Способ определения антикоагулянтного потенциала плазмы крови для диагностики предтромботических состояний Российский патент 2025 года по МПК G01N33/49 G01N33/86 G01N33/52 

Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике, в частности к способам определения антикоагулянтного потенциала плазмы (АКПП) крови человека, основанным на рекальцификации цельной цитратной плазмы крови, и может применяться в клинических лабораториях лечебных учреждений для скрининг-исследований АКПП крови для диагностики предтромботических состояний.

Проблема оценки состояния противосвертывающей активности крови является актуальной, поскольку механизмы, лежащие в основе высокой сосудистой смертности при ряде тяжелых заболеваниях, связанных с повреждением эндотелия, остаются окончательно невыясненными. Нарушения показателей гемостаза наблюдаются на всех этапах свертывания крови. Повышение свертываемости крови вследствие депрессии антикоагулянтного звена системы гемостаза ввиду недостаточности лабораторной диагностики, как правило, остается нераспознанным, а следовательно, при отсутствии своевременной коррекции может иметь фатальный исход. Общеизвестно, что своевременная и адекватная коррекция системы гемостаза, в том числе и ее противосвертывающего компонента, предотвращает дисциркуляторные нарушения в жизненно важных органах.

В настоящее время среди заболеваний, приводящих к смерти, по данным Всемирной организации здравоохранения, лидируют сердечно-сосудистые заболевания. При всем разнообразии нозологических форм в данной группе непосредственной причиной смерти больных чаще всего является тромбоз. Именно тромбоз является основным патогенетическим механизмом инфарктов, инсультов и тромбоэмболии легочных артерий.

В последние годы интенсивно разрабатывается и внедряется множество разнообразных программ, направленных на улучшение лечебного процесса при сердечно-сосудистых заболеваниях: высокотехнологическое хирургическое пособие (стентирование, шунтирование), разработка ранних и активных реабилитационных мероприятий, создание новых фармацевтических препаратов. В ближайшей перспективе стоит задача развития профилактического направления - скрининг групп риска с целью выявления больных, которым требуется раннее начало терапии.

Несмотря на многолетние исследования, многие аспекты работы системы гемостаза до сих пор остаются до конца неизученными. Известно, что в работе системы участвуют более 300 реакций. Уже выделены и охарактеризованы все факторы плазменного гемостаза, созданы реагенты, позволяющие измерить концентрацию/активность этих факторов, и опубликовано множество научных работ о том, как те или иные факторы изменяют свою активность при различных патологиях. Однако весь этот гигантский массив накопленных данных очень сложно использовать практическому врачу.

Одной из основных причин, определяющих сложность интерпретации результатов коагулологических тестов, является отсутствие четкой взаимосвязи данных большинства тестов с регистрируемыми врачом клиническими симптомами (за исключением таких простых для интерпретации осложнений/заболеваний как массивная кровопотеря или гемофилии типа А и В).

Большинство случаев неверной трактовки результатов лабораторных исследований системы гемостаза обусловлены отсутствием понимания роли наблюдаемых изменений в патологических процессах организма. И дело часто не в том, что врач недостаточно информирован о принципах работы свертывающей системы крови, а в том, что данные, получаемые в результате исследования, не могут быть интерпретированы как те или иные патологические изменений в силу чисто технических особенностей теста. Классическим примером могут служить тесты АЧТВ (активированное частично тромбиновое время) и протромбиновое время, которые разработаны для диагностики гипокоагулянтных состояний и склонности к кровоточивости при антикоагулянтной терапии. Для выполнения этих задач, а также для укорочения времени проведения теста и лучшей воспроизводимости в ходе исследования к образцу плазмы добавляют активатор в концентрации, существенно превышающей физиологические. Такой подход не мешает диагностике геморрагических состояний, но делает эти тесты практически полностью нечувствительными к гиперкоагулянтным состояниям, т.к. на фоне такой сильной активации образца плазмы тонкие прокоагулянтные изменения нивелируются [Серебрийский И.И. «Глобальные» и «локальные тесты системы гемостаза в диагностике гиперкоагуляционного синдрома. Справочник заведующего КДЛ. 2012. №12. С.27-34].

