Способ определения активности альтернативного пути комплемента для прогнозирования предтромботических состояний Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 G01N33/86 

Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике, в частности к способу прогнозирования тяжести течения вирусных инфекции путем определения гиперкоагуляции и микротромбозов при активации альтернативного пути комплемента человека. Способ основан на коагуляции нитратной плазмы крови в присутствии активатора альтернативного пути комплемента, липополисахарида (ЛПС) и ионов магния.

Тяжелый острый респираторный синдром при коронавирусной болезни (SARS-CoV-2) на сегодняшний день стал причиной более 4 миллионов смертей во всем мире [WHO corona virus disease (COVID-19) dashboard. World Health Organization. Available at: https://covid19.who.int. Accessed September 1, 2021]. У большинства пациентов COVID-19 протекает в легкой или умеренной степени тяжести, и только примерно у 5% пациентов наблюдается тяжелое заболевание, характеризующееся острым респираторным дистресс-синдромом, которое может привести к полиорганной недостаточности и смерти [Huang С. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020;395:497-506; Smadja D.M., et al. COVID-19 is a systemic vascular hemopathy: insight for mechanistic and clinical aspects. Angiogenesis. 2021;24:755-88]. Ранее было показано, что у пациентов с тяжелым течением COVID-19 наблюдается несбалансированный иммунный ответ с нарушением активности интерферона I типа в сочетании с чрезмерным воспалением [Hadjadj J. et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020;369:718-724]. Было показано, что глюкокортикоиды снижают смертность от COVID-19, однако дополнительные методы лечения могут более целенаправленно воздействовать на определенные элементы иммунного ответа [RECOVERY Collaborative Group.Horby P. et al. Dexamethasone in hospitalized patients with Covid-19 - preliminary report. N Engl J Med. 2021;384:693-704]. В этом контексте система комплемента стала привлекательным кандидатом.

Система комплемента играет ключевую роль во врожденном иммунитете на стыке с адаптивной иммунной системой [Reis ES et al. New insights in to the immune functions of complement. Nat Rev Immunol. 2019;19:503-16]. Активация каскада комплемента приводит к расщеплению СЗ и отложению СЗb на активирующих поверхностях, запуская фагоцитоз или расщепление С5 на С5а и C5b и последующее образование мембраноатакующего комплекса C5b-9, что приводит к нарушению клеточной мембраны. Кроме того, С3а и С5а являются анафилатоксинами, способными рекрутировать и активировать лейкоциты, тем самым преодолевая разрыв между врожденным и адаптивным иммунитетом и способствуя воспалению. Каскад комплемента может быть активирован различными путями, все из которых сходятся к расщеплению С3: так, один из них - классический путь обнаруживает связанные антитела или другие белки острой фазы через C1q; второй - лектиновый путь распознает углеводные структуры в патогенах и поврежденных мембранах клеток. Активация комплемента связана с тяжестью заболевания при бактериальной и вирусной пневмонии, респираторном дистресс-синдроме и полиорганной недостаточности [Rittirsch D. et al. Functional roles for C5a receptors in sepsis. Nat. 2008;14:551-7]. Что касается SARS-CoV-2, система комплемента была одним из наиболее сильно индуцируемых внутриклеточных путей в инфицированных эпителиальных клетках легких, обусловленным транскрипцией C1r, C1s, фактора В и С3 [Yan В. et al. SARS-CoV-2 drives JAK1/2-dependent local complement hyperactivation. Sci Immunol. 2021; 6]. Кроме того, в сыворотке пациентов с COVID-19 были обнаружены множественные продукты системы комплемента, включая sC5b-9, С5а, C3bc, C3bBbP и C4d [Holter JC et al. Systemic complement activation is associated with respiratory failure in COVID-19 hospitalized patients. Proc Natl Acad Sci USA. 2020; 117:25018-25]. Соответственно, у пациентов с COVID-19, с тяжелым течением заболевания, наблюдались повышенные концентрации в плазме С5а, С3а и sC5b9 [Carvelli J. et al. Association of COVID-19 inflammation with activation of the C5a-C5aRl axis. Nature. 2020;588:146-50; Gao T, et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over-activation. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.29.20041962v2.full.pdf; Ma L, et al. Increased complement activation is a distinctive feature of severe SARS-CoV-2 infection. Sci Immunol. 2021; 6; Peffault de Latour R, et al. Complement C5 inhibition in patients with COVID-19 - a promising target? Haematologica. 2020; 105:2847-50], а генетические дефекты в генах, регулирующих комплемент, таких как CD55 и фактор Н, были связаны с тяжестью заболевания [Ramlall V. et al. Immune complement and coagulation dysfunction in adverse outcomes of SARS-CoV-2 infection. Nat Med. 2020;26:1609-15]. Кроме того, антитела против C5aR1 ингибировали повреждение легких у мышей с нокаутом C5aR1 человека, что указывает на то, что нацеливание на комплемент может снизить тяжесть заболевания [Carvelli J. et al. Association of COVID-19 inflammation with activation of the C5a-C5aR1 axis. Nature. 2020; 588:146-50].

