Способ определения количества повреждений митохондриальной ДНК берёзы для оценки устойчивости к солевому стрессу in vitro Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 A01H1/00 

Настоящее изобретение относится к области лесного хозяйства, а именно к способам оценки уровня устойчивости древесных пород в условиях солевого стресса. Данное изобретение может быть использовано при отборе наиболее устойчивых к солевому стрессу растений березы.

Солевой стресс является одним из главных абиотических факторов, негативно влияющих на жизнедеятельность как растений в целом, так и древесных пород в частности. Данная проблема актуальна для любой климатической зоны, и факторы, влияющие на степень засоления, достаточно многообразны и связаны с физическими особенностями и составом почв, рельефом местности, климатическими факторами, а также хозяйственной деятельностью человека. Минеральные соли, в особенности хлорид натрия., негативно влияют на физиолого-биохимические показатели растений, такие изменения приводят к ухудшению выживаемости деревьев и негативно сказываются на их хозяйственно-ценных свойствах. В связи с этим, перед лесным хозяйством стоит задача вывести устойчивые к солевому стрессу древесные породы (Белова Т.А. Физиологические основы адаптации растений к воздействию солевого стресса / Т.А. Белова, А.С.Кравченко // Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета. - 2018. - Т. 17, №1. - С. 1-7). Для выполнения поставленной задачи необходимо разработать методы, позволяющие оценить степень резистентности растений данным факторам.

Для данной цели удобным маркером является митохондриальная ДНК, поскольку солевой стресс в том числе влияет на мембранный потенциал митохондрий и образование активных форм кислорода, к которым мтДНК является уязвимой. Уязвимость обусловлена близким расположением мтДНК к источникам активных форм кислорода, находясь в матриксе митохондрий (J. Lin. Salt stress-induced programmed cell death in tobacco protoplasts is mediated by reactive oxygen species and mitochondrial permeability transition pore status / J. Lin, Y. Wang, G. Wang // J Plant Physiol. - 2006. - Vol. 7, №163. - P. 731-739).

Прототипом данного изобретения является патент № РФ 2663719, который предлагает способ определения генотоксичности ксенобиотиков на основе анализа повреждений мтДНК земляного шмеля (Bombus terrestris). Данным методом предусмотрены следующие этапы: 1) забор биологического материала, 2) выделение ДНК, 3) определение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК методом ПЦР в реальном времени, 4) сравнение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК экспериментальной и контрольной группы. При этом предварительно ведут кормление земляных шмелей (Bombus terrestris) тестируемым ксенобиотиком на протяжении суток, ДНК выделяют из грудных мышц шмеля, ПЦР проводят при температуре элонгации 66,1±0,5°С в течение 5 минут с использованием Encyclo-полимеразы и соответствующего ей Encyclo-буфера с парами праймеров, имеющих заданные последовательности.

Тем не менее, этот метод не позволяет оценивать повреждения митохондриальной ДНК растений в условиях солевого стресса в связи со специфическим устройством растительного митохондриального генома по сравнению с митогеномом животных. В силу этого также усложняется процесс выделения ДНК, который в случае работы с растительным геномом имеет ряд особенностей.

Задачей данного изобретения является разработка способа оценки солеустойчивости берез на базе оценки повреждений митохондриальной ДНК.

Технический результат заключается в разработке хорошо воспроизводимого, высокочувствительного способа определения количества повреждений митохондриальной ДНК различных видов березы в условиях солевого стресса.

Технический результат достигается тем, что в способе определения количества повреждений митохондриальной ДНК березы для оценки устойчивости к солевому стрессу, включающему приготовление питательной среды 1/2 нормы макросолей MS (1/2 MS) без гормонов с добавлением 0,5% NaCl; микрочеренкование in vitro, выдерживание растений в заданных условиях в течение недели; выделение ДНК с использованием метода дифференциального цетрифугирования; определение количества повреждений митохондриальной ДНК осуществляемого с помощью ПЦР в длинных фрагментов митохондриальной ДНК в реальном времени с использованием Encyclo-полимеразы ПЦР и соответствующего ей Encyclo-буфера с парами праймеров, имеющих последовательности согласно Перечня последовательностей, которые позволяют амплифицировать фрагменты митохондриальной ДНК, кодирующие длинный и короткий фрагменты гена Cox1 (в качестве референса используется короткий фрагмент этого гена), общая денатурация: 95°С, 3 мин, денатурация в начале цикла: 95°С, 10 с, отжиг праймеров: 59°С, 30 с, элонгация: 72°С, 4 мин и 30 с, 35 циклов, расчет количества повреждений ведут согласно формуле:

где D₁₀ - значение повреждений на 10000 пар нуклеотидов

Е - значение эффективности ПЦР

ΔSh=Cq короткого таргетного фрагмента - Cq короткого контрольного фрагмента,

ΔL=Cq длинного таргетного фрагмента - Cq длинного контрольного фрагмента,

L_f - длина фрагмента, т.п.н.

