Способ определения ингибиторного потенциала крови для прогнозирования неконтролируемой активации системы комплемента при Ковид-19 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может быть использовано для определения ингибиторного потенциала крови для прогнозирования неконтролируемой активации системы комплемента при Ковид-19.

Коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19) имеет бимодальное течение: первая фаза характеризуется гриппоподобными симптомами, а вторая связана с пневмонией и полиорганным поражением. Конечный клинический результат неоднороден. В то время как у большинства пациентов наблюдается легкое или умеренное заболевание верхних дыхательных путей, не требующее госпитализации, у некоторых развивается тяжелое заболевание и опасный для жизни острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) [Zhou F., et al. Clinical course and risk factors for mortality of adult in patients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet. 2020; 395:1054-1062. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30566-3; Wu Z., McGoogan J.M. Characteristics of and important lessons from the coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak in China: summary of a report of 72 314 cases from the Chinese Center for Disease Control and Prevention. JAMA. 2020; 323:1239-1242. doi: 10.1001/jama.2020.2648; Guan W.J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. N Engl J Med. 2020; 382:1708-1720. doi: 10.1056/NEJMoa2002032].

Эти осложнения во многом обусловлены иммунной дисрегуляцией с гипервоспалительной и протромботической реакцией (иммунотромбозом), запускаемой вирусом SARS-CoV-2 и поддерживаемой различными патогенными механизмами [Knight J.S., Caricchio R., Casanova J.L., Combes A.J., Diamond В., Fox S.E., et al. The intersection of COVID-19 and autoimmunity. J Clin Invest. 2021:131 doi: 10.1172/JCI154886. e154886; Stephenson E., et al. Single-cell multi-omics analysis of the immune response in COVID-19. Nat Med. 2021; 27:904-916. doi: 10.1038/s41591-021-01329-2.]. Помимо высоких уровней циркулирующих провоспалительных цитокинов (например, интерлейкина (ИЛ)-6), появляется все больше доказательств того, что активация комплемента играет решающую роль [Afzali В., Noris М, Lambrecht B.N., Kemper С.The state of complement in COVID-19. Nat Rev Immunol. 2022;22:77-84. doi: 10.1038/s41577-021-00665-1], о чем свидетельствуют повышенные уровни продуктов активации в плазме (растворимый C5b-9 [sC5b-9], С5а) и отложения комплемента в пораженных тканях пациентов с COVID-19 [Cugno М., et al. Complement activation in patients with COVID-19: a novel therapeutic target. J Allergy Clin Immunol. 2020; 146:215-217. doi: 10.1016/j.jaci.2020.05.006; Cugno M., et al. Complement activation and endothelial perturbation parallel COVID-19 severity and activity. J Autoimmun. 2021; 116 102560; Carvelli J., et al. Association of COVID-19 inflammation with activation of the C5a-C5aR1 axis. Nature. 2020; 588:146-150. doi: 10.1038/s41586-020-2600-6].

Этот вывод согласуется с участием комплемента, о котором сообщалось при некоторых вирусных заболеваниях, включая инфекции другими коронавирусами [Ostrycharz Е., Hukowska-Szematowicz В. New insights into the role of the complement system in human viral diseases. Biomolecules. 2022;12:226. doi: 10.3390/bioml2020226; Wang R., et al. The role of C5a in acute lung injury induced by highly pathogenic viral infections. Emerg Microbes Infect. 2015; 4 doi: 10.1038/emi.2015.28; Zhou Y., et al. A single asparagine-linked glycosylation site of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein facilitates inhibition by mannose-binding lectin through multiple mechanisms. J Virol. 2010; 84:8753-8764. doi: 10.1128/JVI.00554-10], и предполагаемыми защитными эффектами блокады комплемента при COVID-19 [Cugno М., et al. Complement activation in patients with COVID-19: a novel therapeutic target. J Allergy Clin Immunol. 2020; 146:215-217. doi: 10.1016/j.jaci.2020.05.006].

Более того, активация комплемента связана с эндотелиопатией, увеличением маркеров некроза и тяжестью заболевания с тенденцией к нормализации в период ремиссии [Cugno М.. et al. Complement activation and endothelial perturbation parallel COVID-19 severity and activity. J Autoimmun. 2021; 116 102560; Laudanski K., et al. A disturbed balance between blood complement protective factors (FH, ApoE) and common pathway effectors (C5a. TCC) in acute COVID-19 and during convalesce. Sci Rep. 2022; 12:13658. doi: 10.1038/s41598-022-17011-7]. В целом, это открытие подтверждает, что воспаление и, в частности, активация комплемента имеет решающее значение в патогенезе COVID-19 и может использоваться в качестве прогностического показателя.

Прогнозирование риска тяжелого течения COVID-19 было бы полезно для направления ограниченных ресурсов здравоохранения на пациентов с самым высоким риском, требующих более интенсивного лечения. Возраст, мужской пол, генетические маркеры и сопутствующие заболевания (например, ожирение, диабет, иммуносупрессия) являются хорошо известными переменными, влияющими на окончательный исход заболевания и являющимися предикторами более тяжелого заболевания [Zhang J.J., Dong X., Liu G.H., Gao Y.D. Risk and protective factors for COVID-19 morbidity, severity, and mortality. Clin Rev Allergy Immunol. 2022; Jan19:1-18. doi: 10.1007/s 12016-022-08921-5].

