Способ лечения пролиферативных процессов заднего отрезка глаза Российский патент 2019 года по МПК A61K31/198 A61P27/02 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения пролиферативных процессов заднего отрезка глаза (пролиферативной витреоретинопатии (ПВР)) с помощью интравитреального введения препарата Мелфалан в малых дозах.

Пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) является сложным гетерогенным заболеванием, которое характеризуется формированием клеточных мембранных образований на внутренней поверхности сетчатки. Особенностью этих мембран является наличие у них тракционных свойств, приводящих к тракционной отслойке сетчатки с потерей зрительных функций. ПВР, как многофакторный патологический процесс, чаще всего возникает как осложнение при таких клинических состояниях, как регматогенная отслойка сетчатки, травматическая отслойка сетчатки. Развитие ПВР после хирургического лечения отслойки сетчатки вызывает рецидивы заболевания - неприлегание сетчатки.

Исследования медикаментозной профилактики и лечения ПВР являются в настоящее время приоритетными и многообещающими. Несмотря на успехи хирургического лечения в 60-80%, функциональный успех операций наблюдается в 40-80% случаев, когда достигнуто прилегание сетчатки. (Pastor J.C. de la Rua ER, Martin F. Proliferative vitreoretinnopathy: risk factors and pathobiology. Prog Retin eye Res. 2002; 21(1): 127-144).

Направленность медикаментозного воздействия связана со стадийностью ПВР. Многочисленные препараты, протестированные на моделях животных и клеточных культурах, демонстрируют свою эффективность (Pastor J.C, Rodriguez Е., Marcos М. et all. Combined pharmacologic therapy in a rabbit model of proliferative vitreoretinopathy (PVR). // Ophthalmic Res. 2000. - 32. - P. 25-29).

Однако многие из них имеют тяжелые побочные эффекты, и лишь некоторые используются в клинической практике. Сложность заключается и в достижении терапевтической концентрации при введении их рутинным способом. Введение препаратов инравитреально не используется в клинической практике, так как существует концепция о токсичном влиянии в отношении сетчатки и недостаток информации об интраокулярной фармакокинетике (Asaria R.H., Kon С.Н., Bunce С, Charteris D.G., Wong D., et all. How to predict proliferative vitreoretinopathy. A prospective study. // Ophthalmology. 2001. - 108. - P. 1184-1186., Jonas J.B., Hayler J.K., Panda-Jonas S. Intravitreal inlection of crystalline cortisone as adjunctive treatment of proliferative vitreoretinopathy // Br. J. Ophthalmol. 2000.- 84. - P. 1064-1067).

Накопленные знания о цитопатогенезе ПВР ориентируют на использование адъюнктивной терапии на различные стадии заболевания: стадию воспаления-альтерации, пролиферативную стадию и стадию рубцевания. Подобный подход имеет научную актуальность и практическую значимость.

После нарушения гематоретинального барьера и активной стадии воспаления наступает пролиферативная фаза ПВР. На стадии пролиферации заболевания широко изучается применение и эффективность использования противоопухолевых препаратов, ингибирующих клеточный цикл и клеточную пролиферацию.

