РЕАССОРТИРОВАННЫЙ ВИРУС ISA Российский патент 2024 года по МПК C12N15/63 C07K14/11 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к области реассортации вирусов ISA. Кроме того, оно относится к производству вакцин для защиты от вирусов ISA.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инфекционная анемия лосося (ISA) представляет собой вирусное заболевание атлантического лосося (Salmo salar), вызываемое изавирусом лосося. Он поражает рыбные фермы в Канаде, Норвегии, Шотландии и Чили, нанося серьезный ущерб зараженным фермам. Заболевание вызывается общей инфекцией, которая, среди прочего, вызывает тяжелую анемию и кровоточащие поражения. Болезнь распространяется медленно в зараженной рыбной ферме, и смертность может варьироваться от 15 до 100%.

Вирус ISA (ISAV) содержит геном отрицательно заряженной одноцепочечной РНК из 8 сегментов. Общий размер сегментов составляет 14,5 Кб (1,5 х 10³ пар оснований). Вирус воспроизводит себя в ядре. Он представляет 100-120 оболочечный вирус с 10 нм пепломерами, и он отделяется от клеточной мембраны почкованием. Вирус принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Геном кодирует, по меньшей мере, 10 белков. Анализ последовательности сегментов разных ISAV постоянно выявляет два генотипа, обозначенных в соответствии с их географическим происхождением как европейский (генотип I) и североамериканский (генотип II).

Первая вспышка ISA в Чили произошла в середине июня 2007 и длилась по 2010, и в настоящее время является эндемическим заболеванием в Чили. Чили, после Норвегии, находится самое большое производство атлантического лосося. Изоляты ISAV, обнаруженные в Чили, относятся к европейскому генотипу I и, вероятно, произошли из норвежского источника.

Вакцинация является мерой контроля инфекций ISA. Имеются коммерческие вакцины ISAV, основанные на инъекциях инактивированных антигенов клеточной культуры ISAV с масляным адъювантом, а также вакцины на основе HE белка ISAV, экспрессируемого в дрожжах.

Клеточные линии SHK-1, TO, ASK-2 и CHSE-214 представляют собой широко используемые клеточные линии, используемые для выделения ISAV, эти клеточные линии также имеют ограничения. Первые три клеточные линии требуют очень низких коэффициентов расщепления, и последняя клеточная линия не поддерживает рост всех изолятов ISAV. Развитие CPE может занять до 17 дней в клетках CHSE-214 с выходом вируса ниже, чем в SHK-1. SHK-1 является очень деликатной клеточной линией, требующей сложной питательной среды, и иногда она теряет чувствительность при более высоких пассажах, кроме того, некоторые изоляты ISAV продуцируют плохо обнаруживаемый и медленно развивающийся СРЕ в клеточной линии SHK-1 (Munir 2006, J. Vet. Sci 7(2), p167-176). По-видимому, существует географическая корреляция со способностью роста в клетках CHSE, хотя молекулярная основа для этого неизвестна (Kibbenge et al., 2005, Vir. Journal 2, (75), p1-6). В целом, североамериканские изоляты генотипа II обычно растут на клетках CHSE-214, в то время как европейские изоляты генотипа I обычно растут хуже или вообще не растут на клетках CHSE-214. Чилийские изоляты ISAV принадлежат к европейскому генотипу I и также плохо растут на клетках CHSE-214.

Следовательно, существует потребность в улучшении культивирования ISAV, особенно ISAV генотипа I, особенно чилийского ISAV. Предпочтительно, имеет место повышенный выход ISAV.

Существуют в основном две системы выращивания вируса в клеточных культурах: в виде монослоя на искусственном субстрате (т.е. адгезивная культура) или свободно плавающего в культуральной среде (суспензионная культура). Суспензионная клеточная культура имеет преимущества перед адгезивной клеточной культурой, такие как более легкое пассирование, отсутствие необходимости ферментативной или механической дислокации, более легкое масштабирование и возможность сохранения в сосудах для культивирования. Следовательно, было бы выгодно иметь возможность выращивать ISAV в суспензионных клетках. К сожалению, ISA чилийского типа обычно очень медленно растет в культуре клеток, особенно в суспензионной культуре клеток.

Также выгодно иметь возможность выращивать вирус на культуральных клетках в бессывороточной среде.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно было обнаружено, что реассортированный вирус ISA, содержащий геномный сегмент 1-8, где, по меньшей мере, один сегмент генома относится к генотипу I, и, по меньшей мере, один сегмент генома относится к генотипу II, где сегмент 6 генома относится к генотипу II, хорошо растет на суспензионных клетках в бессывороточной среде и обеспечивает защиту от инфекции ISAV.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, два сегмента генома генотипа I.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит сегмент 5 генома генотипа I.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит сегмент генома 8 генотипа I.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, один сегмент генома генотипа I чилийского происхождения.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, один сегмент генома генотипа II канадского происхождения.

Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления относится к вакцинной композиции, содержащей реассортированный вирус ISA в соответствии с любым вариантом осуществления, как описано в настоящем документе.

Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления относится к способу получения реассортированного вируса ISA в соответствии с любым вариантом осуществления, описанным в настоящем документе, включающему стадии

(i) заражения культуры-хозяина штаммом вируса ISA генотипа I и штаммом вируса ISA генотипа II;

(ii) культивирования культуры-хозяина для получения реассортированного вируса ISAV и

(iii) определения, имеет ли реассортированный вирус ISAV сегмент генома 6 генотипа II и, по меньшей мере, еще один сегмент генома генотипа I.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, способ включает дополнительную стадию (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii).

Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления относится к способу культивирования реассортированного ISA, включающему

(i) заражение культуры-хозяина реассортированным вирусом в соответствии с любым вариантом осуществления, как описано в настоящем документе;

(ii) культивирование хозяина со стадии (i) для продуцирования дополнительного вируса.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, способ получения реассортированного вируса ISA дополнительно включает стадию (iii) очистки вируса, продуцированного на стадии (ii).

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, культура-хозяин представляет собой суспензионную клетку.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, культура-хозяин представляет собой клетку CHSE-214.

Другой аспект изобретения и/или его варианты осуществления относится к реассортированному вирусу ISA в соответствии с любым вариантом осуществления, как описано в настоящем документе, для применения в способе вакцинации рыб против вируса ISA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Используемый в описании и прилагаемой формуле изобретения термин «лечение» следует понимать как возвращение организма из патологического состояния в его нормальное, здоровое состояние или профилактику патологического состояния. Последнее можно обозначить как «профилактическое лечение». Лечение предназначено для защиты от патологического состояния. Лечение также означает уменьшение патологических изменений по сравнению с индивидуумами, которые не проходили лечение. Соответственно, имеется снижение патологических изменений, по меньшей мере, на 10%, более предпочтительно, патологических изменений, по меньшей мере, на 25%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или даже 100% по сравнению с индивидуумами, которые не проходили лечение.

Используемый в описании и прилагаемой формуле изобретения термин «обеспечивает защиту» следует понимать как профилактику патологического состояния, такую как «профилактическое лечение». Защита также означает наличие меньшего количества патологических изменений по сравнению с индивидуумами, которые не проходили лечение. Соответственно, патологических изменений, по меньшей мере, на 10% меньше, более предпочтительно, патологических изменений, по меньшей мере, на 25%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или даже на 100% меньше по сравнению с индивидуумами, которые не проходили лечение.

Предполагается, что термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает состав, используемый для стабилизации, растворения или иного смешивания с активными ингредиентами для введения живым животным, включая рыб. Это включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и подобные, совместимые с фармацевтическим введением.

Термин «заболевание», используемый в настоящем документе, обычно является синонимом и используется взаимозаменяемо с терминами «нарушение» и «состояние» (как в случае медицинского состояния), поскольку все они отражают ненормальное состояние организма или одной из его частей, что нарушает нормальное функционирование и обычно проявляется отличительными признаками и симптомами.