Что связывает систему комплемента с тяжестью COVID-19, до сих пор плохо изучено, но одна из гипотез заключается в его связи с коагулопатией [Lo MW et al. COVID-19: Complement, coagulation, and collateral damage. J Immunol. 2020;205:1488-95]. Было показано, что тяжелая форма COVID-19 вызывает тромбоз [Middeldorp S. et al. Incidence of venous thromboembolism in hospitalized patients with COVID-19. J Thromb Haemost. 2020; 18:1995-2002; Oxley TJ, et al. Large-vessel stroke as a presenting feature of Covid-19 in the young. N Engl J Med. 2020;382:e60], а маркеры коагуляции связаны с критическим состоянием заболевания. Помимо выявленных связей между воспалением и коагулопатией, данные свидетельствуют о перекрестных связях между каскадами комплемента и коагуляции [Ward PA. The dark side of C5a insepsis. Nat Rev Immunol. 2004;4:133-42].

Хотя исследования показали связь активации комплемента с тяжелым течением COVID-19, интегративный подход, оценивающий вклад путей комплемента как на белковом, так и на транскриптомном уровне, отсутствует. Чтобы решить эту проблему, были проанализировали уровни РНК и белков компонентов трех путей комплемента у пациентов с COVID-19 и у здоровых людей [Boussier J. et al. Severe COVID-19 is associated with hyperactivation of the alternative complement pathway. J Allergy Clin Immunol. 2022; 149(2):550-6.е2]. С этой целью систематически оценивали уровни РНК 28 генов комплемента в циркулирующей цельной крови пациентов с COVID-19 и здоровых людей, включая гены альтернативного пути, данные по которым остаются недостаточными. Была обнаружена дифференциальная экспрессия генов, участвующих в системе комплемента, но с различными паттернами экспрессии: в то время как у пациентов с умеренным заболеванием была повышенная экспрессия генов классического пути, тяжелое заболевание было связано с повышенной активацией лектинового и альтернативного пути, что коррелировало с маркерами воспаления и коагулопатии. Кроме того, пропердин, основной положительный регулятор альтернативного пути, показал высокую экспрессию РНК, но был обнаружен в низких концентрациях у пациентов с тяжелым и критическим состоянием, что предполагает его отложение в местах активации комплемента. Примечательно, что низкие уровни пропердина были в значительной степени связаны с использованием искусственной вентиляции легких. Это исследование проливает свет на роль альтернативного пути при тяжелом течении COVID-19 и дает дополнительное обоснование для тестирования препаратов, ингибирующих альтернативный путь системы комплемента.

У больных с тяжелым течением COVID-19 наблюдаются системные микротромбозы и тромбоэмболии, что подтверждается повышенным уровнем маркера гиперкоагуляции - Д-димера [Ramlall V. et al. Immune complement and coagulation dysfunction in adverse outcomes of SARS-CoV-2 infection. Nat Med. 2020;26:1609-15; Middeldorp S. et al. Incidence of venous thromboembolism in hospitalized patients with COVID-19. J Thromb Haemost. 2020;18:1995-2002].

Помимо выявленных связей между воспалением и коагулопатией, полученные данные свидетельствуют о перекрестной связи между каскадами комплемента и коагуляции [Ward P. A hedark side of С5а in sepsis. Nat Rev Immunol. 2004;4:133-42]. Хотя исследования показали связь активации комплемента с тяжелым течением Covid-19, интегративных подходов (методов), оценивающих вклад активации комплемента как на белковом, так и на генетических уровнях, в настоящее время не разработано.