Известно использование противоопухолевых, антипролиферативных препаратов для воздействия на ПВР, во многих случаях установлено их токсическое действие на сетчатку. Препараты вводили интравитреально однократной инъекцией или в перфузионном растворе во время проведения витреоретинальной операции. Эти препараты включают соединения: 5 фторурацил, даунорубицин, таксол, колхицин, ретиноевую кислоту, рибозимы, этопозид и др. (Sundaram V, Barsam A, Vergili G. Intravital low molecular weight heparin and 5-fluorouracil for the prevention of proliferative vitreoretinopathy following retinal reattachment surgery. Cochrane Database Syst Rev. 2010, 7: CD006421; Kumar A, Nainiwal S, Choudbary I, Tewari HK, Verma LK. Role of daunorubicin in inhibiting proliferative vitreoretinopathy after retinal detachment surgery. Clin Experiment Ophthalmol.2002; 30(5): 348-351.; Daniels SA, Coonley KG, Yoshizumi MO. Taxol treatment of experimental proliferative vitreoretinopathy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1990; 228 (6): 513-516; Berman DH, Gombe GM. Proliferative vitreoretinopathy: does oral low-dose colchicine have an inhibitory effect? A controlled study in humans. Ophthalmic Surg. 1989; 20(4): 268-272; Chang YC, Hu DN, Wu WC. Effect of oral 13-cis-retinoic acid treatment on postoperative clinical outcome of eyes with proliferative vitreoretinopathy. Am J ophthalmolol. 2008; 146(3): 440-446; Liang CM, Tai MC, Chang YH, et al. Glucosamine inhibits epithelial-to-mesenchymal transition and migration of retinal pigment epithelium cells in culture and morphologic changes in mouse model of proliferative vitreoretinopathy. Acta Ophthalmol. 2011; 89(6): 505-514; Schiff Wm, Hwang Jc, Ober MD, et al. Safety and efficacy assessment of chimeric ribozyme to proliferating cell nuclear antigen to prevent recurrence of proliferative vitreoretinopathy. Arch Ophthalmol. 2007; 125(9): 1161-1167; Kuo HK, Wu PC, Yang PM, Chen YH, Wu YC, HuDN. Effects of topoisomerase II inhibitors on retinal pigment epithelium and experimental proliferative vitreoretonopathy. J Ocul Pharmacol Ther. 2007; 23(1): 14-20).

Ближайшим аналогом предлагаемого нами изобретения способ того же назначения, включающий интравитреальное введение 5-фторурацила.

5-фторурацил - один из наиболее изученных препаратов для лечения ПВР. Препарат действует на синтез ДНК, предотвращая образование тимидина. Borhani с соавт. оценивали на модели ПВР у кроликов замедленное высвобождение препарата, заключенного в биоустройство, введенное интравитреально в концентрациях 0.5 мг и 1 мг. Исследования показали эффективность лечебного действия 5-фторурацилана на развитие ПВР, а в большей концентрации препарата авторы отмечали предотвращение развития тракционной ОС в 100% случаев. (Barhani Н, Peyman GA, Rahimy MH, Thompson Н. Supression of experimental proliferative vitreoretinopaty by sustained intraocular delivery of 5-FU. Int Ophthalmol. 1995; 19(1): 43-49).

Три рандомизированных контролируемых клинических исследования были проведены по применению 5-фторурацила 200 мг/мл и низкомолекулярного гепарина 5 ЕД/мл, добавленными в ирригационный раствор во время витреоретинальной операции. Известно, что низкомолекулярный гепарин (LMWH) обладает несколькими эффектами, препятствующих развитию ПВР: он уменьшает образование фибрина, уменьшает образование клеточного субстрата путем связывания фибронектина, а так же связывает факторы роста фибробластов и ингибирует клеточную пролиферацию склеральных фибробластов и клеток РПЭ. (Charteris DG. Proliferative vitreoretinopathy pathology, surgical management and adjunctive treatment. Br J Ophthaloml 1995: 79: 953-960. Asaria RH, Kon CH, Bunce С et al. Adjuvant 5-ftuorouracil and heparin prevents proliferative vitreoretinopathy: resulta from a randomized, double-blind controlled clinical trial. Ophthalmology. 2000; 108(7): 1179-1183. Wickham L, Bunce C, Wong D, McGurn D, Charteris DG. Randomized controlled trial of combined 5-fluoroouracil and low-molecular-weight heparin in the management of unselected rhegmatogenous retinal detachments undergoing primary vitrectomy. Ophthalmology. 2007; 114(4): 698-704). В первом исследовании приняли участие 174 пациента. Авторы отметили значительное снижение частоты послеоперационной ПВР, так же сделали вывод и о экономической эффективности лечения, в связи с сокращением количества повторных операций в группе лечени. (Sundaram V, Barsam A, Vergili G. Intravitral low molecular weight heparin and 5-fluorouracil for the prevention of proliferative vitreoretinopathy following retinal reattachment surgery. Cochrane Database Syst Rev. 2010, 7: CD006421). В исследовании Уикхэм с соавт. изучали результаты операций 641 пациента с первичной регматогенной ОС, перенесших витрэктомию с газовоздушной тампонадой. Они обнаружили, что адъюнктивная терапия с 5-фторурацилом и низкомолекулярным гепарином, введенными интравитреально, не улучшила ни анатомического, ни функционального результата операций после 6 мес.наблюдения (Wickham L, Bunce С, Wong D, McGurn D, Charteris DG. Randomized controlled trial of combined 5-fluoroouracil and low-molecular-weight heparin in the management of unselected rhegmatogenous retinal detachments undergoing primary vitrectomy. Ophthalmology. 2007; 114(4): 698-704). Различия между полученными результатами клинических исследований можно было объяснить в различных критерия отбора больных в группы лечения. В первом были включены исследовании с повышенным риском развития ПВР, а во втором - все больные с ОС.

