетчаткой, позволяющая говорить о распределении субретинально введенного клеточного материала (белая стрелка). В эти же сроки профиль и структура сетчатки оставались неизмененными (Фиг. 7. ОКТ-снимок сетчатки кролика на отдаленных сроках после трансплантации в здоровый глаз).

Таким образом, результаты офтальмологических и гистологических методов исследований доказывают способность комбинированной иммуносупрессивной терапии, включающей однократное интраоперационное интравитреальное введение кеналога+пероральное введение циклоспорина А, предотвратить реакцию отторжения ксеногенного клеточного материала при субретинальной трансплантации как в здоровый глаз, так и с предварительно моделированной атрофией ретинального пигментного эпителия. Относительно простой и экономичный способ воспроизведения состояния иммунологической толерантности у животных с крупным глазом (кроликов) позволяет широко его использовать при тестировании заместительной клеточной терапии в эксперименте в офтальмологии.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Кролику с моделью атрофии ретинального пигментного эпителия сразу после трансплантации производят однократную интравитреальную инъекцию 0,2 мл препарата Кеналог в концентрации 40 мг/мл. С первых суток послеоперационного периода осуществляют пероральное введение раствора Циклоспорина А в составе пищевой смеси в концентрации 100 мг/мл и в дозе 10 мг на 1 кг массы тела 1 раз в сутки в течение всего периода эксперимента. Изобретение обеспечивает возможность воспроизведения состояния иммунологической толерантности у экспериментальных животных с моделью атрофии РПЭ для изучения биологических эффектов потенциальных биомедицинских клеточных продуктов. 7 ил., 2 пр.

Способ предотвращения отторжения ксеногенного клеточного материала при субретинальной ксеногенной трансплантации в эксперименте, заключающийся в том, что кролику с моделью атрофии ретинального пигментного эпителия сразу после трансплантации производят однократную интравитреальную инъекцию 0,2 мл препарата Кеналог в концентрации 40 мг/мл, а с первых суток послеоперационного периода осуществляют пероральное введение раствора Циклоспорина А в составе пищевой смеси в концентрации 100 мг/мл и в дозе 10 мг на 1 кг массы тела 1 раз в сутки в течение всего периода эксперимента.