Несколько особое положение занимает такой тест как измерение уровня Д-димера. Его трактовка часто бывает не совсем однозначной. Причиной тому служит полиэтиологичность происхождения этого маркера. Д-димер является продуктом одновременной работы трех систем: прокоагулянтной и антикоагулянтной при образовании фибринового сгустка - с одной стороны, и фибринолитической при разрушении этого сгустка - с другой. Повышенный уровень Д-димера свидетельствует постфактум о том, что отложение фибриновых нитей уже случилось и в данный момент идет процесс их фибринолиза, но этот тест не может ничего сказать о повышенной предрасположенности к тромбообразованию на момент выполнения анализа.

Повышенные уровни Д-димера и продуктов деградации фибриногена (ПДФ), снижение уровня фибриногена и антитромбина III были связаны с плохим прогнозом при Ковид-19 [Tang N, Li D, Wang X, et al. Abnormal coagulation parameters are associated with poor prognosis in patients with novel coronavirus pneumonia. J Thromb Haemost. 2020; 18:844-7]. Также у пациентов с гриппом, ОРВИ, ВИЧ, хантавирусом, вирусами Эбола, Денге и SARS-Cov-2 наблюдались повышенные уровни D-димера, фрагментов протромбина, тромбин-антитромбиновых комплексов и/или комплексов плазмин-а2-антиплазмин [Goeijenbier М, van Wissen М, van de Weg С, et al. Viral infections and mechanisms of thrombosis and bleeding. J Med Virol. 2012; 84:1680-96]. Как и у пациентов с инфекциями SARS-CoV-2, между повышенным уровнем D-димера и смертностью наблюдалась прямая связь [Wong RS, Wu А, То KF, et al. Haematological manifestations in patients with severe acute respiratory syndrome: Retrospective analysis. BMJ. 2003; 326:1358-62].

Кроме того, во время пандемии H1N1 пациенты с тяжелой формой заболевания имели высокие показатели венозной тромбоэмболии (ВТЭ) и у многих пациентов с тромбоэмболией не было доказательств системного диссеминированного внутрисосудистого синдрома (ДВС) [Centers for Disease Control and Prevention. Intensive-care patients with severe novel influenza A (H1N1) virus infection. Michigan, 2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2009; 58:749-52; Avnon LS, Munteanu D, Smoliakov A, et al. Thromboembolic events in patients with severe pandemic influenza A(H1N1). Eur JIntern Med. 2015; 26:596-8]. Пациенты с ОРДС, вызванным гриппом H1N1 имели более чем 20-кратное увеличение риска легочной эмболии по сравнению с пациентами с ОРДС, несвязанными с H1N1 [Obi AT, Tignanelli CJ, Jacobs BN, et al. Empirical systemic anticoagulation is associated with decreased venous thromboembolism in critically ill influenza A H1N1 acute respiratory distress syndrome patients. J Vase Surg Venous Lymph at Disord. 2019;7:317-24].

COVID-19 ассоциируется с тяжелым заболеванием и высоким риском смерти. Повреждение миокарда может быть результатом системного синдрома воспалительного ответа, а также острых тромботических событий [Corrales-MedinaVF, Madjid М, Musher DM. Role of acute infection in triggering acute coronary syndromes. Lancet Infect Dis. 2010; 10:83-92]. Аналогичные наблюдения повреждения миокарда были обнаружены у пациентов с другими вирусными инфекциями.

Хотя опубликовано всего несколько патологоанатомических отчетов умерших пациентов с COVID-19, гистопатология образцов легких с ранним заболеванием показывает характерные находки ОРДС и доказательства окклюзии мелких сосудов [Xu Z, Shi L, Wang Y, et al. Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome. Lancet Respir Med. 2020; 8:420-2].