Проведенные экспериментальные и клинические исследования по применению противоопухолевых/антипролиферативных препаратов в качестве местной и системной адъюнктивной терапии при развитии ПВР доказывают актуальность использования новых антипролиферативных препаратов для лечения ПВР. При этом, учитывая необходимость использования препаратов в терапевтической концентрации и присутствие специфического гематоофтальмического барьера, является целесообразным введение препаратов данной группы интравитреально, а не системно (парентерально, перорально), минимизируя их системные побочные эффекты.

Известен препарат Мелфалан, используемый в онкологической практике. Препарат Мелфалан является производным азотистого иприта, относится к бифункциональным алкилирующим соединениям циклонеспецифического действия. Препарат обладает противоопухолевым, алкилирующим, цитостатическим и иммунодепрессивным действием. Препарат вызывает повреждение макромолекулы ДНК и нарушает ее полимеризацию и редупликацию, способствует образованию дефектных форм ДНК и РНК и останавливает синтез белка. Цитотоксичность обусловлена блокадой межцепочечных перекрестных обратимых сшивок в молекуле ДНК вследствие ковалентного связывания с гуанином в 7 позиции и взаимодействия с фосфатными, сульфгидрильными и другими группами нуклеиновых кислот и белков. При этом нарушается клеточная репликация. Препарат активен в отношении покоящихся и активно делящихся опухолевых клеток. Наиболее чувствительными фазами митотического цикла являются конец фазы G2 и переход G2-M.

Мелфалан применяли в офтальмоонкологии при лечении ретинобластомы в качестве препарата для внутриартериальной химиотерапии дополнительно к внутривенной химиотерапии, а затем в виде основной терапии. Однако, несмотря на положительный эффект - резорбцию опухоли, появлялись рецидивы в виде отсевов в стекловидном теле. Введение препарата интравитреально позволило добиться полной резорбции отсевов (Francis J., Schaiquevich P., Buiatrago E. Local and systemic toxicity of intravitreal melphalan for vitreous seeding in retinoblastoma: a preclinical and clinical study. Ophthallmology. 2014; 121(9):1810-1817. Chassemi F., Shields C. Intravitreal melphalan for refractory or recurrent vitreous seeding from retinoblastoma. Arch. Ophthalm. 2012; 130(10): 1268-1271). В настоящее время в американских и многих европейских клиниках интравитреальное введение Мелфалана входит в протокол лечения детей с двусторонней ретинобластомой. (Francis J., Marr В., Brodie S. Anterior ocular toxicity of intravitreous melphalan for retinoblastoma. JAMA Ophthalmol. 2015; 133(12); 1459-1463). Авторы отмечают, что системная химиотерапия совместно с интравитреальным введением мелфалана в дозах 20-30 мкг в 0.1 мл позволяет сохранить ребенку не только глаз, но и зрение. Как альтернатива энуклеации единственного глаза ребенку с ретинобластомой проводилась витреоретинальная операция с постоянной ирригацией мелфалана в ходе вмешательства (Алкеран 5 мг/мл) (Яровой А.А., Горшков И.М., Ушакова Т.Л. Интраокулярная хирургия с ирригацией мелфалана в лечении гемофтальма на единственном глазу у ребенка с ретинобластомой (клинический случай). Современные технологии лечения витреоретинальной патологии. 2014 №1. 119-120).