ISAV обычно указывается в двух генотипах. Эти генотипы получили названия генотип I и генотип II. Иногда эти генотипы относят к европейскому генотипу (генотип I) и североамериканскому (генотип II). Генотипирование основано на анализе последовательностей сегментов разных ISAV. Они группируются в два разных и различимых генотипа (Kibenge et al. (2001) Antigenic variation among isolates of infectious salmon anaemia virus correlates with genetic variation of the viral haemagglutinin gene. J Gen Virol 82:2869-2879; Kibenge et al. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virol 13, 3 (2016)) Группа EU была дополнительно разделена на четыре клады (геногруппы): три европейские (EU-1 до EU-3) и подобная европейской группа из северо-востока Северной Америки (EU-NA).

Были получены реассортированные вирусы ISA, содержащие, по меньшей мере, один сегмент генома из генотипа I и, по меньшей мере, один сегмент генома из генотипа II. Было обнаружено, что когда сегмент 6 генома относится к генотипу II, вирус ISA хорошо растет на суспензионных клетках и в бессывороточной среде. Это был первый случай получения реассортированных вирусов ISA. Как обсуждалось выше, геном вируса ISA содержит восемь сегментов. Слова «сегмент» и «сегмент генома» или «геномный сегмент» используются взаимозаменяемо, и все они относятся к одному или нескольким из восьми сегментов генома вируса ISA.

Предпочтительно реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, два сегмента генотипа II, более предпочтительно, по меньшей мере, 2-7 сегментов генотипа II, более предпочтительно, по меньшей мере, 3-6 сегментов генотипа II, более предпочтительно, по меньшей мере, 4-5 сегментов генотипа II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, вирус ISA содержит 2-6 сегментов генотипа II, более предпочтительно, 2-5 сегментов генотипа II.

Было обнаружено, что реассортированные вирусы ISA, в которых сегмент 6 генома относится к генотипу II, вирус ISA хорошо растет на суспензионных клетках и в бессывороточной среде. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, сегменты 6 и 1 относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегменты 6 и 2 относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегменты 6 и 3 относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, сегменты 6 и 4 относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, сегменты 6 и 7 относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 6 и, по меньшей мере, два сегмента генома, выбранные из группы, включающей сегмент 1, сегмент 2, сегмент 3, сегмент 4, сегмент 7 и сегмент 8, относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 6 и, по меньшей мере, два сегмента генома, выбранные из группы, включающей сегмент 1, сегмент 2, сегмент 3 и сегмент 4, относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 6 и, по меньшей мере, три сегмента генома, выбранные из группы, включающей сегмент 1, сегмент 2, сегмент 3, сегмент 4, сегмент 7 и сегмент 8, относятся к генотипу II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 6 и, по меньшей мере, три сегмента генома, выбранные из группы, включающей сегмент 1, сегмент 2, сегмент 3 и сегмент 4, относятся к генотипу II.

По меньшей мере, один сегмент генома должен принадлежать к генотипу I, чтобы обеспечить защиту или лечение от инфекции вирусом ISA, предпочтительно вирусом ISA генотипа I. Предпочтительно, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, два сегмента генотипа I, более предпочтительно, по меньшей мере, 2-7 сегментов относятся к генотипу I, более предпочтительно, по меньшей мере, 3-6 сегментов относятся к генотипу I, более предпочтительно, по меньшей мере, 4-5 сегментов относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, вирус ISA содержит 2-6 сегментов генотипа I, более предпочтительно, вирус ISA содержит 2-5 сегментов генотипа I.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 5 относится к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 8 относится к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантов осуществления, по меньшей мере, сегмент 7 относится к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 3 относится к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 5 и 8 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 5 и 7 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 5 и 3 являются генотипом I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 7 и 8 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 3 и 7 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 3 и 8 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент 5, 7 и 8 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантов осуществления, по меньшей мере, сегменты 5, 7 и 3 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантов осуществления, по меньшей мере, сегменты 5, 3 и 8 относятся к генотипу I. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или его вариантов осуществления, по меньшей мере, сегменты 3, 5, 7 и 8 относятся к генотипу I.

В предпочтительном варианте изобретения и его вариантах осуществления, реассортированный вирус обеспечивает защиту от заражения вирусом ISA генотипа I. В предпочтительном варианте изобретения и его вариантах осуществления, реассортированный вирус обеспечивает защиту от заражения вирусом ISA генотипа II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и его вариантах осуществления, реассортированный вирус обеспечивает защиту от заражения вирусом ISA генотипа I и генотипа II.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, один сегмент генома генотипа I имеет чилийское происхождение. Сегмент чилийского происхождения означает, что сегмент происходит от чилийского штамма. В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, два сегмента генома генотипа I чилийского происхождения. В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, три сегмента генома генотипа I чилийского происхождения. В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, четыре сегмента генотипа I чилийского происхождения.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, один сегмент генома генотипа II канадского происхождения. Сегмент канадского происхождения означает, что сегмент получен из канадского штамма. В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, два сегмента генома генотипа II канадского происхождения. В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, три сегмента генома генотипа II канадского происхождения. В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, реассортированный вирус ISA содержит, по меньшей мере, четыре сегмента генотипа II канадского происхождения.

Геномная организация вируса ISA известна (см., например, Clouthier et al. J. Gen. Virol 2002; 421-428).

Было идентифицировано восемь сегментов геномной вирусной РНК длиной от 1,0 до 2,4 т.п.н.

Каждый сегмент кодирует следующие белки

Сегмент Кодируемый белок 1 Полимераза (PB2) 2 Полимераза (PB1) 3 Нуклеопротеин (NP) 4 РНК полимераза (РА) 5 Слияние (F) 6 Гемагглютинин-эстераза (HE) 7 неструктурные белки (NS1, NS2) 8 Матричные белки (M1, M2)

Генотип и происхождение сегмента генома можно легко определить с помощью ОТ-ПЦР и/или филогенетического анализа, см., например, экспериментальный раздел. Сегменты ISAV, включая его генотип и происхождение, были определены несколько раз (см., например, Kibenge et al. 2001, J. Gen Virol, 82, p2869-2879; Kibenge et al. 2016 Virology Journal 13:3; Cottet et al. J. Virol, 2010, p11916-11928). В настоящем документе описаны праймеры и зонды для различных сегментов. Филогенетический анализ предоставляет информацию о региональном происхождении и/или генотипе путем выравнивания последовательностей с помощью хорошо известных способов, таких как Clustal X, и последующего создания филогенетических деревьев с помощью хорошо известных способов, таких как Clustal X.

Последовательность каждого сегмента ISAV можно определить и затем сравнить с другими известными последовательностями ISAV (например, в Genbank) и классифицировать как определенный генотип, используя, например, BLASTN. Члены одного и того же генотипа имеют сходство 90% или выше, тогда как представители двух разных генотипов имеют сходство ниже 90%, ниже 85% и даже ниже 80%. Было обнаружено, что особенно сегменты 2, 6 и 8 обеспечивают наилучшее определение генотипа. Кроме того, используя только внеклеточную область гемагглютинина, европейские изоляты можно разделить на подгруппы (Cottet et al. Virus Research 155 (2011) 10-19).

Например, используя праймер SEQ ID NO: 10 (прямой праймер сегмента 6 генотипа II,) и праймер SEQ ID NO: 11 (обратный праймер сегмента 6 генотипа II), получают ампликон сегмента 6. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа II ISAV или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа I ISAV.

Например, используя праймер SEQ ID NO: 7 (прямой праймер сегмента 6 генотипа I) и праймер SEQ ID NO: 8 (обратный праймер сегмента 6 генотипа I), получают ампликон сегмента 6. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа II ISAV.

В варианте осуществления настоящего изобретения и/или его вариантах осуществления, генотип сегмента 6 определяется SEQ ID NO: 7 и 8 и SEQ ID NO: 10 и 11. Если ампликон, полученный с помощью этих праймеров, имеет более 90% идентичность с сегментом 6 генотипа II ISAV, то сегмент 6 является генотипом II. Если ампликон, продуцируемый этими праймерами, имеет более 90% идентичность с сегментом 6 генотипа I ISAV, то сегмент 6 является генотипом I.

