НОВАЯ ПОЛНОРАЗМЕРНАЯ ГЕНОМНАЯ PHK ВИРУСА ЯПОНСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ПОЛУЧЕННАЯ ИЗ НЕЕ ИНФЕКЦИОННАЯ кДНК JEV И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2007 года по МПК C12N15/40 C12N15/63 A61K39/12 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к определению аутентичных РНК-последовательностей генома вируса японского энцефалита (JEV), к конструированию инфекционных кДНК-клонов и к применению этих клонов или их производных для цели терапевтических, вакцинных и диагностических применений. Кроме того, данное изобретение относится также к JEV-векторам, например, для систем экспрессии гетерологичных генов, генетической иммунизации и транзиторной генотерапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

JEV является членом семейства Flaviviridae и передается комарами. Он является важным патогеном человека, который вызывает нейропсихиатрические осложнения и даже летальное заболевание, особенно у детей (Tsai, Vaccine, 2000, 18(Suppl 2), 1-25; Solomon, Neurological Infections and Epidemiology, 1997, 2, 191-199; Umenai et al., Bull. W.H.O., 1985, 63, 625-631). До 50000 случаев с коэффициентом смертности приблизительно 25% сообщаются ежегодно, и приблизительно половина выживших пациентов проявляют перманентные нейропсихиатрические последствия (Vaughn and Hoke, Epidemiol. Rev., 1992, 14, 197-221; Burke and Leake, Japanese encephalitis, 1988, 63-92, CRC Press Publisher). JEV распространен главным образом в Азии от бывшего Советского Союза до Индии. Однако в последние годы передачу этого вируса наблюдали недавно в южном полушарии, что свидетельствует о том, что этот вирус может стать угрозой здоровью населения по всему миру (Hanna, et al., Med. J. Aust., 1999, 170, 533-536; Hanna, et al., Med. J. Aust., 1996, 165, 256-260; Mackenzie et al., Arch. Virol., 1994, 136, 447-467).

JEV является малым имеющим оболочку вирусом с одноцепочечным позитивно-смысловым (+) РНК-геномом с длиной приблизительно 11 т.п.н. Этот геном содержит единственную длинную открытую рамку считывания (ORF), фланкированную 5'- и 3'-нетранслируемыми областями (NTR), которые являются важными цис-действующими элементами для репликации вируса. РНК-геном JEV имеет структуру кэпа типа I на его 5'-конце, но не имеет поли(А)-хвоста на его 3'-конце. Эта ORF транслируется в большой полипротеин, который ко- или посттрансляционно процессируется в три структурных белка и семь неструктурных белков, гены которых расположены в геноме следующим образом: С-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 (Lindenbach and Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 2001, 991-1041, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; Venugopal and Gould, Vaccine, 1994, 12, 966-975; Chamber et al., Ann. Rev. Microbiol., 1990, 44, 649-688). Дополнительная информация, например, в отношении функции большинства генных продуктов JEV и молекулярных механизмов, участвующих в репликации, нейровирулентности и патогенезе JEV является ограниченной в значительной степени вследствие отсутствия надежной системы обратной генетики.

Исследование РНК-вирусов с позитивной цепью заметно прогрессировало с развитием системы обратной генетики. В системе обратной генетики конструируют инфекционные кДНК-клоны представляющего интерес вирусного генома, и они становятся матрицами для синтеза инфекционной РНК, который генерирует синтетические вирусы. Имеются два подхода, РНК-запускаемый подход и ДНК-запускаемый подход, для системы обратной генетики. В классическом «РНК-запускаемом» подходе клетки трансфицируют РНК-транскриптами, полученными из инфекционных кДНК-клонов и затем синтетические вирусы извлекают их этих клеток (Satyanarayana et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 7433-7438; van Dinten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 991-996; Liljestrom and Garoff, Biotechnology, 1991, 9, 1356-1361; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296, Rice et al., J. Virol., 1987, 61, 3809-3819). В альтернативном «ДНК-запускаемом» подходе синтетические вирусы получают прямой трансфекцией инфекционных кДНК-клонов в чувствительные клетки. Этот подход был впервые сообщен для полиовируса (Racaniello and Baltimore, Science, 1981, 214, 916-919) и был адаптирован для альфавирусов (Schlesinger and Dubensky, Curr. Opin. Biotechnol., 1999, 10, 434-439).

Оба эти подхода использовали для конструирования инфекционных кДНК-клонов для многих семейств РНК-вирусов с позитивной нитью (позитивно-смысловых РНК-вирусов), в том числе коронавирусов, которые имеют самые большие РНК-геномы (Almazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521). Эти клоны были бесценными в решении многих вопросов, касающихся позитивно-смысловых РНК-вирусов. Однако конструирование полноразмерного инфекционного кДНК-клона для JEV было затруднительным, в значительной степени вследствие генетической нестабильности клонированной кДНК. Несмотря на интенсивные попытки генетически стабильный полноразмерный инфекционный кДНК-молекулярный клон для JEV не существует (Mishin et al., Virus Res., 2001, 81, 113-123; Zhang et al., J. Virol. Methods, 2001, 96, 171-182; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol. 1992, 66, 5425-5431).

Таким образом, авторы данного изобретения описали полную полноразмерную нуклеотидную последовательность штамма JEV CNU/LP2, выделенную из пула циркулирующих комаров в Корее. На основе этой последовательности авторы данного изобретения разработали также удобную и надежную систему обратной генетики для JEV посредством синтеза полноразмерных инфекционных кДНК-молекулярных клонов JEV. Система обратной генетики на основе новой инфекционной кДНК JEV данного изобретения может быть эффективно использована для исследования функций генных продуктов JEV и других молекулярно-биологических механизмов, касающихся репликации, нейровирулентности и патогенеза JEV. Кроме того, авторы данного изобретения разработали данное изобретение подтверждением того, что инфекционная кДНК JEV может быть эффективно использована в качестве вектора для экспрессии гетерологичных генов в различных способах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ

Целью данного изобретения является обеспечение аутентичных РНК-последовательностей генома JEV, полученных из них инфекционных кДНК-клонов и применение этих клонов или их производных для экспрессирующих новый ген векторов.

Для выполнения этой цели:

1) данное изобретение относится к аутентичным РНК-последовательностям генома JEV;

2) данное изобретение относится к инфекционным кДНК-клонам JEV, которые способны продуцировать самореплицируемые РНК-транскрипты JEV;

3) данное изобретение относится к вектору на основе JEV;

4) данное изобретение относится к самореплицируемому РНК-транскрипту, синтезированному из вышеуказанного вектора на основе JEV;

5) данное изобретение относится к рекомбинантному вирусу JEV, полученному из клеток, трансфицированных синтетическим РНК-транскриптом, синтезированным из вектора на основе JEV;

6) данное изобретение относится к экспрессирующему вектору на основе JEV;

7) данное изобретение относится к различным стратегиям для экспрессии гетерологичных генов с использованием экспрессирующего вектора на основе JEV.

Дополнительные признаки данного изобретения будут описаны далее.

1. Данное изобретение относится к аутентичным РНК-последовательностям генома JEV.

Геномная РНК корейского изолята JEV данного изобретения состоит из 5'-нетранслируемой области (NTR), кодирующей полипептид области и 3'-NTR. В частности, полноразмерный РНК-геном имеет длину 10968 п.н. и состоит из 95 п.н. 5'-NTR, за которым следует открытая рамка считывания из 10299 п.н., и заканчивается 3'-NTR из 574 п.н.

Согласно предпочтительному варианту осуществления данного изобретения новая геномная РНК JEV имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:15. И эта новая геномная РНК данного изобретения включает в себя также любую последовательность, имеющую 98% гомологию с геномной РНК JEV, представленной SEQ ID NO:15.

Корейский изолят JEV данного изобретения был выделен и очищен из корейского штамма JEV К87Р39 с использованием способа очистки из бляшек и был назван "JEV CNU/LP2" (см. фиг.1).

Для определения полной нуклеотидной последовательности CNU/LP2, корейского изолята JEV, авторы данного изобретения амплифицировали полный вирусный РНК-геном, за исключением его 5'- и 3'-концов, с использованием длинной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и получили три перекрывающихся кДНК-продукта, названных JVF (нуклеотиды (нт) 1-3865), JVM (нт 3266-8170) и JVR (нт 7565-10893) (с длиной 3,9, 4,9 и 3,3 т.п.н. соответственно) (см. фиг.2А).

3'-концевую последовательность вирусной РНК CNU/LP2 анализировали после лигирования с ней синтетического олигонуклеотида Т. Олигонуклеотид Т служит в качестве специфического сайта праймирования для синтеза кДНК и амплификации ПЦР (см. фиг.2В). Электрофорез в агарозном геле выявил, что амплифицированные продукты мигрировали в виде двух полос, причем большая полоса была приблизительно 700 п.н. и меньшая полоса была приблизительно 450 п.н. (см. фиг 2С). Обе полосы очищали и клонировали и 20 и 10 случайным образом извлеченных выскребанием клонов, содержащих большую и меньшую полосы соответственно, секвенировали. Как было документировано для большинства полностью секвенированных изолятов JEV, авторы данного изобретения обнаружили, что все клоны с большим инсертом (приблизительно 700 п.н.) терминировали вирусный геном последовательностью -GATCT¹⁰⁹⁶⁸. В отличие от этого все клоны с меньшим инсертом (приблизительно 450 п.н.) обнаружили вирусный геном, усеченный при нт 10684, что приводило к усеченной на 284 п.н. полосе. Во время сборки полноразмерной кДНК JEV авторы данного изобретения использовали нуклеотидные последовательности большего инсерта, так как меньший инсерт не содержал 284 нуклеотидов на 3'-конце этого вирусного генома.

5'-концевую последовательность вирусной РНК CNU/LP2 исследовали после удаления кэп-структуры на ее 5'-конце инкубированием с кислой пирофосфатазой табака. Затем полученная вирусная РНК самолигировалась, и это соединение 3'-5' подвергали синтезу кДНК и ПЦР-амплификации с позитивно-смысловым праймером для ОТ-ПЦР, комплементарным последовательности вблизи вирусного 3'-конца (нт 10259 - нт 10276), и негативно-смысловым праймером, соответствующим последовательности вблизи вирусного 5'-конца (нт 164 - нт 181) (см. фиг.2D). Электрофорез в агарозном геле обнаружил амплифицированные продукты в виде единственной полосы приблизительно 850 п.н. (см. фиг.2Е). Эти ампликоны клонировали и секвенировали 12 случайным образом извлеченных выскребанием клонов. Во всех 12 клонах за -GATCT¹⁰⁹⁶⁸ вирусной 3'-концевой последовательностью следовала 5'-концевая последовательность ¹AGAAGT- (см. фиг.2В и 2С).

Таким образом, авторы данного изобретения определили полную нуклеотидную последовательность изолята JEV CNU/LP2, представленную SEQ ID NO:15. Полноразмерный РНК-геном JEV CNU/LP2 имеет длину 10968 п.н. и состоит из 5'-NTR из 95 п.н., за которым следует единственная открытая рамка считывания из 10299 п.н., и заканчивается 3'-NTR из 574 п.н. Авторы данного изобретения сравнивали полную нуклеотидную последовательность изолята CNU/LP2 с последовательностями всех 26 штаммов JEV (Ishikawa, K94P05, FU, CH2195LA, CH2195SA, RP-2ms, RP-9, CH1392, T1P1, YL, JaGAr01, HVI, TC, TL, Beijing-1, Ling, Vellore P20778, p3, SA14-14-2, SA(A), SA14-12-1-7, SA14-2-8, SA14, SA(V), GP78 и JaOArS982), доступных в базе данных GenBank. Такие информации, касающиеся вирусных штаммов, используемые для сравнения, в виде районов выделения, лет выделения, источников и номеров доступа GenBank, представлены вкратце далее (см. таблицу 1).

<Таблица 1>Географическое местоположениеГодШтаммИсточник доступа Номер в GenBankАвстралия1995FUСыворотка человекаAF217620Китай1954SA14КомарU14163SA14-14-2Производное SA14AF3155119SA14-12-1-2Производное SA14AF416457SA14-2-8Производное SA14U15763SA(V)Производное SA14D90194SA(A)Производное SA14-14-2D901951949Beijing-1Головной мозг человекаL489611949р3КомарU47032Индия1978GP78Головной мозг человекаAF0757231958Vellore Р20778Головной мозг человекаAF080251Япония1982JaOArS982КомарM18370IUIshikawaIUAB0512921959JaGAr01КомарAF069076Корея1994К94Р05КомарAF0455511987CNU/LP2КомарДанное изобретениеТайвань1997Т1Р1КомарAF2544531994CH2195LAПроизводное CH2195AF2214991994CH2195SAПроизводное CH2195AF2215001990CH1392КомарAF2544521985RP-2msКомарAF0141601985RP-9КомарAF0141611965LingГоловной мозг человекаL78128IUYLIUAF486638IUTCКомарAF098736IUTLКомарAF098737IUHVIКомарAF098735IU: Информация недоступна

Из сравнения нуклеотидной последовательности изолята CNU/LP2 с нуклеотидными последовательностями других штаммов JEV видно, что геном изолята JEV CNU/LP2 имеет различные степени сходства последовательности с этими другими геномами [89,0% (Ishikawa), 89,1% (K94P05), 89,3% (FU), 95,8% (CH2195LA), 95,9% (CH2195SA), 97,1% (RP-2ms), 97,2% (RP-9), 97,3% (CH1392), 97,3% (T1P1), 97,0% (YL), 97,4% (JaGAr01), 97,1% (HVI), 96,9% (TC), 96,7% (YL), 96,4% (Beijing-1), 96,3% (Ling), 96,0% (Vellore P20778), 97,1% (p3), 97,4% (SA14-14-2), 97,5% (SA(A)), 97,5% (SA14-12-1-7), 97,7% (SA14-2-8), 97,9% (SA14), 97,9% (SA(V)), 96,3% (GP78) и 97,1% (JaOArS982) (см. Таблицу 2). Таким образом, нуклеотидные последовательности геномной РНК вируса JEV, имеющие сходство последовательности более 98% с нуклеотидной последовательностью данного изобретения, представленной SEQ ID NO:15, могут быть включены в категорию пункта формулы данного изобретения.

<Таблица 2>

^а Процентные идентичности последовательностей полных геномов представлены в верхней правой части. Процентные идентичности аминокислотных последовательностей полных геномов показаны в нижней левой части. Проценты идентичностей последовательности CNU/LP2 показаны жирным шрифтом.

Кроме определения нуклеотидной последовательности кодирующего полипептида области JEV, нуклеотидные последовательности 5'- и 3'-NTR, включающие в себя цис-действующие элементы, участвующие в регуляции вирусной репликации, транскрипции и трансляции этого вируса, также были определены с использованием молекулярно-биологических подходов. Важность обеих областей подтверждалась некоторыми более ранними исследованиями, сообщающими, что как 5'-, так и 3'-концевые области являются необходимыми для инициации репликации РНК флавивируса in vitro (You and Padmanabhan, J. Biol. Chem., 1999, 274, 33714-33722) и in vivo (Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728). В частности, предполагается, что ¹AGAAGT- и -GATCT¹⁰⁹⁶⁸, которые, как было доказано в данном изобретении, являются нуклеотидными последовательностями 5'- и 3'-концевых областей JEV CNU/LP2, играют важную роль в саморепликации этого вируса.

Авторы данного изобретения показали иллюстрируемыми здесь экспериментами, что инфекционный синтетический JEV мог быть продуцирован при трансфекции клеток синтетическим РНК-транскриптом, имеющим полноразмерную нуклеотидную последовательность JEV, и, кроме того, авторы данного изобретения впервые доказали функцию полноразмерной нуклеотидной последовательности, которая является необходимой для саморепликации JEV.

II. Данное изобретение относится к инфекционным кДНК-клонам JEV, которые способны продуцировать самореплицируемые РНК-транскрипты JEV.

Синтезировали инфекционные кДНК-клоны JEV данного изобретения с нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO:15, или с нуклеотидными последовательностями полноразмерной геномной РНК JEV, имеющими более чем 98% сходство с ней, и использовали в качестве матрицы для синтеза самореплицируемого РНК-транскрипта JEV посредством транскрипции in vitro. Для конструирования полноразмерных кДНК-клонов JEV вирусная геномная РНК, включающая в себя 5'- и 3'-концевые области, должна была быть амплифицирована при помощи ОТ-ПЦР, и затем полученные перекрывающиеся кДНК последовательно собирали.

Для получения полноразмерного синтетического РНК-транскрипта реакцией runoff-транскрипции in vitro стартовый сайт транскрипции промотора SP6 или Т7 помещали перед 5'-концом геномной РНК JEV и уникальный сайт узнавания рестриктазы помещали в конце вирусного генома (см. фиг.3А). В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения конструировали три запускаемых SP6 полноразмерных кДНК JEV и три запускаемых Т7-полноразмерных кДНК JEV с использованием трех перекрывающихся кДНК JEV (JVF, JVM и JVR) и две дополнительные кДНК: одну, соответствующую 5'-концевой области, включающую в себя промоторную последовательность SP6 или Т7, и другую, соответствующую 3'-концевой области, включающую в себя последовательность узнавания XhoI и XbaI в качестве runoff-сайта (см. фиг.3В и 3С). Однако специалистам с квалификацией в данной области хорошо известно, что могут быть также использованы другие промоторы, кроме вышеуказанных промоторов. Полноразмерная кДНК JEV, разработанная в данном изобретении, использует XhoI и XbaI в качестве runoff-сайта, но могут быть использованы также другие рестрикционные ферменты, как это известно.

кДНК-клоны JEV данного изобретения конструируют получением субклонов, содержащих многочисленные перекрывающиеся кДНК, с использованием плазмиды бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) pBeloBAC11 в качестве вектора и последовательного связывания этих субклонов в полноразмерные кДНК JEV.

В предпочтительном варианте данного изобретения авторы обеспечивают одну серию из трех кДНК-клонов JEV, имеющих промотор SP6 и представленных SEQ ID NO:43, 44 и 45 соответственно. Кроме того, авторы данного изобретения обеспечивают также другую серию из трех кДНК-клонов JEV, имеющих промотор Т7 и представленных SEQ ID NO:46, 47 и 48 соответственно (см. фиг.3В и 3С). Для гарантии того, что 3'-конец вирусного генома после runoff-транскрипции был близким к аутентичному, во всех случаях авторы данного изобретения помещали уникальный сайт рестриктазы, либо XhoI, либо XbaI, на конце вирусного генома (см. фиг.3В и 3С).

III. Данное изобретение относится к вектору на основе JEV.

Вектор данного изобретения характеризуется тем, что он включает в себя полноразмерную инфекционную кДНК JEV. В предпочтительном варианте осуществления авторы данного изобретения обеспечивают векторы 'pBAC^sp6/JVFL/XhoI', 'pBAC^sp6/JVFLx/XhoI' и 'pBAC^sp6/JVFLx/XbaI', которые все имеют промотор SP6 и каждый из которых представлен SEQ ID NO:43, 44 и 45, а также векторы 'pBAC^Т7/JVFL/XhoI', 'pBAC^Т7/JVFLx/XhoI' и 'pBAC^Т7/JVFLx/XbaI', которые все имеют промотор Т7 и каждый из которых представлен SEQ ID NO:46, 47 и 48. Авторы данного изобретения депонировали два наиболее эффективных вектора из приведенных выше, 'pBAC^Т7/JVFLx/XbaI' и 'pBAC^sp6/JVFLx/XbaI', в банке генов Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии (KRIBB) 2 октября 2002 года (номер доступа: KCTC 10346BP, KCTC 10347BP).

IV. Данное изобретение относится к самореплицируемому РНК-транскрипту, синтезированному из вышеуказанного вектора на основе JEV.