Есть несколько механизмов, с помощью которых SARS-CoV-2 инфекция может привести к микрососудистым и макрососудистым тромбозам, в том числе и цитокиновому шторму с активацией лейкоцитов, эндотелия и тромбоцитов, что приводит к активация тканевого фактора, активация коагуляции, образование тромбина и фибрина [Sebag SC, Bastarache JA, Ware LB. Therapeutic modulation of coagulation and fibrinolysis in acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome. Curr Pharm Biotechnol. 2011; 12:1481-96].

Тромбы в легочной микро- и макрососудистой сети наблюдаются у пациентов с ОРДС с явным ДВС-синдром и изменения, соответствующие протромботическому состоянию, обнаружены в крови и в бронхоальвеолярной жидкости этих пациентов [Bone RC, Francis РВ, Pierce АК. Intravascular coagulation associated with the adult respiratory distress syndrome. Am J Med. 1976; 61: 585-9].

Более высокие уровни ПДФ и D-димера наблюдаются у пациентов, у которых развился ОРДС, по сравнению с пациентами со схожими предрасполагающими состояниями, у которых не развивался ОРДС [Haynes JB, Hyers ТМ, Giclas PC, et al. Elevated fibrin(ogen) degradation products in the adult respiratory distress syndrome. Am Rev Respir Dis. 1980; 122:841-7]. Более низкий уровень протеина С и более высокий уровень растворимого тромбомодулина и PAI-1 также связаны с полиорганной недостаточностью, тяжестью заболевания и смертностью при ОРДС [Sapru A, Calfee CS, Liu KD, et al. Plasma soluble thrombomodulin levels are associated with mortality in the acute respiratory distress syndrome. Int Care Med. 2015; 41:470-8; Ware LB, Matthay MA, Parsons PE, et al. Pathogenetic and prognostic significance of altered coagulation and fibrinolysis in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 2007; 35:1821-8; Thompson ВТ, Chambers RC, Liu KD. Acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 2017; 377:1904-5]. Наконец, в плазме крови и бронхоальвеолярной жидкости уровни тканевого фактора у пациентов выше с ОРДС, чем у пациентов с отеком легких [Bastarache JA, Wang L, Geiser T, et al. The alveolare pithelium can initiate the extrinsic coagulation cascade through expression of tissue factor. Thorax. 2007; 62: 608-16].

При повреждении сосуда кровь должна свертываться лишь в месте повреждения. Это обеспечивается имеющейся в крови противосвертывающей системой. Она же, в условиях нормы, играет ведущую роль в сохранении жидкого состояния крови. Различают два типа антикоагулянтов: антикоагулянты прямого действия (предсуществующие) - самостоятельно синтезированные (гепарин, антитромбин III - АТ-Ш, протеин С, протеин S, α₂-макроглобулин); антикоагулянты непрямого действия, образующиеся во время свертывания крови, фибринолиза и активации других протеолитических систем (фибрин-антитромбин I, антитромбин IV, ингибиторы факторов VIII, IX и др.) [Кишкун А.А. Клиническая лабораторная диагностика: учебное пособие. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 976 с]. Из всех предсуществующих антикоагулянтов наиболее универсален по действию и активности антитромбин III (АТ-Ш). Это один из α₂-глобулинов плазмы. Концентрация его в плазме крови около 240 мг/мл и он составляет 75% антикоагулянтной ее активности. Он инактивирует тромбин и почти все другие активированные факторы - XIIa, XIa, Ха, IXa.