Подходящее сравнение сегмента 6 можно провести для генотипа II, например, с NC_006499.

Также для других сегментов можно определить генотип.

Сегмент 1:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 16 (прямой праймер сегмента 1) и праймер SEQ ID NO: 17 (обратный праймер сегмента 1), получают ампликон сегмента 1. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 1 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 1 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 1 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 1 генотипа II ISAV.

Сегмент 2:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 18 (прямой праймер сегмента 2) и праймер SEQ ID NO: 19 (обратный праймер сегмента 2), получают ампликон сегмента 2. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 2 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 2 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 2 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 2 генотипа II ISAV.

Сегмент 3:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 20 (прямой праймер сегмента 3) и праймер SEQ ID NO: 21 (обратный праймер сегмента 3), получают ампликон сегмента 3. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 3 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 3 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 3 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 3 генотипа II ISAV.

Сегмент 4:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 22 (прямой праймер сегмента 4) и праймер SEQ ID NO: 23 (обратный праймер сегмента 4), получают ампликон сегмента 4. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 4 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 4 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 4 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 4 генотипа II ISAV.

Сегмент 4:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 24 (прямой праймер сегмента 4) и праймер SEQ ID NO: 25 (обратный праймер сегмента 4), получают ампликон сегмента 4. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 4 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 14 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 4 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 4 генотипа II ISAV.

Сегмент 5:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 26 (прямой праймер сегмента 5) и праймер SEQ ID NO: 27 (обратный праймер сегмента 5), получают ампликон сегмента 5. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 5 генотипа II ISAV, или имеет менее чем 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 5 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 5 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 5 генотипа II ISAV.

Сегмент 6:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 28 (прямой праймер сегмента 6) и праймер SEQ ID NO: 29 (обратный праймер сегмента 6), получают ампликон сегмента 6. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 6 генотипа II ISAV.

Сегмент 7:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 30 (прямой праймер сегмента 7) и праймер SEQ ID NO: 31 (обратный праймер сегмента 7), получают ампликон сегмента 7. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 7 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 7 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 7 генотипа I ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 7 генотипа II ISAV.

Сегмент 8:

Например, используя праймер SEQ ID NO: 32 (прямой праймер сегмента 8) и праймер SEQ ID NO: 33 (обратный праймер сегмента 8), получают ампликон сегмента 8. Если этот сегмент относится к генотипу II, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 8 генотипа II ISAV, или имеет менее 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 8 генотипа I ISAV. Если этот сегмент относится к генотипу I, то этот ампликон имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с другими сегментами 8 генотипа I ISAV, или имеет менее чем 85% или даже менее 80% идентичность последовательности с другими сегментами 8 генотипа II ISAV.

Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления относится к вакцинной композиции, содержащей реассортированный вирус ISA в соответствии с любым вариантом осуществления, как описано в настоящем документе.

Подходящим образом, вакцину используют для лечения или защиты рыб от ISA. Вакцину целесообразно использовать для защиты рыб от ISA. Подходящая вакцина содержит реассортированный вирус по изобретению и/или любой его вариант, живой, убитый, аттенуированный или иной. Предпочтительно, вакцина содержит убитый или аттенуированный реассортированный вирус по изобретению и/или любому его варианту осуществления. Предпочтительно, вакцина содержит инактивированный реассортированный вирус ISA по изобретению и/или любому его варианту осуществления.

Вакцина может необязательно содержать один или несколько адъювантов и/или фармацевтически приемлемых ингредиентов. Вакцина по настоящему изобретению и/или ее варианты осуществления могут быть приготовлены в форме водного раствора, эмульсии масло-в-воде или суспензии в фармацевтически приемлемом носителе, таком как солевой раствор, фосфатно-солевой буфер (PBS) или любой другой фармацевтически приемлемый носитель. Адъюванты могут содержать сигнальные молекулы, включая цитокины, хемокины, иммуностимулирующие молекулы, агонисты Toll-подобных рецепторов или ингибиторы иммунодепрессивных путей. Также могут быть использованы традиционные адъюванты, включая убитые бактерии, бактериальные компоненты, такие как LPS, соли алюминия, масляные эмульсии, частицы полисахаридов, липосомы и биополимеры. В подходящих системах используются наночастицы на основе биоразлагаемых полимеров. Могут быть использованы синтетические полимеры, такие как поли(винилпиридин), полилактид-со-гликолиды (PLG) и полилактид-со-гликолидная кислота (PLGA).

Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в составе вакцины по изобретению, должны быть стерильными и физиологически совместимыми, например, стерильная вода, солевой раствор, водные буферы, такие как PBS, спирты, полиолы и подобные. Указанная вакцина может также содержать другие добавки, такие как адъюванты, стабилизаторы, антиоксиданты, консерванты и подобные. Доступные адъюванты включают, но не ограничены ими, соли или гели алюминия, карбомеры, неионогенные блок-сополимеры, токоферолы, мурамилдипептид, масляные эмульсии, цитокины и т.д. Количество адъюванта, которое может быть добавлено, зависит от природы адъюванта. Стабилизаторами, доступными для использования в вакцинах по изобретению, являются, например, углеводы, включая сорбит, маннит, декстрин, глюкозу и белки, такие как альбумин и казеин, и буферы, такие как щелочная фосфатаза. Доступные консерванты включают, среди прочего, тимеросал, мертиолат и гентамицин.

Вакцины, содержащие инактивированные вирусные антигены, часто требуют иммуностимулятор для оптимальной эффективности: адъювант. В качестве эксципиента, такой адъювант должен быть фармацевтически приемлемым и экономически эффективным. Хорошо известными адъювантами, используемыми в вакцинах для рыб, являются: соли алюминия, липосомы, глюканы, альгинаты и, в частности: масла.

Вакцина по изобретению и/или ее варианты могут быть получены с использованием обычных способов, известных специалисту в данной области техники. В одном варианте осуществления, указанную вакцину получают путем получения реассортированного вируса ISA по изобретению и/или любых его вариантов осуществления, и последующего смешивания его с маслом с образованием эмульсии. Вирус ISA предпочтительно инактивирован. В подходящем варианте осуществления, используют культуру вируса ISA. Соответственно, культура вируса ISA может быть концентрирована или разведена в зависимости от титра вируса и требуемой дозы. Альтернативно, вирус ISA сначала очищают от культуральной среды. Вирус ISA подходящим образом смешивают с маслом для образования эмульсии. Подходящими эмульсиями являются эмульсии вода-в-масле (В/М), эмульсии масло-в-воде (М/В) и эмульсии вода-в-масле-в-воде (В/М/В) и микроэмульсии. Подходящими маслами являются минеральные масла, не минеральные масла и синтетические масла. Могут быть добавлены дополнительные адъюванты, такие как лиганды Toll-рецепторов и цитокины.

Для создания и сохранения такой эмульсии требуется приложение и механической, и химической энергии: отдельные жидкости смешиваются в соответствующем устройстве с использованием определенных уровней силы сдвига, давления и температуры для диспергирования одной фазы в другую. Химическая энергия обеспечивается с помощью эмульгатора (также: поверхностно-активного вещества), который стабилизирует диспергированную фазу, занимая положение на границе раздела воды и масла. Вакцинная эмульсия может состоять из одного или нескольких адъювантов с одним или несколькими эмульгаторами.

Доступно большое количество эмульгаторов для использования в эмульсионных вакцинах, и постоянно разрабатываются новые. Краткий обзор этой области был сделан Ascarateil & Dupuis (2006, Vaccine vol. 24S2, p.S2/83 - S2/85).

Примерами комбинаций адъювантов и эмульгаторов, используемых в коммерческих ветеринарных вакцинах, являются: Amphigen® (Zoetis), содержащий легкое минеральное масло с лецитином в качестве эмульгатора; Xsolve® (ранее называвшийся: Microsol-Diluvac Forte®, MSD Animal Health), который содержит комбинацию адъювантов легкого минерального масла и ацетата витамина Е с эмульгатором Tween® 80 (Polysorbate 80 или моноолеат полиоксиэтиленсорбитана); и MetaStim® (Zoetis), включающий сквалан, Pluronic® (неионогенный тройной блок-сополимер блоков полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и Tween 80.