В то время как исследования прогностических маркеров тяжести заболевания в основном проводились у тяжелых/госпитализированных пациентов, гораздо меньше информации доступно для легкой формы COVID-19 на ранней стадии заболевания или у относительно здоровых лиц.

Поэтому исследования для выяснения вопроса активируется ли уже комплемент при проявлении заболевания различной степени тяжести и могут ли уровни продуктов активации комплемента в плазме предсказать клинический исход и, в частности, степень поражения легких, а также установление взаимосвязи между циркулирующими уровнями маркеров воспаления и активации комплемента на исходном уровне и тяжестью COVID-19 (классифицированной как легкая, умеренная и тяжелая) остаются в настоящее время весьма актуальными.

Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 30 компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль, как в клиренсе иммунных комплексов, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки. Система комплемента может активироваться тремя путями: классическим, альтернативным и лектиновым.

Классический путь является Ca²⁺/Mg²⁺-зависимым каскадом, который в норме активируется при формировании иммунного комплекса (ИК). Компонент С1, первый ферментный комплекс в каскаде, является пентамолекулярным комплексом. Включает одну молекулу C1q и по две молекулы C1r и C1s. С1 комплекс связывается с Fc-фрагментом иммуноглобулинов в составе ИК через C1q и инициирует ферментативный каскад системы комплемента. Как только активируется С1 комплекс, C1s расщепляет компонент С4, приводя к образованию C4b, который затем связывает компонент С2. Иммобилизованный компонент С2 расщепляется при помощи фермента C1s с образованием С3-конвертазы (C4bC2a) классического пути.

Альтернативный путь является Mg²⁺-зависимым и активируется рядом разнообразных веществ, включающих полисахариды клеточных стенок дрожжей и бактерий, определенные биополимерные материалы. При иммобилизации C3b на поверхности на него садится фактор В, который под действием фермента, фактора D, расщепляется и образуется С3-конвертаза (C3bBb) альтернативного пути.

Пектиновый путь активирует комплемент при помощи маннан-связывающего лектина (МСЛ) и двух ассоциированных с ним сериновых протеаз (МАСП-1 и МАСП-2) (подобно с C1r и C1s в классическом пути активации комплемента). Как и в классическом пути активации комплемента, для лектинового пути также требуются компоненты С2 и С4. Активация лектинового пути приводит к формированию С3-конвертазы, аналогичной С3-конвертазе классического пути (C4bC2a) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М: Мир, 2000. - 592 с.].

Субстратом С3-конвертазы трех путей активации является ключевой компонент комплемента, компонент С3, при гидролизе которого образуется С3а (анафилатоксин) и C3b (опсонин). Присоединяя дополнительно молекулу C3b, С3-конвертаза обретает способность гидролизовать компонент С5, который запускает реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).

При активации комплемента генерируются биологически активные фрагменты белков С3 и С5 (С3а и С5а - анафилатоксины) и C5b-9 (МАК), которые опосредуют воспалительные активности, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости, цитолиз и тканевое повреждение [SahuA., Lambris J.D. Complement inhibitors are surget conceptin anti-inflamatory therapeutics // Immunopharmacology - 2000. - V. 49. - P. 133-148.].

Эффективный контроль комплемента достигается с помощью регуляторов, экспрессированных на мембране клеток и в жидкой фазе. Гиперактивация комплемента из-за потери этого контроля часто связана с тромботической болезнью.

Ингибитор сериновой протеазы, ингибитор Cl-эстеразы (C1-INH), является ярким примером скоординированной регуляции свертывания крови и комплемента. C1-INH связывается и инактивирует несколько протеаз, связанных с комплементом, включая C1r и C1s классического пути, а также MASP-1 и MASP-2 лектинового пути, тем самым предотвращая образование конвертаз этих путей. Его ингибирующая активность потенцируется полианионами, таким как гепарин [Wijeyewickrema LC et al. Molecular determinants of the substrate specificity of the complement-initiating protease, Clr. J Biol Chem 2013; 288: 15571-80; Pike RN, Wijeyewickrema LC. The molecular switches controlling the interaction between complement proteases of the classical and lectin pathways and their substrates. Curr Opin Struct Biol 2013; 23: 820-7]. По тому же механизму C1-INH также взаимодействует с фактором XIa, фактором XIIa и калликреином, ослабляя активацию свертывания через контактный путь и уменьшая провоспалительные эффекты калликреина. Интересно, что антитромбин (АТ)-III, основной ингибитор тромбина и фактора свертывания крови Ха, также ингибирует протеазы лектинового пути [Parej K, Dobo J, Zavodszky Р, Gal P. The control of the complement lectin pathway activation revisited: both Cl-inhibitor and antithrombin are likely physiological inhibitors, while alpha2-macroglobulin is not. Mol Immunol 2013; 54: 415-22], и как C1-INH, так и АТ-III требуют взаимодействия с анионной поверхностью для оптимального функционирования.