Для runoff-транскрипции in vitro кДНК-матрицы JEV линеаризовали расщеплением XhoI или XbaI, которые встраивали генной инженерией для runoff-сайта справа после 3'-концевой области вирусного генома (см. фиг.3). Runoff-транскрипция полимеразой SР6 двух XhoI-линеаризованных плазмид ('pBAC^sp6/JVFL/XhoI' и 'pBAC^sp6/JVFLx/XhoI') в присутствии аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')A давала кэппированные синтетические РНК, содержащие три нуклеотида (CGA) не относящейся к вирусу последовательности на их 3'-концах (см. фиг.3В). Это является результатом копирования 5'-выступа, оставленного расщеплением с использованием XhoI. Подобным образом runoff-транскрипция полимеразой SР6 XbaI-линеаризованной плазмиды ('pBAC^sp6/JVFLx/XbaI') в присутствии аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')A давала кэппированные синтетические РНК, содержащие четыре нуклеотида (CTAG) не относящейся к вирусу последовательности на их 3'-концах (см. фиг.3В).

Авторы данного изобретения выполняли анализ инфекционного центра для измерения удельной инфективности этих синтетических РНК-транскриптов JEV. В результате, при трансфекции чувствительных клеток ВНК-21 этими синтетическими РНК-транскриптами все были высокоинфекционными (3,4-4,3 × 10⁵ БОЕ/мкг, см. таблицу 3). Подобные результаты (2,9-3,8 × 10⁵ БОЕ/мкг) получали также с синтетическими РНК, транскрибированными из Т7-запускаемых кДНК-конструкций runoff-транскрипцией полимеразой Т7 (см. таблицу 3).

Сообщалось, что для некоторых флавивирусов присутствие не относящихся к вирусу последовательностей на 3'-конце синтетических РНК, транскрибированных из инфекционной кДНК, уменьшает или подавляет их удельную инфективность (Yamshchikov et al., Virology, 2001, 281, 294-304). На основании этого сообщения авторы данного изобретения получали синтетические РНК, лишенные не относящихся к вирусу последовательностей на их 3'-концах, и сравнивали их удельные инфективности.

В частности, авторы данного изобретения создали синтетические РНК, лишенные не относящихся к вирусу последовательностей обработкой линеаризованной XbaI плазмиды pBAC^sp6/JVFLx/XbaI нуклеазой фасоли золотистой (маша) (MBN) перед реакцией транскрипции, которая удаляла четыре избыточных нуклеотида CTAG. Для подтверждения активности MBN линеаризованную XbaI и обработанную MBN плазмиду pBAC^sp6/JVFLx/XbaI самолигировали и ее вирусный 3'-конец секвенировали, демонстрируя удаление четырех лишних нуклеотидов CTAG. РНК-транскрипты из линеаризованной XbaI и обработанной MBN плазмиды pBAC^sp6/JVFLx/XbaI и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI (pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN, см. фиг.3В и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI^MBN, см. фиг.3С), оба, имели увеличенные удельные инфективности в сравнении с необработанными транскриптами. А именно, было определено, что удельная инфективность РНК, транскрибированных из pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN, была равна 3,1×10⁶ БОЕ/мкг, приблизительно в 10 раз выше, чем удельная инфективность (3,4×10⁵ БОЕ/мкг) немодифицированной матрицы (см. таблицу 3, инфективность). РНК, полученные из pBAC^Т7/JVFLx/XbaI, также увеличивали удельную эффективность после модификации MBN (2,7×10⁶ БОЕ/мкг) (см. табл. 3, инфективность). Таким образом, авторы данного изобретения подтвердили, что аутентичный 3'-конец генома JEV должен был присутствовать для гарантии получения высокоинфекционных синтетических РНК-транскриптов JEV.

Таким образом, инфекционные кДНК-клоны JEV данного изобретения могли быть использованы в качестве матриц для runoff-транскрипции, которая генерирует высокоинфекционные синтетические РНК с удельной инфективностью 10⁵ - 10⁶ БОЕ/мкг.

Все предыдущие попытки (Mishin et al., Virus Res., 2001, 81, 113-123; Zhang et al., J. Virol. Methods, 2001, 96, 171-182; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431) собрать полноразмерную инфекционную кДНК JEV были безуспешными вследствие генетической нестабильности клонированной кДНК JEV. Одно исследование пыталось преодолеть эту проблему созданием системы, в которой матрица генерировалась лигированием in vitro двух перекрывающихся кДНК-клонов JEV (Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431). Затем эту матрицу использовали для синтеза инфекционных РНК-транскриптов in vitro. Однако удельная инфективность этих транскриптов была равна приблизительно 100 БОЕ/мкг, что было слишком низким для того, чтобы сделать эту систему применимой для молекулярных и генетических анализов биологии вируса (Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431).

В данном изобретении авторы сумели преодолеть генетическую нестабильность кДНК JEV клонированием ее в ВАС-плазмиду, которая поддерживается в виде одной или двух копий в E. coli. Генетическая структура и функциональная целостность этой инфекционной кДНК-плазмиды оставалась стабильной в течение по меньшей мере 180 генераций во время ее размножения в E. coli (см. фиг.7). Таким образом, авторы данного изобретения решили проблему генетической нестабильности получением полноразмерной инфекционной кДНК JEV введением ВАС и дополнительно смогли стабильно обрабатывать эту синтетическую инфекционную кДНК JEV.

Важно получать полноразмерную инфекционную кДНК, которая при транскрипции in vitro генерировала бы РНК-транскрипты с аутентичными 5'- и 3'-концами, так как несколько исследований показали, что как 5'-, так и 3'-концевые области являются необходимыми для инициации репликации РНК флавивируса in vitro (You and Padmanabhan, J. Biol. Chem., 1999, 274, 33714-33722) и in vivo (Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728). Для достижения этой цели авторы данного изобретения использовали подход, используемый ранее для других флавивирусов (van der Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 2330-2334; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296). После кэп-структуры в геномной РНК JEV следует динуклеотид AG, абсолютно консервативный признак флавивирусов (Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 1996, 931-960, Lippincott-Raven Publisher). Аутентичность 5'-конца гарантировалась помещением старта транскрипции либо промотора SP6, либо промотора T7 в начале вирусного генома. Включением аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')А в запускаемые SP6- или Т7-полимеразой реакции транскрипции (Contreras et al., Nucleic Acids Res., 1982, 10, 6353-6362) авторы данного изобретения синтезировали кэппированные РНК-транскрипты с аутентичными 5'-концами, которые были высокоинфекционными после трансфекции в чувствительные клетки. Кроме того, включение аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')G в запускаемые SP6- или Т7-полимеразой реакции транскрипции (Contreras et al., Nucleic Acids Res., 1982, 10, 6353-6362) помещает дополнительный нуклеотид G слева от динуклеотида AG. Как сообщалось ранее (Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296), авторы данного изобретения действительно обнаружили, что этот дополнительный нуклеотид терялся из геномной РНК извлеченного потомства JEV. Кроме того, авторы данного изобретения не наблюдали, что инфективность или репликация синтетических РНК, транскрибированных из инфекционных кДНК-матриц, изменялись при добавлении авторами изобретения этого дополнительного нуклеотида.

Динуклеотид СТ, расположенный на 3'-конце РНК JEV, является абсолютно консервативным среди флавивирусов (Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 1996, 931-960, Lippincott-Raven Publisher). Это предполагает, что эти нуклеотиды являются важными для вирусной репликации и что транскрипты из инфекционных кДНК должны иметь аутентичные 3'-концы. Таким образом, авторы данного изобретения сконструировали свою систему обратной генетики для JEV таким образом, что синтетические РНК должны были оканчиваться аутентичными 3'-концами. В самом деле, авторы данного изобретения показали, что РНК-транскрипты с аутентичными 3'-концами были в 10 раз более инфекционными, чем транскрипты с тремя или четырьмя не относящимися к вирусу нуклеотидами, свисающими на их 3'-концах.

V. Данное изобретение относится к рекомбинантному вирусу JEV, полученному из клеток, трансфицированных синтетическим РНК-транскриптом, синтезированным из вектора на основе JEV.

В данном изобретении получали синтетические вирусы JEV, продуцируемые из клеток, трансфицированных РНК-транскриптами, синтезированными из полноразмерных инфекционных кДНК JEV. Трансфицированные клетки обнаруживали сильное цитопатическое действие, индуцированное инфицированием вирусом JEV, и все эти синтетические вирусы были неотличимыми от исходного вируса CNU/LP2 в отношении морфологии бляшек, цитопатогенности, кинетики роста, экспрессии белка и накопления РНК (см. фиг.5). Кроме того, рекомбинантные мутанты вируса JEV могли быть получены индукцией сайт-направленной мутации на специфической области кДНК JEV, что свидетельствует о том, что инфекционная кДНК JEV может подвергаться манипуляции в E. coli. Таким образом, система обратной генетики, использующая кДНК JEV данного изобретения, может эффективно применяться для генетических исследований механизма репликации генома JEV.

VI. Данное изобретение относится к экспрессирующему вектору на основе JEV.

Данное изобретение относится к применению кДНК JEV в качестве нового экспрессирующего вектора в различных типах клеток. Альфавирусы, которые также являются РНК-вирусами, могут реплицироваться в различных обычно используемых клетках животных и, следовательно, успешно применялись в качестве эукариотических экспрессирующих векторов в культуре клеток и in vivo (Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12944; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 11371-11377; Schlesinger, Trends Biotechnol., 1993, 11, 18-22). Сообщалось, что JEV, подобно альфавирусам, также способен реплицироваться в большом разнообразии первичных и непрерывных клеточных культур из человека, мышей, обезьян, свиней и хомяков (Burke and Monath, Flaviviruses, 2001, 1043-1125, Lippincott Williams & Wilkins Publishers). Это предполагает, что JEV может быть использован в качестве вектора для экспрессии гетерологичных генов во множестве различных клеток. При применении полноразмерной инфекционной кДНК JEV в качестве экспрессирующего вектора, в котором вставлены гетерологичные гены, РНК-транскрипты, имеющие гетерологичные гены, продуцируются посредством реакции транскрипции in vitro. Эти транскрипты могут самореплицироваться при их трансфекции в клетки, так что могут быть получены большие количества чужеродных белков.

Экспрессионную кассету предпочтительно инсертируют в начале 3'-NTR JEV для экспрессии гетерологичного гена. Существует делеция 9-25 п.н. в начале вирусного 3'-NTR в штамме CNP/LP2 и трех других полностью секвенированных штаммов JEV (Williams et al., J. Gen. Virol., 2000, 81, 2471-2480; Nam et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 2001, 65, 388-392; Jan et al., Am. J. Troop. Med. Hyg., 1996, 55, 603-609), что позволяет предполагать, что этот сайт может быть хорошим сайтом для встраивания чужеродных генов. Таким образом, инфекционная кДНК JEV, разработанная данным изобретением, может действовать в качестве вектора для быстрой экспрессии гетерологичных генов в разнообразных клетках, в том числе клетках млекопитающих.

VII. Данное изобретение относится к различным стратегиям для экспрессии гетерологичных генов с использованием экспрессирующего вектора на основе JEV.

Функцией этого экспрессирующего вектора является доставка представляющих интерес гетерологичных генов в клетки для экспрессии этих генов. В данном изобретении было продемонстрировано, что полноразмерная инфекционная кДНК JEV действует в качестве вектора экспрессии гетерологичных генов в разнообразных типах клеток, в том числе клетках млекопитающих.

Данное изобретение описывает также систему экспрессии гетерологичных генов, основанную на полноразмерной инфекционной кДНК JEV, которая служит в качестве ВАС (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). В качестве транзиторной экспрессионной системы JEV предоставляет несколько преимуществ: (i) высокие титры этого вируса быстро продуцируются, (ii) этот вирус инфицирует большой диапазон клеток-хозяев, в том числе типы клеток насекомых и человека, (iii) генетически стабильная инфекционная кДНК является доступной и легко манипулируемой, и (iv) цитоплазматическая репликация РНК-генома минимизирует возможность его интеграции в геном хозяина и последующие нежелательные мутагенные последствия.

Авторы данного изобретения показали здесь, что система на основе JEV может быть использована для экспрессии чужеродных генов тремя различными путями. Один путь включает в себя инфекционные рекомбинантные векторные РНК/вирусы, кодирующие чужеродный ген, второй путь включает в себя получение вирусной компетентной по репликации, но дефектной по размножению векторной РНК вирусного репликона. Третий путь включает в себя прменение пакующих систем для образования частиц вирусного репликона (VRP). Таким образом, авторы данного изобретения показали здесь, что система JEV может быть использована для получения вектора вирус JEV/инфекционная РНК/РНК репликона/VRP, который будет быстро экспрессировать представляющие интерес чужеродные гены в большом разнообразии типов клеток млекопитающих.

Основной способ экспрессии гетерологичных генов с использованием инфекционных или репликонсодержащих кДНК-векторов JEV данного изобретения состоит из следующих стадий:

1) получение рекомбинантного экспрессирующего вектора кДНК JEV встраиванием гетерологичных генов в инфекционный или репликонсодержащий вектор кДНК JEV;

2) получение РНК-транскрипта JEV из вышеупомянутого рекомбинантного экспрессирующего вектора кДНК JEV;

3) получение трансформанта трансфекцией клеток-хозяев вышеупомянутым РНК-транскриптом JEV и

4) экспрессию чужеродных белков культивированием вышеупомянутого трансформанта.

Авторы данного изобретения получили полноразмерные инфекционные рекомбинантные кДНК JEV, экспрессирующие зеленый флуоресцирующий белок (GFP), усиленный GFP (EGFP), люциферазу (LUC) и гены LacZ и доминантный селективный маркер пуромицин-N-ацетилтрансферазу (РАС), который придает устойчивость к лекарственному средству пуромицину, в соответствии со способом, объясненным выше (см. фиг.8 и 9). Клетки ВНК-21 трансфицировали РНК-транскриптами JEV, транскрибированными с рекомбинантных кДНК JEV. Экспрессия GFP, EGFP, LUC, LacZ и РАС показана на фиг.8 и 10. Кроме того, из культуральных супернатантов получали рекомбинантные инфекционные JEV-вирусные частицы. Экспрессию этих гетерологичных генов дополнительно исследовали после инфицирования различных клеточных линий животных (ВНК-21, Vero, NIH-3T3, ST, HeLa, MDCK, CRFK, B103 и SHSY-5Y), которые обычно использовали в области биологии и медицины, рекомбинантными вирусами. В результате, ген GFP или LUC встраивался в вирусный геном во всех тестированных клетках (см. табл. 4). Таким образом, было подтверждено, что рекомбинантные кДНК JEV, РНК-транскрипты JEV и рекомбинантные JEV-вирусные частицы могут быть эффективно использованы в качестве вектора для экспрессии чужеродных гетерологичных генов во многих типах клеток.

Для независимой экспрессии чужеродных генов с использованием аппарата репликации РНК JEV авторы данного изобретения генерировали панель самореплицирующихся самоограничивающихся вирусных репликонов делецией одного, двух или всех вирусных структурных генов, которые удовлетворяют строгим требованиям безопасности (фиг.11А). Эти вирусные репликоны были способны инициировать репликацию и экспрессию генов после трансфекции РНК (см. фиг.11В и 11С).

Применимость экспрессирующих векторов на основе репликона JEV была дополнительно разработана созданием панели стабильных пакующих репликон клеточных линий (PCL), которые будут конститутивно экспрессировать все структурные белки вируса JEV (С, prM и Е) в транс-положении (см. фиг.12). Эти PCL сделали возможной транс-комплементацию эффективной упаковки репликонов вируса JEV. Таким образом, было показано, что эти PCL применимы для эффективного продуцирования вирусных VRP высокого титра после введения репликонов вируса JEV (см. фиг.12).

Авторы данного изобретения показали также, что инфекционные рекомбинантные РНК вируса JEV, кодирующие гетерологичные гены до 3 т.п.н., могут быть упакованы в вирусные частицы. С использованием векторов репликонов вируса JEV, таких как JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ и JEV/Rep/NS1, было приближенно определено, что чужеродный ген по меньшей мере 5 т.п.н. мог быть упакован в эти VRP JEV. Будет представлять интерес испытание верхнего предела размеров чужеродных последовательностей, которые могут быть упакованы в этот вирион JEV. Это может быть важным вопросом, если желательно экспрессировать длинные гены, такие как регулятор трансмембранной проводимости муковисцидоза, кодирующая последовательность которого равна приблизительно 4,5 т.п.н. (Flotte et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 3781-3790). Кроме того, большая пакующая способность вирусных репликонов JEV была бы полезной, если желательно добавить две или более экспрессионных единиц (Thiel et al., J. Virol., 2003, 77, 9790-9798; Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994). В случае вектора на основе аденоассоциированного вируса его пакующая способность была изящным образом увеличена для обхода его природного ограничения размера (Duan et al., Nat. Med., 2000, 6, 595-598; Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6716-6721), что указывает на то, что может быть возможным увеличение пакующих способностей вирусных репликонов JEV подобным образом.

Как и в случае других полученных из РНК-вирусов векторов (Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994; Pushko et al., Virology, 1997, 239, 389-401; Berglund et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16, 562-565; Basak et al., J. Interferon Cytokine Res., 1998, 18, 305-313; Barclay et al., J. Gen. Virol., 1998, 79, 1725-1734; Khromykh and Westaway, J. Virol., 1997, 71, 1497-1505; Molenkamp et al., J. Virol., 2003, 77, 1644-1648; Shi et al., Virology, 2002, 296-233; Varnavski and Khromykh, Virology, 1999, 255, 366-375; Perri et al., J. Virol., 2000, 74, 9802-9807; Curtis et al., J. Virol., 2002, 76, 1422-1434), авторы данного изобретения могли также конструировать разнообразные РНК векторов вирусных репликонов JEV, которые могут быть упакованы, когда структурные белки поставляются в транс-положении с использованием экспрессионной системы на основе альфавируса (Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994). Таким образом, была ясно продемонстрирована способность пакующих систем эффективно генерировать биологически безопасные векторы JEV. В отличие от альфавирусов (Frolova et al., J. Virol., 1997, 71, 248-258; White et al., J. Virol., 1998, 72, 4320-4326) и ретровирусов (Rein, Arch. Virol. Suppl., 1994, 9, 513-522) мало известно о сигналах упаковки, используемых флавивирусами, в том числе JEV. Система транс-комплементации для JEV авторов данного изобретения относится к данным, которые предполагают, что вся структурная область JEV вряд ли играет роль в упаковке. Таким образом, эта система будет применима в определении сигналов упаковки в РНК JEV и областей в структурных белках, которые участвуют в инкапсидации РНК и морфогенезе. Эта информация будет дополнительно повышать применимость экспрессионных систем на основе JEV данного изобретения.

Таким образом, полноразмерная геномная РНК JEV и полученная из нее инфекционная кДНК JEV данного изобретения не только способны идентифицировать связанные с нейровирулентностью и связанные с патогенезом гены JEV, но также доступны для исследования молекулярных механизмов репликации, транскрипции и трансляции JEV. Кроме того, полноразмерная геномная РНК JEV и инфекционная кДНК JEV могут быть эффективно использованы для развития агентов лечения, вакцин, диагностических реагентов и диагностических наборов для JEV, а также вектора экспрессии для представляющих интерес гетерологичных генов в эукариотических клетках. Кроме того, векторная система на основе JEV, описанная в данном изобретении, является многообещающей системой, при помощи которой чужеродные гены могут доставляться в клетки in vitro и, возможно, in vivo для ДНК-иммунизации и транзиторной генотерапии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Применение предпочтительных вариантов осуществления данного изобретения может быть наилучшим образом понятым со ссылкой на сопутствующие чертежи.

Фиг.1 является серией фотографий, показывающих сравнение образующего большие бляшки изолята JEV CNU/LP2 и исходного штамма К87Р39. (А-В) Серия фотографий, показывающих морфологию бляшек, с использованием клеток ВНК-21 (А) или клеток Vero (В). Клетки ВНК-21 (А) или клетки Vero (В) ложноинфицировали (ложноинфицированные) или инфицировали исходным штаммом JEV К87Р39 (К87Р39-инфицированные), и они образовали гетерогенную смесь размеров вирусных бляшек. Изолят CNU/LP2, очищенный в данном изобретении, образовал гомогенную популяцию больших бляшек (CNU/LP2-инфицированные). (С) Уровни и распределения экспрессии белка JEV. Клетки ВНК-21 ложноинфицировали или инфицировали К87Р39, CNU/LP2 или штаммом вируса желтой лихорадки YF17D. Спустя восемнадцать часов их фиксировали и окрашивали JEV-специфическими мышиными гипериммунными асцитами с последующей обработкой конъюгированного с флуоресцеинизотиоцианатом козьим антителом против мышиного иммуноглобулина G (зеленая флуоресценция) и последующей конфокальной микроскопией. Ядра визуализировали окрашиванием иодидом пропидия (красная флуоресценция) в присутствии РНКазы А.