Вакцина по настоящему изобретению и/или ее варианты осуществления могут содержать другие патогены рыб, выбранные из группы, состоящей из альфа-вируса лосося (SAV), вируса инфекционного гемоэтического некроза (IHNV), вируса озерной тилапии (TLV), реовируса рыб (PRV), вируса кардиомиопатии (CMV), вируса эпизоотического гемопоэтического некроза (EHNV), Piscirickettsia, Franciscella, Aeromonas, Vibrio, Moritella, Edwardsiella, Flexibacter, Pasteurella, Cytophaga, патогена Coryne, патогена Renia, Arthrobacter, патогена Flavoa, патогена Fusarium, Bacillus, Yersinia, патогена Myco, Neorickettsia, Listonella, Flexibacter, Streptococcus, Shewanella, Pseudomonas, патогена Photo, Clostridium, Tenacibaculum, Lactococcus, Leucothrix и Nocardia.

Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления относится к способу получения реассортированного вируса ISA в соответствии с любым вариантом осуществления, описанным в настоящем документе, включающему стадии

(i) заражения культуры-хозяина штаммом вируса ISA генотипа I и штаммом вируса ISA генотипа II;

(ii) культивирования культуры-хозяина для получения реассортированного вируса ISAV и

(iii) определения того, имеет ли реассортированный вирус ISAV сегмент 6 генотипа II и, по меньшей мере, еще один сегмент генотипа I.

Реассортированный вирус ISA может быть получен путем совместного культивирования вируса ISA генотипа I и вируса ISA генотипа II. Для вирусов гриппа А было известно, что они обладают уникальной способностью подвергаться высокой степени антигенной изменчивости в течение короткого периода времени. Среди антигенов HA и нейраминидазы (NA) вирусов гриппа А наблюдаются значительные различия. В случае изолятов ISAV, информация об антигенной изменчивости отсутствует (Kibbenge 2001 J. Gen. Virol 82). Однако оказалось, что для получения реассортированного вируса ISA подходят те же способы, что и для реассортированного вируса гриппа А. После совместного культивирования селектируют вирус ISA с сегментом 6 генотипа II. ПЦР можно использовать для селектирвоания вируса с сегментом 6 из генотипа II. Праймеры и зонды, как описано Kibenge et al. 2001, J. Gen Virol, 82, p2869-2879; Kibenge et al. 2016 Virology Journal 13:3; или Cottet et al. J. Virol, 2010, p11916-11928, а также праймеры, использованные в экспериментальной части, как описано в настоящем документе. Вирусы совместно культивируют в культуре адгезивных клеток или в суспензионной культуре клеток. Предпочтительно, вирусы совместно культивируют в культуре адгезивных клеток. Подходящей культурой-хозяином являются клетки CHSE-214. Предпочтительно, вирусы совместно культивируют в бессывороточной среде.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, способ получения реассортированного вируса ISA включает дополнительную стадию (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii). Полученный таким образом вирус также может быть дополнительно культивирован в суспензии клеток и/или в бессывороточной среде. Культивирование на суспензии клеток и/или бессывороточной среде также можно использовать для селекции реассортированного вируса по изобретению и/или любому варианту его осуществления.

Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления относится к способу культивирования реассортированных ISA, включающему

(i) заражение культуры-хозяина реассортированным вирусом в соответствии с любым вариантом осуществления, как описано в настоящем документе

(ii) культивирование хозяина со стадии (i) для продуцирования дополнительного вируса.

Предпочтительно, реассортированные вирусы ISA культивируют в суспензионной культуре-хозяине. Реассортированные вирусы ISA предпочтительно культивируют в бессывороточной среде. Подходящей культурой-хозяином является суспензия клеток CHSE-214. Предпочтительно, реассортированные ISA культивируют в бессывороточной среде на суспензии клеток CHSE-214.

Суспензионные клетки рыб хорошо известны специалисту в данной области техники. Адгезивные клетки, такие как многие клетки рыб, могут стать суспензионными клетками при выращивании в суспензионной культуральной среде. Клетки, прилипшие к стенке контейнера, обрабатывают смешанным раствором трипсина и ЭДТК по общепринятой методике, и отделяют. После получения плавающих клеток таким образом, клетки культивируют, приспосабливая их к среде для суспензионных культур. Среда для суспензионных культур является коммерчески доступной, например MEM среда Игла для суспензионных культур и среда Игла модифицированная по Джоклику.

JPH1066563 описывает получение клеточной линии суспензионной культуры из рыб таким способом. Была разработана линия клеток суспензионной культуры эпителиомы карпа (клетки EPC/NIAH) и линия клеток суспензионной культуры почек японского угря (клетки EK-1/NIAH).

Клетки рыб, такие как клетки CHSE лосося и клетки FHMP карпа, можно выращивать в бессывороточной среде путем повторения и селекции клеток, которые хорошо растут в среде со все более низким содержанием сыворотки, до тех пор, пока в среде не будет сыворотки.

JP2003219873 описывает, что суспензии клеток CHSE-214 можно культивировать в бессывороточной среде, и что их можно хранить при низкой температуре, такой как около 4 градусов Цельсия.

Shea and Berry (In Vitro vol 19, no. 11, (1983), p818-825) описывают, что ряд клеточных линий рыб можно выращивать на бессывороточной среде, включая клетки CHSE-214, и они способны поддерживать репликацию вируса золотой рыбки-2 на уровнях, эквивалентных клеткам, выращенным в среде с сывороткой.

В JP2003219873 описаны клетки CHSE-214, которые растут в суспензии и могут культивироваться в бессывороточной среде. Кроме того, сообщалось о других клетках рыб, способных расти в суспензии. Один представляет собой способ культивирования клеток CHSE-214 в суспендированном культуральном растворе EMEM-S, содержащем карбоксиметилцеллюлозу (Lidgerding, Develop.Biol. Standard, 49, 233-241 (1981)), и другой представляет собой способ с использованием MB752/1 среда Waymouse без CaCl2 (Hasobe M., et al., Bull. Eur. Asso. Fish Pathol., 11, 142-144 (1991)).

JP2003219873 описывает, что суспензионные клетки CHSE-214 можно культивировать в бессывороточной культуре с добавлением гидролизата лактальбумина в качестве заменителя сыворотки. Подходящей средой является среда Waymouth MB752/1 без добавления CaCl2, 14 мМ Hepes (доведение pH с помощью NaOH), добавляют 10% водный раствор гидролизата лактальбумина 5% и 0,06 г/л канамицина. Среда имеет рН 7,4.

Бессывороточная среда коммерчески доступна. В качестве заменителей сыворотки или альбумина можно использовать экстракты дрожжей или гидролазаты глютена пшеницы. WO 99/57246 описывает бессывороточную среду для культивирования клеток, полностью лишенную животных белков и липидов. В настоящем документе, белок получают из риса, сои, картофеля, кукурузы и алоэ вера, и липиды получают из риса, сои, картофеля, кукурузы и алоэ вера, а также из бактерий, дрожжей и грибов.

В одном варианте осуществления изобретения и/или его вариантах осуществления, способ выращивания реассортированного вируса ISA дополнительно включает стадию (iii) очистки вируса, продуцированного на стадии (ii).

Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления, относится к реассортированному вирусу ISA по изобретению и/или любому его варианту осуществления для применения в способе вакцинации рыб против вируса ISA. Другой аспект изобретения и/или его варианты осуществления относится к реассортированному вирусу ISA по изобретению и/или любому его варианту осуществления для применения в способе защиты рыб от заражения вирусом ISA. Другой аспект изобретения и/или его вариантов осуществления относится к способу лечения для защиты от инфицирования вирусом ISAV путем введения реассортированного вируса ISA по изобретению и/или любому его варианту осуществления.