Однако при интравитреальном введении Мелфалан оказывает токсическое влияние на сетчатку в дозах 20-30 мкг/мл. В результате токсического действия развиваются атрофические процессы в сетчатке (Shaiquevich P., Buitrago Е., Taich A. Pharmacokinetic analisis of melphalan after superselective ophthalmic artery infusion in preclinic models and retinoblastoma patients. Invest Ophthalmol Vis Sci 53 (7): 4205-12, 2012).

Задачей предлагаемого способа является разработка способа лечения пролиферативных процессов заднего отрезка глаза с помощью интравитреального введения антипролиферативного препарата.

Техническим результатом предлагаемого способа является получение антипролиферативного эффекта при отсутствии токсического повереждения сетчатки и ретинального пигментного эпителия.

Технический результат достигается за счет однократного интравитреального введения 0,005 мг в объеме 0.1 мл препарата Мелфалан.

Нами были проведены исследования по изучению действия Мелфалана в различных концентрациях на сетчатку и ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) при его интравитреальном введении в эксперименте на кроликах. Важной задачей исследования было определить морфологические структуры глаза, являющиеся мишенью действия Мелфалана, а также выявить концентрацию препарата, не оказывающую токсических изменений. Проводилось сравнительное экспериментальное исследование влияния Мелфалана на внутриглазные структуры глаза кролика в концентрациях: 0.02 мг, 0.01 мг, 0.0075 мг и 0.005 мг. В проведенных исследованиях было установлено, что морфологические изменения в сетчатке и РПЭ носили дозозависимый характер, а также характеризовались его токсическими свойствами. В основе токсического действия препарата лежало поражение наружных слоев сетчатки в связи с преимущественным избыточным накоплением Мелфалана в РПЭ. Проведенные исследования показали, что дозы Мефалана 0.0075 мг и 0.005 мг, введенные однократно интравитреально, обладают минимальной ретинотоксичностью и безопасны для введения эндовитреально.

Мы изучили антипролиферативное действие Мелфалана на модели экспериментальной ПВР, ранее разработанной нами (И.П. Хорошилова-Маслова, Н.Л. Лепарская, Е.А. Воротеляк, А.В. Васильева «Роль фибробластов в моделировании пролиферативной витреоретинопатии. Вестник офтальмологии. №5 2017 Том 133. стр 4-10»). Материалом для исследования модели явились 12 кроликов (24 глаза) породы Шиншилла весом 2.5-3.0 кг, у которых моделировали ПВР на обоих глазах путем эндовитреального введения через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G культуры клеток гетерогенных активированных фибробластов 200000 клеток в 0.1 мл. Животных наблюдали в течение 3 месяцев. 6 кроликов выводили из эксперимента через 1 мес. после начала эксперимента, остальных 6 кроликов выводили из эксперимента через 3 мес. После вывода животных из эксперимента глаза энуклеировали, фиксировали в 10% забуференном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопической системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении ×200 - ×600.

Развитие ПВР имело место в 100% случаев и было подтверждено клинико-морфологическими исследованиями. Через 30 дней моделирования ПВР наблюдалось появление ЭРМ в виде волокнистых структур на внутренней поверхности сетчатки, выявлялись крупные фибробластоподобные клетки. Гистоструктура сетчатки и ее слоистость сохранялась (Фиг. 1).

Через 90 дней наблюдалось утолщение эпиретинальной мембраны (ЭРМ) за счет преобладания в них волокнистых компонентов и накопления экстрацеллюлярного матрикса (Фиг. 2). Также наблюдалось нарушение гистоструктуры сетчатки, исчезновение слоистости сетчатки (слоя палочек и колбочек, плексиформного слоя). Появлялись тракционные свойства ЭРМ - складчатость и отслойка сетчатки (Фиг. 3).