Другой антикоагулянт - гепарин, активен только вместе с АТ-Ш. Гепарин способствует фиксации АТ-Ш на поверхности эндотелиальных клеток, что в сотни раз повышает его активность. В печени в присутствии витамина К синтезируются протеин С и протеин S. Они снижают активность факторов V и VIII. Эндотелиальные клетки неповрежденной сосудистой стенки не только препятствуют адгезии тромбоцитов, но и синтезируют простациклин и гепариноподобный фактор (последний синтезируется также и тучными клетками соединительной ткани). Простациклин является мощным ингибитором агрегации тромбоцитов. В процессе свертывания крови и фибринолиза многие прокоагулянты и их метаболиты приобретают антикоагулянтные свойства. Наиболее мощным из них является фибрин, который адсорбирует и инактивирует образующийся при свертывании тромбин, который также проявляет антикоагулянтные свойства. Действуя ферментативно на протромбин, он отщепляет от последнего ингибитор фактора Ха [Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед, 2008. 292 с; Баркаган З.С., Котовщикова Е.Ф., Шилова А.Н. О новых подходах к мониторингу антитромботических средств. Клиническая фармакология и терапия. 2005; Т.14(3):51-3; Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. СПб.: Форма Т, 2006. 208 с.].

Тест системы гемостаза, которые используются в лаборатории в настоящее время, можно разделить на два вида. Первый - «локальные» тесты, результаты которых позволяют охарактеризовать состояние отдельных факторов или звеньев каскадной реакции. В их число входят рутинные тесты, такие как АЧТВ, протромбиновое время (ПВ), протромбиновый индекс (ПТИ), международное нормализованное отношение (MHO), фибриноген, Д-димер, антитромбин III, протеин С, фактор VIII, концентрация и активность некоторых других факторов. Второй - «глобальные» коагулологические тесты, результаты которых позволяют оценивать систему гемостаза в целом тромбоэластография/метрия, тест генерации тромбина и тромбодинамика.

«Локальные» тесты фиксируют изменения активности/концентрации отдельных факторов свертывания, но при этом не могут охарактеризовать, насколько эти локальные изменения повлияли (или не повлияли) на общую способность плазмы больного к образованию сгустка. «Глобальные» тесты могут дать в руки врача интегральную картину совокупных изменений, произошедших со свертывающей системой крови больного, но не способны охарактеризовать отдельные факторы коагуляционного каскада.

Тест генерации тромбина является одним из «глобальных» тестов, разработанных в 2001 г. [Hemker НС, Giesen Р, AlDieri R, et al. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysiol Haemost Thromb. 2003; V. 33:4-15.] Принцип метода заключается в использовании специфического к тромбину флуорогенного субстрата. После предварительной инкубации тромбоцит-богатой плазмы крови в нее вносят буфер, содержащий ионизированный кальций и флуорогенный субстрат.Образующийся тромбин расщепляет субстрат, в результате высвобождается молекула флуорофора, излучение которого автоматически регистрируется флуориметром через равные промежутки времени. Интенсивность свечения пропорциональна концентрации образовавшегося тромбина. На основании измерений с помощью программного обеспечения выстраивается кривая генерации тромбина. В ходе исследования оцениваются время задержки образования тромбина (лаг-период), максимальная скорость образования тромбина (пик), время достижения максимальной скорости (время пик), количество образовавшегося тромбина (площадь под кривой, эндогенный тромбиновый потенциал) и некоторые другие параметры. Недостатком данного теста является использование избыточного количества тканевого фактора в качестве активатора гемостаза, а также дорогостоящего научного оборудования и реагентов (флуориметра и флуорогенного субстрата). Данный тест также не отражает концентрацию и активность природного субстрата тромбина - фибриногена. Учитывая данные недостатки, тест генерации тромбина до сих пор не нашел широкого применения в рутинной практике.

Итоговое гиперкоагуляционное состояние гемостаза является следствием процессов, одновременно происходящих в двух подсистемах: прокоагулянтных изменений любой этиологии в работе свертывающей системы и неудовлетворительной работы антикоагулянтных систем (антитромбин III, протеина С, TFPI) в попытке нивелировать первые. В силу необходимости одновременной оценки суммы вклада всех участников этого процесса «локальные» тесты слабо применимы для решения данной задачи. Напротив, «глобальные» коагулологические тесты по той же самой причине не могут справиться с этим вопросом. Именно поэтому оптимальным представляется комбинированное использование «глобальных» и «локальных» тестов. «Глобальные» тесты позволяют зафиксировать сам феномен гиперкоагуляции, а «локальные» - разобраться в некоторых составляющих его этиологии.