Полифосфат (polyP) представляет собой сильно анионный линейный полимер ортофосфата [Harold FM. Inorganic polyphosphates in biology: structure, metabolism, and function. Bacterial Rev 1966; 30: 772-94], повсеместно экспрессируемый в клетках млекопитающих, но в изобилии присутствующий в альфа- и плотных гранулах тромбоцитов, откуда он высвобождается при активации [Muller F, et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell 2009; 139: 1143-56]. Недавние исследования [Smith SA, et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 903-8]. продемонстрировали, что полиР способствует коагуляции на нескольких этапах в системе свертывания крови [Muller F, et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell 2009; 139:1143-56] путем связывания с тромбином [Mutch NJ, Myles T, Leung LL, Morrissey JH. Polyphosphate binds with high affinity to exosite II of thrombin. J Thromb Haemost 2010; 8: 548-55], фибриногеном [Mutch NJ, et al. Polyphosphate modifies the fibrin network and down-regulates fibrinolysis by attenuating binding of tPA and plasminogen to fibrin. Blood 2010; 115: 3980-8], факторами XI и XII, пре/калликреином, высокомолекулярным кининогеном (HMWK) и фактором фон Виллебранда (VWF) [Montilla М, et al. Polyphosphate binds to human von Willebrand factor in vivo and modulates its interaction with Glycoprotein Ib. J Thromb Haemost 2012; 10: 2315-23]. Показано, что полиР связывается с C1-INH [Wat J, et al. Polyphosphate suppresses complement via the terminal pathway. Blood 2014; 123: 768-76] и увеличивает его способность подавлять расщепление C1s компонентов С4 и С2. Этот подавляющий комплемент эффект полиР согласуется с данными, где полиР негативно регулирует терминальный путь. Это также согласуется с сообщениями о том, что некоторые бактерий используют полиР для защиты от лизиса, опосредованного комплементом [Zhang Q, Li Y, Tang CM. The role of the exopolyphosphatase PPX in avoidance by Neisseria meningitidis of complement-mediated killing. J Biol Chem 2010; 285: 34259-68]. Антикомплементные эффекты полиР несколько неожиданны для системы млекопитающих в свете его роли в стимулировании коагуляции, предполагая, что полиР модулируют коагуляцию и комплемент сложными способами, зависящими от контекста.

Подобно C1-INH, ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) ингибирует лектиновый путь активации путем вмешательства в расщепление MASP-2 компонентов С4 и С2 [Keizer MP, et al. TFPI inhibits lectin pathway of complement activation by direct interaction with MASP-2. Eur J Immunol 2015; 45: 544-50]. TFPI связан с эндотелиальными клетками микрососудов посредством гликозилфосфатидилинозитоловой (GPI) связи и является основным ингибитором пути TF, нейтрализуя TF-фактор VIIa зависимым от фактора Ха образом. Таким образом, он координированно регулирует оба каскада. Интересно, что посколькупароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) вызывается мутацией гена фосфатидилинозитолгликанов класса A (PIG-A), который кодирует белок, необходимый для связывания GPI, TFPI также будет отсутствовать в пораженных клетках. Это может помочь объяснить, почему у пациентов с избыточной активацией комплемента повышен риск тромбоза. Регуляция MASP также может быть достигнута путем синтеза МАР-1 (также известного как Мар44) и sMAP, которые представляют собой альтернативные формы сплайсинга из генов для MASP-1/3 и MASP-2, соответственно. Они конкурируют со связыванием MASP с MBL и фиколинами, делая комплекс MBL неактивным. Физиологическая значимость их остается неясной, но их терапевтическое применение при сосудистых заболеваниях изучается [Pavlov VI, et al. Endogenous and natural complement inhibitor attenuates myocardial injury and arterial thrombogenesis. Circulation 2012; 126: 2227-35]. C3b расположен в точке схождения трех путей активации. Factor Н (FH) является основным ингибитором альтернативного пути в жидкой фазе, который главным образом нацелен на C3b [Licht С, et al. Platelet-associated complement factor H in healthy persons and patients with atypical HUS. Blood 2009; 114: 4538-45]. FH одновременно связывается с C3b и с клетками-хозяевами, где он подавляет активацию комплемента следующим образом: (а) действует как кофактор для опосредованного протеазным фактором I (FI) расщепления C3b до iC3b; (б) ускоряет распад С3-конвертазы альтернативного пути; (в) конкурировать за связыванием FB комплемента с C3b. Функция FH может быть подавлена во время сепсиса с помощью высвобождаемой из тромбоцитов киназы [Ekdahl KN, Nilsson В. Phosphorylation of complement component С3 and С3 fragments by a human platelet protein kinase. Inhibition of factor I-mediated cleavage of C3b. J Immunol 1995; 154: 6502-10], которая модифицирует C3b так, что он плохо связывается с FH, неэффективно инактивируется FI и легче откладывается в поврежденных тканях хозяина, тем самым способствуя усиленной и устойчивой воспалительной реакции [Nilsson-Ekdahl K, Nilsson В. Phosphorylation of С3 by a casein kinase released from activated human platelets increases opsonization of immune complexes and binding to complement receptor type 1. Eur J Immunol 2001; 31: 1047- 54]. Имеются убедительные доказательства того, что FH и другие компоненты альтернативного пути связывают комплемент и коагуляцию. Пациенты с мутациями FH имеют повышенный риск развития тромботической микроангиопатии, aHUS, а также сердечно-сосудистых заболеваний [Ferreira VP, et al. The binding of factor H to a complex of physiological polyanions and C3b on cells is impaired in atypical hemolytic uremic syndrome. J Immunol 2009; 182: 7009-18; Saunders RE, et al. The interactive Factor H-atypical hemolytic uremic syndrome mutation database and website: update and integration of membrane cofactor protein and Factor I mutations with structural models. Hum Mutat 2007; 28: 222-34]. Более того, мутации с потерей или усилением функции в компонентах альтернативного пути составляют 60-70% всех случаев аГУС [Tsai НМ. A mechanistic approach to the diagnosis and management of atypical hemolytic uremic syndrome. Transfus Med Rev 2014; 28: 187-97; Mele C, Remuzzi G, Noris M. Hemolytic uremic syndrome. Semin Immunopathol 2014; 36: 399-420]. Хотя о мутациях в FH не сообщалось при тромботической тромбоцитопенической пурпуре (ТТР), было показано, что FH совместно локализуется с VWF в тельцах Weibel-Palade и связывается с VWF. Существуют некоторые разногласия относительно того, мешает ли FH опосредованному ADAMTS13 протеолизу растворимого сверхбольшого фактора Виллебранда (ULVWF) в мономеры и димеры или облегчает его [Feng S, et al. The interaction between factor H and von Willebrand factor. PLoS One 2013; 8: e73715]. Тромбомодулин (TM), гликопротеин эндотелиальных клеток с антикоагулянтными, антифибринолитическими и противовоспалительными свойствами, усиливает FI-опосредованную инактивацию C3b в присутствии FH. Некоторые мутации ТМ увеличивают риск развития aHUS Delvaeye М, et al. Thrombomodulin mutations in atypical hemolytic-uremic syndrome. N Engl J Med 2009; 361: 345-57] и увеличивают отложение комплемента в почках мышей после индукции HUS с помощью Shiga токсина Zoja С, et al. Lack of the lectin-like domain of thrombomodulin worsens shiga toxin-associated HUS in mice. J Immunol 2012; 189: 3661-8].