В предпочтительном варианте изобретения и его вариантах осуществления, реассортированный вирус обеспечивает защиту от заражения вирусом ISA генотипа I. В предпочтительном варианте изобретения и его вариантах осуществления, реассортированный вирус обеспечивает защиту от заражения вирусом ISA генотипа II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и его вариантах осуществления, реассортированный вирус обеспечивает защиту от заражения вирусом ISA генотипа I и генотипа II. Преимущественно, реассортированный вирус ISA по изобретению и/или любые его варианты осуществления обеспечивают защиту и могут быть использованы для лечения инфекции вируса ISA генотипа I и генотипа II.

Соответственно, рыба представляет собой лососевых. К лососевым относятся лосось, форель, гольцы, пресноводные сиги и хариусы. Подходящей рыбой является лосось, форель или голец. Подходящей рыбой является лосось или форель. Подходящей рыбой является лосось, и наиболее подходящей, атлантический лосось (Salmo salar).

Используемые в настоящем документе термины «защищающий» или «обеспечивающий защиту» и «способствующий защите» не требуют полной защиты от любого признака инфекции. Например, «помощь в защите» может означать, что защита достаточна для того, чтобы после заражения симптомы основной инфекции, по меньшей мере, уменьшились, и/или чтобы одна или несколько основных клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих симптомы, уменьшались и/или устранялись. Понятно, что «уменьшенный», как используется в этом контексте, применяется относительно состояния инфекции, включая молекулярное состояние инфекции, а не только физиологическое состояние инфекции. Защита от ISAV означает уменьшение хотя бы одного из симптомов, выбранных из группы, состоящей из тяжелой анемии, асцита, кровоизлияния во внутренние органы и потемнения печени. Защита от ISAV может также означать снижение смертности после заражения ISAV.

Предпочтительно, снижается, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, один из симптомов, выбранных из группы, состоящей из тяжелой анемии, асцита, кровоизлияния во внутренние органы и потемнения печени. Более предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или даже на 95% снижается, по меньшей мере, один из симптомов, выбранных из группы, состоящей из тяжелой анемии, асцита, кровоизлияния во внутренние органы и потемнения печени, по сравнению с рыбой, инфицированной ISAV и не обработанной реассортированным вирусом по настоящему изобретению и/или его вариантами осуществления.

Подходящая защита означает снижение смертности, по меньшей мере, на 10% по сравнению с рыбой, инфицированной ISAV и не обработанной реассортированным вирусом ISA по настоящему изобретению и/или любому его варианту осуществления. Более предпочтительно, имеется, по меньшей мере, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или даже 95% снижение смертности по сравнению с рыбой, инфицированной ISAV и не обработанной реассортированным вирусом ISA по настоящему изобретению и/или любому его варианту осуществления. Подходящим образом, имеется снижение смертности от 100% до 20%, более предпочтительно, снижение смертности от 30% до 90%, более предпочтительно, снижение смертности от 35% до 85%, более предпочтительно, снижение смертности от 40% до 80%, более предпочтительно, снижение смертности от 45% до 75%, более предпочтительно, снижение смертности от 50% до 70%, более предпочтительно, снижение смертности от 55% до 65%.

«Введение» вакцины по изобретению рыбе-мишени может быть осуществлено с использованием любого возможного способа и пути. Как правило, оптимальный способ введения будет определяться типом применяемой вакцины, а также характеристиками мишени и бактериального заболевания, от которого она предназначена защищать. В зависимости от того, основана ли вакцина по изобретению на эмульсии М/В или В/М, могут применяться различные методы введения. Например, в виде эмульсии М/В вакцина по изобретению может вводиться энтерально или через слизистую оболочку, т.е. в виде глазных капель, капель в нос, оральных, энтеросолюбильных, рото-назальных капель, спрея. Другой возможностью является способ массового введения, такой как питьевая вода, грубое распыление, распыление, кормление и т.д.

Предпочтительным способом введения для способа вакцинации по изобретению является парентеральный путь. «Парентеральное» относится к введению через кожу, например, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным, подслизистым или подкожным путем.

Объем дозы вакцины по изобретению и/или его вариантам осуществления, например, при введении парентеральным путем, представляет собой объем, приемлемый для рыбы-мишени, и может, например, составлять от примерно 0,01 мл до примерно 5 мл. Предпочтительно, одна доза имеет объем от 0,02 мл до 2 мл, более предпочтительно, одна доза составляет от 0,05 мл до 1 мл, более предпочтительно, от 0,1 мл до 0,5 мл.

При внутримышечном введении, объем одной дозы предпочтительно составляет от примерно 0,05 до примерно 2 мл, более предпочтительно, от 0,1 до 1 мл.

В одном варианте осуществления вакцина содержит на дозу от 5 до 500 единиц HA вируса ISA, более предпочтительно, от 10 до 200 единиц HA вируса ISA, более предпочтительно, от 15 до 150 единиц HA, более предпочтительно, от 20 до 100 единиц HA, более предпочтительно, от 25 до 90 единиц НА, более предпочтительно, от 30 до 85 единиц НА, более предпочтительно, от 35 до 80 единиц НА, более предпочтительно, от 40 до 75 единиц НА, более предпочтительно, от 45 до 70 единиц НА, более предпочтительно, от 50 до 65 единиц НА, более предпочтительно, от 55 до 60 единиц HA.

Единицы НА (HAU) являются единицами гемагглютинации и могут быть определены хорошо известными способами. Одним из таких способов является измерение степени агглютинации вируса с эритроцитами (RBC) в серийном разведении. HAU можно определить путем измерения OD₄₉₂. Гемагглютинирующий (НА) титр рассчитывают при OD₄₉₂₌1,5. Если ни одно из разведений, использованных при титровании, не дает OD точно 1,5, титр находят путем интерполяции между самым высоким разведением с OD<1,5 и самым низким разведением, дающим OD>1,5:

Титр при OD1,50 (TOD1,5)=(1,5 - b) / a

где

а=(Y2 - Y1) / (X2 - X1)

b=Y1 - а * X1

X1: Наименьшее разведение, дающее OD>1,5.

Y1: OD при X1 (T>1,5)

X2: Максимальное разведение, дающее OD<1,5.

Y2: OD при X2 (T<1,5)

Конечная концентрация HAU/мл в образце выражается относительно эталонного стандарта с заданным значением (4000 HAU/мл) по формуле:

Изобретение далее будет описано с помощью следующих неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Выделение ISAV

Изоляты ISAV норвежского, чилийского и канадского происхождения культивируют в адгезивных клетках CHSE-214 и подвергают скринингу (косвенно) на повышенные уровни репликации с помощью ПЦР в реальном времени. Культуры-кандидаты ISAV с высоким уровнем репликации подвергают предельному разведению и очистке бляшек для получения одиночных клонов ISAV.

Таблица 1. Сводная таблица происхождения и генотипа изолятов ISAV, использованных для культивирования. Изолировать ISA Источник Страна (округ), год Генотип Misund 99 Норвегия (Sogn og Fjordane), 1999 I Fjaler 00 Норвегия (Sogn og Fjordane), 2000 I Eikelandsosen 87 Норвегия (Hordaland), 1987 I Bremnes 98 Норвегия (Hordaland), 1998 I Canada 97 (Bay of Fundy) Канада (New Brunswick), 1997 II CH 0108 Чили (не указано), 2008 I CH 3509 Чили (Region X), 2009 I CH 107-12 Чили (Region X, Quellón), 2008 I

Изоляты сначала выделяют и пассируют один раз в клетках ASK-3 перед инокуляцией в 25 см² колбы для культивирования клеток, содержащих 80% конфлюентный слой клеток CHSE-214 с добавлением 2% FCS сохраняющей среды EMEM.

В целом, данные ПЦР в реальном времени показывают, что изоляты ISA с европейским генотипом демонстрируют незначительные или отсутствие признаков адаптации к повышенной репликации в адгезивных клетках CHSE-214, и, в частности, обнаружено, что чилийские изоляты не способны сохраняться посредством серийных пассажей в клетках CHSE-214. С другой стороны, канадский изолят (Bay of Fundy -97), по-видимому, хорошо адаптируется к репликации в клетках CHSE-214, о чем свидетельствуют значения Ct ОФ ПЦР в реальном времени. Изолят Canada-97 принадлежит к североамериканскому генотипу ISAV, который, как известно, плохо защищает от контрольного заражения ISAV европейского генотипа.