Известен способ оценки гемостаза с использованием теста тромбодинамики. Тромбодинамика как метод исследования плазменного гемостаза был предложен в 1994 г. [Атауллаханов Ф.И. и др. Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель. Биофизика. 1994; 39(1):97-106]. В основу метода положена модель распространения сгустка, начиная от повреждения сосудистой стенки вглубь сосуда. Имитация поврежденной сосудистой стенки достигается путем нанесения тонкого (30-50 нм) слоя тканевого фактора на поверхность вставки-активатора, которая и запускает процесс образования сгустка на поверхности пластины. В ходе исследования оцениваются параметры пространственного роста сгустка (лаг-период, Tlag), начальная скорость сгустка (Vo), стационарная скорость сгустка (Vst), размер сгустка (CS), оптическая плотность сгустка (CD). Таким образом, врач получает возможность характеризовать процессы активации свертывания с участием тканевого фактора. Также этот метод позволяет регистрировать феномен спонтанного образования сгустка.

Недостатком метода тромбодинамики является низкая производительность (2 анализа в течение 45 мин), необходимость дополнительной подготовки пробы путем высокоскоростного центрифугирования, необходимость специального прибора для регистрации теста тромбодинамики, набора реагентов и расходных материалов и, соответственно, высокая себестоимость одного анализа для рутинных исследований. Также недостатком метода тромбодинамики является использование ингибитора контактного пути коагуляции, ингибитора трипсина из кукурузы, который снижает информативность теста и оценивает только активацию свертывания через тканевой фактор. Также тест тромбодинамики не отражает участие комплемента в гемостазе.

Наиболее близким техническим решением является скрининг-тест определения активности контактного пути коагуляции [Патент №2660706. Опубл. 09.07.2018 г. Бюл. №19]. Суть теста заключается в том, что проводят рекальцификацию путем добавления раствора хлорида кальция к цитратной плазме крови в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа, инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Определение коагуляции плазмы проводят турбидиметрически при длине волны 450 нм с 5-минутным интервалом. Коагуляцию плазмы в течение 10 мин характеризуют как гиперкоагуляцию, 15 мин - повышенную коагуляцию, 20 мин - как нормальную коагуляцию плазмы крови и 25 и более мин как гипокоагуляцию.

Основным недостатком СТОКПК является анализ только коагуляции цитратной плазмы при рекальцификации, и не учитывается вклад альтернативного пути активации системы комплемента в гемостаз и, как следствие, гиперкоагуляция и системный микро- и макротромбоз у больных с COVID-19.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа для прогнозирования тяжести течения COVID-19 или другой инфекции у здоровых лиц путем выявления гиперкоагуляции контактного пути активации плазменного гемостаза при активации альтернативного пути системы комплемента человека.

Техническим результатом предлагаемого способа является прогнозирование гиперкоагуляции плазмы и угрозы системного тромбоза при активации альтернативного пути системы комплемента в тесте определения активности контактного пути коагуляции, повышение производительности, сокращение длительности процедуры исследования, упрощение, удешевление, а также адаптация метода для рутинных скрининговых исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий практического здравоохранения.

Указанный результат достигается тем, что проводят рекальцификацию цитратной плазмы в присутствии ионов магния и активатора альтернативного пути системы комплемента, липополисахарида, в 96-ти луночных иммунологических планшетах с плоским дном, инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Определение коагуляции плазмы проводят турбидиметрически при длине волны 450 нм в течение 30 мин с 5-минутными интервалами между измерениями. В качестве контроля в этих пробах параллельно проводят скрининг-тест определения активности контактного пути коагуляции, т.е. рекальцификацию цитратной плазмы без ЛПС. Рассчитывают % коагуляции фибриногена при активации альтернативного пути. Усиление коагуляции фибриногена при активации альтернативного пути в тесте активации контактного пути (СТОКПК) до 19% считают низкой, от 20 до 70% - повышенной коагуляцией ФГ, свыше 70% - гиперкоагуляцией, угрозой системного микротромбоза и полиорганной недостаточности при COVID-19 или при других вирусных заболеваниях.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1, готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Тест рекальцификации плазмы проводят в присутствии ионов магния и активатора альтернативного пути системы комплемента, липополисахарида в опытной пробе и без ЛПС (контрольная проба), в 96-ти луночных плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа. Проводят инкубацию при 37°С в течение 30 мин. Определение коагуляции плазмы проводят методом турбидиметрии при длине волны 450 нм с интервалами измерения 5 мин.