Фиг.2 является серией диаграмм и парой фотографий электрофореза, показывающими стратегии, используемые для секвенирования геномной РНК CNU/LP2. (А) Схематическая диаграмма, показывающая ОТ-ПЦР-амплификацию трех перекрывающихся кДНК-ампликонов, представляющих полную геномную РНК JEV, кроме 5'- и 3'-концов. РНК показана серым цветом, а кДНК указана жирными параллельными линиями. Верхняя панель схематически изображает геномную РНК JEV CNU/LP2 (с длиной 10968 п.н.). Нижние панели изображают три перекрывающиеся кДНК, JVF (нт 1-3865), JVM (нт 3266-8170) и JVR (нт 7565-10893). (В) Схематическая диаграмма, показывающая процедуру секвенирования последовательности 3'-конца геномной РНК CNU/LP2. 5'-фосфорилированный и 3'-блокированный олигонуклеотид Т (олиго Т) лигировали с 3'-концом геномной РНК JEV с использованием РНК-лигазы Т7 и затем полученную РНК использовали для синтеза и амплификации кДНК с праймерами, указанными стрелками. Полученные продукты клонировали и секвенировали. (С) Фотография электрофореза, показывающая JEV-специфические ампликоны, синтезированные из лигированной с олигонуклеотидом Т геномной РНК JEV, описанной в (В). Первую цепь кДНК синтезировали с олигонуклеотидом TR, комплементарным олигонуклеотидом Т и реакцию ОТ (обратной транскриптазы) проводили в присутствии (дорожка 1) или в отсутствие (дорожка 2) обратной транскриптазы Superscript II. кДНК амплифицировали с олигонуклеотидом TR и праймером J35, который является комплементарным нт 10259-10276. Ожидаемым размером ПЦР-продукта является размер 727 п.н. Продукты разделяли на 1,2% агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромидом этидия (EtBr). (D) Схематическая диаграмма, показывающая процедуру секвенирования 5'-конца геномной РНК CNU/LP2. Струтуру кэпа вирусной геномной РНК удаляли кислой пирофосфатазой табака, и затем вирусная РНК с удаленным кэпом самолигировалась РНК-лигазой Т4, и ее использовали для синтеза и амплификации кДНК. Полученные амплифицированные продукты клонировали и секвенировали. (Е) Фотография электрофореза, показывающая JEV-специфические ампликоны, синтезированные из самолигированной геномной РНК JEV, описанной в (D). Синтез первой цепи кДНК проводили с праймером J40, который комплементарен нт 215-232. ОТ-реакцию выполняли в присутствии (дорожка 1) или в отсутствие (дорожка 2) обратной транскриптазы Superscript II. кДНК амплифицировали с праймером J35 и праймером J39, который комплементарен нт 164-181. Ожидаемым размером этого ПЦР-продукта является размер 890 п.н. Амплифицированные продукты разделяли на 1,2% агарозном геле и визуализировали окрашиванием EtBr. Дорожка М показывает маркер-лэддер ДНК с шагом 100 п.н. (в п.н.).

Фиг.3 является серией диаграмм, показывающих конструирование полноразмерных кДНК-клонов JEV в бактериальной искусственной хромосоме (ВАС) pBeloBAC11. (А) Схематическая диаграмма полноразмерных кДНК JEV, сконструированных в pBeloBAC11. Вирусные белки показаны толстыми жирными линиями на обоих концах, представляющих 5'- и 3'-NTR вирусного генома. Стартовые сайты транскрипции промоторов SP6 и Т7 и уникальный сайт узнавания рестриктазы показаны на 5'- и 3'-концах соответственно. (В-С) Серия схематических диаграмм, показывающих 5'- и 3'-концы полноразмерных кДНК-клонов JEV. Нуклеотидные последовательности геномной РНК JEV показаны жирными курсивными строчными буквами. Иллюстрированы 5'-концы четырех запускаемых SP6 (В) и четырех запускаемых Т7 (С) полноразмерных кДНК-матриц JEV. Для получения runoff-продуктов РНК-полимеразы SP6 и Т7 3'-концы двух запускаемых SP6 (В, pBAC^sp6/JVFL/XhoI и pBAC^sp6/JVFLx/XhoI) и двух запускаемых Т7 (С, pBAC^Т7/JVFL/XhoI и pBAC^Т7/JVFLx/XhoI) кДНК-матриц JEV линеаризовали расщеплением рестриктазой XhoI с получением трех нуклеотидов (CGA) не относящейся к вирусу последовательности на 3'-концах. Подобным образом разрезание 3'-концов запускаемой SP6 (В, pBAC^sp6/JVFLx/XbaI) и запускаемой Т7 (С, pBAC^Т7/JVFLx/XbaI) кДНК-матрицы JEV рестриктазой XbaI приводило к четырем нуклеотидам (CTAG) не относящейся к вирусу последовательности на 3'-концах. В отличие от этого аутентичный 3'-конец геномной РНК JEV присутствовал, когда запускаемую SP6 (В, pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN) и запускаемую Т7 (С, pBAC^Т7/JVFLx/XbaI^MBN) кДНК-матрицы JEV линеаризовали расщеплением рестриктазы XbaI и затем обрабатывали нуклеазой фасоли золотистой (маша) (MBN) для удаления не относящихся к вирусу одноцепочечных последовательностей. Подчеркнут сайт узнавания рестриктазой, введенный на 3'-конце вирусного генома. Острие стрелки указывает сайт расщепления.

Фиг.4 является фотографией и диаграммой, показывающими тот факт, что полноразмерная кДНК-матрица JEV в отдельности не является инфекционной, но является необходимой для образования инфекционных синтетических РНК во время транскрипции in vitro. (А) Фотография электрофореза, показывающая кДНК-матрицу и синтетические РНК-транскрипты. (В) Диаграмма, показывающая инфективность, полученную трансфекцией клеток ВНК-21 реакционной смесью для транскрипции in vitro, которая содержит полноразмерную кДНК-матрицу JEV и синтетические РНК-транскрипты. pBAC^sp6/JVFLx/XbaI (100-200 нг), линеаризованную рестриктазой XbaI и обработанную MBN, использовали для транскрипции SP6-полимеразой в отсутствие (А, дорожка 1; без обработки) или в присутствии (А, дорожка 2; В, ДНКаза I во время реакции) ДНКазы I. После синтеза реакционную смесь транскрипции обрабатывали в течение 30 минут при 37°С ДНКазой I (А, дорожка 3; В, ДНКаза I после реакции) или РНКазой А (А, дорожка 4; В, РНКаза А после реакции). В качестве контроля реакцию проводили в отсутствие РНК-полимеразы SP6 (А, дорожка 5; В, без полимеразы SP6). (А) После обработки 5% реакционную смесь разделяли на 0,6% агарозном геле и кДНК-матрицу и РНК-транскрипты визуализировали окрашиванием EtBr. (В) Эти реакционные смеси использовали для трансфекции клеток ВНК-21 и определяли инфекционные центры бляшек.

Фиг.5 является серией фотографий и диаграмм, показывающих сравнение синтетических JEV с исходным вирусом CNU/LP2. (А) Репрезентативные анализы бляшек синтетических JEV и исходного CNU/LP2. Клетки ВНК-21 инфицировали исходным или синтетическими вирусами, покрывали агарозой и окрашивали спустя 3 дня кристаллическим фиолетовым красителем. (В) Кинетика роста в клетках ВНК-21 синтетических JEV и исходного CNU/LP2, инфицированных при множественностях заражения (MOI) 0,01, 1 и 10. Вирусы собирали при указанных часах после инфицирования (h.p.i.) и титры определяли с использованием способа бляшек. (С-D) Уровни вирусного белка и РНК анализировали иммуноблоттингом (С) и Нозерн-блоттингом (D) соответственно. Клетки ВНК-21 инфицировали при MOI 1 синтетическими JEV (дорожки 1-4) или CNU/LP2 (дорожка 5) или ложноинфицировали (дорожка 6) и культивировали в течение 18 часов. (С) Экстракты белка готовили из приблизительно 3×10⁴ клеток и разделяли на 10% ДСН-полиакриламидных гелях. Вирусные белки визуализировали иммуноблоттингом с JEV-специфическими мышиными гипериммунными асцитами (верхняя панель). Параллельно детектировали белок актин в качестве контроля нанесения и миграции (нижняя панель). Положения промежуточных продуктов, связанных с расщеплением вирусного белка, и актина показаны остриями стрелок слева. Маркеры молекулярных масс в кДа указаны справа. (D) Тотальную РНК из приблизительно 1×10⁵ клеток экстрагировали и анализировали Нозерн-блоттингом с использованием ³²Р-меченого антисмыслового рибозонда, гибридизующегося с последовательностью гена NS5, включающей в себя нт 9143-9351 (верхняя панель). Окрашенные EtBr полосы рРНК 18S показаны в качестве контроля нанесения (нижняя панель). Полноразмерная геномная вирусная РНК (11 т.п.н.) и рРНК 18 S показаны слева.

Фиг.6 является серией диаграмм и фотографией электрофореза, показывающими присутствие генетического маркера XhoI в рекомбинантных JEV, произведенных из pBAC^sp6/JVFLx/gm/XbaI. (А) Схематическая диаграмма ОТ-ПЦР-фрагментов JVFLx/XbaI^MBN и JVFLx/gm/XbaI^MBN, ожидаемых после расщепления XhoI. Указаны праймеры, используемые для ОТ-ПЦР (стрелки), введенный сайт XhoI (звездочка) и размеры ОТ-ПЦР-продуктов (2580 п.н.) и двух продуктов расщепления рестриктазой XhoI (1506 п.н. и 1074 п.н.), ожидаемых после расщепления JVFLx/gm/XbaI^MBN рестриктазой XhoI. (В) Клетки ВНК-21 трансфицировали синтетическими РНК, транскрибированными из pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN или pBAC^sp6/JVFLx/gm/XbaI^MBN. Вирусы извлекали спустя 24 часа и серийно пассировали в клетки ВНК-21 при множественности заражения 0,1. При каждом пассаже перед следующим раундом инфицирования вирусы инкубировали с ДНКазой I и РНКазой А. При пассаже 1 и 3 вирусную РНК экстрагировали из культурального супернатанта, содержащего высвобожденные вирусы, и использовали для ОТ-ПЦР. ПЦР-продукты инкубировали в присутствии (+) или в отсутствие (-) XhoI, разделяли на 1% агарозном геле и окрашивали EtBr. Ожидаемые размеры нерасщепленных и расщепленных ПЦР-продуктов показаны слева. Дорожка М показывает маркер-лэддер ДНК с шагом 1 т.п.н. (в п.н.).

Фиг.7 является графиком, показывающим удельную инфективность синтетических РНК, транскрибированных из инфекционных кДНК-клонов JEV (pBAC^sp6/JVFLx/XbaI), размноженных в течение 180 генераций. Два независимых клона, несущих pBAC^sp6/JVFLx/XbaI (черные и белые кружки), культивировали при 37°С в течение ночи в 2хYT с хлорамфениколом. Эти первичные культуры размножали каждый день в течение девяти дней 10⁶-кратным разведением и добавлением свежего бульона для выращивания в течение ночи. Каждый пассаж, согласно оценке, содержал приблизительно 20 генераций. При указанных пассажах ДНК-плазмиды очищали, линеаризовали расщеплением рестриктазой XbaI и обрабатывали MBN и использовали в качестве матриц для runoff-транскрипции с использованием РНК-полимеразы SP6. Затем эти транскрипты использовали для трансфекции клеток ВНК-21 для определения удельной инфективности.

Фиг.8 является серией диаграмм, фотографий и графиком, показывающими экспрессию чужеродных генов с кДНК JEV в качестве вектора. (А) Схематическая диаграмма кДНК-матриц, используемых для runoff-транскрипции РНК-полимеразой SP6. Показаны гены GFP или LUC, запускаемые внутренним сайтом вхождения рибосомы (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMSV), встроенные в начале 3'-NTR этого вирусного генома, старт транскрипции промотора SP и runoff-сайт, генерированный расщеплением XbaI и обработкой MBN (XbaI/MBN). В pBAC^sp6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN, жирная вертикальная черта указывает делецию 83 нуклеотидов (нт 5580-5663) в середине гена NS3, которая преждевременно терминирует вирусную трансляцию при нуклеотиде 5596 (звездочка). (В) Экспрессия белка GFP. Клетки ВНК-21 ложнотрансфицировали (Mock) или трансфицировали 2 мкг синтетических РНК, транскрибированных из матрицы pBAC^sp6/JVFLx/GFP/XbaI^MBN (JVFLx/GFP/XbaI^MBN), инкубировали в течение 30 часов и затем фиксировали и исследовали под конфокальным микроскопом. (С) Индукция белка LUC. Клетки ВНК-21 (8×10⁶) ложнотрансфицировали или трансфицировали 2 мкг синтетических РНК, транскрибированных из матриц pBAC^sp6/JVFLx/LUC/XbaI^MBN или pBAC^sp6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN (0), и засевали в 6-луночную чашку при плотности 6×10⁵ клеток на лунку. Клетки лизировали в указанных временных точках и определяли активность LUC. Стандартные отклонения, полученные из трех независимых экспериментов, указаны столбиками ошибок.

Фиг.9 показывает конструирование и характеристику кодирующих гетерологичный ген инфекционных рекомбинантных JEV, которые основаны на бицистронной полноразмерной инфекционной кДНК JEV, которая служит в качестве ВАС. (А) Стратегия конструирования инфекционных рекомбинантных кДНК JEV. Показана структура исходной инфекционной кДНК JEV (pJEV/FL) (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). Вирусные ORF иллюстрированы толстыми жирными линиями на каждом конце, которые указывают 5'- и 3'-NTR вирусного генома. Дополнительная экспрессионная единица, запускаемая IRES EMCV, была встроена в начале 3'-NTR с использованием уникального природного сайта NsiI. Показаны стартовый сайт транскрипции промотора SP6 (SP6-промотора) и runoff-сайт, генерированный расщеплением рестриктазой XbaI и обработкой MBN (XbaI/MBN). Х указывает представляющий интерес чужеродный ген. (В) Показаны структуры инфекционных рекомбинантных кДНК JEV, сконструированные в данном изобретении. Три обычно применяемых репортера (EGFP, 768 п.н.; LUC, 1653 п.н. и LacZ, 3012 п.н.) или доминантный селективный маркер РАС (600 п.н.) конструировали таким образом, что они находятся в начале 3'-NTR. В случае компетентной по репликации кДНК pJEV/FL/LUC некомпетентную по репликации кДНК pJEV/FL/LUC^Rep- использовали также в качестве отрицательного контроля введением делеции из 83 нуклеотидов в середине гена NS3, которая приводит к преждевременной терминации трансляции вируса при нт 5596 (*), как описано ранее (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). (С-D) Сравнение инфекционности рекомбинантных JEV с инфекционностью исходного штамма. Клетки ВНК-21 (8×10⁶) ложнотрансфицировали или трансфицировали 2 мкг РНК исходного штамма или рекомбинантных РНК JEV, которые были транскрибированы из соответствующих кДНК JEV, как указано. (С) Репрезентативные бляшки. Трансфицированные клетки покрывали агарозой и окрашивали спустя 5 дней красителем кристаллическим фиолетовым. (D) Накопление вирусного белка. Трансфицированные клетки (4×10⁵) лизировали 1Х буфером для нанесения проб в указанных временных точках и экстракты белка разделяли на 10% ДСН/полиакриламидных гелях. Вирусные белки визуализировали иммуноблоттингом с JEV-специфическими мышиными гипериммунными сыворотками (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). Положения вирусных белков (Е и NS1) и связанные с расщеплением промежуточные продукты указаны остриями стрелок слева. Маркеры молекулярных масс в т.п.н. указаны справа. V указывает ВНК-21 клетки, инфицированные JEV CNU/LP2, а N указывает необработанные клетки ВНК-21.

Фиг.10 показывает экспрессию обычно используемых репортерных генов и доминантного селективного маркера с использованием инфекционной кДНК JEV в качестве вектора. Клетки ВНК-21 (8×10⁶) ложнотрансфицировали или трансфицировали 2 мкг РНК исходного штамма или рекомбинантных РНК JEV, которые были транскрибированы из каждой плазмиды. (А-В) pJEV/FL/EGFP, (C) pJEV/FL/LacZ, (D) pJEV/FL/LUC или pJEV/FL/LUC^REP-, (E) pJEV/FL/PAC. (А-В) Экспрессия EGFP. Трансфицированные клетки получали при 36 часах после трансфекции для конфокальной микроскопии (А) и проточного цитометрического анализа (В). - указывает клетки, трансфицированные РНК JEV/FL/EGFP, а ... ... указывает ложнотрансфицированные клетки. (С) Экспрессия LacZ. Трансфицированные клеток обрабатывали окрашиванием на Х-gal спустя 36 часов после трансфекции. (D) Индукция LUC. Трансфицированные клетки высевали на шестилуночные чашки при плотности 4×10⁵ клеток на лунку. В указанных временных точках клеточные лизаты подвергали анализам на LUC. Эти эксперименты выполняли в трех повторностях, и средние величины показаны столбиками ошибок. указывает клетки, трансфицированные РНК JEV/FL/LUC, 0 указывает клетки, трансфицированные РНК JEV/FL/LUC^REP-, а - указывает уровень фоновой люминесценции необработанных клеток. (Е) Экспрессия РАС. Трансфицированные клетки высевали на шестилуночные чашки и инкубировали в полной среде (чашки 1, 3, 5 и 7) или при содержащем 0,5% агарозу покрытии (чашки 2, 4, 6 и 8). После 2 дней инкубации эти чашки инкубировали в течение дополнительных 3 дней в присутствии 10 мкг/мл пуромицина (чашки 5-8) или в его отсутствие (чашки 1-4). Затем эти клетки фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым красителем.

Фиг.11 показывает конструирование и характеристики векторов вирусных репликонов JEV. (А) Показаны структуры вирусных репликонов JEV. Черные блоки показывают делеции в рамке считывания, которые были введены в геном инфекционной конструкции pJEV/FL/LUC. Четыре конструкции, а именно pJEV/Rep/ΔСС/LUC, pJEV/Rep/ΔС/LUC, pJEV/Rep/ΔprM/LUC и pJEV/Rep/ΔЕ/LUC, содержат единственную делецию в рамке считывания в каждом структурном гене JEV. pJEV/Rep/ΔСС/LUC имеет делецию, которая простирается до предположительного мотива последовательности циклизации в 5'-области С-гена, в отличие от pJEV/Rep/ΔС/LUC. Три конструкции, а именно pJEV/Rep/ΔС+ΔprM/LUC, pJEV/Rep/ΔС+ΔЕ/LUC и pJEV/Rep/ΔprM+ΔЕ/LUC, содержат двойные делеции в рамке считывания, тогда как pJEV/Rep/ ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC несет тройные делеции в рамке считывания во всех этих структурных белках. Конструировали также pJEV/Rep/NS1/LUC, которая кодирует 35 N-концевых и 24 С-концевых аминокислот С-белка, за которыми следуют сразу же N-конец белка NS1 и остальная часть вирусного генома. (В) Индукция LUC. Необработанные клетки ВНК-21 (8×10⁶) трансфицировали 2 мкг РНК исходного штамма или РНК вирусных репликонов JEV, которые были транскрибированы из каждой плазмиды, и затем высевали на шестилуночные чашки при плотности 4×10⁵ клеток на лунку. В указанных временных точках клеточные лизаты подвергали анализам на LUC. Эти эксперименты выполняли в трех повторностях и показаны средние величины. черный, pJEV/FL/LUC; черный, pJEV/FL/LUC^REP-; синий, pJEV/Rep/ΔСС/LUC; синий, pJEV/Rep/ΔС/LUC; синий, pJEV/Rep/ΔprM/LUC; синий, pJEV/Rep/ΔЕ/LUC; красный, pJEV/Rep/ΔС+ΔprM/LUC; красный, pJEV/Rep/ΔС+ΔЕ/LUC; красный, pJEV/Rep/ΔprM+ΔЕ/LUC; зеленый, pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC; зеленый, pJEV/Rep/NS1/LUC. - указывает уровень фоновой люминесценции необработанных клеток. (С) Накопление вирусного белка. Трансфицированные клетки (4×10⁵) лизировали 1Х буфером для нанесения проб спустя 48 часов после трансфекции и экстракты белков разделяли на 10% ДСН/полиакриламидных гелях. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и подвергали иммуноблоттингу с JEV-специфическими мышиными гипериммунными сыворотками.