Кроме того, две отдельных пробирки с клеточными культурами одновременно инфицируют смесью ISAV (см. таблицу 2). Для каждого пассажа, супернатант вируса инокулируют на отдельные пробирки с клеточными культурами каждые 12-14 дней в объемном соотношении 1:5 или 1:100. На 6 пассаже, две клеточные культуры (№5 и 8) разделяют на две линии; - одну пассируют дальше в соотношении 1:5 (линии 5 и 8) и одну в соотношении 1:100 (линии 10 и 11; см. таблицу 2).

Таблица 2. Обзор различных вирусных культур/линий с результатами ОТ-ПЦР в реальном времени из выбранных пассажей клеточных культур. Вирусные культуры/линии 1-9 пассируют в соотношении 1:5, тогда как 10 и 11 пассируют в соотношении 1:100. Вирусные культуры/линии 10 и 11 получают из №5 и №8, начиная с уровня пассажа 6 и далее. Пр=прекращено; н/о=не обнаружено. Культура ISAV/№линии Значение Ct в ASK-3 (p1) Значение Ct в CHSE-214 р5 р7 р15 р20 1 Misund 99 21,5 32,4 29,1 27,7 27,8 2 Fjaler 00 21,9 35,2 Пр - - 3 Eikelandsosen 87 21,1 31,5 25,8 28,5 29,9 4 Bremnes 98 21,0 н/о Пр - - 5 Canada 97 23,3 32,2 25,2 Пр - 6 CH 0108 20,2 37,1 Пр - - 7 CH 3509 18,9 н/о Пр - - 8 CH 107-12/Canada 97 (смесь) 22,4 28,3 23,0 23,9 23,3 9 Смесь №1-8 - 30,7 29,1 22,8 24,5 10 Canada 97 (1:100) - - 24,6 25,1 Пр 11 CH 107-12/Canada 97 (смесь) (1:100) - - 22,8 22,2 23,3

Основываясь на результатах ПЦР в реальном времени, три пробирки со смешанной инфекцией (8, 9 и 11 (таблица 2)) считают наиболее перспективными для использования в производственной системе на основе CHSE-214, поскольку они, по-видимому, хорошо адаптированы к росту в клетках CHSE-214. Чтобы проверить, будет ли вирус в этих линиях также защищать от ISA, проводят предварительное исследование эффективности, которое демонстрирует, что тестируемая вакцина, приготовленная с инактивированным вирусом смешанной инфекции CH 107-12/Canada 97 (№11, таблица 2), обеспечивает отличную защиту от повторного заражения ISAV чилийского происхождения.

Скрининг пассажей ISAV в адгезивных клетках CHSE-214

Поскольку вирусный материал из выбранной выше линии (CH 107-12/Canada 97 (№11, таблица 2)) создан в результате одновременного инфицирования двумя различными генотипами ISAV, отдельные вирусные клоны очищают и снова тестируют на высокую репликацию в клетках CHSE-214, а также эффективность защиты от инфекции ISAV чилийского происхождения.

Для каждого пассажа, перед очисткой от бляшек, отбирают образцы материала клеточной культуры (супернатант+клеточный слой) и замораживают при -80°C. Замороженный материал подвергают экстракции РНК (100 мкл) и последующей ОТ-ПЦР в реальном времени для проверки наличия РНК ISAV с использованием собственного анализа TaqMan MGB, направленного на сегмент 8 генома. Низкие значения Ct указывают на высокую репликацию и успешное размножение ISAV.

После предельного разведения и очистки бляшек, идентичность отдельных клонов проверяют с использованием специфических для Чили и Канады анализов ОТ-ПЦР в реальном времени, таргетирующих геномные сегменты ISAV 5 и 6.

Используя 4 мкл матрицы РНК, ISAV генотип-специфичные анализы ОТ-ПЦР в реальном времени проводят на машине ABI 7500 Fast PCR (Applied Biosystems) и для сегмента 5 генома (кодирующего слитый белок), и для сегмента 6 генома (кодирующего гемагглютинин-эстеразу) на основе следующих анализов Taqman MGB (разработанных с помощью программы Primer Express 3.0.1, Applied Biosystems), специфичных для чилийских/европейских и канадских/североамериканских генотипов:

Последовательности праймеров и зондов Taqman MGB для генотип-специфического обнаружения 5 и 6 геномных сегментов ISAV:

ISAV сегмент 5 Анализ чилийского/ европейского seg5 Анализ канадского/ североамериканского seg5 Посл. прямого праймера SEQ ID NO: 1
CGGCCTCGCTAACCAACAT SEQ ID NO: 4
GAGTCGGAGGAGCGTGGTT Посл. обратного праймера SEQ ID NO: 2
CCCAAAGTAAATCCACAGCATTT SEQ ID NO: 5
CGGCACCGTCACCTTGA Посл. зонда Taqman MGB (меченого FAM) SEQ ID NO: 3
ATGGTCTAAATACAACTTC SEQ ID NO: 6
CAAGCCTACTTAAATGGAA ISAV сегмент 6 Анализ чилийского/ европейского seg6 Анализ канадского/ североамериканского seg6 Посл. прямого праймера SEQ ID NO: 7
AAAATCAGGGTAGACGCAATCC SEQ ID NO: 10
CTGCATTGCTGCCTCTTCTG Посл. обратного праймера SEQ ID NO: 8
GAACAGAGCAATCCCAAAACCT SEQ ID NO: 11
CCGCATCCGTTCACCAA Посл. зонда Taqman MGB (меченого FAM) SEQ ID NO: 9
ACCTCAGCTGAACCAA SEQ ID NO: 12
AAACGTAGGCGGAGTCA

Последовательности праймеров и зонда, используемые для анализа ОТ-ПЦР в реальном времени, специфичного для EIV HA (экзогенный внутренний контроль), опубликованы Foord et al: (Foord AJ, Selleck P, Colling A, Klippel J, Middleton D, Heine HG. Real-time RT-PCR for detection of equine influenza and evaluation using samples from horses infected with A/equine/Sydney/2007 (H3N8).; Vet Microbiol. 2009 May 28; 137(1-2):1-9)

Анализ EIV HA Посл. прямого праймера SEQ ID NO: 13
CAGCGCTTTCAGCAATTGC Посл. обратного праймера SEQ ID NO: 14
GAYCGGAGCGATGCATAGTC Посл. зонда Taqman MGB (меченого VIC) SEQ ID NO: 15
CCCATATGACATCCC

Более 200 клонов из анализа очистки от бляшек тестируют на наличие комбинации сегментов 5 и 6 генома. Из них отбирают 4 различных клона (таблица 3) на основе комбинации чилийских и канадских сегментов 5 и 6 генома.

Таблица 3. Генотипирование RT-PCR в реальном времени сегментов 5 и 6 генома клонов ISAV 4, 22, 77 и 93. Все 4 клона получают из вирусного материала, собранного из культуры/линии ISAV №11 на уровне пассажа 15 или 20. Выполняют дополнительные 5 пассажей в культуре клеток CHSE-214, включая стадии, включающие предельное разведение и очистку бляшек. Клон ISAV Сегмент 5 генома Сегмент 6 генома Вирусный материал №культуры/линии ISAV Уровень пассажа* Клон 4 II II 11 Р25 [Р20+5] Клон 22 I II 11 Р25 [Р20+5] Клон 77 I II 11 Р20 [Р15+5] Клон 93 I I 11 Р20 [Р15+5] * Конечный уровень пассажей подлежит генотипированию с указанием количества пассажей до и после очистки от бляшек.

Клоны в таблице 3 тестируют на репликацию в клетках CHSE-214, суспензионных клетках CHSE-214, выход антигена (HA), а также в испытаниях эффективности после составления, вакцинации и контрольного заражения ISAV.