Данная модель характеризовалась закономерным плоскостным ростом фибробластов на внутренней поверхности сетчатки с формированием эпиретинальных мембран, контрактильные свойства которых определяли появление складчатости сетчатки и ее отслойку. Данная экспериментальная модель ПВР отражала заключительную фиброзную стадию ПВР и может быть использована для объективной оценки эффективности антипролиферативных препаратов.

Лечение экспериментальной ПВР проводили через 1 день после моделирования процесса. В первой группе животных (6 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили Мелфалан в концентрации 0.02 мг в 0,1 мл. Во второй группе животных (6 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили Мелфалан в концентрации 0,005 мг в 0,1 мл. Концентрация Мелфалана 0.02 мг применяется онкологами для эндовитреального введения при лечении ретинобластомы. Учитывая осложнения при эндовитреальном введении препарата в данной концентрации, мы использовали концентрацию Мелфалана в 4 раза меньше - 0.005 мг. Животных наблюдали в течение 1 месяца с использованием методов офтальмологического исследования: биомикроскопии и офтальмоскопии. После вывода животных из эксперимента глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопической системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении ×200 - ×600.

При исследовании I группы (6 кроликов - 12 глаз) в 6 глазах, получавших лечение, отмечалось отсутствие эпиретинальных мембран. Однако доминирующими были атрофические изменения сетчатки, которые имели различную выраженность в виде, преимущественно, двух типов изменений.

Очаги первого типа характеризовались поражением всех слоев сетчатки с глиальным ее замещением. Отмечалось полное разрушение сетчатки, утрата ее слоистости. Сетчатка превращалась в глиальную ткань, спаянную с атрофичной хориоидеей (Фиг. 4).

Очаги второго типа характеризовались истончением сетчатки с исчезновением фоторецепторного слоя (наружного ядерного и плексиформного слоев), сохранялся лишь редуцированный внутренний ядерный слой (Фиг. 5).

Во всех глазах также диагностировались выраженные деструктивные процессы в RPE: диссоциация клеток, их миграция, оголение мембраны Бруха (Фиг. 6).

При исследовании II группы (6 кроликов - 12 глаз) в 6 глазах, получивших лечение, микроскопически отмечалась редукция пролиферативного процесса. ПВР отсутствовала, сетчатка сохраняла свою нормальную структуру (Фиг. 7).

Грубые атрофические изменения в сетчатке (первого и второго типа), в отличие от наличия их в I группе, отсутствовали. Однако в 5 глазах отмечались единичные дистрофические очаги третьего типа, которые характеризовались истончением наружного ядерного слоя, укорочением палочек и колбочек, при этом отмечалось полное сохранение внутренних слоев сетчатки (Фиг. 8).

Отмечались единичные деструктивные изменения в РПЭ с диссоциацией РПЭ и оголением мембраны Бруха (Фиг. 9).