Фиг.12 показывает конструирование системы упаковки для вирусных репликонов JEV. (А) Структуры экспрессионных кассет структурных белков JEV, основанные на экспрессирующем векторе на основе вируса Синдбис. pSinRep19 является двойным субгеномным нецитопатическим РНК-вектором. Чужеродный ген и ген РАС экспрессируются с использованием отдельных субгеномных промоторов, как показано стрелками. Кассета pSinRep10/JEV C-E кодирует гены С, prM и Е JEV. Кассета pSinRep19/JEV C-E-BglII кодирует гены С, prM и Е JEV, затем следуют 58 N-концевых остатков NS1, тогда как pSinRep19/JEV C-NS1 несет остальную часть гена NS1. MCS указывает сайты множественного клонирования. (В) Вестерн-блот-анализ структурных белков JEV, экспрессируемых из трех экспрессионных кассет структурных белков JEV. Клетки ВНК-21 ложнотрансфицировали или трансфицировали РНК каждого экспрессирующего вектора структурных белков JEV и спустя 48 часов получали лизаты. Эквивалентные количества клеточных лизатов разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и зондировали JEV-специфическими гипериммунными сыворотками. Указаны положения вирусных белков Е и NS1 справа и маркеры молекулярных масс в кДа слева. (С) Схематическое представление, показывающее, как могут быть получены VRP JEV (i) котрансфекцией РНК экспрессирующих векторов структурных белков JEV с РНК вирусных репликонов JEV или (ii) трансфекцией экспрессирующих структурный белок JEV PCL (пакующих клеточных линий) РНК вирусных репликонов JEV. (D-E) Получение VRP JEV. Использовали два подхода. Один подход включает в себя котрансфекцию необработанных клеток ВНК-21 двумя векторными РНК, а именно РНК экспрессирующего вектора структурного белка и РНК указанных векторов вирусных репликонов JEV (D). Другой подход включает в себя PCL (пакующие линии) JEV, которые были трансфицированы РНК указанных векторов вирусных репликонов JEV (Е). Были использованы следующие РНК вирусных репликонов JEV: зеленый, JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/EGFP; зеленый, JEV/Rep/NS1/EGFP; синий, JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LacZ; синий, JEV/Rep/NS1/LacZ; черный, JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC; черный, JEV/Rep/NS1/LUC. Супернатанты собирали спустя 48 часов после трансфекции и использовали для инфицирования необработанных клеток ВНК-21 для определения титров VRP и испытания экспрессии соответствующих репортерных генов. - указывает уровень фоновой люминесценции необработанных клеток.

ПРИМЕРЫ

Практические и предпочтительные в настоящее время варианты осуществления данного изобретения являются иллюстративными, как показано в следующих примерах.

Однако должно быть понятно, что специалисты с квалификацией в данной области, с учетом данного описания, смогут производить модификации и усовершенствования в пределах идеи и объема данного изобретения.

Пример 1: Выделение вирусов JEV

<1-1> Клеточные линии и вирусы

Клеточная линия ВНК-21 была получена от доктора Чарльза М. Райса из Rockfeller University и поддерживалась в минимальной эссенциальной среде альфа (МЕМ), дополненной 19% фетальной телячьей сывороткой (ФТС), 2 мМ L-глутамином, витаминами и антибиотиками. Все реагенты, использованные в клеточной культуре, покупали из Gibco/BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD. Корейский штамм К87Р39 (Chung et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 1996, 55, 91-97) был получен из Korean National Institute of Health. Этот JEV К87Р39 был выделен из диких комаров в Корее в 1987 году и подвергнут пяти пассажам в головном мозге неотлученных от маток мышей. Вирус желтой лихорадки YF17D получали из инфекционной кДНК pACNR/YF17D (полученной от доктора Чарльза М. Райса) runoff-транскрипцией полимеразой SP6, как описано ниже.

<1-2> Очистка методом бляшек

Клетки, инфицированные штаммом JEV К87Р39, покрывали МЕМ, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 0,5% агарозы SeaKem LE (FMC BioProducts, Rockland, Maine), и инкубировали в термостате с 5% СО₂, 37°С в течение 3-4 дней. После культивирования в течение 3-4 дней эти инфицированные клетки фиксировали 3,7% формальдегидом при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем удаляли агарозное покрытие. Бляшки визуализировали окрашиванием красителем кристаллическим фиолетовым. В результате штамм К87Р39 образовывал гетерогенную смесь размеров вирусных бляшек (фиг.1А, К87Р39-инфицированные).

Поэтому авторы данного изобретения выполняли анализ очистки из бляшек с клетками ВНК-21 для выделения гомогенной популяции образующего большие бляшки варианта, который авторы назвали CNU/LP2. Клетки ВНК-21, инфицированные штаммом JEV К87Р39, покрывали средой МЕМ, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 0,5% агарозу SeaKem LE, и инкубировали в термостате с 5% СО₂, 37°С в течение 3-4 дней. Индивидуальные бляшки выскребали стерильными пастеровскими пипетками и ресуспендировали в 1 мл МЕМ. Вирусы элюировали из агарозы при 4°С в течение 2 часов. Элюат амплифицировали только один раз в клетках ВНК-21 и хранили при -80°С.

Анализ бляшек выполняли для сравнения размеров вирусных бляшек чувствительных клеток ВНК-21, инфицированных штаммами JEV К87Р39 и JEV CNU/LP2. В результате размеры вирусных бляшек чувствительных клеток ВНК-21, инфицированных к87Р39, варьировались (фиг.1А, К87Р39-инфицированные). С другой стороны, CNU/LP2, очищенный в данном изобретении, образовывал гомогенную популяцию больших бляшек (фиг.1А, CNU/LP2-инфицированные). Кроме того, наблюдали также сходные морфологии бляшек при инфицировании клеток Vero штаммами JEV К87Р39 и JEV CNU/LP2.

<1-3> Иммунофлуоресценция

Для испытания экспрессии JEV в инфицированных клетках ВНК-21 конфокальной микроскопией клетки (2×10⁵) высевали в предметном стекле с четырьмя лунками, инкубировали в течение 12 часов и затем ложноинфицировали или инфицировали при MOI 1 в течение 18 часов с любым из исходного штамма JEV К87Р39, изолята CNU/LP2 JEV или штамма YF17D. Иммуноокрашивание на вирусные белки JEV выполняли сначала фиксированием этих клеток инкубированием в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР), содержащем 0,37% (об./об.) формальдегид, в течение 30 минут при 25°С. Затем эти клетки промывали три раза ЗФР и увеличивали проницаемость в течение 10 минут при 37°С с использованием ЗФР, содержащего 0,2% (об./об.) Тритон Х-100. После этого клетки промывали четыре раза ЗФР, повторно гидратировали в ЗФР в течение 15 минут и блокировали в течение 1 часа при 37°С ЗФР, содержащим 5% (масса/объем) бычий сывороточный альбумин (БСА). Затем эти клетки инкубировали в течение 2 часов при 25°С с разбавленной 1:500 мышиной гипериммунной асцитной жидкостью, специфической для JEV, промывали три раза ЗФР, инкубировали в течение 2 часов при 25°С с разведенным 1:500 FITC-конъюгированным козьим антителом против мышиного IgG (Jackson ImmunoResearch Labs Inc.) и опять промывали три раза ЗФР. После этого эти клетки инкубировали в течение 30 минут при 37°С в ЗФР, содержащем 5 мкг/мл иодида пропидия и 5 мкг/мл РНКазы А, для локализации ядер и заключали в 0,2 мл 80% глицерина. Изображения получали на конфокальном микроскопе Zeiss Axioskop, снабженном объективом 63Х с использованием программного обеспечения Bio-Rad MRC 1024 b LaserSharp.

Конфокальная микроскопия с анти-JEV гипериммунными асцитами выявила, что инфицированные CNU/LP2 клетки ВНК-21 экспрессировали вирусные белки JEV около перинуклеарных мембран (фиг.1С, CNU/LP2-инфицированные), сходным образом с инфицированными клетками К97Р39 (фиг.1С, К87Р39-инфицированные). Этого флуоресцирующего окрашивания не наблюдали в ложноинфицированных клетках ВНК-21 (фиг.1С, ложноинфицированные). В качестве отрицательного контроля клетки ВНК-21, инфицированные вирусом желтой лихорадки 17D, флавивирусом, близкородственным JEV, не окрашивались анти-JEV гипериммунными асцитами (фиг.1С, YF17D-инфицированные). Инфекция CNU/LP2 разнообразных линий клеток животных, в том числе нейронных клеточных линий SHSY-5Y (человек) и В103 (мышь) и ненейронных клеточных линий Vero (обезьяна) и MDCK (собака), приводила к высоким титрам вируса (10⁶-10⁷ БОЕ/мл) в культуральных супернатантах. Таким образом, авторы данного изобретения решили использовать CNU/LP2 в качестве исходного штамма для развития системы обратной генетики для JEV.

Пример 2: Анализ полной нуклеотидной последовательности геномной РНК JEV CNU/LP2

Вирусную геномную РНК экстрагировали из 100 мкл вируссодержащей культуральной жидкости с использованием 300 мкл реагента TRIzol LS в соответствии с рекомендациями изготовителя (Gibco/BRL) и затем ресуспендировали в 20 мкл не содержащей РНКаз воды. Для анализа полной нуклеотидной последовательности вирусной геномной РНК пять перекрывающихся кДНК (JVF, JVM, JVR, JV3NTR и JV35NTR), представляющих весь вирусный РНК-геном, амплифицировали с использованием длинной ОТ-ПЦР (фиг.2). Олигонуклеотиды, используемые для синтеза и амплификации кДНК, конструировали в соответствии с консенсусной последовательностью всех 16 полностью секвенированных РНК-геномов JEV, доступных из базы данных GenBank (штаммов СН2195LA, CH2195SA, Fu, GP78, HVI, JaGAr01, JaOArS982, K94P05, Vellore P20778, p3, SA(A), SA(V), SA14, SA14-14-2, TA и TL).

<2-1> Анализ нуклеотидной последовательности геномной РНК JEV CNU/LP2

Для ампликонов JVF (нт 1-3865) использовали праймер J7, представленный SEQ ID NO:1 и комплементарный нт 3986-4003 генома JEV, для синтеза кДНК (фиг.2А). Праймерами для ПЦР-амплификации были праймер J8, представленный SEQ ID NO:2 и комплементарный нт 1-18, и праймер J6, представленный SEQ ID NO:3 и комплементарный нт 3845-3865. Для ампликонов JVM (нт 3266-8170) использовали праймер J4, представленный SEQ ID NO:4 и комплементарный нт 8150-8170 генома JEV, для синтеза кДНК. Праймерами для ПЦР-амплификации были праймер J20, представленный SEQ ID NO:5 и комплементарный нт 3266-3283, и праймер J4. Для ампликонов JVR (нт 7565-10893) использовали праймер J1, представленный SEQ ID NO:6 и комплементарный нт 10947-10967 генома JEV, для синтеза кДНК. Праймерами для ПЦР-амплификации были праймер J12, представленный SEQ ID NO:7 и комплементарный нт 7565-7582, и праймер J2, представленный SEQ ID NO:8 и комплементарный нт 10870-10893. Стандартную ОТ-реакцию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мкл экстрагированной вирусной РНК, 5 пмоль подходящего праймера, 100 Е обратной транскриптазы Superscript II (Gibco/BRL), 40 Е РНКазы OUT (Gibco/BRL), 0,1 мМ дитиотреитол (ДТТ), смесь 10 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) и ОТ-буфер, поставляемый изготовителем (Gibco/BRL). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа и затем нагревали при 70°С в течение 15 минут. Затем аликвоту 5 мкл этой ОТ-смеси использовали для ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы Pyrobest (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) и подходящей пары праймеров. ПЦР выполняли с использованием 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и удлинения при 72°С в течение 5 минут, с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 минут. Во избежание неоднозначности отбора, которая может иметь место вследствие клонирования, не подвергнутые клонированию материалы амплифицированных продуктов непосредственно секвенировали в обоих направлениях при помощи автоматического ДНК-секвенатора 3700. Анализ секвенирования с двумя независимо выделенными препаратами вирусной РНК выполняли в идентичных последовательностях.

В результате полная нуклеотидная последовательность всего вирусного генома JEV CNU/LP2, за исключением 3'- и 5'-концевых областей, была определена и представлена SEQ ID NO:9.

<2-2> Определение 3'-концевой последовательности геномной РНК JEV CNU/LP2

Для секвенирования 3'-концевых последовательностей геномной РНК JEV CNU/LP2 синтетический олигонуклеотид Т, представленный SEQ ID NO:10, лигировали с 3'-концом вирусной геномной РНК для обеспечения праймерсвязывающего сайта для синтеза кДНК и ПЦР-амплификации (Kolykhalov et al., J. Virol., 1996, 70, 3363-3371). 3'-конец олигонуклеотида Т сначала модифицировали включением ddATP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (Takara), который блокирует внутримолекулярное и межмолекулярное лигирование олигонуклеотида Т. 5'-конец олигонуклеотида Т также фосфорилировали полинуклеотидкиназой Т4 (Takara). После этого этот модифицированный олигонуклеотид Т лигировали с 3'-концом вирусной геномной РНК РНК-лигазой Т4 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). 20 мкл реакционной смеси для лигирования содержали 10 Е РНК-лигазы Т4, 40 Е РНКазы OUT, 10 пмоль олигонуклеотида Т, вирусную геномную РНК и буфер, поставляемые изготовителем (NEB). После инкубирования при 16°С в течение 12 часов лигированную вирусную РНК экстрагировали фенолом, осаждали этанолом и ресуспендировали с 20 мкл не содержащей РНКаз воды. Затем 10 мкл этой лигированной с олигонуклеотидом Т вирусной РНК использовали для синтеза кДНК с олигонуклеотидом TR, представленным SEQ ID NO:11, который комплементарен олигонуклеотиду Т, как описано выше. кДНК первой цепи амплифицировали с праймером J35, представленным SEQ ID NO:12 и комплементарным нт 10259-10276, и праймером TR. Для ПЦР аликвоту 5 мкл этой реакционной ОТ-смеси амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Pyrobest и 30 циклов 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 60°С и 1 минуты при 72°С, с последующим конечным удлинением в течение 10 минут при 72°С. ПЦР-смеси были такими же, как описанные выше. Эти кДНК-ампликоны, названные JV3NTR, клонировали в вектор pRS2 (полученный от доктора Чарльза М. Райса) с сайтами рестрикции HindIII и EcoRI, включенными в позитивно-смысловой и негативно-смысловой праймеры соответственно (фиг.2В).

При помощи электрофореза в агарозном геле было обнаружено, что амплифицированные продукты мигрировали в виде двух полос, большей полосы приблизительно 700 п.н. и меньшей полосы приблизительно 450 п.н. (фиг.2С). Обе полосы очищали и клонировали и 20 и 10 случайным образом извлеченных выскребанием клонов, содержащих большую и меньшую полосы соответственно, секвенировали. Как было документировано для большинства полностью секвенированных изолятов JEV, авторы данного изобретения обнаружили, что все клоны с большим инсертом (приблизительно 700 п.н.) имели на конце вирусного генома -GATCT¹⁰⁹⁶⁸. В противоположность этому все клоны с меньшим инсертом (приблизительно 450 п.н.) обнаруживали геном, усеченный при нт 10684, что приводило к полосе, на 284 п.н. более короткой. Во время сборки полноразмерной кДНК JEV авторы данного изобретения использовали нуклеотидные последовательности большего инсерта, так как меньший инсерт не содержал 284 нуклеотида на 3'-конце вирусного генома.

<2-3> Определение 5'-концевой последовательности геномной РНК JEV CNU/LP2

5'-концевую последовательность геномной РНК JEV CNU/LP2 определяли самолигированием вирусной РНК (Campbell and Pletnev, Virology, 2000, 269, 225-237). Сначала отщепляли кэп-структуру вирусной геномной РНК кислой пирофосфатазой табака (ТАР). Реакционная смесь для расщепления (20 мкл) содержала 10 Е ТАР (Epicentre Technology Co., Madison, WI), 10 мкл вирусной РНК и буфер, поставляемый изготовителем (Epicentre Technology Co.). После инкубирования при 37°С в течение 1 часа обработанную ТАР вирусную РНК подвергали экстракции фенолом и осаждению этанолом и ресуспендировали 20 мкл не содержащей РНКаз воды. Половину (10 мкл) вирусной РНК с удаленным кэпом самолигировали в реакционной смеси 20 мкл РНК-лигазой Т4, как описано выше. Четверть (5 мкл) самолигированной вирусной РНК использовали для синтеза кДНК с праймером J40, представленным SEQ ID NO:13 и комплементарным нт 215-232. кДНК первой цепи ПЦР-амплифицировали с праймером J39, представленным SEQ ID NO:14 и комплементарным нт 164-181, и праймером J35 (фиг.2D). Электрофорез в агарозном геле выявил амплифицированные продукты в виде единственной полосы приблизительно 850 п.н. (фиг.2Е). Эти амплифицированные кДНК-ампликоны (JV35NTR) расщепляли ApoI и SpeI и лигировали в вектор pRS2, который был расщеплен ApoI и XbaI, что давало конструкцию pRS2/JV3'5'.

Для секвенирования 5'-концевых последовательностей геномной РНК JEV CNU/LP2 секвенировали 12 случайным образом извлеченных выскребанием клонов. Во всех 12 клонах авторы обнаружили, что за -GATCT¹⁰⁹⁶⁸ вирусной 3'-концевой последовательностью следовала 5'-концевая последовательность ¹AGAAGT- (фиг.2В и 2С). Идентичные результаты получали также прямым циклическим секвенированием неклонированного материала. Таким образом, авторы данного изобретения определили полную нуклеотидную последовательность изолята CNU/LP2 и подтвердили, что эта последовательность представлена SEQ ID NO:15.

Пример 3: Конструирование полноразмерных инфекционных кДНК для JEV

Во время начальных попыток клонирования кДНК РНК-генома CNU/LP2 авторам данного изобретения стало ясно, что конкретная область этого вирусного генома не была совместима с клонированием плазмид с высокой копийностью в E. coli, так как клонированная ДНК подвергалась генетическим реаранжировкам. Эти трудности сообщались также для других флавивирусов (Campbell and Pletnev, Virology, 2000, 269, 225-237; Polo et al., J. Virol., 1997, 71, 5366-5374; Gritsun and Gould, Virology, 1995, 214, 611-618; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296). Попытки клонировать эту область в бактериальную плазмиду с низким числом копий были также безуспешными вследствие генетической нестабильности в сочетании с низким выходом ДНК. Таким образом, авторы данного изобретения использовали бактериальную искусственную хромосому (ВАС) плазмиду pBeloBAC11 в качестве вектора для помещения в нее полноразмерных инфекционных кДНК для JEV.