Выращивание в суспензионных клетках CHSE 214

Клоны из таблицы 3 тестируют на репликацию в адгезивных клетках CHSE 214 и суспензионных клетках CHSE 214.

Адгезивные клетки CHSE-214 высевают в культуральную колбу или роллер-флакон при концентрации 8×10⁴ клеток/см² в культуральной среде и инкубируют при 20°С. Клетки пассируют каждые 6-8 дней. Сбор вирусной культуры из роллер-флаконов и культуральных колб производят с использованием стеклянных шариков, чтобы включить все клетки в сбор.

Биореактор, содержащий суспензию клеток CHSE-214 и бессывороточную среду, инфицируют ISAV с MOI 0,01 и инкубируют при 14°C. Через 14-20 дней вирус собирают.

Клон ISAV Сегмент 5 генома Сегмент 6 генома Рост на адгезивных CHSE-214 Рост на суспензии CHSE-214 Клон 4 II II Д Д Клон 22 I II Д Д Клон 77 I II Д Д Клон 93 I I Д Н

Только клоны с геномным сегментом 6 из Северной Америки, генотипа II, способны расти на суспензионных клетках.

Эффективность вакцины

Двенадцать групп (35 рыб/группу) пред-смолта атлантического лосося вакцинируют в/б разными составами, содержащими ISA-компонент или солевым раствором (отрицательный контроль). Рыб содержат в двух 500 л пресноводных аквариумах (один аквариум с 5 тестируемыми группами, одной группой отрицательного контроля и одной группой положительного контроля (вакцина на основе антигена Bremnes 98 (норвежский изолят), и второй резервуар с 4 тестируемыми группами, одной группой отрицательного контроля и двумя группами положительного контроля (вакцина на основе антигена Bremnes 98)) в течение 6 недель до заражения симбиозом с ISAV (15% отнерестившихся рыб). Смертность регистрируют ежедневно в течение 49 дней после контрольного заражения. Количественное определение антигенов ISA проводят с помощью теста титрования гемагглютинации и/или теста ELISA массы антигенов, следуя стандартным процедурам.

Композиции вакцин:

Составы вода-в-масле (45/55) с адъювантом (минеральное масло; полноразмерный инактивированный ISAV, 50 мкл на дозу, см. таблицу 4

Таблица 4 Состав вакцины вакцина Антигенный штамм Сегмент 5 генома Сегмент 6 генома Вирусный материал ISAV культура Доза HAU 1 Клон 4 II II Суспензия CHSE-214 107 2 Клон 4 II II Суспензия CHSE-214 40 3 Клон 22 I II Суспензия CHSE-214 107 4 Клон 22 I II Суспензия CHSE-214 40 5 Клон 77 I II Суспензия CHSE-214 110 6 Клон 77 I II Суспензия CHSE-214 40 7 Клон 93 I I Адгезивные CHSE-214 85 8 Клон 93 I I Адгезивные CHSE-214 40 9 Норвежский изолят Eikelandsosen H1/87 I I Суспензия CHSE-214 0 Контроль 1 Норвежский изолят Bremnes-98 I I Адгезивные клетки SHK-1 89 Контроль 2 Норвежский изолят Bremnes-98 I I Адгезивные клетки SHK-1 52 Контроль 3 Солевой раствор

Материалом для контрольного заражения является чилийский штамм ISAV CH0108 180509, вводимый внутримышечно в дозе 1,5х10² TCID₅₀/рыбу 0,05 мл.

Рыба, атлантический лосось, 30-35 грамм, по 245 рыб+44 отнерестившихся рыб на аквариум.

Вакцину вводят внутрибрюшинно из расчета 0,05 мл на рыбу. Рыб вакцинируют и через 6 недель повторно заражают введением отнерестившихся рыб.

Смертность регистрируют ежедневно в течение 49 дней после контрольного заражения (конечная точка) и наносили на график отдельно как суммарную долю смертности. Эффективность вакцины выражают как относительную долю выживаемости (RPS) с использованием рыбы, которой вводят солевой раствор, в качестве контрольной группы, и рассчитывают как RPS_EP, относительную долю выживаемости вакцинированных в конечной точке

RPS=(1-М_вакц/М_конт)×100

M_вакц=суммарная смертность вакцинированной группы

M_контр=суммарная смертность контрольной группы

Полученные результаты:

Эксперимент по контрольному заражению является успешным, получают смертность, близкую к 100% (высокая/очень высокая при повторном заражении в группе контрольных групп). Вскрытие мертвой или умирающей рыбы показало клинические признаки и грубую патологию, соответствующие инфекции ISAV.

Данные о выживании для каждой группы показаны в таблице 5.

Все группы вакцинации продемонстрировали высокую степень защиты от ISA, за исключением группы Eikelandsosen, у которой RPS_EP составляет 21% (точное значение Фишера />,=0,275). Группы, вакцинированные любым клоном ISA 77 или 93 демонстрируют наивысшую степень защиты (100% RPS) в группах с дозой 40 HAU.

Таблица 5 Суммарные данные о смертности в аквариумах 1 и 2 для контрольной группы и тестируемых вакцин. Аквариум 1 Группа Антиген вакцины ISA Доза ISA HA (EU) Мертвые/
живые RPS_EP р значение теста Фишера по сравнению с солевым раствором 1 Клон 4 107 5/30 85 Р<0,0001 2 Клон 4 40 2/33 94 Р<0,0001 3 Клон 22 89 0/35 100 Р<0,0001 4 Клон 22 40 3/32 91 Р<0,0001 5 Eikelandsosen 27/8 21 Р<0,05 6 Bremnes-98 (12,5) 2/33 94 Р<0,0001 7 Солевой раствор 34/1 Аквариум 2 Группа Антиген вакцины ISA Доза ISA HA (EU) Мертвые/
живые RPS_EP р значение теста Фишера по сравнению с солевым раствором 8 Клон 77 110 1/34 96 Р<0,0001 9 Клон 4 40 0/35 100 Р<0,0001 10 Клон 22 85 0/35 100 Р<0,0001 11 Клон 22 40 0/35 100 Р<0,0001 12 Bremnes-98 52,5 1/34 96 Р<0,05 13 Bremnes-98 (12,5) 2/33 92 Р<0,0001 14 солевой раствор 25/10

Генотипирование клона 77

Генотипирование и характеризация всех клонов77 суммированы в таблице 6 ниже. Это показывает, что клон 77 представляет собой новый реассортированный вирус ISA, полученный в результате смешения геномных сегментов после коинфицирования клеток CHSE-214 двумя изолятами ISAV CH 107-12 и Canada 97.

Таблица 6 Обзор генотипов I или II, определенных для каждого из 8 сегментов геномной РНК клона 77. Сегмент Кодируемый белок Генотип 1 Полимераза (PB2) II 2 Полимераза (PB1) II 3 Нуклеопротеин (НП) II 4 РНК полимераза (РА) II 5 Слияние (F) I 6 Гемагглютинин-эстераза (HE) II 7 Неструктурные белки (NS1, NS2) II 8 Матричные белки (M1, M2) I