Каждый из методов исследования гемостаза обладает своими выраженными специфическими особенностями в силу различных причин, в том числе технических особенностей реализации того или иного теста, чистоты и специфических свойств реагентов и, конечно, что не менее важно, модели свертывания крови, на основании которой создавался тот или иной тест. Этот список далеко не полон, но он дает представление о значительном количестве причин, обуславливающих уникальную чувствительность и специфичность каждого из тестов в диагностике того или иного нарушения в работе свертывающей системы крови.

У каждого из тестов, относящихся как к классу «глобальных», так и к классу «локальных», есть свои преимущества и недостатки, знание которых позволяет врачу правильно интерпретировать данные о больном, более точно устанавливать диагноз и подобрать максимально адекватное лечение.

В донорской разбавленной плазме in vitro после рекальцификации, даже при отсутствии активаторов, процесс свертывания начинается через 10-20 мин спонтанно в отдельных центрах. Далее спонтанные сгустки увеличиваются в размере, постепенно заполняют весь объем плазмы. Показано также, что количество спонтанных центров с уменьшением числа тромбоцитов в плазме снижается. После ультрацентрифугирования плазмы для удаления всех тромбоцитов и крупных фосфолипидных везикул спонтанные центры практически не образуются. Ингибитор контактной фазы (ингибитор, полученный из зерен кукурузы) значительно снижает число спонтанных сгустков, но не подавляет их полностью [Каротина Н.Г., Ованесов М.В., Плющ О.П., и соавт. Исследование спонтанных сгустков в нормально плазме и плазме больных гемофилией. Гематол. и трансфузиол. 2002; Т. 47:26-30].

Известны лабораторные способы исследования свертывания крови в условиях низкоконтактной активации, основанные на принципе рекальцификации цитратной крови [Исследование системы гемостаза в клинике. Под ред. Баркагана З.С., Барнаул, 1975. 21, 72-73 с; Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. Минск, 1983. 120-124 с; Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Под ред. Балуды В.П. и соавт.Томск, 1980, 55-56 с]. Указанные способы считаются одними из основных в гемостазиологии. Однако накопившийся опыт и расширение знаний в области механизмов свертывания крови показали, что эти способы по своей чувствительности перестали удовлетворять все возрастающим требованиям к выявлению гиперкоагуляции [Rohrer MJ, et al. Ann Isof Surgery. 1988; V.208(5): 554-7].

Известен также тест тромбодинамики - метод исследования плазменного гемостаза, предложенный в 1994 г. [Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.Ю. Пространственные аспекты динамики свертывания крови. П. Феноменологическая модель. Биофизика. 1994; Т. 39(1):97-106]. В основу метода положена модель распространения сгустка начиная от повреждения сосудистой стенки вглубь сосуда. Имитация поврежденной сосудистой стенки достигается путем нанесения тонкого (30-50 нм) слоя тканевого фактора на поверхность вставки-активатора, которая и запускает процесс образования сгустка в плазме. В ходе исследования оценивают параметры пространственного роста сгустка (лаг-период, Tlag), начальную скорость формирования сгустка (Vo), стационарную скорость формирования сгустка (Vst), размер сгустка (CS), плотность сгустка (CD).

Таким образом, врач получает возможность характеризовать процессы активации свертывания с участием тканевого фактора. Также этот метод позволяет регистрировать феномен спонтанного образования сгустка.

Недостатком метода тромбодинамики является низкая производительность (2 анализа в течение 45 мин), необходимость дополнительной подготовки пробы (плазмы) путем высокоскоростного центрифугирования, а также специального прибора для регистрации тромбодинамики, набора реагентов и расходных материалов и, соответственно, высокая стоимость одного анализа для рутинных исследований.