<3-1> Субклонирование трех длинных перекрывающихся кДНК-ампликонов JEV

Авторы данного изобретения использовали способы рекомбинантных ДНК в соответствии со стандартными процедурами (Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). Сначала три перекрывающихся кДНК-ампликона (JVF, JVM и JVR), первоначально использованные для анализа полной нуклеотидной последовательности, субклонировали в pBAC/SV, представленную SEQ ID NO:42, производное плазмиды pBeloBAC11. Плазмида pBAC/SV содержит NotI-AatII (обработанный ДНК-полимеразой Т4)-фрагмент 491 п.н. pACNR/NADL (Mendez et al., J. Virol., 1998, 72, 4737-4745), SacI (обработанный ДНК-полимеразой Т4)-SspI (обработанный ДНК-полимеразой Т4)-фрагмент 9215 п.н. pSINrep19 (Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 11371-11377) и SfiI (обработанный ДНК-полимеразой Т4)-NotI фрагмент 6875 п.н. pBeloBAC11. Таким образом, RsrII-AvrII-фрагмент 3863 п.н. ампликонов JVF, BspEI-MluI-фрагмент 4717 п.н. ампликонов JVM и RsrII-BglII-фрагмент 3326 п.н. ампликонов JVR встраивали в плазмиду pBAC/SV, которая была расщеплена теми же самыми ферментами. Это приводило к конструкциям субклонов pBAC/JVF, pBAC/JVM и pBAC/JVR соответственно. Эти ВАС-плазмиды выращивали в клетках E. coli DH10B и секвенировали. Нуклеотидные последовательности клонированных кДНК были идентичными последовательности CNU/LP2, за исключением точковой мутации, Т⁸⁹⁰⁶ → С (молчащей), в гене NS5 в pBAC/JVR. Эта замена Т⁸⁹⁰⁶ → С была трансляционно молчащей и, вероятно, возникала во время клонирования, так как секвенирование восьми случайным образом извлеченных выскребанием индивидуальных клонов обнаружили остаток Т в нт 8906. Хотя замена Т⁸⁹⁰⁶ → С не изменяла соответствующую аминокислоту, возможно, что это изменение могло влиять на репликацию вируса (Van Dinten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 991-996), и, следовательно, авторы данного изобретения корректировали эту замену обратно в остаток Т. Замену Т⁸⁹⁰⁶ → С корректировали повторным клонированием ApaI-HindIII-фрагмента 315 п.н., соответствующего нт 8827-9142, что приводило к конструкции pBAC/JVRR. Во время манипуляции с ними и их размножения в штамме E. coli DH10B все три субклонированные кДНК JEV оставались генетически стабильными.

<3-2> Встраивание промотора SP6 в 5'-конец полноразмерной кДНК JEV

Для облегчения точного присоединения старта транскрипции промотора SP6 к 5'-концу полноразмерной кДНК JEV авторы изобретения модифицировали pBAC/JVF. Сначала два фрагмента выделили при помощи ПЦР pBAC/SV с праймером J41, представленным SEQ ID NO:16, и праймером J43, представленным SEQ ID NO:17, который включает в себя негативно-смысловую последовательность промотора SP6, и ПЦР pBAC/JVF с праймером J42, представленным SEQ ID NO:18, и праймером J40, представленным SEQ ID NO:19. Эти два фрагмента сливали посредством второго раунда ПЦР с праймерами J41 и J40. Полученные ампликоны расщепляли PacI и PmeI и лигировали с pBAC/JVF, которая была расщеплена теми же самыми двумя ферментами. Это давало pBAC^SP6/JVF.

<3-3> Конструирование полноразмерных кДНК JEV, содержащих промотор SP6

Для получения аутентичного или почти аутентичного 3'-конца во время runoff-транскрипции плазмиды, линеаризованной на 3'-конце вирусного генома, авторы данного изобретения модифицировали pBAC/JVRR таким образом, что за нуклеотидной последовательностью аутентичного 3'-конца следовал уникальный сайт узнавания рестриктазы, либо XhoI, либо XbaI. Для создания субклона pBAC/JVRR/XhoI, содержащего уникальный сайт XhoI на этом конце вирусного генома, фрагмент I синтезировали ПЦР-амплификацией pRS2/JV3'5' с праймером J90, представленным SEQ ID NO:20, и праймером J45, представленным SEQ ID NO:21, который включает в себя сайт XhoI. Ампликоны SfiI-SpeI-части 298 п.н. фрагмента I лигировали с pBAC/JVRR, которая была расщеплена SfiI и NheI. Для создания pBAC/JVRRx/XbaI, которая имеет сайт XbaI на этом конце вирусного генома, существующий сайт XbaI при нт 9131-9136 в гене NS5 сначала инактивировали введением молчащей точковой мутации (А⁹¹³⁴ → Т) при помощи ПЦР. В этой конструкции "x" обозначает присутствие молчащей точковой мутации (А⁹¹³⁴ → Т), которая разрушала первоначальный сайт XbaI. В частности, pBAC/JVRR амплифицировали с праймером J31, представленным SEQ ID NO:22, и праймером J47, представленным SEQ ID NO:23, которые включали замену А⁹¹³⁴ → Т. ApaI-HindIII-часть 315 п.н. этих кДНК-ампликонов, соответствующую нт 8828-9143, клонировали в pBAC/JVRR, что приводило к конструкции pBAC/JVRRx. Затем конструировали pBAC/JVRRx/XbaI таким же способом, который описан для pBAC/JVRR/XhoI. Таким образом, фрагмент II получали ПЦР-амплификацией pRS2/JV3'5' с праймером J90 и праймером J46, представленным SEQ ID NO:24, который включает в себя сайт XbaI. Затем ампликоны SfiI-SpeI-части 298 п.н. фрагмента II лигировали в pBAC/JVRRx, которая была расщеплена SfiI и NheI. Для создания pBAC/JVRRx/XhoI, содержащей уникальный сайт XhoI и замену А⁹¹³⁴ → Т, ампликоны SfiI-SpeI-части 298 п.н. фрагмента I лигировали в pBAC/JVRRx, которая была расщеплена SfiI и NheI.

Таким образом, авторы данного изобретения сконструировали пять плазмид, pBAC^SP6/JVF, pBAC/JVM, pBAC/JVRR/XhoI, pBAC/JVRRx/XbaI и pBAC/JVRRx/XhoI. Эти плазмиды содержали смежные области генома JEV и могли быть теперь использованы для сборки трех различных полноразмерных кДНК JEV (фиг.3). Сначала конструировали субклон pBAC^SP6/JVFM лигированием вместе BspEI-MluI-фрагмента 4717 п.н. pBAC/JVM, BspEI-XbaI-фрагмента 8970 п.н. pBAC^SP6/JVF и XbaI-MluI-фрагмента 3670 п.н. pBAC/SV. Таким образом, два фрагмента pBAC^SP6/JVFM (PacI-SapI-фрагмент 8142 и PacI-BsrGI-фрагмент 4801) лигировали с i) SapI-BsrGI-фрагментом 5620 п.н. pBAC/JVRR/XhoI для генерирования pBAC^SP6/JVFL/XhoI, ii) SapI-BsrGI-фрагментом 5622 п.н. pBAC/JVRRx/XbaI для генерирования pBAC^SP6/JVFLx/XbaI или iii) SapI-BsrGI-фрагментом 5620 п.н. pBAC/JVRRx/XhoI для генерирования pBAC^SP6/JVFLx/XhoI. Наконец, три собранные полноразмерные кДНК JEV были названы pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и представлены SEQ ID NO:43, 44 и 45 соответственно (фиг.3В). Все эти кДНК-клоны имели старт транскрипции промотора SP6 в начале вирусного генома, так что синтетические РНК-транскрипты с аутентичным 5'-концом могли быть генерированы транскрипцией in vitro с использованием РНК-полимеразы SP6 (фиг.3В, серый блок). Для гарантии того, что 3'-конец вирусного генома после runoff-транскрипции будет близким к аутентичному, авторы данного изобретения поместили уникальный сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы, либо XhoI, либо XbaI, на этом конце вирусного генома (фиг.3В, подчеркнутый). Таким образом, pBAC^SP6/JVFL/XhoI несет сайт XhoI на конце вирусного генома. Для конструкции с сайтом XbaI непосредственно на этом конце вирусного генома, поскольку вирусный геном уже содержит сайт XbaI в гене NS5, этот сайт должен был быть разрушен введением молчащей точковой мутации (А⁹¹³⁴ → Т). Эта конструкция была названа pBAC^SP6/JVFLx/XbaI, где "x" обозначает присутствие молчащей точковой мутации, которая разрушила этот исходный сайт XbaI. Третий клон, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, содержит как сайт XhoI на этом конце вирусного генома, так и замену А⁹¹³⁴ → Т.

Авторы данного изобретения депонировали pBAC^SP6/JVFLx/XbaI в Gene Bank of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 2 октября 2002 года (Номер доступа: КСТС 10347ВР).

<3-4> Конструирование полноразмерных кДНК JEV, содержащих промотор Т4

Кроме запускаемых SP6 кДНК JEV, авторы данного изобретения сконструировали также серию из трех запускаемых Т7 полноразмерных кДНК JEV таким же способом, который описан в примере <3-3>. Сначала фрагмент из pBAC/NADLcIn-/PAC (полученный от доктора Чарльза М. Райса) синтезировали при помощи ПЦР с праймером J81, представленным SEQ ID NO:25, и праймером J80, представленным SEQ ID NO:26. Фрагмент из pBAC^SP6/JVFLx/XbaI также синтезировали с праймером J42, представленным SEQ ID NO:27, и праймером J82, представленным SEQ ID NO:28. Эти два фрагмента сливали посредством второго раунда ПЦР с праймерами J81 и J82. EcoRI-SpeI-фрагмент 793 п.н. полученных ампликонов встраивали в вектор pRS2, расщепленный EcoRI и XbaI, что приводило к конструкции pRS2^T7/5'JV. PvuI-PmeI-фрагмент 675 п.н. pRS2^T7/5'JV лигировали с i) PacI-PmeI-фрагментом 18364 pBAC^SP6/JVFL/XhoI с получением pBAC^Т7/JVFL/XhoI, ii) PacI-PmeI-фрагментом 18364 п.н. pBAC^SP6/JVFLx/XhoI с получением pBAC^Т7/JVFLx/XhoI или iii) PacI-PmeI-фрагментом 18366 п.н. pBAC^SP6/JVFLx/XbaI с получением pBAC^Т7/JVFLx/XbaI. Наконец три собранные полноразмерные кДНК JEV были названы pBAC^Т7/JVFL/XhoI, pBAC^Т7/JVFLx/XhoI и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI и представлены SEQ ID NO:46, 47 и 48 соответственно (фиг.3С). На каждой стадии клонирования во время процесса сборки структурную целостность клонированных кДНК оценивали интенсивными рестрикционными анализами и анализами нуклеотидной последовательности. Не наблюдали структурной нестабильности этих инсертов, приводящей к делециям или реаранжировкам.

Авторы данного изобретения депонировали pBAC^Т7/JVFLx/XbaI в Gene Bank of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 2 октября 2002 года (Номер доступа: КСТС 10346ВР).

Пример 4: Транскрипции и трансфекции

Авторы данного изобретения синтезировали РНК-транскрипты транскрипцией in vitro. В частности, 100-200 нг ДНК-матрицы, линеаризованной расщеплением XhoI или XbaI и в некоторых случаях модифицированной MBN, добавляли в реакционную смесь 25 мкл, состоящую из буфера, поставляемого изготовителем (Gibco/BRL) плюс 0,6 мМ аналог кэпа [m⁷G(5')ppp(5')A или m⁷G(5')ppp(5')G, NEB Inc.], 0,5 мкМ [³Н]UTP (1,0 мКи/мл, 50 Ки/ммоль, New England Nuclear Corp., Boston, MA), 10 мМ ДТТ, 1 мМ каждый из UTP, GTP, CTP и ATP, 10 Е РНКазы OUT и 15 Е РНК-полимеразы SP6 (Gibco/BRL). Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение 1 часа. РНК определяли количественно на основе включения [³Н]UTP, измеряемого по адсорбции РНК на фильтровальной бумаге DE-81 (Whatman, Maidstone, UK) (Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). Аликвоту 1-1,5 мкл реакционной смеси испытывали электрофорезом в агарозном геле и аликвоты хранили при -80°С до использования.

Для трансфекции РНК клетки электропорировали синтетическими РНК с использованием электропоратора модели ЕСМ 830 (ВТХ Inc., San Diego, CA) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Вкратце, субконфлюэнтные клетки трипсинизировали, промывали три раза охлажденной на льду не содержащей РНКазы водой и ресуспендировали при плотности 2×10⁷ клеток/мл в ЗФР. Аликвоту 400 мкл этой суспензии смешивали с 2 мкг синтетической РНК и эти клетки немедленно электропорировали при условиях, которые были предварительно определены как оптимальные (980 вольт, длина импульса 99 мкс и пять импульсов). Затем эту электропорированную смесь переносили в 10 мл свежей среды.

Анализ инфекционных центров использовали для количественного определения удельной инфективности синтетической РНК. В частности, для runoff-транскрипции кДНК-матрицы JEV линеаризовали расщеплением XhoI или XbaI. Runoff-транскрипция полимеразой SP6 двух линеаризованных XhoI плазмид (pBAC^SP6/JVFL/XhoI и pBAC^SP6/JVFLx/XhoI) в присутствии аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')A давала кэппированные синтетические РНК, содержащие три нуклеотида (CGA) не относящейся к вирусу последовательности на их 3'-концах (фиг.3В). Это является результатом копирования 5'-выступа, оставленного расщеплением с использованием XhoI (фиг.3В). Подобным образом, runoff-транскрипция полимеразой SH6 XbaI-линеаризованной плазмиды pBAC^sp6/JVFLx/XbaI в присутствии аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')A давала кэппированные синтетические РНК с четырьмя нуклеотидами (CTAG) не относящейся к вирусу последовательности на их 3'-концах (см. фиг.3В). Эти электропорированные клетки серийно разводили в 10 раз и высевали на монослои нетрансфицированных клеток (5×10⁵) в шестилуночной чашке. Клеткам давали прикрепляться в чашке в течение 6 часов, после чего их накрывали содержащей 0,5% агарозу SeaKem LE средой МЕМ, как описано выше. Чашки инкубировали в течение 3-4 дней при 37°С с 5% СО₂ и инфекционные центры в виде бляшек визуализировали окрашиванием кристаллическим фиолетовым красителем.

При трансфекции чувствительных клеток ВНК-21 синтетическими РНК из этих конструкций все они были высокоинфекционными (таблица 3). То есть синтетические РНК, полученные из pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI, трансфицированных при оптимальных условиях электропорации, имели удельные инфективности 3,5×10⁵, 4,3×10⁵ и 3,4×10⁵ БОЕ/мкг соответственно (таблица 3, инфективность). Сходные результаты были также получены с синтетическими РНК, транскрибированными из запускаемых Т7 кДНК-конструкций, runoff-транскрипцией полимеразой Т7 (таблица 3, инфективность).

<Таблица 3>
Удельная инфективность РНК-транскриптов in vitro, генерированных из полноразмерных кДНК-клонов JEV и титр вирусаМатрицы, используемые для транскрипции^аИнфективность^b
(БОЕ/мкг РНК)Титр вируса^с(БОЕ/мл)24 ч48 чpBAC^SP6/JVFL/XhoI
pBAC^Т7/JVFL/XhoI3,5×10⁵
2,9×10⁵4,4×10⁵
2,0×10⁵3,6×10⁶
2,3×10⁶pBAC^SP6/JVFLx/XhoI
pBAC^Т7/JVFLx/XhoI4,3×10⁵
3,8×10⁵2,1×10⁵
3,3×10⁵5,2×10⁶
4,1×10⁶pBAC^SP6/JVFLx/XbaI
pBAC^Т7/JVFLx/XbaI3,4×10⁵
3,0×10⁵3,5×10⁵
2,4×10⁵3,2×10⁶
2,7×10⁶pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN
pBAC^Т7/JVFLx/XbaI^MBN3,1×10⁶
2,7×10⁶6,2×10⁶
5,6×10⁶1,4×10⁶
2,4×10^6а: Все полноразмерные кДНК JEV линеаризовали подходящей рестрикционной эндонуклеазой для runoff-транскрипции, как показано названиями этих кДНК. Для pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI^MBN эти кДНК-матрицы получали линеаризацией расщеплением XbaI, за которой следовала обработка MBN.
^b: После транскрипции in vitro РНК-полимеразой SP6 или Т7, как указано, пробы использовали для электропорации клеток ВНК-21 и определяли инфекционные центры в виде бляшек.
^с: Титры вируса при 24 и 48 часах после электропорации.

<4-1> Конструирование РНК-транскриптов JEV, лишенных не относящихся к вирусу последовательностей на их 3'-концах

Сообщалось, что для некоторых флавивирусов присутствие не относящихся к вирусу последовательностей на 3'-конце синтетических РНК, транскрибированных из инфекционной кДНК, уменьшает или подавляет их удельную инфективность (Yamshchikov et al., Virology, 2001, 281, 294-304). На основании этого сообщения авторы данного изобретения получали синтетические РНК, лишенные не относящихся к вирусу последовательностей на их 3'-концах, и сравнивали их удельные инфективности. В частности, авторы данного изобретения создали синтетические РНК JEV, лишенные не относящихся к вирусу последовательностей обработкой линеаризованной XbaI плазмиды pBAC^sp6/JVFLx/XbaI нуклеазой фасоли золотистой (маша) (MBN) перед реакцией транскрипции, которая удалила четыре избыточных нуклеотида CTAG. РНК-транскрипты из линеаризованных XbaI и обработанных MBN плазмид pBAC^sp6/JVFLx/XbaI и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI (pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN, фиг.3В и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI^MBN, фиг.3С), оба, имели увеличенные удельные инфективности в сравнении с необработанными транскриптами. А именно, было определено, что удельная инфективность РНК, транскрибированных из pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN, была равна 3,1 × 10⁶ БОЕ/мкг, приблизительно в 10 раз выше, чем удельная инфективность (3,4×10⁵ БОЕ/мкг) немодифицированной матрицы (таблица 3, инфективность). РНК, полученные из pBAC^Т7/JVFLx/XbaI, также увеличивали удельную эффективность после модификации MBN (2,7×10⁶ БОЕ/мкг) (таблица 3, инфективность). Таким образом, авторы данного изобретения показали, что аутентичный 3'-конец генома JEV должен был присутствовать для гарантии получения высокоинфекционных синтетических РНК-транскриптов JEV.

Кроме того, измененная удельная инфективность РНК-транскриптов вследствие присутствия трех или четырех не относящихся к вирусу нуклеотидов на 3'-конце влияет также на титры вируса, собранного из культуральных супернатантов трансфицированных клеток ВНК-21. Титры вирусов, высвобожденных из клеток ВНК-21, трансфицированных РНК-транскриптами из MBN-необработанных pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI, находятся в диапазоне 2,1×10⁵-4,4×10⁵ БОЕ/мл при 24 часах после трансфекции (таблица 3, титр вируса 24 ч), в тот момент, когда половина трансфицированных клеток все еще прикреплена к культуральным чашкам, что указывает на индуцированное вирусом сильное цитопатическое действие. Эти титры увеличивались приблизительно в 10 раз до диапазона 3,2×10⁶-5,2×10⁶ БОЕ/мл при 48 часах после трансфекции (таблица 3, титр вируса 48 ч), в тот момент, когда большинство этих клеток умирали и отделялись от дна культуральных чашек. В противоположность этому титр вируса, высвобожденного из клеток ВНК-21, трансфицированных РНК-транскриптами из MBN-обработанных pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN достигал 6,2×10⁶ БОЕ/мл уже при 24 часах после трансфекции, когда большинство трансфицированных клеток умирали (таблица 3, титр вируса 24 ч). Этот титр слегка уменьшался до 1,4×10⁶ БОЕ/мл при 48 часах после трансфекции (таблица 3, титр вируса 48 ч). Сходные картины образования вируса наблюдали с запускаемыми полимеразой Т7 РНК-транскриптами (таблица 3).

Пример 5: Подтверждение специфической инфективности синтетических РНК-транскриптов

Данное изобретение с использованием полноразмерного кДНК-клона pBAC^SP6/JVFLx/XbaI подтвердило, что специфическая инфективность требует транскрипции РНК из полноразмерной кДНК-матрицы JEV (фиг.4). Сама кДНК-матрица не была инфекционной (фиг.4А, дорожка 5 и В, без полимеразы SH6), но требовалась интактная кДНК-матрица во время реакции транскрипции, так как обработка ДНК-азой I устраняла инфективность (фиг.4А, дорожка 2 и В, ДНКаза во время реакции). Добавление ДНКазы I после реакции транскрипции не оказывало действия (фиг.4А, дорожка 3 и В, ДНКаза I после реакции) относительно интактной реакционной смеси (фиг.4А, дорожка 1 и В, без обработки), но обработка РНКазой А устраняла инфективность транскрибированных синтетических РНК (фиг.4А, дорожка 4 и В, РНКаза после реакции).

