Способ приготовления плоскостных препаратов сосудистой оболочки глазного яблока у экспериментальных животных-альбиносов Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно патологической анатомии и офтальмологии, и может быть использовано для приготовления плоскостных препаратов сосудистой оболочки глазного яблока у экспериментальных животных-альбиносов.

Функциональные и структурные повреждения ретинального пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) ведут к развитию дегенеративных заболеваний сетчатки, полное излечение которых, на сегодняшний день, еще недостижимо. И хотя заболевания, ассоциированные с патологией РПЭ часто встречаются, и их клиническая картина хорошо документирована, патогенез и патоморфология многих из них еще довольно слабо изучены.

В настоящее время, среди факторов, связанных со слабой осведомленностью о патогистологических изменениях РПЭ, главным является сложность интерпретации гистологических препаратов, приготовленных по стандартной методике на начальном этапе исследования, а также невозможность сопоставления морфологических изменений при исследовании поперечных срезов РПЭ с результатами иммуногистохимических методов патогистологического исследования, а также с диагностическими изображениями, получаемыми с применением принятых в клинической практике методами лучевой диагностики.

Сложность морфологического исследования РПЭ ввиду особенностей его строения, заключается в малой информативности поперечных срезов, методика приготовления поперечных срезов, применяемая в рутинной патологоанатомической практике, мало применима для оценки патологических изменений РПЭ, поскольку на поперечных срезах плоских клеток, формирующих монослой, даже на серийных срезах практически невозможно полноценно охарактеризовать качественные патоморфологические изменения в отдельно взятой клетке РПЭ и оценить ее взаимоотношения с соседними клетками, а также провести количественную оценку РПЭ.

Известен способ приготовления плоскостных препаратов РПЭ, при котором проводят энуклеацию, фиксацию в забуференном 5% формальдегиде, через 24 часа промывание в дистиллированной воде, удаление переднего сегмента глаза, стекловидного тела и сетчатки. Пласты интактных клеток затем отделяли от мембраны Бруха ножом. Участки площадью от 0,5 до 1 кв. см монтировали на слайды, покрытые альбумином, и подвергали воздействию формалина в течение пяти минут, образцы затем высушивали, погружали в отбеливающий раствор на срок от 16 до 48 часов (Е. Friedman и Ts'o М.О. [Ts'o М. О., Friedman Е. The retinal pigment epithelium. I. Comparative histology. Arch Ophthalmol. 1967 Nov; 78(5):641-9. doi: 10.1001/archopht.1967.00980030643016.). Способ принят за ближайший аналог.Недостатками способа является значительная трудоемкость отделения монослоя РПЭ от сосудистой оболочки, а также небольшая площадь получаемого таким образом препарата, что не позволяет провести качественную и количественную оценку всей поверхности РПЭ.

Животные альбиносы широко применяются в экспериментальной практике, несмотря на то что альбинизм связан с глазными и зрительными аномалиями, животные альбиносы часто используются в доклинических исследованиях в офтальмологии, в частности при разработке экспериментальных моделей и подходов к клеточной терапии различных дегенеративных заболеваний сетчатки.

Задачей изобретения, является разработка высокоинформативного способа приготовления плоскостных препаратов сосудистой оболочки глазного яблока для визуализации РПЭ.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность оценить качественные и количественные изменения клеток РПЭ на всей площади сосудистой оболочки.

Технический результат достигается за счет комбинированной окраски РПЭ глазного яблока in situ с последующим тотальным выделением сосудистой оболочки и РПЭ и приготовлением плоскостных препаратов.

Известен метод серебрения границ между клетками, который заключается в том, что объекты промывают в дистиллированной воде и подвергают на ярком солнечном свету (дольше на рассеянном) действию слабого (1: 500) раствора азотнокислого серебра до появления серовато черноватой окраски. Затем следует промывка в дистиллированной воде или 2% уксусной кислоте и фиксация в течение 5-10 секунд в 2% растворе гипосульфита. (Вайль С.С. - 3-е изд. - Ленинград: Ленингр. отд-ние Медгиза, 1947 (Тип."Печ. двор"). - 264 с.). Метод серебрения используется довольно широко в нейробиологии для окрашивания нервных клеток (например, https://biomolecula.ru/articles/metodv-v-kartinkakh-neirobiologiia).

В нашем исследовании мы использовали новую комбинацию метода серебрения, с одной стороны, и с другой стороны, контрастирующую окраску ядер и цитоплазмы клеток РПЭ гематоксилином Гарриса, являющегося многокомпонентным органо-неорганическим ядерным красителем для гистологических и цитологических препаратов, имеющий в основе эфирно-экстрактивные вещества и смесь эквимолярных растворов кристаллогидратов. Применяется для регрессивного окрашивания. Визуализирует ядра клеток за счет излучения с длиной волны (диапазон значений) от 440 до 485 нм (например, https://www.ld.ru/IHC/item-350060.html.). Эффективность этой комбинации заключается том что при рутинном окрашивании применяется окраска гематоксилином, окрашивающем преимущественно ядро и его структуры и эозином, окрашивающим цитоплазму, но ни одна из них не позволяет непосредственно продемонстрировать клеточную мембрану клетки РПЭ. Комбинация окраски гематоксилином с методом серебрения клеточных мембран позволяет продемонстрировать гистологическую структуру РПЭ на плоскостных препаратах.