Определение оптимальной концентрации кальция и магния для коагуляции цитратной плазмы в тесте активации контактного пути коагуляции. Предварительно в 96-ти луночных плоскодонных планшетах раствор, содержащий 0,15М CaCl₂ и 0,5М MgCl₂, был прогрессивно раститрован по 25 мкл, начиная с первой лунки по 8 лунку включительно. Затем добавляют в пробы 50 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4 и 25 мкл пулированной цитратной плазмы относительно здоровых доноров. Тщательно перемешивают и измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (0 мин) и планшету с пробами ставят на 30-минутную инкубацию при 37°С. Измерение поглощения проб для контроля степени коагуляции проводят каждые 5 мин. Полученные данные представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, коагуляция 25% пулированной цитратной плазмы наблюдается в присутствии 25 мкл (разведения от 1:8 до 1:64) раствора, содержащего Са²⁺ (0,15 М) и Mg²⁺ (0,5М). Для дальнейших исследований нами использовано разведение 1:31 раствора, содержащего 0,15М Са²⁺ и 0,5М Mg²⁺.

Определение оптимальной концентрации липополисахарида (ЛПС) для активации альтернативного пути комплемента в скрининг-тесте определения контактного пути коагуляции в пулированной цитратной плазме доноров

В лунках 96-луночной плоскодонной планшеты прогрессивно разводят ЛПС (10 мг/мл) по 25 мкл, затем добавляют по 25 мкл буфера, пулированной цитратной плазмы крови здоровых доноров и разбавленного (1:31) раствора Са²⁺ и Mg²⁺. Тщательно перемешивают, измеряют поглощение проб при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа. Далее инкубируют в течение 30 мин при 37°С, измеряя каждые 5 мин для контроля коагуляции плазмы. В качестве контроля ставили: контроль плазмы (без ЛПС) и контроль бланка плазмы (без хлорида кальция и магния). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, ЛПС дозо-зависимо усиливает коагуляцию по контактному пути активации плазменного гемостаза.

Таким образом, рекальцификация цитратной плазмы в присутствии Mg²⁺ и ЛПС приводит к гиперкоагуляции плазмы за счет активации альтернативного пути системы комплемента. В дальнейших исследованиях нами использован 10 мкл раствора ЛПС с концентрацией 4 мг/мл.

Пример. Исследование плазменного гемостаза с использованием предлагаемого теста и прототипа (скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК)

Для определения влияния активации альтернативного пути на плазменный гемостаз нами проведены следующие исследования. В лунки 96-луночной плоскодонной планшеты последовательно добавляют по 25 мкл ЛПС (4 мг/мл), трис-имидазолового буфера, рН 7,4, цитратной плазмы крови исследуемых пациентов и разбавленного (1:31) раствора Са²⁺ и Mg²⁺. Тщательно перемешивают, измеряют поглощение проб при 450 нм на фотометре для иммунофементного анализа. Далее инкубируют в течение 30 мин при 37°С, измеряя каждые 5 мин для контроля коагуляции плазмы. В качестве контроля ставили: контроль плазмы (без ЛПС). Полученные результаты коагуляции исследуемых цитратных плазм на 25 минуте инкубации представлены на фиг. 1.

Как видно на фиг. 1, только в двух пробах из 16 тестированных проб цитратной плазмы (пробы №2 и №7) не определяется усиление коагуляции цитратной плазмы в тесте активации контактного пути при параллельной активации альтернативного пути.

Для количественной оценки активности альтернативного пути в тесте активации контактного пути коагуляции был проведен расчет количества общего фибриногена в тестируемых пробах как описано в работе [Патент №2703541. Опубл. 21.10.2019 г. Бюл. №30]. Для этого использовали формулу:

где А₄₅₀(60 мин) и А₄₅₀(0) - оптическая плотность тестируемых проб при инкубации 60 мин и 0 мин соответственно, 13,3 - переводной коэффициент в г/л фибриногена.

Далее рассчитывали количество фибриногена в опытной и контрольной пробах после 25 инкубации. Полученные результаты представлены на фиг. 2.