Пример 6: Сравнение синтетических JEV, извлеченных из полноразмерных инфекционных кДНК, с исходным вирусом CNU/LP2

Авторы данного изобретения сравнивали синтетические JEV, извлеченные из полноразмерных инфекционных кДНК (pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и pBAC^SP6/JVFL/XbaI^MBN) с исходным вирусом CNU/LP2, первоначально используемым для конструирования кДНК (морфологию роста, кинетику роста, экспрессию белков, образование РНК и т.д.).

<6-1> Сравнение морфологии бляшек с использованием анализа бляшек

Клетки ВНК-21 инфицировали синтетическими JEV, извлеченными из полноразмерных кДНК (pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и pBAC^SP6/JVFL/XbaI^MBN), и исходным вирусом CNU/LP2. Эти клетки покрывали МЕМ, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 0,5% агарозу SeaKem LE (FMC Bioproducts, Rockland, Maine) и инкубировали в термостате с 5% СО₂, 37°С в течение 3-4 дней. После культивирования в течение 3-4 дней эти инфицированные клетки фиксировали 3,7% формальдегидом при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем удаляли агарозу, покрывающую эти клетки. Бляшки визуализировали окрашиванием красителем кристаллическим фиолетовым. Как показано на фиг.5А, клетки ВНК-21, инфицированные синтетическими JEV, извлеченными из pBAC^SP6/JVFL/XhoI (чашка 1), pBAC^SP6/JVFLx/XhoI (чашка 2), pBAC^SP6/JVFLx/XbaI (чашка 3) и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN (чашка 4), образовывали гомогенные большие бляшки, аналогично клеткам, инфицированным CNU/LP2 (чашка 5).

<6-2> Сравнение кинетики роста

Авторы данного изобретения инфицировали клетки ВНК-21 синтетическими JEV, извлеченными из полноразмерных инфекционных кДНК (pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN), и исходным вирусом CNU/LP2. Клетки ВНК-21 инфицировали при низкой (0,01 БОЕ на клетку), средней (1,0 БОЕ на клетку) и высокой (10 БОЕ на клетку) множественности заражения (MOI), после чего жидкости культур клеток собирали периодически и использовали для определения кинетики высвобождения инфекционного вируса во времени. В частности, вирусы собирали в указанных временных точках и титры определяли с использованием анализа бляшек. Как показано на фиг.5В, MOI-зависимые титры вирусов, накапливающиеся на протяжении времени, были сходными для этих четырех извлеченных вирусов (pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN) и исходного вируса CNU/LP2.

<6-3> Сравнение уровня белка с использованием Вестерн-блот-анализа

Авторы данного изобретения сравнивали вирусный белок, экспрессируемый в клетках ВНК-21, инфицированных синтетическими JEV, извлеченными из полноразмерных инфекционных кДНК (pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN), с белком в клетках ВНК-21, инфицированных исходным вирусом CNU/LP2. В частности, клетки ВНК-21 (3×10⁵) лизировали 200 мкл буфера для нанесения проб [80 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 2,0% ДСН, 10% глицерин, 0,1 М ДТТ, 0,2% бромфеноловый синий] и одну десятую этого лизата кипятили в течение 5 минут и фракционировали на ДСН-полиакриламидном геле. Белки переносили электрофоретически на активированную метанолом поливинилидендифторидную мембрану с использованием прибора Trans-Blot SD для электрофоретического переноса клеток (Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, CA) и мембрану блокировали при комнатной температуре в течение 1 часа 5% сухим обезжиренным молоком в промывочном растворе (0,2% Твин 20 в ЗФР). После трех промывок промывочным раствором мембраны инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов либо с моноклональным антителом против актина (А4700, Sigma, St. Louis, MO), которое узнает эпитоп, консервативный в С-конце всех изоформ актина, или мышиной гипериммунной асцитной жидкостью, специфической в отношении JEV (АТСС VR-1259AF, American Type Culture Collection). Затем эти мембраны промывали при комнатной температуре в течение 2 часов конъюгированными со щелочной фосфатазой (АР) козьими антителами против мышиного иммуноглобулина G (Jackson ImmunoResearch Labs Inc. West Grove, PA). Эти мембраны промывали три раза промывочным раствором и один раз ЗФР. Полосы актина и белка JEV визуализировали инкубированием с субстратами 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфатом и нитрокрасителем тетразолиевым синим. В результате, было показано, что синтетические JEV и исходный вирус продуцировали сходные количества и идентичные картины вирус-специфических белков (фиг.5С, верхняя панель). Белок актина измеряли в качестве внутреннего контроля нанесения проб и обнаружили эквивалентные уровни белка актина в ложноинфицированных и инфицированных клетках (фиг.5С, нижняя панель).

<6-4> Сравнение уровня вирусной РНК с использованием Нозерн-блот-анализа

Авторы данного изобретения сравнивали вирусную РНК, экспрессируемую в клетках ВНК-21, инфицированных синтетическими JEV, извлеченными из полноразмерных инфекционных кДНК (pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN), с вирусной РНК в клетках ВНК-21, инфицированных исходным вирусом CNU/LP2. В частности, тотальную РНК экстрагировали из инфицированных клеток ВНК-21 (3×10⁵) 1 мл реагента TRIzol (Gibco/BRL). Одну треть этой РНК анализировали на JEV-специфическую РНК с использованием Нозерн-блот-анализа (Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). РНК подвергали электрофорезу в денатурирующих гелях 2,2 М формальдегид-1% агароза и переносили на найлоновые мембраны (Amersham Biosciences Inc., Piscataway, NJ). РНК на мембраных сшивали освещением источником света 254 нм (Stratalinker UV cross-linker, Stratagene, La Jolla, CA) и JEV-специфические РНК детектировали гибридизацией с [³²Р]СТР-меченым антисмысловым рибозондом, который связывается с нт 9143-9351 генома JEV. Этот зонд синтезировали транскрипцией in vitro из линеаризованного BamHI кДНК-клона pGEM3Zf(+)/JV9143, которую конструировали лигированием HindIII-SacI-фрагмента 209 п.н. pBAC^SP6/JVFLx/XbaI с pGEM3Zf(+), расщепленной теми же самыми ферментами. Этот клон транскрибировали с использованием набора T7-MEGAscript (Ambion, Austin, TX) в соответствии с рекомендациями изготовителя с реакционной смесью 20 мкл, содержащей 3,12 мкМ [α-³²Р]CTP (800 Ки/ммоль, Amersham). После обработки ДНКазой I реакционную смесь откручивали в колонке Quick Spin G-50 Sephadex (Boehringer Mannheim) для удаления невключенных рибонуклеозидтрифосфатов. Мембрану предварительно гибридизовали при 55°С в течение 6 часов в гибридизационном растворе [5х SSPE (0,9 М NaCl, 50 мМ NaH₂PO₄ и 5 мМ ЭДТА рН 7,7), 5х реагент Денхардта, 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, 50% формамид] и затем инкубировали при 55°С в течение ночи в гибридизационном растворе, содержащем 10⁷ имп/мин меченого рибозонда. Мембрану промывали три раза при 55°С в течение 10 минут с 1х SSPE-0,5% ДСН и один раз в течение 10 минут с 0,1х SSPE-0,5% ДСН. Полосы вирусной РНК визуализировали радиоавтографией и количественные определения выполняли с использованием Molecular Imager (Bio-Rad Lab). В результате все уровни РНК были сходными (фиг.5D). Количественные измерения этих блотов с использованием анализа изображения выявили, что отношения вирусных геномных РНК (фиг.5D, верхняя панель) к рРНК 18S (фиг.5D, нижняя панель) не имели значимых различий, что свидетельствует о том, что все вирусные геномные РНК продуцировались при сходных уровнях.

Таким образом, все синтетические вирусы, извлеченные из полноразмерных инфекционных кДНК (pBAC^SP6/JVFL/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XhoI, pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN), были неотличимыми от исходного вируса CNU/LP2 в отношении морфологии бляшек, цитопатогенности, кинетики роста, экспрессии белка и продуцирования РНК. Кроме того, анализы 3'-концевой последовательности не выявили дополнительных трех (CGA) или четырех (CTAG) нуклеотидов не относящейся к вирусу последовательности на 3'-конце вирусных РНК-геномов, произведенных из любого из этих синтетических вирусов. Эти результаты подтверждают применение инфекционных кДНК-клонов JEV, разработанных в данном изобретении, для будущей молекулярной генетики.

Пример 7: Проверка возможности того, что трансфицированные культуры были загрязнены исходным вирусом

Хотя приведенные выше результаты в сильной степени предполагают, что кДНК-клоны JEV могут продуцировать высокоинфекционные РНК-транскрипты после транскрипции полимеразой SH6 или Т7, возможность, что эти трансфицированные культуры были загрязнены исходным вирусом CNU/LP2, формально не была исключена. Для оценки этой слабой возможности авторы данного изобретения использовали сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР для введения генетического маркера (gm) в конструкцию pBAC^SP6/JVFLx/XbaI. В частности, точковую мутацию А⁸¹⁷¹ → С (молчащую) помещали внутрь гена NS5 в pBAC^SP6/JVFLx/XbaI сайт-направленным мутагенезом на основе ПЦР для генерирования pBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI (фиг.6А). Эта точковая мутация приводила к получению уникального сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы XhoI. Фрагмент из pBAC^SP6/JVFLx/XbaI сначала генерировали при помощи ПЦР с праймером J48, представленным SEQ ID NO:29, в котором XhoI создавали заменой А⁸¹⁷¹ → С, и праймером J3, представленным SEQ ID NO:30. Затем MluI-ApaI-фрагмент 665 п.н. полученных ампликонов лигировали с ApaI-BsrGI-фрагментом 4802 п.н. и BsrGI-MluI-фрагментом 5874 п.н. pBAC^SP6/JVFLx/XbaI с получением конструкции pBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI. Клетки ВНК-21, трансфицированные РНК-транскриптами из линеаризованной XbaI MBN-обработанной плазмидой pBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI, продуцировали инфекционный вирус, содержащий генетический маркер (названный JVFLx/gm/XbaI^MBN (фиг.6А). Фенотипические характеристики JVFLx/gm/XbaI^MBN не отличались от характеристик исходного вируса JVFLx/XbaI^MBN, свидетельствуя о том, что замена А⁸¹⁷¹ → С не влияет на репликацию вируса.

Для подтверждения, что вирус JVFLx/gm/XbaI^MBN был извлечен из кДНК-матрицы pBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI^MBN, авторы данного изобретения серийно последовательно пассировали извлеченный вирус в клетках ВНК-21 при MOI 0,1. Вирусы, полученные из каждого пассажа, инкубировали с РНКазой А и ДНКазой I во избежание переноса введенного РНК-транскрипта и матричной плазмидной ДНК (Mendez et al., J. Virol., 1998, 72, 4737-4745). Вирусные РНК, экстрагированные из вирусов JVFLx/gm/XbaI^MBN и JVFLx/XbaI^MBN, высвобождаемые при пассажах 1 и 3, использовали в ОТ-ПЦР для амплификации продукта 2580 п.н., который включал в себя замену А⁸¹⁷¹ → С (фиг.6В, дорожки 1, 3 и 5). Расщепление этого амплифицированного продукта из JVFLx/gm/XbaI^MBN с использованием XhoI приводило к двум фрагментам 1506 и 1074 п.н. (фиг.6В, дорожки 2 и 4). С другой стороны, ОТ-ПЦР-продукт, полученный из JVFLx/XbaI^MBN, не расщеплялся XhoI (фиг.6В, сравните дорожку 5 с дорожкой 6), демонстрируя, что замена А⁸¹⁷¹ → С действительно присутствовала в вирусе JVFLx/gm/XbaI^MBN. Таким образом, было подтверждено, что извлеченный вирус JVFLx/gm/XbaI^MBN происходил из полноразмерной инфекционной кДНК pBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI^MBN.

Пример 8: Генетическая стабильность полноразмерной инфекционной кДНК JEV

Предыдущее исследование показало, что конструкции, содержащие полноразмерную кДНК JEV, часто приобретают нонсенс-мутации в областях, кодирующих структурные белки prM и Е (Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431). Поскольку исследования, переходящие в область молекулярной генетики, будут обязательно требовать надежного инфекционного молекулярного клона JEV для манипулирования, авторы данного изобретения манипулировали плазмидой pBAC^SP6/JVFLx/XbaI несколькими путями и интенсивно исследовали ее генетическую структуру и функциональную целостность.

Конкретно, генетическую структуру и функциональную целостность этих инфекционных кДНК JEV анализировали следующим образом. E. coli DH10B трансформировали pBAC^SP6/JVFLx/XbaI и два независимо полученных клона выращивали при 37°С в течение ночи в 10 мл 2х YT, содержащей 12,5 мкг/мл хлорамфеникола. Клетки из этих первичных культур поддерживали в течение 9 дней разведением их 10⁶-кратно каждый день (Almazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521). В экспериментальных условиях данного изобретения каждый пассаж представлял 20 генераций, что согласовалось с наблюдениями, сделанными ранее (Alamzan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521). После третьего, шестого и девятого пассажей выполняли крупномасштабное получение этой инфекционной кДНК-плазмиды при помощи ДСН-щелочного способа и очищали дополнительно центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия (Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). Генетическую структуру плазмидной ДНК подвергали мониторингу картины ее расщепления рестрикционными эндонуклеазами. Плазмиды, экстрагированные из двух культур при пассажах 0, 3, 6 и 9, исследовали анализом с использованием рестрикционных ферментов. Картины рестрикции рестрикционными ферментами при пассажах 3, 6 и 9 не отличались заметно от пассажа 0. Таким образом, при разделении электрофорезом в агарозном геле эти два инфекционных кДНК-клона, по-видимому, были структурно стабильными.

Функциональную целостность кДНК-плазмиды JEV также исследовали измерением удельных инфективностей синтетических РНК, транскрибированных из кДНК-матрицы, которая была линеаризована расщеплением XbaI и обработкой MBN. В результате, инфективность РНК-транскриптов, полученных из этих двух кДНК-клонов, не различалась между пассажем 0 и пассажем 9 (фиг.7). На основании этого результата было подтверждено, что инфекционная кДНК JEV оставалась функционально стабильной во время серийного роста в E. coli.

Пример 9: Инфекционная кДНК JEV в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов

Как описано ранее (Burke and Monath, Flaviviruses, 2001, 1043-1125, Lippincott Williams & Wilkins Publishers), авторы данного изобретения обнаружили, что JEV был способен реплицироваться в большом разнообразии эукариотических клеток, происходящих из ряда видов, в том числе людей, мышей, обезьян, свиней, собак, кошек и хомяков. Это предполагает, что JEV мог бы использоваться в качестве вектора для экспрессии гетерологичных генов во множестве различных клеток. Для испытания этого два обычно используемых репортерных гена, GFP Aequeorea victoria и LUC Photinus pyralis, встраивали в начале вирусного 3'-NTR pBAC^SP6/JVFLx/XbaI в виде экспрессионных кассет, запускаемых элементом IRES EMCV (фиг.8А).

Для создания конструкции pBAC^SP6/JVFLx/GFP/XbaI (фиг.8А) фрагмент из pBAC^SP6/JVFLx/XbaI амплифицировали ПЦР с праймером J72, представленным SEQ ID NO:31, и праймером J73, представленным SEQ ID NO:32. Амплифицировали также фрагмент из pRSGFP-C1 с праймером J74, представленным SEQ ID NO:33, и праймером J75, представленным SEQ ID NO:34. Эти два фрагмента сливали посредством второго раунда ПЦР с праймерами J72 и J75. Затем KpnI-NsiI-фрагмент 913 п.н. полученных ампликонов лигировали с фрагментами NsiI-PacI 8011 п.н. и PacI-KpnI 11021 п.н. pBAC^SP6/JVFLx/XbaI с получением конструкции pBAC^SP6/JVFLx/GFP/XbaI.

Для создания конструкции pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI (фиг.8А) фрагмент pBAC^SP6/JVFLx/XbaI амплифицировали с праймером J72 и праймером J76, представленным SEQ ID NO:35. Амплифицировали также фрагмент pACNR/NADLcIn-/LUC (полученный от доктора Чарльза М. Райса) с праймером J77, представленным SEQ ID NO:36, и праймером J78, представленным SEQ ID NO:37. Затем эти два фрагмента сливали посредством второго раунда ПЦР с праймерами J72 и J78. Затем KpnI-NsiI-фрагмент 1801 п.н. полученных ампликонов лигировали с фрагментами NsiI-PacI 8011 п.н. и PacI-KpnI 11021 п.н. pBAC^SP6/JVFLx/XbaI с получением конструкции pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI.

Для создания pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI (фиг.8А), которая содержит делеции 83 нуклеотидов (нт 5581-5663) в середине гена NS3, которая приводит к преждевременной терминации вирусной трансляции при нт 5596, фрагмент pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI амплифицировали с праймером J89, представленным SEQ ID NO:38, и праймером J91, представленным SEQ ID NO:39. Амплифицировали также фрагмент из pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI с праймером J92, представленным SEQ ID NO:40, и праймером J93, представленным SEQ ID NO:41. Затем эти два фрагмента сливали посредством второго раунда ПЦР с праймерами J89 и J93. Затем SfiI-EagI-фрагмент 3960 п.н. лигировали с EagI-SfiI-фрагментом 6493 п.н. и SfiI-SfiI-фрагментом 10297 п.н. pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI с получением pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI.

Делеция нуклеотидов 9-25 существует в начале вирусного 3'-NTR в CNU/LP2 и трех других полностью секвенированных штаммах JEV (Williams et al., J. Gen. Virol., 2000, 81, 2471-2480; Nam et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 2001, 65, 388-392; Jan et al., Am. J. Troop. Med. Hyg., 1996, 55, 603-609), что позволяет предположить, что это положение может быть хорошим сайтом для встраивания чужеродных генов. Таким образом, при трансфекции клеток ВНК-21 синтетическими РНК, транскрибированными из кДНК pBAC^SP6/JVFLx/GFP/XbaI и pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI, эта инсерция не будет изменять удельную инфективность этих синтетических РНК-транскриптов.

Для испытания экспрессии GFP необработанные клетки ВНК-21 трансфицировали инфекционными синтетическими РНК, транскрибированными из матрицы pBAC^SP6/JVFLx/GFP/XbaI, и исследовали конфокальной микроскопией. В частности, клетки ВНК-21 ложнотрансфицировали или трансфицировали 2 мкг РНК JVFLx/GFP/XbaI^MBN. Трансфицированные клетки (1×10⁵) инкубировали в течение 30 часов на предметном стекле с четырьмя лунками. Клетки промывали два раза ЗФР, фиксировали инкубированием в течение 30 минут при 25°С в ЗФР, содержащем 0,37% (об./об.) формальдегид и заключали с 0,2 мл 80% глицерина. Клетки рассматривали под конфокальным микроскопом и анализировали. В результате, клетки ВНК-21, экспрессирующие GFP, обнаруживали зеленую флуоресценцию как в ядре, так и в цитоплазме (фиг.8В, JVFLx/GFP/XbaI^MBN), так как GFP является достаточно малым для возможности диффузии между ядром и цитоплазмой. Как и ожидалось, эту флуоресценцию не наблюдали в ложнотрансфицированных клетках (фиг.8В, ложнотрансфицированные) или в клетках, трансфицированных РНК-транскриптами из pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN.

Для мониторинга индукции LUC на протяжении времени количественным образом авторы данного изобретения получали не только компетентные по репликации РНК-транскрипты из pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI^MBN, но также и некомпетентные по репликации РНК-транскрипты из pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN (фиг.8А). Матрица pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN содержит делецию из 83 нуклеотидов (нт 5581-нт 6663) в середине гена NS3, которая преждевременно терминирует вирусную трансляцию при нт 5596 (см. * на фиг.8А, pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN).