Эндотелиальные клетки экспрессируют факторы, защищающие от повреждения комплементом, изменения которых связаны с сосудистыми заболеваниями [Tedesco F, et al. Complement-endothelial cell interactions: pathophysiological implications. Mol Immunol 1999; 36: 261-268]. Подобно FH, мембраносвязанный рецептор комплемента (CR)-l, GPI-связанный CD55 и трансмембранный гликопротеи новый рецептор CD46 также способствуют распаду C3b-содержащих конвертаз. Все, кроме CD55, способствуют FI-опосредованному протеолизу C3b до iC3b [Kim DD, Song WC. Membrane complement regulatory proteins. Clin Immunol 2006; 118: 127-136]. Сниженная экспрессия CD55 связана с тромботическими нарушениями PNH [Hill A, Richards SJ, Hillmen P. Recent developments in the understanding and management of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 2007; 137: 181-92] и с ишемией-реперфузией органов [Yamada K, et al. Critical protection from renal ischemia reperfusion injury by CD55 and CD59. J Immunol 2004; 172: 3869-75], в то время как низкий уровень CD46 является причинным фактором для aHUS [Kavanagh D, Goodship TH, Richards A. Atypical haemolytic uraemic syndrome. Br Med Bull2006; 77-78: 5-22]. Описано несколько ингибиторов терминального пути, которые предотвращают лизис клеток, и все они связываются с компонентами терминального пути, препятствуя МАК. CD59 является GPI-сцепленным белком, который связывается с С8 и С9 и предотвращает полимеризацию С9; Ninomiya Н, Sims PJ. The human complement regulatory protein CD59 binds to the alpha-chain of C8 and to the "b"domain of C9. J Biol Chem 1992; 267: 13675-80], дефицит которого связан с ПНГ. Кластерин связывает компоненты С7, С8 и С9, индуцируя конформационные изменения, которые уменьшают интеграцию C5b-9 в мембрану [Falgarone G, Chiocchia G. Chapter 8: clusterin: a multifacet protein at the crossroad of inflammation and autoimmunity. Adv Cancer Res 2009; 104: 139-70]. Витронектин связывается с C5b-7, делая возможным образование растворимых MAC, которые не могут связываться с мембраной [Podack ER, Kolb WP, Muller-Eberhard HJ. The SC5b-7 complex: formation, isolation, properties, and subunit composition. J Immunol 1977; 119: 2024-9]. Наконец, polyP дестабилизирует C5b,6, предотвращая интеграцию C5b-8 и C5b-9 в мембрану-мишень [Wat J, et al. Polyphosphate suppresses complement via the terminal pathway. Blood 2014; 123: 768-776].

Активация комплемента также приводит к высвобождению сильнодействующих анафилатоксинов С3а и С5а. Карбоксипептидаза В2 (СРВ2), также известная как активированный тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза (TAFIa) [Campbell WD, Lazoura E, Okada N, Okada H. Inactivation of С3а and C5a octapeptides by carboxypeptidase R and carboxypeptidase N. Microbiol Immunol 2002; 46: 131-4], образуется в результате опосредованного тромбином расщепления ее профермента TAFI в присутствии кофактора ТМ. TAFIa модифицирует С3а и С5а, снижая большую часть их активности. Анафилатоксины С3а и С5а также могут подвергаться протеолизу с помощью плазмина и матриксной металлопротеиназы-12 [Bellac CL, et al. Macrophage matrix metalloproteinase-12 dampens inflammation and neutrophil influx in arthritis. Cell Rep 2014; 9: 618-32]. Эти пути могут быть мишенями для уменьшения воспаления и избыточного отложения фибрина.