Наиболее близким техническим решением является скрининг-тест определения активности контактного пути коагуляции (СТОКПК), включающий смешивание цитратной плазмы крови с хлоридом кальция с последующей фотометрической регистрацией свертывания. С целью повышения точности используют в качестве активатора контактного пути коагуляции 96-ти луночные плоскодонные полистироловые планшеты для иммуноферментного анализа. Активацию контактного пути коагуляции запускают добавлением раствора хлорида кальция к цитратной плазме и инкубацией при 37°С в течение 30 мин (с интервалом измерения каждые 5 мин). Коагуляцию плазмы в течение 10 мин характеризуют как гиперкоагуляцию, 15 мин - повышенную коагуляцию, 20 мин - как нормальную коагуляцию плазмы крови и 25 и более мин - как гипокоагуляцию.

Единственным недостатком данного теста является использование разбавленной цитратной плазмы при рекальцификации для повышения чувствительности теста за счет разбавления в концентрации естественных антикоагулянтов крови и нивелирование роли антикоагулянтов при коагуляции цитратной плазмы.

Задачей настоящего изобретения является устранение данного недостатка и разработка способа определения антикоагулянтного потенциала плазмы крови (АППК) человека для диагностики предтромботических состояний и прогноза тяжести течения вирусных инфекции или реперфузионного синдрома при сосудистых катастрофах (острые инфаркты миокарда, ишемического инсульта).

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности теста при диагностике гиперкоагуляций за счет запуска контактного пути активации коагуляции неразведенной цитратной плазмы, упрощение методики исследования гемостаза по сравнению с прототипом, а также быстрая адаптация метода для рутинных исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий.

Указанный результат достигается тем, что проводят рекальцификацию неразведенной цитратной плазмы крови путем добавления раствора хлорида кальция в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа в качестве кювет, инкубируют пробы в течение 30 мин при 37°С, а определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с 5-ти минутными интервалами измерения. Коагуляцию плазмы в течение 30 мин характеризуют как гиперкоагуляцию, связанную с дефицитом функциональной активности ингибиторов контактного пути коагуляции плазмы крови.

Способ осуществляют следующим образом: проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1, готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем для запуска контактного пути активации плазменного гемостаза добавляют оптимальную концентрацию раствора хлорида кальция к неразведенной цитратной плазме. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводят каждые 5 мин.

Определение оптимальной концентрации хлорида кальция для запуска контактного пути коагуляции неразведенной цитратной плазмы Предварительно в лунки №1-12 столбцов 96-ти луночных плоскодонных планшет вносят 1, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл 10% раствора хлорида кальция. Контроль плазмы (7 лунка столбца) не содержит CaCl₂. Затем вносят цитратные плазмы по 100 мкл с известной активностью контактного пути коагуляции, которые заранее были определены в тесте «СТОКПК». Тщательно перемешивают и измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для ИФА анализа (0 мин), ставят на 30-минутную инкубацию при 37°С. Измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводят каждые 5 мин. Далее инкубируют дополнительно в течение 60 и 120 мин для оценки полной коагуляции исследуемых проб в динамике. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, коагуляция неразведенной плазмы только в трех пробах (№2, 3 и 6) наблюдается в течение 30 мин после добавления 2 мкл 10% CaCl₂ к 100 мкл цитратной плазмы. Дальнейшая инкубация проб в течение 60 мин приводит к коагуляции еще 5 проб. На 120 минуте инкубации наблюдается коагуляция еще 3 проб и только одна проба (плазма №15) не коагулирует за это время.

Таким образом, оптимальное количество 10% CaCl₂ для коагуляции 100 мкл неразведенной цитратной плазмы при рекальцификации составило 2 мкл в конечном объеме 102 мкл и инкубация в течение 30 мин является оптимальным для тестирования гиперкоагуляции плазмы.

Влияние концентрации цитратной плазмы на активность контактного пути коагуляции Предварительно в лунки №1-6 столбцов 96-ти луночных плоскодонных планшет вносят 100, 50, 25, 20, 15 и 10 мкл цитратной плазмы исследуемых проб пациентов. Затем добавляют соответствующее количество 10% раствора хлорида кальция. Контроль плазмы (7 лунка столбца) не содержит раствора CaCl₂. Тщательно перемешивают и измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для ИФА анализа (0 мин), ставят на 30-минутную инкубацию при 37°С.Измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводят каждые 5 мин. Далее дополнительно инкубируют в течение 30 мин для полной коагуляции плазм. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице, только в пробе №10 наблюдается коагуляция цельной цитратной плазмы при рекальцификации.