Для анализа Luc клетки ВНК-21 (8×10⁶) ложнотрансфицировали или трансфицировали 2 мкг РНК JVFLx/LUC/XbaI^MBN или РНК JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN. Клетки высевали при концентрации 6×10⁵ клеток на лунку в шестилуночной чашке и культивировали. В указанных временных точках эти клетки промывали не содержащим Са²⁺ и Mg²⁺ раствора ЗФР и затем лизировали добавлением 0,2 мл лизисного буфера [25 мМ Трис-фосфат (рН 7,8), 2 мМ ДТТ, 2 мМ 1,2-диаминоциклогексан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота, 10% глицерин, 1% Тритон Х-100 (об./об.)] к каждой лунке. Клеточные лизаты инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и затем клеточные остатки удаляли центрифугированием. Супернатанты быстро помещали при -80°С для хранения до использования. Для определения активности LUC 20 мкл клеточных лизатов помещали в пробирку люменметра, содержащую 100 мкл реагента для анализа LUC [20 мМ Трицин, 1,07 мМ (MgCO₃)₄Mg(OH)₂. 5Н₂О, 2,67 мМ MgSO₄, 0,1 мМ ЭДТА, 33,3 мМ ДТТ, 270 мкМ кофермент А, 470 мкМ люциферин (Promega), 530 мкМ АТФ]. Активность обычно измеряли в течение 10 секунд. Каждая временная точка представляет результаты трех независимых экспериментов.

В результате в клетках ВНК-21, трансфицированных компетентной по репликации РНК JVFLx/LUC/XbaI^MBN (фиг.8С, ), начальная активность LUC спустя 6 часов после трансфекции была 2,4×10³±0,2×10³ относительные световые единицы (RLU). Эта активность разительно увеличивалась до 5,3×10⁴±0,1×10⁴ RLU спустя 30 часов после трансфекции и достигала 7,8×10⁵±0,6×10⁵ RLU спустя 54 часа после трансфекции, и в этой временной точке >50% этих клеток умирали. В противоположность этому в клетках ВНК-21, трансфицированных некомпетентной по репликации РНК JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN, начальная активность LUC спустя 6 часов после трансфекции была 1,9×10³±0,4×10³ RLU (фиг.8С, 0), подобно трансфицированным JVFLx/LUC/XbaI^MBN клеткам (фиг.8С, ), но эта активность постепенно уменьшалась на протяжении времени до 16±1,2 RLU при 54 часах после трансфекции, что находится на уровне фоновой люминесценции необработанных клеток (фиг.8С, 0). Таким образом, уровень активности LUC, экспрессируемой на протяжении времени, варьировался в зависимости от присутствия или отсутствия репликации вируса.

Авторы данного изобретения получили полноразмерные инфекционные рекомбинантные кДНК JEV, имеющие гены GFP и LUC, в соответствии с объясненным выше способом. Клетки ВНК-21 трансфицировали РНК-транскриптами JEV, транскрибированными из этих рекомбинантных кДНК JEV, и затем рекомбинантные JVFLx/GFP/XbaI^MBN и JVFLx/LUC/XbaI^MBN, содержащие гены GFP и LUC, извлекали из культуральных супернатантов. Экспрессию генов GFP и LUC в рекомбинантном JEV исследовали после трансфекции множества линий клеток животных (ВНК-21, Vero, NIH/3T3, ST, HeLa, MDCK, CRFK, B103 и SHSY-5Y), которые обычно использовались в области биологии и медицины с этим вирусом. В результате, ген GFP или LUC, встроенный в геном вируса, экспрессировался во всех испытанных клетках (таблица 4). Таким образом, было подтверждено, что рекомбинантные кДНК JEV, РНК-транскрипты JEV и рекомбинантные вирусные частицы JEV могли быть эффективно использованы в качестве вектора для экспрессии чужеродных гетерологичных генов в различных типах клеток.

<Таблица 4>
Экспрессия генов GFP и LUC, встроенных в инфекционные кДНК JEVКлеточная линияЭкспрессия GFP^аИндукция LUC^bВНК-21ЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяVeroЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяHeLaЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяMDCKЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяCRFKЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяNIH/3T3ЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяSTЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяB103ЭкспрессировалсяЭкспрессировалсяSHSY-5YЭкспрессировалсяЭкспрессировался^a: Экспрессию белка GFP анализировали после инфицирования клеток рекомбинантным JEV JVFLx/GFP/XbaI^MBN.
^b: Экспрессию белка LUC анализировали после инфицирования клеток рекомбинантным JEV JVFLx/LUC/XbaI^MBN.

Пример 10: Применимость инфекционной кДНК JEV для новой системы экспрессии гетерологичных генов

Авторы данного изобретения дополнительно исследовали применимость системы экспрессии на основе JEV в экспрессии представляющих интерес чужеродных генов. Сначала авторы данного изобретения сконструировали полноразмерный вирусный геном для экспрессии трех обычно используемых и имеющих разные размеры генов гетерологичных репортеров, а именно улучшенной версии гена GFP Aequorea victoria (EGFP, 768 п.н.), гена LUC из Photinus pyralis (1653 п.н.) и гена LacZ (3012 п.н.) (фиг.9В). Авторы данного изобретения ввели также доминантный селективный маркер РАС (600 п.н.), который способствовал устойчивости к лекарственному средству пуромицину (фиг.9В).

<10-1> Конструирование и характеристика кодирующих гетерологичные гены инфекционных рекомбинантных JEV, которые основаны на бицистронной полноразмерной инфекционной кДНК JEV, служащей в качестве ВАС

<10-1-1> Конструирование плазмид инфекционных рекомбинантных JEV-векторов

Все плазмиды конструировали с использованием стандартных протоколов молекулярной биологии (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) и все области, амплифицированные ПЦР, подтверждали секвенированием. Все рекомбинантные JEV-векторы, использованные в данном изобретении, конструировали на основе pBAC^SP6/JVFLx/XbaI (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465), которая далее называется pJEV/FL (фиг.9А).

Авторы изобретения сконструировали серию из четырех рекомбинантных JEV-векторов, экспрессирующих гены LUC, EGFP, LacZ и РАС. pJEV/FL/LUC идентична конструкции, называемой pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI выше в примере 9 (фиг.9В). Для конструирования pJEV/FL/LacZ, KpnI-AvrII-фрагмент 2409 п.н. pJEV/FL/LUC сначала субклонировали в pGEM3Zf(+), которую расщепляли KpnI и XbaI, с получением pGEM/LUC. NcoI-StuI-фрагмент 3177 п.н. pSinRep3/LacZ (любезный подарок д-ра Чарльза Райса) лигировали с NcoI-NsiI-фрагментом 3935 п.н. (обработанным ДНК-полимеразой Т4) pGEM/LUC с получением pGEM/LacZ. KpnI-NotI-фрагмент 3873 п.н. pGEM/LacZ лигировали с фрагментами NotI-PacI 7456 п.н. и PacI-KpnI 11021 п.н. pJEV/FL/LUC с образованием pJEV/FL/LacZ (фиг.9В). Для облегчения конструирования pJEV/FL/EGFP SacII-NotI-фрагмент 5792 п.н. pJEV/FL/LacZ встраивали в pRS2, которая была расщеплена теми же самыми ферментами, с получением pRS/LacZ. Фрагмент последовательности, кодирующий EGFP, получали ПЦР-амплификацией pEGFP-C1 с праймерами EGFPF (представленным SEQ ID NO:49) и EGFPR (представленным SEQ ID NO:50). NcoI-StuI-часть 773 п.н. ампликонов фрагмента EGFP лигировали с фрагментами EcoRV-SacII 3241 п.н. и SacII-NcoI 2062 п.н. pRS/LacZ с получением pRS/EGFP. SacII-NotI-фрагмент 3406 п.н. pRS/EGFP лигировали с NotI-PacI-фрагментом 7456 п.н. и PacI-SacII-фрагментом 9102 pJEV/FL/LUC с получением pJEV/FL/EGFP (фиг.9В). Для создания pJEV/FL/РАС фрагмент pACNR/NADLcIns^-/PAC (любезный подарок д-ра Чарльза Райса) ПЦР-амплифицировали с праймерами PACF (представленным SEQ ID NO:51) и PACR (представленным SEQ ID NO:52). DraIII-NsiI-часть 881 п.н. полученных ампликонов лигировали с фрагментами NsiI-PacI 8011 п.н., PacI-NdeI 10096 п.н. и NdeI-DraIII 842 п.н. pJEV/FL/LUC с получением pJEV/FL/РАС (фиг.9В). Экспрессионную кассету, запускаемую IRES EMCV, встраивали в начале вирусного 3'-NTR pJEV/FL (фиг.9А и 9В).

<10-1-2> Анализ на экспрессию EGFP

Клетки высевали в четырехлуночное предметное стекло для 36-48 часов посттрансфекции. После инкубирования клетки фиксировали инкубированием в ЗФР, содержащем 0,37% (об./об.) формальдегид, и затем заключали в 0,2 мл 80% глицерина. Клетки наблюдали под конфокальным микроскопом, снабженным подходящим фильтром. Экспрессию EGFP исследовали также проточным цитометрическим анализом. Конкретно, эти клетки трипсинизировали, промывали один раз ЗФР и ресуспендировали в 0,37% (об./об.) формальдегиде в ЗФР с последующим анализом с использованием проточного цитометра FACSan FACSCalibur (Becton Dickinson). Мертвые клетки исключали с использованием дискриминационных окон, рассеивающих прямой и боковой свет в клеточном сортере. Считали десять тысяч жизнеспособных клеток.

<10-1-3> Анализ β-галактозидазы

Клетки промывали один раз ЗФР, фиксировали 0,05% (об./об.) глутаровым альдегидом в ЗФР в течение 15 минут при комнатной температуре и осторожно промывали три раза ЗФР. Клетки оценивали на активность β-галактозы инкубированием в красящем растворе [5 мМ феррицианид калия, 5 мМ ферроцианид калия, 2 мМ MgCl₂ в ЗФР] с 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-галактопиранозидом (Sigma) при 37°С.

<10-1-4> Анализ люциферазы

Клетки анализировали на активность LUC с использованием субстрата люциферина (Promega), как описано здесь выше (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). Каждый эксперимент выполняли в трех повторностях и представили средние значения.

<10-1-5> Отбор с пуромицином

Клетки высевали в 6-луночные чашки при 37°С и выдерживали в течение 6 часов. Для измерения образования очагов Pur^R клетки покрывали 0,5% агарозой SeaKem LE (FMC BioProducts, Rockland, Maine) в МЕМ, содержащей инактивированную нагреванием ФТС и пенициллин/стрептомицин, и инкубировали при 37°С в течение 2 дней. После этого эти чашки инкубировали в течение дополнительных 3 дней в отсутствие или в присутствии пуромицина (10 мкг/мл). После отбора очаги Pur^R визуализировали окрашиванием кристаллическим фиолетовым фиксированных формальдегидом клеток (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). Для культивирования Pur^R клеток эти клетки оставляли после высвобождения из агарозных пробок и инкубировали в полной среде при 37°С в течение 2 дней. Затем эти клетки культивировали в полной среде, содержащей 10 мкг/мл пуромицина, и спустя 24-48 часов после отбора выжившие клетки визуализировали окрашиванием кристаллическим фиолетовым.

<10-1-6> Гетерологичные белки экспрессируются в клетках ВНК-21, трансфицированных/инфицированных рекомбинантными синтетическими РНК/вирусами JEV, содержащими дополнительную экспрессионную единицу

Для испытания, изменило ли встраивание экспрессионной кассеты ее удельную инфективность/репликацию, авторы данного изобретения испытывали удельную инфективность in vitro синтетических РНК, которые были транскрибированы из этих четырех запускаемых SP6 несущих чужеродный ген инфекционных кДНК-конструкций JEV (таблица 5). Очищенную плазмиду pJEV/FL и произведенные из нее плазмиды линеаризовали расщеплением XbaI с последующей обработкой MBN. Эти линеаризованные плазмиды использовали в реакциях транскрипции in vitro (25 мкл), использующих РНК-полимеразу SP6, как описано выше. После транскрипции эти реакционные смеси дополнительно инкубировали с 10 Е ДНКазы в течение 30 минут и экстрагировали смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт. Выходы РНК определяли количественно на основе [³Н]UTP-включения, измеряемого по абсорбции РНК на фильтровальной бумаге DE-81 (Whatman, Maidstone, UK). РНК (2 мкг) трансфицировали в клетки электропорацией, как описано выше (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465).

Синтетические РНК, происходящие из pJEV/FL/РАС, pJEV/FL/EGFP, pJEV/FL/LUC и pJEV/FL/LacZ, введенные в чувствительные клетки ВНК-21, имели удельные инфективности 3,5×10⁶, 2,5×10⁶, 3,4×10⁶ и 1,1×10⁶ БОЕ/мкг соответственно, которые являются сходными с инфективностью исходного pJEV/FL (3,2×10⁶ БОЕ/мкг). Однако клетки ВНК-21, трансфицированные этими рекомбинантными синтетическими РНК, действительно образовывали гомогенные меньшие бляшки, чем трансфицированные pJEV/FL клетки (фиг.9С). Это согласуется с задержанным продуцированием инфекционного вируса (таблица 5, титр вируса) и уменьшенной цитопатогенностью (таблица 5, СРЕ), которые наблюдали в трансфицированных рекомбинантной РНК клетках. Авторы данного изобретения показали также, что задержанное накопление вирусных белков (фиг.9D) в трансфицированных рекомбинантной РНК клетках ВНК-21 коррелирует с длиной чужеродного гена, который был встроен (фиг.9В).

<Таблица 5>
Удельная инфективность in vitro РНК-транскриптов, генерируемых из производных полноразмерных кДНК JEV, содержащих разные репортерные гены, и титр рекомбинантного вирусаМатрица, использованная для транскрипции^аИнфективность^b
(БОЕ/мкг РНК)Титр вируса^с
(БОЕ/мл)СРЕ^d48 ч72 ч pJEV/FL3,2×10⁶3,0×10⁶5,1×10⁵++++pJEV/FL/РАС3,5×10⁶6,2×10⁴4,0×10⁵++pJEV/FL/EGFP2,5×10⁶9,0×10⁴2,1×10⁵++pJEV/FL/LUC3,4×10⁶2,0×10⁴3,2×10⁵+pJEV/FL/LUC^REP-000-pJEV/FL/LacZ1,1×10⁶1,1×10⁴1,3×10⁵+^а: Все кДНК-матрицы JEV, использованные для реакции транскрипции in vitro, получали линеаризацией расщеплением с использованием XbaI, с последующей обработкой MBN.
^b: После транскрипции in vitro РНК-полимеразой SP6 эти пробы использовали для электропорации клеток ВНК-21 и определяли инфекционные центры в виде бляшек (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465).
^с: Титры вируса при 48 часах и 72 часах после электропорации.
^d: Индуцированное вирусом цитопатогенное действие (СРЕ) наблюдали после электропорации РНК-транскриптами, генерируемыми из производных полноразмерных кДНК JEV. При 24 часах после электропорации наблюдали сильное СРЕ для исходного pJEV/FL, показанное ++++. Для pJEV/FL/РАС и pJEV/FL/EGFP СРЕ наблюдали при 60 часах после электропорации, показанное ++. Для pJEV/FL/LacZ явное СРЕ начинало проявляться при 72 часах после электропорации, показанные +. - указывает на отсутствие СРЕ.

Экспрессия EGFP, LUC, LacZ и РАС с использованием инфекционных кДНК JEV показана на фиг.10. Трансфицированные РНК pJEV/FL/EGFP клетки ВНК-21 показали явную зеленую флуоресценцию под флуоресцирующим микроскопом (фиг.10А). Зеленые флуоресцирующие клетки (-), определяемые проточным цитометрическим анализом, содержали 99,7% клеток в сравнении с ложнотрансфицированными клетками (^{... ...}) (фиг.10В). Фиг.10С демонстрирует картину окрашивания X-gal ВНК-21 клеток, экспрессирующих РНК JEV/FL/LacZ. Авторы данного изобретения подвергали мониторингу во времени также активность LUC клеток ВНК-21, которые были трансфицированы либо компетентной по репликации РНК JEV/FL/LUC (), либо некомпетентной по репликации РНК JEV/FL/LUC^REP- (0), которая лишена участка, который преждевременно терминирует трансляцию вируса при нт 5596 (*). Это показало, что увеличенная репликация вируса коррелировала с увеличенной активностью LUC (фиг.10D), как описано ранее (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). Кроме того, отбор клеток ВНК-21, трансфицированных РНК JEV/FL/РАС, с пуромицином (фиг.10Е) выявил клетки ВНК-21, трансфицированные РНК JEV/FL/РАС, выжившие и ставшие конфлюэнтными в содержащей пуромицин среде (чашка 7) или образовавшие очаги Pur^R под полутвердым агаром, покрытым содержащей пуромицин средой (чашка 8), тогда как ложнотрансфицированные клетки умирали в пределах 24 часов отбора (чашки 5-6). Как и ожидалось, оба типа клеток становились конфлюэнтными в отсутствие пуромицина (чашки 1-4).

<10-2> Конструирование и векторная характеристика вирусных репликонов JEV

<10-2-1> Конструирование векторов, содержащих вирусные репликоны JEV

Плазмиды для всех вирусных репликонов JEV конструировали на основе pJEV/FL/LUC созданием делеций в рамке считывания в кодирующих последовательностях структурных белков. Все делеции отличались новым сайтом XhoI, который приводил к встраиванию двух остатков, а именно Leu и Glu. Во-первых, авторы данного изобретения создали серию из четырех векторов, содержащих вирусный репликон JEV, содержащий единственную делецию в рамке считывания в каждом структурном белке. Для конструирования pJEV/Rep/ΔСС/LUC, которая содержит делецию из 273 нуклеотидов (нт 132-404) в гене С, синтезировали два фрагмента с использованием ПЦР-амплификации pJEV/FL, а именно фрагмент С1 с праймерами DelF (представленным SEQ ID NO:53) и C1R (представленным SEQ ID NO:54) и фрагмент С2 с праймерами С2F (представленным SEQ ID NO:55) и DelR (представленным SEQ ID NO:56). Два фрагмента (PacI-XhoI-часть 267 п.н. ампликонов фрагмента С1 и XhoI-BsiWI-часть 226 п.н. ампликонов фрагмента С2) лигировали с BsiWI-PacI-фрагментом 20073 п.н. pJEV/FL/LUC с получением конструкции pJEV/Rep/ΔСС/LUC. Для генерирования pJEV/Rep/ΔС/LUC, которая содержит делецию из 204 нуклеотидов (нт 201-404) в гене С, фрагмент С3 из pJEV/FL амплифицировали при помощи ПЦР с праймерами DelF и С3R (представленным SEQ ID NO:57). PacI-XhoI-фрагмент 336 п.н. полученных ампликонов лигировали с фрагментами XhoI-RsrII 12850 п.н. и RsrII-PacI 7449 п.н. pJEV/Rep/ΔСС/LUC с получением конструкции pJEV/Rep/ΔС/LUC. Для создания pJEV/Rep/ΔprM/LUC, которая содержит делецию из 282 нуклеотидов (нт 531-812) в гене prM, получали два фрагмента ПЦР-амплификацией pJEV/FL, а именно фрагмент prM1 с праймерами DelF и prM1R (представленным SEQ ID NO:58) и фрагмент prM2 с праймерами prM2F (представленным SEQ ID NO:59) и DelR. Два фрагмента (PacI-XhoI-часть 666 п.н. ампликонов фрагмента prM1 и XhoI-SfiI-часть 1616 п.н. ампликонов фрагмента prM2) лигировали с фрагментами SfiI-NsiI 10264 п.н. и NsiI-PacI 8011 п.н. pJEV/FL/LUC с получением конструкции pJEV/Rep/ΔprM/LUC. Для конструирования pJEV/Rep/ΔЕ/LUC, которая содержит делецию из 1170 нуклеотидов (нт 1032-2201) в гене Е, получали два фрагмента ПЦР-амплификацией pJEV/FL, а именно фрагмент Е1 с праймерами DelF и Е1R (представленным SEQ ID NO:60) и фрагмент Е2 с праймерами E2F (представленным SEQ ID NO: 61) и DelR. Два фрагмента (PacI-XhoI-часть 1167 п.н. ампликонов фрагмента prM1 и XhoI-SfiI-часть 227 п.н. ампликонов фрагмента prM2) лигировали с фрагментами SfiI-NsiI 10264 п.н. и NsiI-PacI 8011 п.н. pJEV/FL/LUC с получением конструкции pJEV/Rep/ΔЕ/LUC (фиг.11А).