Резюмируя полученные в эксперименте результаты, можно сделать заключение, что Мелфалан является эффективным антипролиферативным препаратом, способствующим ингибиции пролиферативного процесса при лечении ПВР. Вместе с тем, препарат обладает токсическими свойствами. Выраженность токсических осложнений зависит от концентрации препарата. Высокая концентрация, применяемая в онкологической практике - 0.02 мг, вызывает распространенные атрофические изменения в сетчатке. В основе токсического действия, как показал анализ морфологического исследования, лежала атрофия преимущественно наружных слоев сетчатки: слоя палочек и колбочек, наружного ядерного и наружного плексиформного слоев, то есть поражался фоторецепторный слой сетчатки. Известно, что функция фоторецепторного слоя тесно связана с метаболизмом РПЭ, который страдал при эндовитреальном введении Мелфалана. Фармакокинетические исследования показали, что Мелфалан накапливался в РПЭ в большей концентрации, чем в сетчатке [Francis J., Marr В., Brodie S. Anterior ocular toxicity of intravitreous melphalan for retinoblastoma. JAMA Ophthalmol. 2015; 133(12); 1459-1463. Shaiquevich P., Buitrago E., Taich A. Pharmacokinetic analisis of melphalan after superselective ophthalmic artery infusion in preclinic models and retinoblastoma patients. Invest Ophthalmol Vis Sci 53 (7): 4205-12, 2012.] Такая «тропность» Мелфалана к РПЭ объясняет возникновение осложнений, связанных с изменением РПЭ и последующих нарушений функций фоторецепторов, ведущих к развитию атрофического процесса сетчатки. Применение в эксперименте концентрации Мелфалана 0.005 мг, вызывало положительный лечебный антипролиферативный эффект на модели ПВР с минимальными осложнениями: развитие атрофического процесса только в отростках фоторецепторных клеток, которые могут носить обратимый характер.

Пример 1. Кролик №4

Кролику породы Шиншилла №4 в правый глаз после инсталляции в конъюнктивальную полость местного анестетика Проксиметакаина 0.5% интравитреально через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введена культура клеток гетерогенных активированных фибробластов 200000 клеток в 0.1 мл. Через 24 часа после однократной инсталляции в конъюнктивальную полость Проксиметакаина 0.5% через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введено 0.1 мл 0.005 мг раствора Мелфалана. Через 30 дней кролик выведен из эксперимента, глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопической системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении ×200 - ×600.

При гистологическом исследовании отмечалось отсутствие новообразованных эпиретинальных мембран на поверхности сетчатки, отсутствовала складчатость сетчатки и тракционная отслойка сетчатки. Сетчатка сохраняла свою гистоструктуру. (Фиг. 10).

Пример 2. Кролик №5

Кролику породы Шиншилла №5 в правый глаз после инсталляции в конъюнктивальную полость местного анестетика Проксиметакаина 0.5% интравитреально через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введена культура клеток гетерогенных активированных фибробластов 200000 клеток в 0.1 мл. Через 24 часа после однократной инсталляции в конъюнктивальную полость Проксиметакаина 0.5% через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введено 0.1 мл 0.005 мг раствора Мелфалана. Через 30 дней кролик выведен из эксперимента, глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопической системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении ×200 - ×600.

При гистологическом исследовании правого глаза отмечалось отсутствие новообразованных эпиретинальных мембран на поверхности сетчатки, отсутствовала складчатость сетчатки и тракционная отслойка сетчатки. Сетчатка сохраняла свою гистоструктуру. (Фиг. 11).

Предлагаемый способ позволит повысить эффективность хирургического лечения регматогенной отслойки сетчатки, осложненной ПВР, а также имеет особую актуальность при использовании во время хирургического лечения травматических повреждений оболочек заднего отрезка глаза, которые сопровождаются активными пролиферативными процессами. Использование эффективного антипролиферативного препарата во время витреоретинальной хирургии позволит снизить активность ПВР при дистрофической и травматической отслойке сетчатки, а также склерохориоретинального рубцевания при травме заднего отрезка глаза, что повысит эффективность хирургического лечения и снизит количество повторных хирургических вмешательств. На основании полученных результатов планируются ограниченные клинические исследования.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для лечения пролиферативной витреоретинопатии (ПВР) в эксперименте. Для лечения ПВР кроликам породы Шиншилла осуществляют интравитреальное введение Мелфалана однократно в количестве 0,005 мг в объеме 0,1 мл. Использование изобретения обеспечивает получение антипролиферативного эффекта при отсутствии токсического повреждения сетчатки и ретинального пигментного эпителия. 11 ил., 2 пр.

Способ лечения ПВР в эксперименте, включающий интравитреальное введение антипролиферативного препарата, отличающийся тем, что в качестве антипролиферативного препарата используют Мелфалан однократно в количестве 0,005 мг в объеме 0.1 мл, который вводят кроликам породы Шиншилла.