Показано также, что С6 играет роль в гемостазе, хотя механизмы этого неясны. Дефицит С6 у грызунов удлиняет время кровотечения, и это может быть связано с дефектной ADP-индуцированной агрегацией тромбоцитов [Bhole D, Stahl GL. Molecular basis for complement component 6 (C6) deficiency in rats and mice. Immunobiology 2004; 209: 559-68] и/или недостаточным высвобождением VWF из эндотелиальных клеток [Ota Н, et al. Terminal complement components mediate release of von Willebrand factor and adhesion of platelets in arteries of allografts. Transplantation 2005; 79: 276-81].

Некоторые прокоагулянтные ферменты, включая тромбин, фактор IХа, фактор Ха, фактор XIa и калликреин активируют компонент С5 независимым от компонента С3 способом, минуя формирование С3- и С5-конвертаз [Huber-Lang М, et al. Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway. Nat Med 2006; 12: 682-687]. Показано, что тромбин вызывает протеолиз компонента С5 с высвобождение С5а и C5b. Авторами также показано, что тромбин сам по себе не очень эффективен в высвобождении С5а. Скорее, был идентифицирован другой, высококонсервативный, чувствительный к тромбину сайт расщепления в С5, который в сочетании с конвертазой С5 приводит к сборке более активного мембрано-атакующего комплекса, так называемого C5b_T-9 [Krisinger MJ, et al. Thrombin generates previously unidentified C5 products that support the terminal complement activation pathway. Blood 2012; 120: 1717-1725]. Физиологическое значение этого вывода еще предстоит определить. Поскольку тромбин и С5-конвертаза, вероятно, сосуществуют при большинстве травм, считается, что C5b_T-9 является вероятной конечной точкой. Интересно, что тромбин также эффективно расщепляет С9 на два фрагмента [Dankert JR, Esser AF. Complement-mediated killing of Escherichia coli: dissipation of membrane potential by a C9-derived peptide. Biochemistry 1986; 25: 1094-1100], релевантность которых также остается загадкой.

Плазмин также может активировать комплемент, но деградирует С5, тем самым предотвращая отложение C5b и образование МАК. Во время этого протеолиза С5 генерируется активный С5а. Действительно, используя животные модели, авторами показано, что плазмин (или ферменты, которые активируются плазмином, например, матриксные металлопротеиназы), вероятно, являются эффективной С5-конвертазой при тромбозе [Barthel D, Schindler S, Zipfel PF. Plasminogen is a complement inhibitor. J Biol Chem 2012; 287: 18831-42; Amara U, et al. Molecular intercommunication between the complement and coagulation systems. J Immunol 2010; 185: 5628-5636].

Другие ферменты, участвующие в воспалении, также проявляют свойства С5-конвертазы. Эластаза нейтрофилов непосредственно расщепляет С5, образуя С5а-подобную часть и комплекс C5b,6. В этом случае образование комплекса C5b-9 ограничивается эластаза-опосредованным гидролизом С6 [Doring G. The role of neutrophil elastase in chronic inflammation. Am J Respir Crit Care Med 1994; 150: S114-7]. Катепсин D, высвобождающийся после повреждения ткани, может также активировать С5 [Huber-Lang М, et al. Cathepsin D is released after severe tissue trauma in vivo and is capable of generating C5a in vitro. Mol Immunol 2012; 50: 60-5].

Таким образом, избыточная (неконтролируемая) активация системы комплемента является частью патогенеза большого числа воспалительных заболеваний. Патологические эффекты могут быть обусловлены повышенной, продолжительной активацией, например, вызванной присутствием иммунных комплексов (системная красная волчанка и связанные с ней заболевания), а также сниженной экспрессией и функцией различных ингибиторов комплемента, или комбинацией этих двух факторов [Carroll M.V., R.В. Sim R.B. Complement in health and disease //Advanced Drug Delivery Reviews. - 2011. - V. 63, №12. - P. 965-975].

Ишемия и последующая реперфузия органов и тканей наблюдается при таких состояниях как инфаркт миокарда или инсульт. Неконтролируемая активация системы комплемента играет важную роль при реперфузионном повреждении. Результатом этого является мультифункциональный воспалительный процесс, вовлекающий генерацию анафилатоксинов, повышенную экспрессию адгезивных белков и тканевых факторов на эндотелиальных клетках и выход из сосудов полиморфно-ядерных лейкоцитов [Banz Y., Rieben R. Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion damage // Annals of Medicine. - 2012. - V. 44, №3. - P. 205-217].

Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (ЕА); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор после центрифугирования. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну гемолитическую единицу комплемента (CH₅₀) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% 0,5 мл стандартной суспензии ЕА при 37°С за 45 мин. В 1 мл сыворотки крови человека содержится 20-40 CH₅₀ [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368 с].