Таблица 7 Наборы праймеров для ПЦР, используемые для амплификации частей 8 геномных сегментов клона 77 и соответствующий размер ампликона. Сегмент Прямой праймер
(наименование/ последовательность) Обратный праймер
(наименование/ последовательность) Размер ампли кона 1 SEQ ID NO: 16
GTAATGCACCTAAAGGGCAC SEQ ID NO: 17
CCTCCTTCACTYCTTACTGRAA 583 п.н. 2 SEQ ID NO: 18
GCAACAGGTTTCAGRGGAAGA SEQ ID NO: 19
GTRAACACTGCTCTCGGCT 245 п.н. 3 SEQ ID NO: 20
YATGAGGAACTGCGGAGGAG SEQ ID NO: 21
GCTGTTGCAACCATTGACAC 438 п.н. 4 SEQ ID NO: 22
TACACAGRGCGACMACAACS SEQ ID NO: 23
CAYRCTYCCCACAACACCCC 500 п.н. 4 SEQ ID NO: 24
ACACCGATCAGCACATG SEQ ID NO: 25
TGGCCCTCCTCTGTAAGGAA 228 п.н. 5 SEQ ID NO: 26
GGAGTGCTCCTGGAGGTGTA SEQ ID NO: 27
CCTCTGGTGGACATCCTCTG 366 п.н. 6 SEQ ID NO: 28
AGCGCTGAAGTATCCGCATCCGTTCACCAAGTTG SEQ ID NO: 29
ACCAACCTTCGTGGGAGCAGCTGAGC 211 п.н. 7 SEQ ID NO: 30
GYCTTACTGARAYGGGRTCA SEQ ID NO: 31
TGAGRTASCAKCCKCCCCAG 450 п.н. 8 SEQ ID NO: 32
CGACGATGACTCTCTACTGTGTGAT SEQ ID NO: 33
TGCATCCTGCTGYGYAGCAT 223 п.н.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>Intervet International BV

<120>РЕАССОРТИРОВАННЫЙ ВИРУС ISA

<130>24907

<160>33

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>19

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>1

cggcctcgct aaccaacat 19

<210>2

<211>23

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>2

cccaaagtaa atccacagca ttt 23

<210>3

<211>19

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>3

atggtctaaa tacaacttc 19

<210>4

<211>19

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>4

gagtcggagg agcgtggtt 19

<210>5

<211>17

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>5

cggcaccgtc accttga 17

<210>6

<211>19

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>6

caagcctact taaatggaa 19

<210>7

<211>22

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>7

aaaatcaggg tagacgcaat cc 22

<210>8

<211>22

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>8

gaacagagca atcccaaaac ct 22

<210>9

<211>16

<212>ДНК

<213>синтетическая

<400>9

acctcagctg aaccaa 16

<210>10

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>10

ctgcattgct gcctcttctg 20

<210>11

<211>17

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>11

ccgcatccgt tcaccaa 17

<210>12

<211>17

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>12

aaacgtaggc ggagtca 17

<210>13

<211>19

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>13

cagcgctttc agcaattgc 19

<210>14

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>14

gaycggagcg atgcatagtc 20

<210>15

<211>15

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>15

cccatatgac atccc 15

<210>16

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>16

gtaatgcacc taaagggcac 20

<210>17

<211>22

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>17

cctccttcac tycttactgr aa 22

<210>18

<211>21

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>18

gcaacaggtt tcagrggaag a 21

<210>19

<211>19

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>19

gtraacactg ctctcggct 19

<210>20

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>20

yatgaggaac tgcggaggag 20

<210>21

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>21

gctgttgcaa ccattgacac 20

<210>22

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>22

tacacagrgc gacmacaacs 20

<210>23

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>23

cayrctyccc acaacacccc 20

<210>24

<211>17

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>24

acaccgatca gcacatg 17

<210>25

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>25

tggccctcct ctgtaaggaa 20

<210>26

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>26

ggagtgctcc tggaggtgta 20

<210>27

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>27

cctctggtgg acatcctctg 20

<210>28

<211>34

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>28

agcgctgaag tatccgcatc cgttcaccaa gttg 34

<210>29

<211>26

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>29

accaaccttc gtgggagcag ctgagc 26

<210>30

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>30

gycttactga raygggrtca 20

<210>31

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>31

tgagrtasca kcckccccag 20

<210>32

<211>25

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>32

cgacgatgac tctctactgt gtgat 25

<210>33

<211>20

<212>ДНК

<213>Синтетическая

<400>33

tgcatcctgc tgygyagcat 20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан реассортированный вирус инфекционной анемии лосося (ISA) для защиты от инфекции вируса ISA, содержащий сегменты 1-8 генома, где по меньшей мере один сегмент генома относится к генотипу I и по меньшей мере один сегмент генома относится к генотипу II и где сегмент 6 генома относится к генотипу II. Также описана вакцинная композиция для вакцинации рыбы против вируса ISA, содержащая указанный реассортированный вирус ISA. Кроме того, раскрыт способ получения реассортированного вируса ISA, включающий стадии инфицирования культуры-хозяина штаммом вируса ISA генотипа I и штаммом вируса ISA генотипа II; культивирования культуры-хозяина для получения реассортированного вируса ISAV и определения того, имеет ли реассортированный вирус ISAV сегмент 6 генотипа II и по меньшей мере еще один сегмент генотипа I. Раскрыт способ культивирования реассортированного вируса ISA, включающий (i) инфицирование хозяина культуры реассортированным вирусом; (ii) культивирование хозяина со стадии (i) для получения дополнительного вируса. Изобретение позволяет выращивать вирус на суспензионных клетках в бессывороточной среде и обеспечивает защиту от инфекции ISAV. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 табл.

1. Реассортированный вирус инфекционной анемии лосося (ISA) для защиты от инфекции вируса ISA, содержащий сегменты 1-8 генома, где по меньшей мере один сегмент генома относится к генотипу I и по меньшей мере один сегмент генома относится к генотипу II и где сегмент 6 генома относится к генотипу II.

2. Реассортированный вирус ISA по п. 1, где по меньшей мере два сегмента относятся к генотипу I.

3. Реассортированный вирус ISA по п. 1 или 2, где сегмент 5 генома относится к генотипу I.

4. Реассортированный вирус ISA по любому из пп. 1-3, где сегмент 8 генома относится к генотипу I.

5. Реассортированный вирус ISA по любому из пп. 1-4, где сегмент генома генотипа I имеет чилийское происхождение.

6. Реассортированный вирус ISA по любому из пп. 1-5, где сегмент генотипа II имеет канадское происхождение.

7. Вакцинная композиция для вакцинации рыбы против вируса ISA, содержащая реассортированный вирус ISA по любому из пп. 1-6.

8. Способ получения реассортированного вируса ISA по любому из пп. 1-6, включающий стадии:

(i) инфицирования культуры-хозяина штаммом вируса ISA генотипа I и штаммом вируса ISA генотипа II;

(ii) культивирования культуры-хозяина для получения реассортированного вируса ISAV и

(iii) определения того, имеет ли реассортированный вирус ISAV сегмент 6 генотипа II и по меньшей мере еще один сегмент генотипа I.

9. Способ по п. 8, дополнительно включающий стадию (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii).

10. Способ культивирования реассортированного вируса ISA, включающий:

(i) инфицирование хозяина культуры реассортированным вирусом по любому из пп. 1-6;

(ii) культивирование хозяина со стадии (i) для получения дополнительного вируса.

11. Способ по п. 10, дополнительно включающий стадию (iii) очистки вируса, полученного на стадии (ii).

12. Способ по любому из пп. 8-11, где культура-хозяин представляет собой суспензионную клетку, предпочтительно клетку CHSE-214.

13. Способ по любому из пп. 8-12, где вирус ISA культивируют в бессывороточной среде.

14. Реассортированный вирус ISA по любому из пп. 1-6 или способ по любому из пп. 8-13, где сегмент 6 имеет генотип II, когда последовательность ампликона, полученного прямым праймером с SEQ ID NO: 10 и обратным праймером с SEQ ID NO: 11, имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с сегментом 6 NC_006499.

15. Реассортированный вирус ISA по любому из пп. 1-6 и 14 или способ по любому из пп. 8-14, где генотип сегмента определен при получении ампликона сегмента следующими парами праймеров:

Сегмент Прямой праймер Обратный праймер 1 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 2 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 3 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 4 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 4 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 5 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 6 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 7 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 8 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33

и сравнении последовательности ампликона с последовательностью соответствующего сегмента NC_006499;

когда ампликон имеет менее 85%, предпочтительно менее 80% идентичности последовательности с соответствующим сегментом NC_006499, то сегмент имеет генотип I;

когда ампликон имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с соответствующим сегментом NC_006499, то сегмент имеет генотип II.

16. Применение реассортированного вируса ISA по любому из пп. 1-6 или вакцины по п. 7 для вакцинации рыб против вируса ISA.