Еще одной отличительной особенностью способа является то, что комбинированное окрашивание РПЭ проводят in situ. Окраска, осуществляемая in situ, позволяет окрашивать РПЭ по всей поверхности сосудистой оболочки без артифициального фонового окрашивания глубжележащих структур сосудистой оболочки, используя естественную герметичность слоя РПЭ и склерохороидального пространства.

При рутинном методе фиксации погружением глазного яблока в раствор формалина скорость проникновения формалина через склеру и сосудистую оболочку недостаточно высока, что может приводить к аутолитическим изменениям РПЭ и сетчатки. Для достижения оптимальной и равномерной фиксации тканей глазного яблока раствор формалина вводят в витреальную полость, что обеспечивает более ранний контакт фиксирующей жидкости с внутренними оболочками глазного яблока и более быструю и равномерную фиксацию, минимизируя, аутолитические изменения.

Отсечение переднего сегмента глазного яблока разрезом во фронтальной плоскости, удается не нарушить естественную герметичность склерохориоидального пространства и, следовательно, минимизировать фоновое окрашивание сосудистой оболочки, препятствующее исследованию РПЭ в проходящем свете.

В результате совокупности приемов способа удается получить препараты, пригодные для световой микроскопии в проходящем свете с использованием масляной иммерсии без применения проводки и микротомии с возможностью количественной и качественной оценки

патоморфологических изменений как в отдельных клетках РПЭ, так и нарушений тканевых взаимоотношений клеток РПЭ между собой и сосудистой оболочкой, а также выявлять протяженность и топографию патологических изменений на протяжении.

Способ осуществляют следующим образом:

Глазное яблоко энуклеируют, фиксируют введенным интравитреально 10% забуференным нейтральным раствором формалина. Погружают глазное яблоко в такой же раствор на 24 часа. Отсекают передний сегмент глазного яблока, извлекают хрусталик, стекловидное тело, отделяют нейросетчатку с обнажением ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Проводят комбинированное окрашивание РПЭ in situ с применением импрегнации границ клеток РПЭ солями серебра с контрастирующей окраской гематоксилином Гарриса. Циркулярно подрезают глазной бокал, в пределах плоской части цилиарного тела, отсекают зрительный нерв вместе с диском зрительного нерва, сосудистую оболочку со слоем РПЭ отделяют от склеры на всем протяжении. Рассекают радиальными разрезами и помещают с помощью гидрофильной среды под покровное стекло.

Экспериментальные исследования с применением предложенного способа были проведены на 10 (20 глаз) кроликов породы альбино, массой 2,0-2,5 кг и 10 (20 глаз) крыс-альбиносов линии вистар, массой 200-250 г.

Полученные предложенным способом препараты были изучены с количественной и качественной оценкой. Таким образом, изучение приготовленных по нашему методу плоскостных препаратов, позволяет оценить зону и локализацию патологических изменений, форму и размеры клетки РПЭ, количество форму и положение ядра в клетке РПЭ, соотношение объема ядра и цитоплазмы, а также сохранность межклеточных соединений.

Способ пригоден и легко воспроизводим для исследования морфологии РПЭ, дает надежный и стабильный результат.

Фиг. 1-4, демонстрируют полученные результаты.

Фиг. 1. Глазное яблоко кролика породы альбино А - вид сбоку, Б - вид спереди. Пунктирной линией обозначена линия разреза для отсечения переднего сегмента глазного яблока.

Фиг. 2. Контроль качества процедуры окраски. Проводится путем осмотра поверхности РПЭ с помощью препаровального стереомикроскопа, окрашенные клетки, должны приобрести вид «булыжной мостовой»

Фиг. 3. Отделенная сосудистая оболочка со слоем РПЭ.

Фиг. 4. Нормальный РПЭ кроликов альбиносов, 1 - клетка РПЭ, 2 - ядро РПЭ, 3 - вакуоль РПЭ.

Пример 1. Кролик альбино, вес 2.5 кг. Анестезия: внутримышечно введением золетила 50 (0.3 мл) и ксилазина 2% (0.55 мл.), после введения в наркоз животное выведено из эксперимента путем воздушной эмболии. Проведена энуклеация, фиксация глазного яблока 10% забуференным нейтральным раствором формалина. Погрузили глазное яблоко в такой же раствор на 24 часа. Отсекли передний сегмент глазного яблока, извлекли хрусталик, стекловидное тело, отделили нейросетчатку с обнажением ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Провели комбинированное окрашивание РПЭ in situ с применением импрегнации границ клеток РПЭ солями серебра с контрастирующей окраской гематоксилином Гарриса. Циркулярно подрезали края глазного бокала так, чтобы срез приходился на плоскую часть цилиарного тела (Фиг. 1). Отсекли зрительный нерв вместе с диском зрительного нерва, сосудистую оболочку со слоем РПЭ отделили от склеры на всем протяжении. Для оценки качества отделения сетчатки и удаления мелких подпаянных фрагментов использовали препаровальный стереомикроскоп, окрашенные клетки приобрели вид «булыжной мостовой» (Фиг. 2). Сосудистая оболочка отделена от склеры, на сосудистую оболочку нанесены радиальные и послабляющие разрезы и поместили с помощью гидрофильной среды под покровное стекло (Фиг. 3). Приготовленный таким образом плоскостной препарат исследовали с помощью светового микроскопа в проходящем свете в том числе, с использованием масляной иммерсии.