Последовательности праймеров для определения количества повреждений мтДНК березы приведены в Перечне последовательностей.

Устойчивые к засолению клоны березы поддерживали in vitro по ранее описанной методике путем редкого субкультирования на питательной среде нормы макросолей (1/2 MS) без гормонов (Табацкая Т.М. Опыт долговременного хранения коллекции ценных генотипов березы с использованием безгормональных питательных сред. / Т.М. Табацкая, О.С. Машкина // Лесоведение. - 2020. - №2. - С. 147-161). Для проведения культивирования в условиях засоления готовят питательную среду 1/2 MS без гормонов с добавлением хлорида натрия в концентрации 0,5%, содержащей также 20 г/л сахарозы, 6 г/л агар-агара, рН=5,6-5,8 (Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bio assays with Tobacco tissue cultures / Murashige Т., Skoog F. // Phisiol. Plant. - 1962. - Vol. 15, №13. P. 473-497.). Среду разливают по биологическим пробиркам, которые затем закрывают колпачками из фольги и автоклавируют при 0,8 атм в течение 15 минут.

Проводят микрочеренкование стерильных микрорастений в асептических условиях в ламинар-боксе. Микрорастения разрезают лезвием на микропобеги с 1 пазушной почкой (размер 1-1,5 см), которые помещают по одному в культуральный сосуд на ранее приготовленную питательную среду, и переносят в культуральную комнату, где выдерживают в стандартных условиях климатического режима (температура 25±2°С, фотопериод 16 ч день / 8 ч ночь, интенсивность освещения 2,0 клк) в течение одной недели. По окончании заданного периода образцы хранят в культуральных сосудах в морозильной камере при -76°С. Образцы являются готовыми для выделения ДНК из листьев.

Процесс выделения ДНК предполагает гомогенизацию образца в 250 мкл буфера для экстракции. В состав буфера входят 0,2 М Tris-HCl (рН=9,0), 0,4 М LiCl, 25 мМ ЭДТА и 1% SDS. Далее проводится центрифугирование при 14000 об/мин в течение 10 минут, после чего отбирается супернатант (175 мкл) и переносится в чистую пробирку. Затем ДНК осаждают равным объемом изопропилового спирта, пробирку переворачивают 10 раз, аккуратно перемешивая, после чего центрифугирование повторяют при тех же параметрах. Полученный супернатант удаляют, осадок промывают 2 минуты 70% этиловым спиртом (150 мкл) и кратко центрифугируют, пробирку с образцом высушивают и полученную ДНК растворяют в 100 мкл деионизированной воды Milli-Q.

Для того чтобы рассчитать количество повреждений мтДНК березы, необходимо провести постановку ПЦР с каждой из пар праймеров. Реакционная смесь для оценки эффективности ПЦР и дальнейшего измерения количества повреждений включает в себя: 2 мкл 10Х Encyclo буфер, 0,4 мкл 50Х смеси полимераз Encyclo, 0,4 мкл смеси dNTP (10 мМ каждого), 1 мкл 20Х SYBR-green, 1-10 нг ДНК-матрицы, 0,5 мкл 10 мкМ прямого и 0.5 мкл 10 мкМ обратного праймера (таблица 1). Доводится водой MilliQ до объема 20 мкл. Условия ПЦР: общая денатурация: 95°С 3 мин, денатурация в начале цикла: 95°С, 10 с, отжиг праймеров: 59°С 30 с, элонгация: 72°С, 4 мин и 30 с, 35 циклов. Расчет полученных результатов производится по формуле:

где D₁₀ - значение повреждений на 10000 пар нуклеотидов

Е - значение эффективности ПЦР

ΔSh=Cq короткого таргетного фрагмента - Cq короткого контрольного фрагмента,

Δ=Cq длинного таргетного фрагмента - Cq длинного контрольного фрагмента

L_f - длина фрагмента, т.п.н.

Способ поясняется примером.

Нами были сравнены образцы растений березы пушистой (Betula pubescens) и березы повислой далекарлийской (Betula pendula f. 'Dalecarlica'). С помощью селективных питательных сред NaCl (0,2-1,0%) были отобраны клоны березы, которые поддерживались в культуре in vitro по ранее описанной методике путем редкого субкультивирования (один раз в 5-6 месяцев) микрорастений на питательной среде нормы макросолей MS (1/2 MS) без гормонов.

Для культивирования в условиях засоления была приготовлена питательная среда MS без гормонов с добавлением хлорида натрия в концентрация 0,5%, а также 20 г/л сахарозы, 6 г/л агар-агара, рН=5,6-5,8. Питательная среда была разлита по биологическим пробиркам, которые закрывают колпачками из фольги. Пробирки были автоклавированы при 0,8 атм в течение 15 минут. Далее проводили микрочеренкование стерильных растений. Все действия были проведены в асептических условиях в ламинар-боксе. Микрорастения разрезали лезвием на микропобеги с одной пазушной почкой размером 1-1,5 см, затем помещали по одному в биологическую пробирку на питательную среду с NaCl. Образцы переносили в культуральную комнату и выдерживались в стандартных условиях климатического режима (температура 25±2°С, фотопериод 16 ч день /8 ч ночь, интенсивность освещения 2,0 клк).