Во-вторых, авторы данного изобретения сконструировали панель из трех векторов, содержащих вирусные репликоны JEV, которые содержат двойную делецию в рамке считывания в структурных генах JEV. Два фрагмента pJEV/FL/LUC (фрагменты SfiI-NsiI 10264 п.н. и NsiI-PacI 8011 п.н.) лигировали с (i) PacI-HindIII-фрагментом 438 п.н. pJEV/Rep/ΔС/LUC и HindIII-SfiI-фрагментом 1646 п.н. pJEV/Rep/ΔprM/LUC с получением pJEV/Rep/ΔС+ΔprM/LUC, (ii) PacI-MluI-фрагментом 866 п.н. pJEV/Rep/ΔС/LUC и MluI-SfiI-фрагментом 330 п.н. pJEV/Rep/ΔС+ΔЕ/LUC или (iii) PacI-MluI-фрагментом 788 п.н. pJEV/Rep/ΔprM/LUC и MluI-SfiI-фрагментом 330 п.н. pJEV/Rep/ΔЕ/LUC с получением pJEV/Rep/ΔprM+ΔЕ/LUC (фиг.11А).

В третьих, авторы данного изобретения создали серию из двух векторов, содержащих вирусные репликоны JEV, в которых отсутствуют все структурные белки JEV. Для создания pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC два фрагмента pJEV/FL/LUC (фрагменты SfiI-NsiI 10264 п.н. и NsiI-PacI 8011 п.н.) лигировали с PacI-MluI-фрагментом 590 п.н. pJEV/Rep/ΔС+ΔprM/LUC и MluI-SfiI-фрагментом 330 п.н. pJEV/Rep/ΔЕ/LUC. Авторы данного изобретения сконструировали также pJEV/Rep/NS1/LUC, которая содержит 35 N-концевых и 24 С-концевых аминокислот белка С, за которыми следует непосредственно N-конец белка NS1 и остальная часть вирусного генома. Сначала синтезировали фрагмент из pJEV/Rep/ΔС/LUC при помощи ПЦР с праймерами DelF и NS1R (представленным SEQ ID NO:62). Затем синтезировали фрагмент из pJEV/FL с праймерами NS1F (представленным SEQ ID NO:63) и RR (представленным SEQ ID NO:64). Эти два фрагмента сливали посредством второго раунда ПЦР с праймерами DelF и RR. PacI-ApaLI-фрагмент 474 п.н. полученных ампликонов лигировали с фрагментами ApaI-BamHI 3038 п.н. и BamHI-PacI 15122 pJEV/FL/LUC с получением pJEV/Rep/NS1/LUC (фиг.11А).

Кроме pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC и pJEV/Rep/NS1/LUC, авторы данного изобретения сконструировали также восемь других векторов, содержащих вирусные репликоны JEV. BamHI-NotI-фрагмент 6797 п.н. pJEV/FL/EGFP лигировали с (i) BamHI-NotI-фрагментом 11529 п.н. pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC с получением pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/EGFP или (ii) BamHI-NotI-фрагментом 10968 п.н. pJEV/Rep/NS1/LUC с получением pJEV/Rep/NS1/EGFP. SacII-NotI-фрагмент 5792 п.н. pJEV/FL/LacZ лигировали с (i) фрагментами NotI-PacI 7456 п.н. и PacI-SacII 7464 п.н. pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC с получением pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LacZ или (ii) фрагментами NotI-PacI 7456 п.н. и PacI-SacII 6903 п.н. pJEV/Rep/NS1/LUC с получением pJEV/Rep/NS1/LacZ. BamHI-NotI-фрагмент 6663 п.н. pJEV/FL/РАС лигировали с (i) BamHI-NotI-фрагментом 11529 п.н. pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC с получением pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/РАС или (ii) BamHI-NotI-фрагментом 10968 п.н. pJEV/Rep/NS1/LUC с получением pJEV/Rep/NS1/РАС.

<10-2-2> Гетерологичные белки экспрессируются из различных самореплицирующихся, самоограничивающихся вирусных репликонов JEV

Для независимой экспрессии чужеродных генов с использованием аппарата репликации РНК JEV авторы данного изобретения генерировали панель самореплицирующихся самоограничивающихся вирусных репликонов, которые удовлетворяют строгим требованиям безопасности (фиг.11А). Сначала авторы данного изобретения использовали репортер LUC в качестве гетерологичного гена, так как он облегчает мониторинг вирусной репликации чувствительным и количественным образом. Таким образом, множество содержащих вирусные репликоны векторов конструировали тщательным образом в контексте pJEV/FL/LUC посредством делеции в рамке считывания одного, двух или всех вирусных структурных генов (С, prM и Е) с учетом мембранной ориентации каждого белка (фиг.11А).

Активности LUC клеток ВНК-21, которые были трансфицированы различными вирусными репликонами, строили в виде графика в зависимости от времени (фиг.11В). В клетках ВНК-21, трансфицированных компетентной по репликации РНК JEV/FL/LUC (, черный) в качестве положительного контроля, начальная активность LUC при 6 часах трансфекции была 5,5±0,3×10³ RLU. Эта активность разительно увеличивалась до 2,7±0,5×10⁶ RLU при 48 часах после трансфекции и поддерживалась до 96 часов после трансфекции. В клетках ВНК-21, трансфицированных некомпетентной по репликации РНК JEV/FL/LUC^REP- (, черный) начальная активность LUC, экспрессируемая из введенной вирусной РНК при 6 часах после трансфекции, была сходной, а именно 5,2±0,6×10³ RLU. Однако эта активность постепенно уменьшалась на протяжении времени до 8,8±1,0 RLU при 96 часах после трансфекции, что является эквивалентным фоновой люминесценции необработанных клеток. Кроме pJEV/Rep/ΔСС/LUC (, синий), который лишен последовательности в 3'-NTR, которая является консервативной во всех флавивирусах (Bredenbeek et al., J. Gen. Virol., 2003, 84, 1261-1268; Lo et al., J. Virol. 2003, 77, 10004-10014; Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728), активности LUC клеток ВНК-21, трансфицированных вирусными репликонами, лишенными части генов одного или нескольких структурных белков, были почти идентичными при 6-48 часах после трансфекции активностям LUC ВНК-21-клеток, трансфицированных компетентной по репликации РНК JEV/FL/LUC (, черный). Однако после этого эти активности разительно уменьшались на протяжении времени вследствие вирусного развертывания, сходного с JEV/FL/LUC^REP-. Интересно, что активности LUC, обусловленные РНК JEV/Rep/NS1/LUC ( зеленый), но не JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC ( зеленый) были приблизительно в 5-раз более высокими во всех временных точках в сравнении с активностями других компетентных по репликации вирусных репликонов.

Профили экспрессии LUC согласовались с накоплением вирусного белка (фиг.11С), определяемым количественно иммуноблоттингом с JEV-специфическими гипериммунными сыворотками. Авторы данного изобретения подтвердили также, что другие репортерные гены могут эффективно экспрессироваться в различных обычно используемых клетках животных с использованием векторов на основе вирусных репликонов, таких как pJEV/Rep/NS1 и pJEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ.

<10-3> Конструирование пакующей системы для вирусных репликонов JEV

<10-3-1> Конструирование плазмид экспрессирующих векторов структурных белков JEV на основе вектора pSinRep19

Авторы данного изобретения сконструировали три экспрессирующих вектора структурных белков JEV на основе pSinRep19 (Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994). Для pSinRep19/JEV С-Е фрагмент pJEV/FL амплифицировали с праймером JEVCF (5'-GATTCTAGAATGACTAAAAAACCA, представленным SEQ ID NO:65), который включает в себя сайт XbaI (подчеркнутый) и праймером JEVER (5'-GATGTTTAAACTATTAAGCATGCACATTGGT, представленным SEQ ID NO:66), который включает в себя сайт PmeI (подчеркнутый). XbaI-PmeI-фрагмент 2393 п.н. полученных ампликонов лигировали с XbaI-MluI (обработанным ДНК-полимеразой Т4)-фрагментом 10864 п.н. pSinRep19 для конструирования pSinRep19/JEV С-Е (фиг.12А). Для pSinRep19/JEV С-NS1 фрагмент получали ПЦР-амплификацией pJEV/FL с праймером JEVCF и праймером JEVNS1R (5'-GATGTTTAAACTATTAAGCATCAACCTGTGA, представленный SEQ ID NO:67), который включает в себя сайт PmeI (подчеркнутый). Затем XbaI-PmeI-фрагмент 3449 п.н. полученных ампликонов лигировали с XbaI-MluI (обработанным ДНК-полимеразой Т4)-фрагментом 10864 п.н. pSinRep19 для конструирования pSinRep19/JEV С-NS1 (фиг.12А). Для pSinRep19/JEV С-Е-BglII XbaI-BglII (обработанный ДНК-полимеразой Т4)-фрагмент 2559 п.н. pSinRep19/JEV С-NS1 лигировали с XbaI-MluI (обработанным ДНК-полимеразой Т4)-фрагментом 10862 п.н. pSinRep19 (фиг.12А).

<10-3-2> Генерирование пакующих клеточных линий для РНК векторов полученных из JEV репликонов

Применимость экспрессирующих векторов на основе репликонов JEV выясняли развитием пакующих клеточных линий (PCL), которые конститутивно экспрессируют все структурные белки JEV (С, prM и Е) и делают возможной транс-комплементацию эффективной упаковки вирусных репликонов. На основе экспрессирующего вектора pSinRep19, который содержит ген РАС, запускаемый субгеномным промотором, который облегчает отбор (фиг.12А), авторы данного изобретения сконструировали три различные конструкции экспрессионных кассет структурных белков JEV, которые кодируют последовательности для С-Е (pSinRep19/JEV С-Е), С-Е плюс 58 N-концевых остатков NS1 (pSinRep19/JEV С-Е-BglII) и С-NS1 (pSinRep19/JEV С-NS1).

Экспрессию белка, производимую этими векторами, оценивали в клетках ВНК-21, трансфицированных синтетическими РНК, которые были транскрибированы in vitro из соответствующего вектора. pSinRep19 и ее производные линеаризовали расщеплением XhoI. Эти линеаризованные плазмиды использовали в реакциях транскрипции in vitro (25 мкл), использующих РНК-полимеразу SP6, как описано выше. После транскрипции реакционные смеси дополнительно инкубировали с 10 Е ДНКазы I в течение 30 минут и экстрагировали смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт. Выходы РНК определяли количественно на основе [³Н]UTP-включения, измеряемого по абсорбции РНК на фильтровальной бумаге DE-81 (Whatman, Maidstone, UK). РНК (2 мкг) трансфицировали в клетки электропорацией, как описано выше (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). При анализе клеточных лизатов из трансфицированных клеток иммуноблоттингом с JEV-специфическими гипериммунными сыворотками равные количества вирусного гликопротеина Е детектировали в клетках ВНК-21, трансфицированных каждым из этих трех векторов (фиг.12В). Как и задумано, белок NS1 был обнаружен только в клетках, трансфицированных РНК SinRep19/JEV С-NS1 (фиг.12В).

На фиг.12С иллюстрированы два подхода к получению частиц вирусных репликонов JEV (VRP). Один подход включает в себя транзиторную котрансфекцию транскрибируемой in vitro РНК вектора репликона JEV с РНК вектора SinRep19, которая экспрессирует структурные белки JEV. Определение титра и мониторинг упакованных VRP были возможны посредством инфицирования необработанных клеток ВНК-21 этими VRP и затем анализа на экспрессию репортерного гена. Котрансфекция РНК SinRep19/JEV С-NS1 РНК экспрессирующего EGFP вирусного репликона JEV [либо JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/EGFP (, зеленый), либо JEV/Rep/NS1/EGFP (, зеленый)] в нескольких экспериментах давала 1,1-4,3×10⁴ инфекционных единиц/мл (ИЕ/мл) VRP (фиг.12D). Сходные результаты получали с использованием экспрессирующих LacZ вирусных репликонов JEV, а именно либо JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LacZ (□, синий), либо JEV/Rep/NS1/LacZ (, синий). Не наблюдали различия при использовании экспрессионных кассет структурных белков JEV SinRep19/JEV С-NS1 или SinRep19/JEV С-Е-BglII. Однако котрансфекция РНК вектора SinRep19/JEV С-Е с вирусными репликонами, экспрессирующими либо EGFP, либо LacZ, давала приблизительно в 100 раз меньше VRP (фиг.12D). Эти наблюдения были подтверждены котрансфекцией РНК вектора, экспрессирующего все структурные белки JEV, с РНК экспрессирующего LUC репликона JEV, а именно JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ/LUC (□, черный) или JEV/Rep/NS1/LUC (, черный) (фиг.12D).

Другой подход к получению VRP JEV основан на использовании непрерывных PCL, которые установлены трансфекцией клеток РНК экспрессирующего вектора структурных белков JEV и отбором с пуромицином. Клетки ВНК-21 трансфицировали РНК экспрессирующих векторов структурных белков JEV, как упоминалось выше. После трансфекции эти клетки высевали и поддерживали в течение приблизительно 24 часов и эти среды заменяли свежими полными средами, содержащими 10 мкг/мл пуромицина (Sigma). После этого клетки поддерживали в присутствии пуромицина и пассировали или замораживали, как и исходные клетки ВНК-21.

Было показано, что отобранные клетки стабильно экспрессировали структурные белки JEV без каких-либо вредных действий в отношении клетки-хозяина и были слегка более эффективными в продуцировании VRP на основе JEV, чем исходные клетки ВНК-21. Во всех случаях более высокие титры VRP (1,0×10³-1,2×10⁵ ИЕ/мл) получали после трансфекции этих PCL РНК вектора вирусного репликона JEV в сравнении с протоколом, включающим в себя котрансфекцию исходных клеток ВНК-21 РНК двух векторов (фиг.12Е).

Для испытания на присутствие компетентных по репликации вирусных частиц в пакующей системе, разработанной в данном изобретении, необработанные клетки ВНК-21 инфицировали 3×10⁵ ИЕ VRP при MOI 1 в течение 72 часов. Неразбавленный супернатант, полученный из этих инфицированных клеток, дополнительно пассировали три раза для размножения, возможно, присутствующих очень низких количеств компетентных по репликации вирусных частиц. В конце этих пассажей инфицированные клетки испытывали на экспрессию репортерного гена или вирусного белка IFA с использованием JEV-специфических гипериммунных сывороток. Никогда не детектировали компетентных по репликации вирусных частиц. Кроме того, РНК репликона вируса Синдбис, которые экспрессируют структурные белки JEV, не инкапсидировались в высвобожденных VRP.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Как объяснялось выше, аутентичная нуклеотидная последовательность геномной РНК JEV и полноразмерная инфекционная кДНК JEV данного изобретения, синтезированная из нее, могут быть использованы не только для идентификации генов JEV, но также для молекулярно-биологических исследований, включающих в себя репликацию, транскрипцию и трансляцию JEV. Кроме того, они могут применяться также для развития терапевтических агентов, вакцин, диагностических реагентов и диагностических устройств для японского энцефалита и могут быть использованы в качестве экспрессирующего вектора для различных чужеродных генов.

Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что концепции и конкретные варианты осуществления, описанные в предыдущем описании, могут быть легко использованы в качестве основы для модификации и планирования других экспериментов для достижения тех же самых целей данного изобретения. Специалистам с квалификацией в данной области будет также понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не отклоняются от идеи и объема данного изобретения, изложенных в прилагаемой формуле изобретения.

Изобретение относится к области вирусологии и иммунологии. Получена геномная РНК Корейского изолята JEV с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO:15. Также получена инфекционная кДНК из геномной РНК, которая используется для терапии, вакцинации и диагностики. Предложены также рекомбинантный ВАС-вектор, содержащий инфекционную кДНК, способ его получения, способ получения инфекционного РНК-транскрипта JEV, синтетический JEV и вакцина против JEV. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 11 н. и 16 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл.

1. Геномная РНК Корейского изолята JEV, имеющая нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 15, или нуклеотидные последовательности полноразмерной геномной РНК JEV, имеющие более чем 98%-ную гомологию с ней для цели терапевтических, вакцинных и диагностических применений, где геномная РНК JEV составляет 10968 пар оснований в длину и состоит из 95 нуклеотидов 5`-нетраслируемой области (NTR), за которыми следуют 10299 нуклеотидов области, кодирующей единственный полипептид, и терминируется 574 нуклеотидами 3`-нетранслируемой области (NTR).2. Геномная РНК JEV по п.1, где 5`-нетранслируемая область содержит 5`-концевую последовательность, представленную ¹AGAAGT-.3. Геномная РНК JEV по п.1, где 3`-нетранслируемая область содержит 3`-концевую последовательность, представленную -GATCT¹⁰⁹⁶⁸.4. Инфекционная кДНК JEV для цели терапевтических, вакцинных и диагностических применений полученная из полноразмерной геномной РНК JEV по п.1.5. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы), содержащий инфекционную кДНК JEV, где рекомбинантный ВАС-вектор содержит промотор в начале 5`-конца кДНК JEV, последовательности кДНК JEV для полноразмерной геномной РНК JEV и последовательность узнавания рестрикционной эндонуклеазы в конце 3`-конца в качестве runoff-сайта по порядку.6. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где промотором является промотор SP6 или промотор Т7.7. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где последовательность узнавания рестрикционной эндонуклеазы не существует в геномной РНК JEV.8. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где последовательность узнавания рестрикционной эндонуклеазы представляет собой XhoI или XbaI.9. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где кДНК JEV выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных SEQ ID NO:43, 44 и 45, все из которых имеют промотор SP6, и последовательностей, представленных SEQ ID NO:46, 47 и 48, все из которых имеют промотор Т7.10. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где кДНК JEV представляет собой кДНК JEV по п.4.11. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где вектор выбран из группы, состоящей из pBACSP6/JVFL/XhoI, содержащей кДНК JEV, представленную SEQ ID NO:43, pBACSP6/JVFLx/XhoI, содержащей кДНК JEV, представленную SEQ ID NO:44, pBACSP6/JVFLx/XbaI, содержащей кДНК JEV, представленную SEQ ID NO:45, pBACT7/JVFL/XhoI, содержащей кДНК JEV, представленную SEQ ID NO:46, pBACT7/JVPLx/XhoI, содержащей к ДНК JEV, представленную SEQ ID NO:47 и pBACT7/JVFLx/XbaI, содержащей кДНК JEV, представленную SEQ ID NO:48.12. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где вектором является pBACT7/JVFLx/XbaI, имеющий промотор Т7 (номер доступа: КСТС 10346ВР).13. Рекомбинантный ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, где вектором является pBACSP6/JVFLx/XbaI, имеющий промотор SP6 (номер доступа: КСТС 10347ВР).14. Способ получения рекомбинантного BAC-вектора (вектора бактериальной искусственной хромосомы) по п.5, предусматривающий следующие стадии:

1) выделение геномной РНК JEV из клеток, инфицированных JEV;

2) получение кДНК из указанной геномной РНК JEV посредством обратной транскрипции и RT-PCR;

3) детектирование 5`-концевой и 3`-концевой последовательностей указанной кДНК;

4) получение инфекционной кДНК JEV путем соединения промотора в начале 5`-конца и последовательности узнавания рестрикционнои эндонуклеазы в качестве runoff-сайта в конце 3`-конца с указанной кДНК со стадии 2; и

клонирование инфекционной кДНК JEV в ВАС-вектор (вектор бактериальной искусственной хромосомы).

1) расщепление последовательности узнавания рестрикционной эндонуклеазы в runoff-сайте рекомбинантного ВАС-вектора по п.5 ферментом рестрикции;

2) проведение транскрипции in vitro с указанным расщепленным рекомбинантным ВАС-вектором в качестве матрицы в буфере, содержащем РНК-полимеразу, аналог кэп-структуры, rUTP, rGTP, rCTP и rATP.

1) получение рекомбинантного экспрессирующего ВАС-вектора кДНК JEV встраиванием гетерологичных генов в ВАС-вектор кДНК JEV по п.5;

2) получение РНК-транскрипта JEV из рекомбинантного экспрессирующего ВАС-вектора кДНК JEV;

3) получение клетки, трансфицированной вышеупомянутым РНК-транскриптом JEV; и

4) экспрессия чужеродных белков культивированием вышеупомянутой клетки.