Нормальный РПЭ кролика альбиноса в препаратах, приготовленных по предложенному способу, имеет типичный вид: клетки РПЭ имеют форму многоугольников с четкими сероватыми границами, голубоватой мелкозернистой цитоплазмой с одной - двумя вакуолями, а также одним -тремя округлыми ядрами, содержащими мелкозернистый хроматин иногда с мелким базофильным ядрышком - Фиг. 4.

Пример 2. Крыса альбинос линии вистар, вес 200 г. Анестезия: внутримышечно введением золетила 50 (0.15 мл) и ксилазина 2% (0.2 мл.), после введения в наркоз животное выведено из эксперимента путем воздушной эмболии. Проведена энуклеация, фиксация глазного яблока 10% забуференным нейтральным раствором формалина, с погружением глазного яблока в такой же раствор на 24 часа. Передний сегмент глазного яблока отсечен фронтальным разрезом с последующим комбинированным окрашиванием РПЭ in situ с применением импрегнации границ клеток РПЭ солями серебра с контрастирующей окраской гематоксилином Гарриса, сосудистая оболочка со слоем РПЭ отделена от склеры на всем протяжении. После нанесения на сетчатку радиальных и послабляющих разрезов, сосудистая оболочка с прилежащим слоем РПЭ помещена с помощью гидрофильной среды под покровное стекло. Приготовленный таким образом плоскостной препарат исследовали с помощью светового микроскопа в проходящем свете в том числе, с использованием масляной иммерсии.

Нормальный РПЭ крысы альбиноса в препаратах, приготовленных по предложенному способу, имеет типичный вид: клетки РПЭ имеют форму многоугольников с четкими сероватыми границами, голубоватой мелкозернистой цитоплазмой с одной - двумя вакуолями, а также одним -двумя округлыми ядрами, содержащими мелкозернистый хроматин иногда с базофильным ядрышком.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить плоскостные препараты сосудистой оболочки глазного яблока и обеспечивает возможность оценить качественные и количественные изменения клеток РПЭ на всей площади сосудистой оболочки.

Изобретение относится к медицине, а именно патологической анатомии и офтальмологии, и может быть использовано для приготовления плоскостных препаратов сосудистой оболочки глазного яблока у экспериментальных животных-альбиносов. Глазное яблоко энуклеируют, фиксируют введенным интравитреально 10% забуференным нейтральным раствором формалина. Погружают глазное яблоко в такой же раствор на 24 часа. Отсекают передний сегмент глазного яблока, извлекают хрусталик, стекловидное тело, отделяют нейросетчатку с обнажением ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Проводят комбинированное окрашивание РПЭ in situ с применением импрегнации границ клеток РПЭ солями серебра с контрастирующей окраской гематоксилином Гарриса. Циркулярно подрезают глазной бокал, в пределах плоской части цилиарного тела, отсекают зрительный нерв вместе с диском зрительного нерва, сосудистую оболочку со слоем РПЭ отделяют от склеры на всем протяжении. Рассекают радиальными разрезами и помещают с помощью гидрофильной среды под покровное стекло. Изобретение обеспечивает возможность оценить качественные и количественные изменения клеток РПЭ на всей площади сосудистой оболочки. 4 ил.

Способ приготовления плоскостных препаратов сосудистой оболочки глазного яблока у экспериментальных животных-альбиносов, включающий энуклеацию, погружение глазного яблока в 10% забуференный нейтральный раствор формалина, отличающийся тем, что раствор формалина сначала вводят в витреальную полость энуклеированного глаза, затем погружают глазное яблоко в такой же раствор на 24 часа, затем отсекают передний сегмент глазного яблока, извлекают хрусталик, стекловидное тело, отделяют нейросетчатку с обнажением ретинального пигментного эпителия (РПЭ), проводят комбинированное окрашивание in situ с применением импрегнации границ клеток РПЭ солями серебра с контрастирующей окраской гематоксилином Гарриса, циркулярно подрезают края глазного бокала так, чтобы срез приходился на плоскую часть цилиарного тела, отсекают зрительный нерв вместе с диском зрительного нерва, а сосудистую оболочку со слоем РПЭ отделяют от склеры на всем протяжении, рассекают радиальными и послабляющими разрезами и помещают с помощью гидрофильной среды под покровное стекло.