Существенным недостатком этого метода является длительность выполнения теста, недостаточная точность (колебания нормальных значений в два раза), для оценки степени лизиса требуется центрифугирование и определение гемоглобина в супернатанте (дополнительный контакт оператора с биоматериалом).

Также из уровня техники известен тест определения функциональной активности системы комплемента по классическому пути, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА). Суть теста заключается в определении активности классического пути системы комплемента по сорбции мембрано-атакующего комплекса (МАК) на подложке 96-ти луночной планшеты, сорбированной агрегированными иммуноглобулинами. Связывание МАК проявляют моноклональными антителами, конъюгированными с ферментом, щелочной фосфатазой, с использованием его субстрата. В качестве стандарта используют лиофильно высушенный препарат сыворотки крови человека. Рассчитывают в процентах функциональную активность классического пути активации комплемента относительно стандарта [WIESLAB Complement system Classical pathway. "EuroDiagnostica", Швеция].

Существенным недостатком ИФА-теста скрининга комплемента по классическому пути является длительность проведения анализа (не менее 3 часов), использование моноклональных антител, которые делают данный анализ недоступным для рутинных исследований. Также использование лиофильно высушенной сыворотки в качестве стандарта требуют специальных условий для хранения и транспортировки (-20°С), а также подобный стандарт может завышать активность комплемента при анализе из-за потери функциональной активности самого стандарта при лиофилизации, хранении и транспортировке.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является скрининг-тест определения активности классического пути системы комплемента человека методом турбидиметрии [патент на изобретение РФ №2704121, опубл. 24.10.2019 Бюл. №30]. Суть метода заключается в определении функциональной активности классического пути системы комплемента с использованием реакции лизиса эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), в условиях вероналового солевого буфера (VBS²⁺) при температуре (37,0±0,5)°С в течение 10 мин. Реакцию комплемент-зависимого лизиса ЕА определяют турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии ЕА при длине волны 620 нм, затем определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по калибровочному графику, где контроль ЕА представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса ЕА - 100% лизис.

Недостатком данного гемолитического теста является только исследование активности комплемента в сыворотке или плазме крови и не позволяет прогнозировать неконтролируемую активацию комплемента при разных заболеваниях, т.е. не отражает ингибиторный потенциал крови и тяжесть течения заболевания или состояния.

Таким образом, на настоящий момент не существует доступного теста для скрининга ингибиторного потенциала крови для прогнозирования неконтролируемой активации комплемента (тяжести течения) при Ковид-19.

Техническим результатом предлагаемого способа является оценка ингибиторного потенциала крови для прогнозирования неконтролируемой активации системы комплемента (тяжести течения) при Ковид-19 в рутинных исследованиях.

Указанный результат достигается тем, что определение функциональной активности классического пути системы комплемента проводят одновременно в сыворотке и в ЭДТА-плазме крови с использованием 1% суспензии эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) в условиях вероналового солевого буфера (VBS²⁺) при температуре (37,0±0,5)°С в течение 10 мин. Реакцию комплемент-зависимого лизиса ЕА оценивают турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии ЕА при длине волны 620 нм, определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по графику, где контроль ЕА представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса ЕА -100% лизис, при этом разница активности комплемента в сыворотке и ЭДТА-плазме на уровне ±10%) характеризует оптимальный уровень ингибиторного потенциала крови, более высокая активность комплемента (более 10%) в сыворотке по сравнению с ЭДТА-плазмой свидетельствует о низкой функциональной активности С1-ингибитора, более низкая активность комплемента в сыворотке крови (от 10% до 45%) характеризует сниженный ингибиторный (преимущественно антитромбина III) потенциал и низкая активность комплемента в сыворотке крови по сравнению с ЭДТА-плазмой более 45% оценивается как угроза неконтролируемой активации комплемента, угроза острого респираторного дистресс-синдрома при Ковид-19.

Заявленное изобретение поясняется фигурами:

на фиг. 1 представлен график для определения степени лизиса ЕА в % методом турбидиметрии;

на фиг. 2 представлена ошибка метода турбидиметрии при определении активности системы комплемента по классическому пути;

на фиг. 3 представлено потребление комплемента при свертывании крови;

на фиг. 4 представлено потребление комплемента в сыворотке крови крыс при предварительной инкубации;

на фиг. 5 представлено потребление комплемента человека при свертывании крови.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови у обследуемых лиц, готовят сыворотку и ЭДТА-плазму. Гемолитический тест проводят с использованием 1%) суспензии ЕА в вероналовом солевом буфере, содержащем Са²⁺ и Mg²⁺(VBS²⁺). Время проведения скрининг-теста - 10 мин. Суть метода заключается в изменении светорассеивания эритроцитов при их лизисе в 96-ти луночных иммунологических плоскодонных планшетах. Изменение светорассеивания при лизисе эритроцитов определяют турбидиметрически при длине волны 620 нм с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. Для определения степени лизиса эритроцитов в опытных образцах строят калибровочный график зависимости оптической плотности А₆₂₀ от лизиса ЕА по которому определяют степень лизиса (фиг. 1), где за 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля ЕА, на спонтанный лизис, соответственно за 100% лизиса принимают оптическую плотность контроля на полный лизис. Разница активности комплемента в сыворотке и ЭДТА-плазме на уровне ±10% характеризует оптимальный уровень ингибиторного потенциала крови, более высокая активность комплемента (более 10%) в сыворотке по сравнению с ЭДТА-плазмой свидетельствует о низкой функциональной активности С1 - ингибитора, более низкая активность комплемента в сыворотке крови (от 10% до 45%) характеризует сниженный ингибиторный (преимущественно антитромбина III) потенциал и очень низкая активность комплемента в сыворотке крови по сравнению с ЭДТА-плазмой более 45% оценивается как угроза неконтролируемой активации комплемента, угроза острого респираторного дистресс-синдрома при Ковид-19.