Таким образом, рекальцификация цельной плазмы только у одного пациента приводит к коагуляции.

Пример. Исследование антикоагулянтного потенциала плазмы (АКПП) крови с использованием предлагаемого теста, прототипа и теста тромбодинамика

Для оценки информативности предлагаемого теста АППК для диагностики предтромботических состояний (гиперкоагуляции) были проведены сравнительные исследования с использованием скрининг-теста определения активности контактного пути коагуляции (СТОКПК) и модифицированного теста тромбодинамики (мтТД). Модификация теста тромбодинамики заключалась в том, что тест рекальцификации цитратной плазмы проводили в кюветах для тромбодинамики, а коагуляцию плазмы регистрировали на приборе для тромбодинамики. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, из 21 пробы цитратной плазмы в тесте АППК гиперкоагуляция выявлена в 3 пробах (№3, 6, 12), причем наиболее низкий антикоагулянтный потенциал выявлен в пробе №3 (коагуляция в течение 15 мин). В тесте определения активности контактного пути коагуляции в пробах №6, 12 и 16 выявлены гиперкоагуляция (коагуляция в течение 10 мин). Модифицированный тест тромбодинамики выявил гиперкоагуляцию в пробах №6 и 12.

Таким образом, данные, полученные предлагаемым тестом АППК и мтТД однонаправленно выявляют гиперкоагуляцию, в то время как данные СТОКПК выявили гиперкоагуляцию в пробе №16. Данный факт можно объяснить функциональным дефицитом ингибиторов гемостаза при разведении плазмы в 4 раза. В концентрированной плазме пробы №16 в тестах АППК и мтТД мы не выявляем гиперкоагуляции.

Таким образом, предлагаемый способ отличается простотой, реагенты и расходные материалы являются доступными для диагностических лабораторий. Для регистрации коагуляции плазмы требуется термостат для 96-ти луночных плоскодонных планшетов и фотометр для иммуноферментного анализа. Использование простого и информативного теста определения антикоагулянтного потенциала плазмы крови позволяет проводить скрининг и выявлять людей склонных к тромбозу как на фоне антикоагулянтной терапии, так и у практически здоровых людей и лиц с постковидным синдромом, что позволит начать раннюю профилактику тромбозов, инсультов и инфарктов на этапе до сердечно-сосудистых катастроф.

Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для скрининг-теста определения антикоагулянтного потенциала плазмы крови для диагностики предтромботических состояний. Суть теста заключается в рекальцификации цельной плазмы крови хлоридом кальция и регистрации коагуляции на фотометре для иммуноферментного анализа. Коагуляция цельной плазмы при инкубации в течение 30 мин при 37°С свидетельствует о сниженном антикоагулянтном потенциале плазмы крови и об угрозе тромбоза при вирусной инфекции или при воспалительных состояниях человека, а также при постковидном синдроме. Внедрение предлагаемого теста для определения антикоагулянтного потенциала плазмы крови позволит своевременно начать профилактику тромбозов, инсультов и инфарктов на этапе до сердечно-сосудистых катастроф. 3 табл., 1 пр.

Способ определения антикоагулянтного потенциала плазмы крови для диагностики предтромботических состояний, включающий смешивание цитратной плазмы крови с хлоридом кальция в 96-луночных плоскодонных планшетах с последующей регистрацией свертывания, отличающийся тем, что запускают активацию контактного пути коагуляции добавлением 2 мкл 10% раствора хлорида кальция к 100 мкл цитратной плазмы, инкубируют в течение 30 мин при 37°С, определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 5 мин, коагуляцию плазмы в течение 30 мин характеризуют как гиперкоагуляцию, связанную с низким антикоагулянтным потенциалом плазмы крови человека.