Как видно из данных, представленных на фиг. 2, в пробе №7 в тесте активации контактного пути коагуляции при инкубации в течение 60 мин коагуляция плазмы не определялась. Поэтому в дальнейших исследованиях были использованы оставшиеся 15 проб.

Также из представленных данных видно, что при инкубации в течение 25 мин наблюдается коагуляция фибриногена в тесте активации контактного пути в отсутствии ЛПС. Поэтому для определения вклада активации альтернативного пути нами получена разность между фибриногеном (ФГ), полученным при активации альтернативного пути (опыт) и в условиях исключающих активацию альтернативного пути (контрольные пробы). Полученные данные представлены на фиг. 3.

Рассчитывают % коагуляции фибриногена при активации альтернативного пути (фиг. 4).

Как видно из данных, представленных на фиг. 4, в 7 пробах (№2, 6, 9, 12, 13, 14 и 16) коагуляция фибриногена при активации альтернативного пути ниже 20%, также в семи пробах (№1, 3, 4, 8, 11 и 15) коагуляция фибриногена от 20 до 70% и только в пробе №5 коагуляция фибриногена свыше 70%.

Таким образом, усиление коагуляции фибриногена при активации альтернативного пути в тесте активации контактного пути (СТОКПК) до 20% считают низкой, от 20 до 70% - повышенной коагуляцией ФГ, свыше 70% - гиперкоагуляцией, угрозой системного микротромбоза и полиорганной недостаточности при COVID-19 или при других вирусных заболеваниях.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Влияние активации альтернативного пути комплемента на контактный путь коагуляции плазмы: ряд 1 - Опыт; ряд 2 - контроль контактного пути коагуляции плазмы.

Фиг. 2. Активность альтернативного пути комплемента в тесте коагуляции фибриногена: ряд 1 - ФГ в плазме; ряд 2 - ФГ при активации АПК; ряд 3 - ФГ в контрольных пробах.

Фиг. 3. Содержание фибриногена в плазме (ряд 1) и фибриногена, генерированного при активации альтернативного пути комплемента в тесте коагуляции ФГ (ряд 2).

Фиг. 4. Коагуляция ФГ в % при активации альтернативного пути комплемента.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу определения активности альтернативного пути комплемента для прогнозирования предтромботических состояний. Указанный способ включает смешивание цитратной плазмы крови с раствором, содержащим 0,15 М хлорида кальция, с последующей регистрацией свертывания на фотометре для иммуноферментного анализа, причем рекальцификацию цитратной плазмы проводят в присутствии активатора альтернативного пути системы комплемента, представляющего собой липополисахарид, в концентрации 4 мг/мл, и 0,5 М ионов магния. При этом в качестве контроля в этих пробах параллельно проводят рекальцификацию цитратной плазмы без липополисахарида, рассчитывают процент коагуляции фибриногена при активации альтернативного пути. Настоящее изобретение обеспечивает прогнозирование гиперкоагуляции плазмы и угрозы системного тромбоза при активации альтернативного пути системы комплемента в тесте определения активности контактного пути коагуляции. 4 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ определения активности альтернативного пути комплемента для прогнозирования предтромботических состояний, включающий смешивание цитратной плазмы крови с раствором, содержащим 0,15 М хлорида кальция, разведенного 1:31, с последующей регистрацией свертывания на фотометре для иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что рекальцификацию цитратной плазмы проводят в присутствии активатора альтернативного пути системы комплемента, представляющего собой липополисахарид, в концентрации 4 мг/мл, и 0,5 М ионов магния, разведенного в соотношении 1:31, и инкубируют в течение 30 мин при 37°С, определение коагуляции плазмы проводят турбидиметрически при длине волны 450 нм в течение 30 мин с 5-минутными интервалами между измерениями, в качестве контроля в этих пробах параллельно проводят тест определения активности контактного пути коагуляции, т.е. рекальцификацию цитратной плазмы без липополисахарида, рассчитывают процент коагуляции фибриногена при активации альтернативного пути, при усилении коагуляции фибриногена в тесте определения активности контактного пути коагуляции до 19% коагуляцию считают низкой, от 20 до 70% коагуляцию считают нормальной, свыше 70% коагуляцию считают гиперкоагуляцией и прогнозируют угрозу системного микротромбоза и полиорганной недостаточности при COVID-19 или других вирусных инфекциях.