Для определения степени лизиса эритроцитов нами предложен калибровочный график (фиг. 1), где степень лизиса эритроцитов оценивают по снижению оптической плотности при длине волны 620 нм. За 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов человека на спонтанный лизис (25 мкл 2% ЕА + 75 мкл VBS²⁺), соответственно за 100% лизис принимают оптическую плотность контроля на полный лизис (25 мкл 2% ЕА + 75 мкл Н₂О).

Для выявления ошибки теста турбидиметрического определения активности системы комплемента нами проведены следующие исследования. Определяли активность комплемента в сыворотке крови одного человека в 16 повторах. Расчет степени лизиса (у) в % проводили по формуле:

У (%)=100-{[А620_оп (10 мин)-А620_п/л]×100/[А620_оп(0 мин)-А620_п/л]},

где А620_оп - оптическая плотность опытной пробы до инкубации (0 мин) и после инкубации в течение 10 мин при 37°С;

А620_п/л - оптическая плотность контроля на полный лизис (бланк для теста турбидиметрии), равный величине 0,05;

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таким образом, калибровочный график и расчетный показатель степени лизиса практически не отличаются и позволяют определять методом турбидиметрии без стадии центрифугирования и измерения гемоглобина в супернатанте и последующего расчета степени лизиса эритроцитов, что существенно упрощает регистрацию результатов анализа функциональной активности классического пути системы комплемента в рутинных исследованиях. Определение степени лизиса эритроцитов методом турбидиметрии также позволяет проводить кинетические исследования функциональной активности комплемента, т.е. исследования комплемент-опосредованного лизиса эритроцитов во времени без остановки реакции для измерения степени лизиса.

Рассчитывали ошибку метода турбидиметрического теста определения активности классического пути системы комплемента. Полученные результаты представлены на фиг. 2.

Как видно из данных, представленных на фиг. 2, определения степени лизиса в сыворотке крови №1 (16 повторов) ошибка метода варьировала на уровне ±10% лизиса.

Пример 1. Определение функциональной активности классического пути системы комплемента в сыворотке и в ЭДТА плазме крови крыс.

В первую лунку планшеты вносят 1 мкл сыворотки крысы, а во вторую - 1 мкл ЭДТА-плазмы этой же крысы, затем добавляют 74 мкл буфера VBS²⁺ и 25 мкл 1% ЕА. Тщательно перемешивают и измеряют мутность проб при А620 нм (0 мин инкубации), далее инкубируют в течение 10 минут при 37°С. Тщательно перемешивают и повторно измеряют мутность проб. Степень лизиса ЕА в % определяют по калибровочному графику, как описано выше. Потребление комплемента при свертывании крови определяют как разность степени лизиса в ЭДТА-плазме и соответствующей сыворотке Проведено исследования активности комплемента в сыворотке и ЭДТА-плазме крови 20 крыс. Полученные результаты представлены на фиг. 3.

Как видно из данных, представленных на фиг.3, только в 3 пробах разница степени лизиса находится в пределах ±10%, в 11 пробах активность комплемента выше в сыворотке по сравнению с ЭДТА плазмой (от 11% до 35%) и в оставшихся 5 пробах наблюдается более низкая активность комплемента в сыворотке (от 11% до 41%).

Полученные результаты свидетельствуют о состоянии функциональной активности ингибиторов (ингибиторный потенциал) крови. Отсутствие разницы активности комплемента в сыворотке и ЭДТА-плазме свидетельствуют об оптимальном уровне и функциональной активности ингибиторов системы комплемента и гемостаза, когда свертывание крови не приводит к потреблению как ингибиторов, так и системы комплемента (разница на уровне ±10%). Более высокая активность комплемента в сыворотке крови по сравнению с ЭДТА-плазмой свидетельствует о потреблении С1-ингибитора при свертывании крови, что приводит к более высокой активности комплемента в сыворотке (более 10%). Низкая активность комплемента в сыворотке по сравнению с ЭДТА-плазмой свидетельствует, прежде всего, о прямой активации компонентов С3 и С5 тромбином, что может привести к формированию мембрано-атакующего комплекса, и при предварительной инкубации проявляется как снижение активности комплемента в сыворотке после свертывания крови в пробирке.

Для подтверждения полученных данных проведены исследования стабильности системы комплемента в сыворотке крови у крыс.