Образцы хранили в морозильной камере при температуре -76°С. Образцы тканей гомогенизировали в буфере для экстракции. Затем проводили центрифугирование при 14000 об/мин в течение 10 минут, после чего отобрали супернатант (175 мкл) и перенесли в чистую пробирку. Далее ДНК осадили равным объемом изопропилового спирта, переворачивали пробирку 10 раз, аккуратно перемешивая, после чего при тех же параметрах повторили центрифугирование. Полученный супернатант удалили, промывали осадок в течение 2 минуты 70% этиловым спиртом (150 мкл) и кратко центрифугировали. Пробирку с образцом высушили и полученную ДНК растворили в 100 мкл деионизированной воды Milli-Q. Была проведена серия измерений в четырех повторностях для каждого из двух образцов представленных пород.

Было показано, что растения березы пушистой являются более устойчивыми к солевому стрессу, чем березы далекарлийской. Так, значение повреждений для всех исследованных образцов составляет 1,465±1,16 повреждений / 10 т.п.н., в то время, как аналогичный параметр для березы далекарлийской составляет 3,3±0,93 повреждений / 10 т.п.н (Фигура). Из этого следует, что по сравнению с березой пушистой, береза далекарлийская является значительно менее устойчивой к условиям засоления (Фигура).

Таким образом, данный метод может применяться для оценки устойчивости к солевому стрессу у берез in vitro. В дальнейшем, данный метод может также быть применим и для других древесных пород, подвергающихся засолению.

Предложенный способ определения количества повреждений митохондриальной ДНК березы является хорошо воспроизводимым и высокочувствительным. Анализ может проводиться в лабораториях, в которых имеются низкотемпературная морозильная камера (-80°С), ламинар-бокс, осветитель с программируемыми режимами, термоциклер для проведения ПЦР в реальном времени, камеру для гель-электрофореза, сопутствующие реактивы и расходные материалы.

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

-<ST26SequenceListing productionDate="2024-09-06" softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Патент Способ определения количества повреждений митохондриальной ДНК берёзы для оценки устойчивости к солевому стрессу in vitro.xml" dtdVersion="V1_3" nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" originalFreeTextLanguageCode="ru">

-<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022127193/10(059458)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-10-18</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

-<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022127193/10(059458)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-10-18</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии (ВНИИЛГИСбиотех)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Vserossijskij nauchno-issledovatel'skij institut lesnoj genetiki, selekcii i biotekhnologii (VNIILGISbiotekh)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Машкина Ольга Сергеева</InventorName>

<InventorNameLatin>Mashkina Olga Sergeeva</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ определения количества повреждений митохондриальной ДНК берёзы для оценки устойчивости к солевому стрессу in vitro</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

-<SequenceData sequenceIDNumber="1">

-<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

-<INSDSeq_feature-table>

-<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

-<INSDFeature_quals>

-<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

-<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Betula pendula</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccgaccaaagattttaccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

-<SequenceData sequenceIDNumber="2">

-<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

-<INSDSeq_feature-table>

-<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

-<INSDFeature_quals>

-<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

-<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Betula pendula</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggcaaattctgggctagaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

-<SequenceData sequenceIDNumber="3">

-<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

-<INSDSeq_feature-table>

-<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

-<INSDFeature_quals>

-<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

-<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Betula pendula</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgcggcttcttcatcttctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения количества повреждений митохондриальной ДНК берёзы для оценки устойчивости к солевому стрессу in vitro. Изобретение позволяет эффективно оценивать устойчивость березы к солевому стрессу in vitro. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ определения количества повреждений митохондриальной ДНК берёзы для оценки устойчивости к солевому стрессу in vitro, включающий приготовление питательной среды 1/2 MS без гормонов с добавлением хлорида натрия в концентрации 0,5%; микрочеренкование in vitro, выдерживание растений в заданных условиях в течение недели, выделение ДНК с использованием буфера для экстракции, определение количества повреждений митохондриальной ДНК осуществляемого с помощью ПЦР в длинных фрагментов митохондриальной ДНК в реальном времени с использованием Encyclo- полимеразы ПЦР и соответствующего ей Encyclo-буфера с парами праймеров SEQ ID NO: 1-3, которые позволяют амплифицировать фрагменты митохондриальной ДНК, кодирующие длинные и короткие фрагменты гена Coxl, при этом общая денатурация: 95°С, 3 мин, денатурация в начале цикла: 95°С, 10 с, отжиг праймеров: 59°С, 30 с, элонгация: 72°С, 4 мин и 30 с, 35 циклов, ведут расчёт количества повреждений митохондриальной ДНК.