Пример 2. Определение стабильности системы комплемента в сыворотке крови крыс. Для определения стабильности системы комплемента определяли влияние предварительно инкубации сыворотки крысы на функциональную активность системы комплемента. В опытной пробе 1 мкл сыворотки крысы вносили в лунку 96-ти луночной планшеты с плоским дном, добавляли 74 мкл буфера VBS²⁺ и инкубировали в течение 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации в пробы вносили по 25 мкл 1% ЕА и инкубировали в течение 10 мин при тех же условиях. С контрольной пробой сыворотки не проводили предварительной инкубации. Проведены исследования 16 проб сыворотки крови крыс. После второй инкубации определяли степень лизиса в % по калибровочному графику, как описано выше. Стабильность системы комплемента или потребление комплемента определяли как разность степени лизиса в контрольной и опытной пробах. Полученные результаты представлены на фиг. 4.

Как видно из данных, представленных в фиг.4, только в 5 пробах разница активности комплемента в опытной и контрольной сыворотках не превышает 10% (±10%), в 3 опытных пробах сыворотки наблюдается более высокая (более 10%) активность комплемента (от 17 до 24%) и в 8 опытных пробах активность комплемента ниже активности соответствующих контрольных проб.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что стабильность системы комплемента зависит от функциональной активности ингибиторов (ингибиторный потенциал) крови.

Пример 3. Определение функциональной активности классического пути системы комплемента в сыворотке и в ЭДТА-плазме крови человека. Проведены исследования активности комплемента в сыворотке и ЭДТА плазме 32 обследуемых людей. Условия эксперимента описано выше (см. пример 1). Полученные результаты представлены на фиг. 5.

Как видно из данных, представленных в фиг. 5, в 25 (78%) пробах потребление комплемента находится на уровне ±10%, что свидетельствует об оптимальном уровне и функциональной активности ингибиторов крови, в 7 пробах (22%) наблюдается потребление комплемента при свертывании крови на уровне от 11%) и до 30%. В отличие от сыворотки крови крыс у людей практически не наблюдается потребление С1-ингибитора при свертывании крови.

Таким образом, предлагаемый способ определения ингибиторного потенциала крови может быть использован для прогнозирования неконтролируемой активации системы комплемента как при микротромбозах, которые наблюдаются при Ковид-19, так и при ОРДС, вызванном вирусом SARS-CoV-2. Раннее выявление лиц со сниженным ингибиторным потенциалом позволит проводить адекватную терапию при Ковид-19 путем использования моноклональных анти-С5 антител.

Изобретение относится к медицинской иммунологии. Раскрыт способ определения ингибиторного потенциала крови для прогнозирования неконтролируемой активации системы комплемента при COVID-19 путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), сывороткой крови человека в условиях вероналового солевого буфера VBS²⁺ при температуре 37,0±0,5°С, пробы инкубируют в течение 10 мин, реакцию комплемент-зависимого лизиса ЕА оценивают турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии ЕА при длине волны 620 нм, строят калибровочный график зависимости оптической плотности А₆₂₀ от лизиса ЕА, по которому определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах. При этом параллельно определяют активность системы комплемента в соответствующих ЭДТА-плазмах, потребление комплемента при свертывании крови рассчитывают как разность степени лизиса в ЭДТА-плазме и сыворотке крови, разность активности комплемента в сыворотке и ЭДТА-плазме на уровне ±10% характеризует оптимальный уровень ингибиторного потенциала крови, более высокая активность комплемента более 10% в сыворотке по сравнению с ЭДТА-плазмой свидетельствует о низкой функциональной активности С1-ингибитора, более низкая активность от 10% до 45% комплемента в сыворотке крови характеризует сниженный ингибиторный потенциал преимущественно за счет антитромбина III и очень низкая активность комплемента в сыворотке крови по сравнению с ЭДТА-плазмой более 45% оценивается как угроза неконтролируемой активации комплемента, угроза острого респираторного дистресс-синдрома при COVID-19. Изобретение обеспечивает оценку ингибиторного потенциала крови для прогнозирования неконтролируемой активации системы комплемента при COVID-19 в рутинных исследованиях. 5 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ определения ингибиторного потенциала крови для прогнозирования неконтролируемой активации системы комплемента при COVID-19 путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), сывороткой крови человека в условиях вероналового солевого буфера VBS²⁺ при температуре 37,0±0,5°С, пробы инкубируют в течение 10 мин, реакцию комплемент-зависимого лизиса ЕА оценивают турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии ЕА при длине волны 620 нм, строят калибровочный график зависимости оптической плотности А₆₂₀ от лизиса ЕА, по которому определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах, отличающийся тем, что параллельно определяют активность системы комплемента в соответствующих ЭДТА-плазмах, потребление комплемента при свертывании крови рассчитывают как разность степени лизиса в ЭДТА-плазме и сыворотке крови, разность активности комплемента в сыворотке и ЭДТА-плазме на уровне ±10% характеризует оптимальный уровень ингибиторного потенциала крови, более высокая активность комплемента более 10% в сыворотке по сравнению с ЭДТА-плазмой свидетельствует о низкой функциональной активности С1-ингибитора, более низкая активность от 10% до 45% комплемента в сыворотке крови характеризует сниженный ингибиторный потенциал преимущественно за счет антитромбина III и очень низкая активность комплемента в сыворотке крови по сравнению с ЭДТА-плазмой более 45% оценивается как угроза неконтролируемой активации комплемента, угроза острого респираторного дистресс-синдрома при COVID-19.